（临床兽医学专业论文）洛克沙胂残留对土壤的生态毒性研究.pdf

摘要 摘要 洛克沙胂作为饲料添加剂在畜禽养殖中大量使用，主要以原形从粪便捧出。 在我国畜禽粪便大多未经过无害化处理，作为有机肥使用后，其中残留的洛克沙 脾以惊人的数量进入土壤，势必会造成区域性的土壤污染，并具有使农作物产品 中砷超标的风险，最终通过生物链可能影响人类的健康。 通过洛克沙胂残留对土壤微生物活性的影响、污染土壤中青菜、番茄的生长 影响和砷累积的研究；建立了f i p l c 方法，研究洛克沙胂在土壤中的消除规律和 吸附特性，综合评价洛克沙胂残留对土壤的生态毒性。 洛克沙肿残留设为0 、2 0 、5 0 、8 0 、1 5 0 、2 5 0 m g k g 剂量组，进行土壤微生 物及青菜番茄的生长试验。对土壤呼吸作用、氨化作用和硝化作用的试验结果表 明，不同浓度的洛克沙胂对土壤呼吸作用无明显影响( p 0 0 5 ) ，对土壤氨 化、硝化作用均有明显抑制作用( p o 0 5 ) 。洛克沙胂污染会影响到土壤的氮 循环和土壤肥力。 2 0 、5 0 、8 0 m g k g 低浓度的洛克沙肿对番茄的生长有一定的刺激作用，1 5 0 、 2 5 0 m g k g 高浓度的洛克沙胂对青菜和番茄株长和株重均有明显的抑制作用。青菜 和番茄植株中砷富集量在5 0 d 时达到峰值，砷累积量随土壤中洛克沙肿浓度增加 两增加。h p l c 测得洛克沙胂在土壤中的消除是较缓慢的，至6 0 d 时土壤中的含 量多大于1 0 m g k g 。 通过平衡振荡法研究了洛克沙胂在不同深度土壤a p 、b t l 、b t 2 土壤中的吸 附行为。洛克沙胂在三种土壤中的吸附均能符合f r e u n d l i c h 吸附等温方程，k f 值 分别为0 1 8 2 4 、0 5 1 5 2 、0 9 6 1 6 。三种土壤对洛克沙胂的吸附能力a p b t l o 0 5 ) c o m p a r i n gw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ，t h ei n h i b i t o r ye f f e c t so ns o i ln i t r i f i c a t i o nw e r em o r e o b v i o u sw i mt h er o x a r s o n ed o s ei n c r e a s e d t h e8 0m e g k ga n d1 5 0 m e k gg r o u p sh a d s i g n i f i c a n t l yi n h i b i t o r ye f f e c t so v e rt h ew h o l ee x p e r i m e n tp e r i o d s ( p o 0 5 ) t h es o i l a m m o n i f i c a t i o nw a sw e a k e n e di n2 0m g k ga n d5 0 m g k gr o x a r s o n eg r o u p sa f t e r t r e a t e d2 d ( p a p t h es o r p f i o nc a p a c i t yo fa ps o i lw a sd e c r e a s e dw i t ht h ep 8i n c r e a s i n g ，t h e s o r p t i o no f r o x a r s o n eo nb ts o i ls h o w e d n op hd e p e n d e n c e k e yw o r d s ：r o x a r s o n e ；e c o t o x i c i t y ；s o i l ；a d s o r p t i o n 符号说明 符号说明 洛克沙肿 体重 半数致死量 最高残留限量 高效液相色谱 变异系数 美国食品与药品管理局 世界卫生组织 气相色谱分析 离子色谱一电感耦合等离子体质 谱法 原子荧光光谱法 浓度 转 标准偏差 吸附系数 升 天 摄氏度 紫外吸收检测器 千克 克 毫克 微克 微升 分钟 毫升 小时 b o d yw e i g h t m i n i m a ll e t h a ld o s e m a x i m u m s i d u el i m i t s h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y c o e 目丘c i e n to f 晡a t i o n f o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o n w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n g a sc h r o m a t o g r a p h y i o nc h r o m a t o g r a p h y q n d u c t i v e l y c o u p l e dp l a s m a - m a s ss p e c t r o m e t r y a t o m i cf l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y c o n c e n t r a t i o n r o l l s t a n d a r dd e v i a t i o n t h ea d s o r p t i o nc o e l i i e i e n t l i t e r o a r c e n t i g r a d et h e r m o m e t e r u l t r a v i o l e ta b s o r p t i o nd e t e c t i o n k i l o g r a m g r a m m i l l i g r a m m i c r o g r a m m i c r o l i t e r m i n u t e m i l l i l i t t e r h o u r 懈跚眦 一凹烈眦凇鹏c， 陆l d啪蚝g避呈2 m菩碰h 陈冬梅：洛克沙胂残留对土壤的生态毒性研究 ! 文献综述 洛克沙胂，与其它有机胂制剂( 如阿散酸) 作为含砷饲料添加剂，在畜禽养殖 中被广泛应用。美国食品和药品管理局( f d a ) 最早于1 9 6 4 年允许洛克沙胂用于 鸡的饲料，1 9 8 3 年正式批准用作猪鸡的促生长剂。我国农业部1 9 9 6 年批准了该药 的使用，之后在国内逐渐开始了大量生产，并广泛应用于养鸡业和养猪业【l l 。 1 洛克沙胂及其理化性质 洛克沙胂( r o x a r s o n e ，r o x ) ，化学名为3 一硝基一4 - 羟基一苯胂酸，其结构式见 图l 。分子式c 6 h 6 0 弧s n ，分子量2 6 3 0 4 ，美国化学文摘登记号1 2 1 - 1 9 7 。淡黄色 棱柱状结晶，无臭、无味，冷水中的溶解度l ，热水中约l o ，易溶于甲醇、乙 醇、乙酸、碱水溶液，不溶于醚【2 1 。可形成一元、二元和三元金属盐。由于洛克沙 胂具有苯环等紫外吸收基团，水溶液在2 6 0 生2 n m 、3 4 2 - t ：2 n m 处有最大吸收例，用含 洛克沙胂2 0 9 r l 的磷酸氢二钾水溶液在波长2 0 0 4 0 0 n m 范围进行扫描，显示 2 2 2 n m 、2 6 6 n m 处吸收值很高【4 1 ，洛克沙胂溶液( 甲醇溶解) 在2 6 4 n m 处有最大吸 收峰脚，紫外吸收光谱图见图2 。 图1 洛克沙胂的结构式图2 洛克沙胂溶液紫外吸收光谱图 2 洛克沙胂的作用及机理 洛克沙胂作为有机胂饲料添加剂，在养殖业中已广泛应用。其功能概括起来主 要有以下几方面【q ：( 1 ) 提高饲料转化率，降低养殖成本。有机胂使肠壁变薄改菩 扬州大学硕士论文 2 肠道细胞代谢，促进物质的消化吸收，从而提高饲料利用效率。( 2 ) 刺激动物生 长，促进蛋白质的合成，降低蛋白质的分解代谢，提高动物增重。( 3 ) 抗菌，对多 种肠道致病菌有较强的抑制或杀灭作用，与多种抗生素合用有协同作用显著降低 肠道细菌数量。此外，有机胂减轻或避免了病原微生物产生的有害代谢产物对动物 视体中间代谢过程的不利影响。节约了机体用于解毒作用的物质和能量损耗。“) 抗寄生虫，与多种抗球虫药如盐霉素、球痢灵及尼卡巴嗪等配伍，都具有协同作 用，能提高这些药物的抗球虫效果。( 5 ) 刺激造血器官，促进血红蛋白的形成和铁 的利用。小剂量的砷激发动物的骨骼造血机能，促进红细胞和血色素的生成，使动 物毛色发亮、增强皮肤着色效果、改善胴体品质。( 6 ) 能显著降低饲喂高铜引起的 肝铜浓度升高。 洛克沙胂作为添加剂对畜禽养殖的作用，国内外已有大量研究报道。洛克沙胂 在猪和鸡的锔- j g t 中允许添加量为5 0 m e , ，l 【g ，陈继兰等 7 1 分别在日粮中添加5 0 m g k g 洛克沙胂，t o o m g 恕阿散酸及对氨基苯砷酸钠饲喂肉仔鸡，结果表明，三种有机 肿制剂在鸡的生长期中使其成活率分别提高3 9 、2 9 和2 1 ，洛克沙胂效果最 好。潘穗华等【s l 也研究了洛克沙胂饲养黄羽肉鸡的效果，与对照组比。洛克沙胂组 提高增重7 8 ，饲料效率提高4 6 。有机胂制剂对提高增重、改善饲料转化效率 效果明显，龙以洛克沙胂的效果最显著。猪饲料中添加洛克沙脖后，仔猪日增重提 高1 0 1 8 2 7 9 6 ，饲料效率提高4 8 1 7 4 8 ，单位增重成本降低8 7 7 1 4 ，3 3 。生长猪日增重提高2 4 1 5 3 9 ，饲料效率提高4 5 1 6 2 2 ，单位增 重成本降低4 3 3 1 2 ，8 3 t g j 。 目前，有机肿制剂的作用机理还不完全清楚。一般认为，a s 在动物体内多以 越尹、a s 升形式存在，且可以相互转化，起着氧化还原的作用。砷可与氧化酶中的 巯基结合并使之失活，从而减弱异化作用，增强同化作用，使机体内轻度缺氧，基 础代谢降低，皮下脂肪增厚，皮肤营养改善，红细胞增加。砷还可以取代磷脂中的 磷，所生成的砷脂不仅发挥着与磷脂相同的功能，且具有新的特殊功能，可加强蛋 白质和脂肪的吸收代谢，促进动物生长。同时砷又是碘、汞以及铅元素的颉颃剂， 与抗生素和v b l 2 有协同作用。促进机体新陈代谢l 姗。但大剂量时会导致中毒【1 1 1 。 3 洛克沙胂的毒性及残留 洛克沙胂的毒性很低。美国依阿华州查尔斯城d r s a l s b u r y s 实验室的k e e r 等 陈冬梅：洛克沙胂残留对土壤的生态毒性研究 3 _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - - _ _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ 。- _ _ _ _ _ _ - 。_ _ _ _ _ 。_ _ _ _ 。_ _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ - 。- 。_ _ _ _ _ - 。_ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ - - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ 一 一 l 嘲人进行了洛克沙胂的急性毒性试验，所用动物为鼠、鸡和火鸡等，试验药剂有该 产品的胶囊和水溶液。试验结果：对鼠经口给药的l d 为1 5 5 m g k gb w ，对鸡经 口给药的l d s o 为1 1 0 1 2 3 m g k gb w 。 此外，美国威斯康星州麦迪逊城w i s c o n s i na l u m n i 研究所的p r i e r 等1 1 2 】人进行 了洛克沙胂的慢性毒性试验，试验动物为狗和鼠，试验周期为2 年，试验用药量为 5 0m g k g 、1 0 0m g k g 和2 0 0m g k g 。试验结果，对狗和鼠在两年整的时问内口服摄 取5 0m g k g 和1 0 0m g k g 饲料的洛克沙肿，无任何可检测到的影响作用。对于大鼠 在5 0m g k g 时未观察到任何影响作用，在2 0 0m g k g 水平唯一的影响是轻微的而且 是在早期的生长速度的下降。每只鼠局部皮肤使用约l i n g 洛克沙肿，每周三次持 续一年，在两年多的观察期内未发现任何影响作用，在相同的观察期内也未发现单 独大剂量亚皮层注射引起的任何中毒反应。 不同种属动物对洛克沙胂的敏感有差异性。洛克沙胂对鸭可引起脂肪肝等严重 毒性，因此不应将洛克沙胂用于鸭的养殖t i l l 4 1 。 尽管洛克沙胂是一种毒性很低的饲料添加剂，但是近年来由于不少饲料生产企 业片面强调有机胂制剂的促生长作用和防病的效果，加上使用洛克沙胂后可使动物 皮肤红润，致使有机肿制剂的应用越来越广泛，添加剂量也日趋增高。因此，相应 的畜禽产品中砷的残留令人担忧。 据刘文芳【”l 报道，在肉鸡饲料中分别添加l o m g k g 、2 0 m g k g 、5 0 m g k g 和 s o m g k g 的洛克沙胂，7 周龄后立即屠宰，肝中砷的含量分别是0 6 4 7m g k g 、3 1 2 8 m g , k g 、3 5 3 5m g k g 和3 7 6 3m g k g 。此外，a k h t e r 等【l l 】发现，猪饲喂洛克沙肿剂 量过大时，以肝脏中砷的残留量最多，其次是肾脏，肌肉中含量最低，但停喂5 d 后肝脏中的砷下降很快，1 0 d 后各组织砷都恢复到安全水平。 只要按规定的添加量使用，并遵守休药期，就不会产生畜禽产品中砷残留超 标。但是不幸的是。很多地方的饲料中总砷超过国家允许含量( 2 m g k g ) 。袁慧等l l o j 采用家标准检测法 g b l 3 0 7 9 - 9 1 检测了湖南省六个地区二十个猪、鸡配合饲料中总 砷的含量。结果显示，8 5 的样品中总砷含量超过国家标准，其中有1 3 个样品总 砷含量在2 1 0 m g k g 之间，占总数的4 5 ，有4 个样品高于l s m g l 【g ，占2 0 ，超标情况是严重的。 为此，我国食品卫生及饲料卫生标准均对各种食品和饲料原料、产品中的砷含 量作了严格规定，洛克沙胂最高残留限量( m r l ) 为( 以总砷计) ：猪肌肉为0 5 扬州大学硕士论文 4 m g k g ，肝和肾为2 m g k g ；鸡肌肉、蛋和副产品均为0 5 m g k g 。猪和鸡的休药期是 5 日，蛋鸡产蛋期禁用f i t 。美国f d a 对使用含有机胂饲料的动物也规定了屠宰前必 须有5 d 的休药期，动物产品肉、蛋和肝、肾脏中的砷允许残留限量分别为0 5 和 2 m g k g 。世界卫生组织6 v t o ) 规定食品中砷含量应该小于o , m g k g 【埘。 4 洛克沙胂残留的环境行为 有机肿作为饲料 添j d 药物，在畜禽体内沉积量少，绝大多数以原形随畜禽粪便 排出动物体外。有研究结果证明，有机胂被消化道吸收较少，被吸收的苯胂酸大部 分无变化，并且很快随动物的排泄物排出，全部排泄需时2 3 d 1 1 9 2 0 l 。 养殖业中，畜禽给予洛克沙胂后，以原形随动物粪便排出的洛克沙胂大量进入 环境，随着有机肥的使用，进一步进入到土壤、地表水和地下水中。g a r b a r i n oj 等1 2 l 】报道，在肉鸡7 周龄的生长期中，每只按正常剂量给予洛克沙胂，将总共向周 围环境扫 出1 5 0 m g 洛克沙胂，从鸡场废弃物样品中检测n 3 0 5 0 m g k g 的砷( 以总砷 计) ，如果一个养殖场每年养殖2 亿羽肉鸡，则每年将向环境排放8 吨以上的砷。此 外，h a n c o c kt c 等 2 2 l 研究结果，在美国一个n d e l m a r v ap e n i n s u l a 的盆地地区， 估计每年养殖约6 亿羽肉鸡，将产生1 5 亿吨粪便，每年向周围排放2 0 5 0 吨砷。这 样的排放数量是相当惊人的。 国内也有相关研究报道，按照农业部规定的药物饲料添加剂使用规范，日粮中 添加洛克沙肿5 0 m g k g 饲喂猪，l 头商品猪一生有机胂使用量约1 0 9 ，含砷元素 2 9 9 ，一个年出栏量万头的商品猪场，一年中向环境排放的砷元素约有2 9 k g 。另 外，按规定添加洛克沙胂，1 只肉鸡使用约为0 3 9 的砷制剂，含砷元素0 0 8 9 ，一个 出栏1 0 0 万只肉鸡的鸡场1 年约排放砷元素8 0 k g 。这样日积月累的使用与排放砷元 素，势必会导致土壤和水源质量的进一步恶化【l l 】。 4 1 洛克沙胂在环境中的降解和转化 g a r b a r i n oj i l 等伫l 】研究了洛克沙胂在环境中的降解，在室温下用去离子水萃取 火鸡排泄物中的洛克沙肿1 h ，离心后检测到萃取物中的砷含量占火鸡排泄物中总砷 含量的7 0 ，而萃取物中砷的主要形态是洛克沙胂、a s ( r e x a s 3 + ) 、3 - 氨基一4 - 羟 基苯胂酸( d m a ) 以及一些未知成分。表明了当堆肥或进行农业灌溉时，洛克沙胂较 容易被雨水淋洗进入环境中。进一步研究表明，洛克沙胂迁移入环境之后，可以迸 陈冬堡：洛衷狮残匿世攘塑生查童丝堕一 三 行生物的和非生物的降解。在室温、厌氧条件下，从畜禽粪便中用水萃取出的洛克 沙肿在4 8 4 , 时内被转化成各种不同的含砷成分。转化率与温度有关，温度升高时。 降解速度加快。相反，温度降低时降解变慢。但如果萃取液被灭菌，则洛克沙胂至 少可以稳定1 0 天。这说明，洛克沙胂的降解过程主要是由微生物进行的。对降解产 物进行电喷雾离子源质谱分析表明，产物中的最主要成分是d m a a b c d n a r 等【2 4 】报道鸡场排泄物中洛克沙胂的水溶性提取物，经实验室光化学试验 可降解为以2 ，4 一二硝基苯酚为主的多种芳香化合物，同时会转变为毒性更大的无 机砷。光降解洛克沙胂速率与存在于自然畜禽粪便中的硝酸盐和有机质相关，光降 解速率与硝酸盐浓度成正比例，而光降解速率随有机质浓度的降低而升高。高浓度 的有机质类似于家禽排泄物，光降解相对慢。生物降解洛克沙胂主要在堆肥中，非 生物降解( 主要是光降解) 对乱丢乱弃的排泄物有重要意义。 b r o 硼等口5 】研究发现，含洛克沙胂的鸡场排泄物作为肥料施肥后，在土壤和水 系中可能通过生物的或非生物的( 主要是矿化作用) 反应使其转变为迁移能力更 强、毒性更大的三价和五价的无机砷化合物，并在土壤中有一定的吸附和蓄积作 用。另外，有报道从养鸡场附近以及农田中采集了施过禽粪便的土壤样品，同时采 集不含禽粪的土壤样品作对照。去离子水分离萃取这些土样2 4 h ，萃取到的砷主要 是a s ( 、，) ( 即a s 5 + ) ，而且被洛克沙肿污染的壤萃取到的砷是对照组土壤的5 到l o 倍。但是一次性水萃取只能萃取到样品中总砷的i 3 ，且大多数水能萃取到的 砷是与有机质结合在一起的。与农田相连的沟渠底泥中萃取到的砷中a s ( i i d 的含量 是最多的。这可能暗示着一个规律，在底泥这样的厌氧环境中，细菌可促进a s ( v ) 还 原到a s ，并使蜘甲基化而成d m a 。 以上试验都证明了从畜禽粪便中排出的洛克沙胂在环境中可以由有机胂转化成 无机砷，而使毒性增强 4 2 洛克沙鼬在环境中的吸附和转移 r l 曲e r 6 ) r dd w 等嘲研究了洛克沙胂在土壤中的吸附性能。分别采集农田、森 林和养殖场周围的土壤，用去离子水萃取，含洛克沙胂的土壤中能够萃取到更多的 砷，而且第一次萃取的量与以后萃取的量具有相关性，可以用第一次的萃取量来代 替以后的萃取量。水萃取法和过氧化氢萃取法与有机碳含量的相关性高、与总砷及 离子含量的相关性低，表明部分砷可以从有机质中释放出来。用草酸连二硫酸盐 扬州大学硕士论文 萃取法与总砷及离子含量的相关性高，表明土壤中绝大部分砷被金属氧化物所吸 附。 b r o w n b l 田】研究了洛克沙胂在土壤中的吸附特性。探索不同深度的土层与洛 克沙胂之间的吸附关系。土壤采集于家禽养殖多的维吉尼亚地区，将土层分为a p 和b t 两类。a p 土层为0 2 2 e m 深度的土，b t 土层为2 2 8 3 e m 深度的土。a p 土壤吸 附洛克沙胂较缓和，而b t 土壤则强烈吸附洛克沙胂。但是a p 土壤去除有机质后很 大程度改变了吸附特性，表明有机质很可能包裹在无机物或矿物表面。这些研究结 果与洛克沙胂在农田区域的吸附迁移相关。畜禽粪便作为有机肥施予农田后，洛克 沙胂在土壤中同时发生的吸附和迁移。在富含有机质的a p 土壤中，有机质控制吸 附，洛克沙胂很少结合在有机质上，它极可能随农田灌溉或雨水快速渗入到水中， 一旦洛克沙胂接触到b t 土壤上，它就会被强烈吸附到金属氧化物( f e 2 0 3 等) 或粘 土上，从而减少渗入地下水i 搀可能性。但是，磷酸盐或有机酸的竞争吸附矿物表面 的吸附位点会影响洛克沙胂在b t 土壤中的贮留。 此外，m i l l e rc v 等1 2 司检测了一条流经农田的河流及其支流中的悬浮颗粒及河 床淤泥中的砷，砷的浓度从1 9 9 7 年塑j 1 9 9 9 年为0 g 2 1 m g k g ，比全美国河流的平均 值要高。同一地点经过滤的地表水中的砷浓度均小于l m g l 。在此条河流的其他支 漉中发现可溶解砷及含砷悬浮颗粒也在这个浓度范围之内，但这些地区的禽养殖场 密度要低些。地下水中溶解砷的浓度范围是1 o 7 6 m g l ，这样高的砷浓度，地下 水好象是该地区砷循环的一个重要贮存库。砷具有致癌性，因此美国已将饮用水中 砷最高允许含量m s o p g ：t 降n 1 0 t g l 。这些地下水中砷含量己严重超标。不能供饮 用。地表水中检测到的砷远低于地下水中的现象暗示着一个尚未知晓的砷的沉积过 程。在这个过程中洛克沙胂可能保持原形或降解成其它有机砷形式，且蔚尚无合适 的方法来检测。 4 3 洛克沙胂对环境中生物的潜在危害 王克俭、廖新悌鲫进行了猪场周围环境中砷的分布及迁移规律的研究，对广东 省5 个典型用洛克沙肿等饲料添加剂的猪场周围的土壤、植物、水和鱼中的砷含量 进行了检测。结果表明，土壤中的砷虽未超标，但含量有升高趋势，且距离猪场越 近的地方，土壤中砷含量就越高；植物蔬菜中的砷含量超标率为1 0 0 ，其中6 7 * , 为重污染，尤其是距离猪场最近的菜地，其中蔬菜的砷含量已经超标几倍，食用这 陈冬梅：洛克沙舯残留对士壤的生态毒性研究 7 _ - - - - _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ - 。- _ _ _ _ _ _ - - _ _ - _ - 。_ 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。- - _ _ _ _ 。_ _ _ - _ _ _ 。- _ _ _ _ - i _ - _ - - 。_ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - - _ _ - _ _ 一 一 种蔬菜对人体的危害及其严重。还有的未超标土壤中的蔬菜中砷超标，可能是菜农 经常用粪便直接浇灌所致：水中的砷超标率为6 6 ，为轻度污染，这与对从猪场排 出粪便的处理方式相关；鱼肉中的砷的检出率为1 0 0 ，其中超标率为6 7 ，这与 鱼塘中鱼的品种、取食习性、生活的水层有关，生活在水的底层、以畜禽废弃物为 食的鱼其组织中的砷含量很高。说明猪场周围环境中砷污染严重，且从环境向生物 体富集。 王付民等p o j 对广东省长期使用洛克沙肿、阿散酸作为饲料添加剂的1 5 个大型猪 场的周围环境及农田进行了调查，检测结果表明：猪场内长期施用猪粪作为肥料的 甘薯其根内的总砷含量已为国家规定最高检出限( o 5 m g k g ) 的3 6 倍；甘薯地土壤 的砷含量介于2 5 8 3 5 5 5 4 m g k g ，远远高于自然界中最高砷含量的背景值 1 5 m g k g ；且甘薯的各组织中总砷含量与土壤砷含量成正比。绝大多数猪场附近鱼 塘中水的总砷含量已超过渔业水质标准0 0 5 m g 亿；虽然鱼肌肉的总砷含量未超过国 家规定标准0 5 m g k g ，但是在鱼的可食性组织脂肪、脑的总砷含量却远远超标，约 为肌肉组织中3 4 倍。猪场排污口附近的土壤，砷污染范围介于2 0 0 5 0 0 m 之间； 其中在距排污口约5 m 、5 0 m 的土壤，砷的含量远超过自然界的砷含量的最高背景值 1 5m g k g 。长期施用猪粪作为肥料的稻田，大多数土壤中总砷含量已超过国家规定 的最高标准；另外，水稻对砷有一定的富集能力，且水稻各组织的砷含量与土壤的 砷含量也存在明显的正相关。 洛克沙胂在畜禽应用后，大部分以原形随粪尿排出体外，进入周围的土壤、地 表水或地下水中，其通过水体污染或经生物富集和食物链方式进而威胁到人类健 康。孙永学等1 3 ”以养殖场周围的鱼塘和河流中常见的鲫鱼为对象，通过洛克沙肿对 鲫鱼暴露的毒性效应研究，探讨了洛克沙胂所致水环境砷污染的生物检测。研究了 急性暴露胁迫对抗氧化系统的影响。试验发现，洛克沙胂对鲫鱼的急性毒性较低， 以乳酸脱氢酶( l d h ) 活性、丙二醛( m d a ) 和超氧化物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽 一s 转移酶( g s h - s t ) 为指标。结果为：2 4 d , 时l c 如为1 8 1 6 9 m g l ，4 8 小时l c f , o 和 9 6 小时l c 5 0 均为1 7 6 5 7 m g l 。以a s 计3 0 m g l 、4 5 m g l 洛克沙胂连续暴露5 天，鲫鱼 脑、和肝l d h 受到显著抑制( p 如0 5 ) 并呈剂量一效应关系。鱼脑和肝的m d a 含 量显著升高( p 0 0 5 ) 。鲫鱼脑、肝和鳃组织的s o d 活性在初期显著升高 ( p o ，0 5 ) ，但在试验后期随剂量的增高而受到显著抑制( p 0 0 5 ) 。鱼脑g s h - s t 受到极显著的抑制( p 9 8 5 ) ，浙江省康达动物保健有限公司，批号为 0 5 0 4 2 0 。 试剂：氢氧化钠、盐酸、葡萄糖、氯化铵、碘化汞，碘化钾、氯化钾、蛋白 胨、硫酸、阿拉伯胶等均分析纯级， 氨化菌液体培养基：k z u p 0 45 9 、f e 2 ( s 0 4 ) 30 0 5 9 、m g s 0 4 7 h 2 02 5 9 、m n s 0 4 0 0 5 9 、c a c l 22 5 9 、蒸馏水1 l ，用o 1 m o l lk o h 调至p h 7 2 ，使用前按l ：2 0 稀 释。 奈氏试剂：称4 5 5 9 i 。和3 4 9 e , k i 溶于5 0 0 m l 无氨蒸馏水中。 硝化菌培养基：n a n 0 2l g 、m g s 0 4 7 h 2 00 0 3 9 、k 2 i - i p 0 40 7 5 9 、m n s 0 4 0 0 1 9 、n a h 2 p 0 30 2 5 9 、c a c 0 33 0 9 、n a 2 c 0 31 o g 、蒸馏水l l 格里斯试剂i ：0 6 9 对氨基苯磺酸于7 0m l 沸蒸馏水中。冷却后加入2 0 m l 浓 盐酸。然后用水稀释成1 0 0 m l 。贮于棕色瓶中，4 1 2 保存，备用。 格里斯试剂i i ：0 6 9 伽萘胺于含l m l 浓盐酸的蒸馏水中，稀释至1 0 0 m l 。贮 于棕色瓶中，4 保存，备用。 仪器：电热恒温培养箱，南京市长江电器仪器厂；b p l l 0 s 电子分析天平。德 国赛多利斯天平公司。 陈冬梅：洛克沙胂残留对土壤的生态毒性研究 旦 1 2 对土壤呼吸作用的影响 以碱吸收滴定法测定土壤呼吸作用强度。具体步骤如下：精密移取0 。i m o l l 氢氧化钠溶液2 0 m l 于5 0 0 m l 广口瓶内。供试土壤分别加入适量的洛克沙胂，使洛 克沙胂含量分别为0 、2 0 、5 0 、8 0 、1 5 0 m g k g 土。分别取2 0 9 土样及0 i g 葡萄糖 拌匀，用沙布包裹悬于瓶内，塞紧瓶塞，于2 8 c 培养。同时做不加土壤的空白对 照。分别在培养后2 、4 、6 、8 、1 0 、1 2 d ，以酚酞为指示剂，用0 1 m o l l 盐酸溶 液滴定。根据样品和空白样品消耗0 i r a o l l 盐酸的体积差，计算二氧化碳释放 量。试验重复3 次。 1 3 对土壤氮化作用的影响 氨态氮标准曲线的绘制：称取适量氯化铵，用无氨蒸馏水配制成5 0 “g m l 的 氮标准溶液。分别吸取该标准溶液0 0 、o 5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 m l 于2 5 m i 容量 瓶中，加水至约1 0 m l ，加入0 8 m l 奈氏试剂，摇匀。缓慢地加入i m o l l 氢氧化钠 溶液4 m l ，显色后稀释至刻度。1 0 m i n 后，于4 6 0 n m 测定吸光度值。以氨态氮质量 为x ，吸光度值为y 迸行标准曲线方程回归。 称取供试土壤1 5 0 9 置于2 5 0 m i 三角瓶中，加入灭菌的o 2 蛋白胨溶液5 m l 及 氨化菌液体培养基2 m l ，并加入洛克沙胂使其终浓度分别为0 、2 0 、5 0 、8 0 、1 5 0 m g k g 土，以土：水( 3 ：1 ) 加入水。摇匀后塞上棉塞，于2 8 c 培养。分别于培养 后2 、4 、6 、8 、1 0 、1 2 d 进行氨态氮测定。各试验重复3 次。 康维皿扩散法测定氨态氮【4 5 i 。称取培养后的土壤2 0 9 ，加入i m o l l 氯化钾溶 液8 0 m l ，振荡浸提1 h ，过滤后取滤液4 m l 置于康维皿外室，中心小室加入 2 m 0 i m o l l 的硫酸。在皿盖边沿涂上阿拉伯胶甘油液，盖上皿盖。由小孔处迅速 滴加4 0 氢氧化钠溶液i m l ，立即盖严并轻轻摇动。置于4 0 放置4 h 后，中心小 室的溶液用i o m l 蒸馏水分4 次转移至2 5 m i 容量瓶中，加入奈氏试剂显色，方法同 标准曲线绘制。根据吸光度值从标准曲线上求得相应的含氮量。供试土壤含水率用 干燥失重法测定，根据土壤含水量再折算成每克干土中氨态氮含量。 1 4 对土壤硝化作用的影响 n 0 2 - n 标准曲线的绘制：称取适量亚硝酸钠配成含氮量为0 ，i m g m l 的贮备 液，临用前稀释成0 0 0 1 m g r r d 的标准工作液。分别吸取标准工作液0 、5 、1 0 、 2 0 、3 0 、4 0 m l 于5 0 m l 容量瓶中，加水至约4 0 m l ，加入i r a | 格里斯试剂i ，摇匀 扬州样萄! 主冷文_ 一三! 后暗处放置1 0 m i n 。再加入1 m l 格里斯试剂和2 0 醋酸钠溶液l m l ，显色后用水 稀释至刻度，放置1 0 m i n 后，在分光光度计上5 3 0 n m 处测定吸光度。以n 0 2 - n 含 量为横坐标( x ) ，光密度值为纵座标进行标准曲线绘制或标准曲线方程回归。 称取供试土壤1 0 9 ，加无菌水1 0 0 m l 制成i 1 0 土壤悬液。于2 5 0 m i 三角瓶中 加入硝化菌培养基3 0 r a l ，并加入洛克沙胂使其浓度分别为0 、2 0 、5 0 、8 0 、 1 5 0 m 矾。，再加入土壤悬液1 m l ，置2 s 培养箱中培养。分别于培养后3 、6 、9 、 1 2 、1 5 、1 8 d ，取培养液3 4 1 过滤，准确吸取滤液l m i 于5 0 m l 容量瓶中，加水 约4 0 m l ，以下同n 0 2 - n 标准曲线的绘制。各试验重复3 次。 2 结果 2 1 洛克沙胂残留对土壤呼吸作用的影响 土壤呼吸作用可以看作衡量土壤微生物总的活性指标。不同浓度洛克沙胂残留 对土壤呼吸作用的影响，测定结果见表l 和图1 。在4 6 d 内，不同浓度洛克沙胂 残留试验组二氧化碳释放量高于c k 组，但只有5 0 、1 5 0 m 孚傲g 土4 d 及2 0 l l t 酣( g 土8 d 时有显著性差异，说明洛克沙肿残留在此期间有一定的呼吸刺激作用，但对 土壤呼吸作用总体无明显性影响。 表l 不同浓度洛克沙胂处理土壤的二氧化碳释放量( 单位：聪) 注： 尸0 0 5 ，与c k 比较。 陈冬梅：洛克沙肿残留对土壤的生态毒性研究 图1 不同浓度洛克沙肿残留对土壤呼吸作用的影响 2 2 洛克沙胂对土壤氨化作用的影响 不同浓度洛克沙胂残留对土壤氨化作用的影响测定结果见表2 和图2 。从实 验结果可以看出，高浓度洛克沙肿对土壤氨化作用整个在试验期有极明显抑制影 响；除了2 0 、8 0 m g k g 土剂量组在2 d 时氨态氮高于c k 组外，在以后的培养期均 显著或极显著地低于c k 组。说明洛克沙胂对土壤氨化作用有明显抑制作用。 表2 洛克沙肿对土壤氨化作用影响澍定结果( 呜g 土) 组别 0 d 2 d 4 d 6 d8 d 1 0 d1 2 d 4 2 6 9 o 8 2 4 2 6 9 o 8 2 4 2 6 9 o 8 2 4 2 6 9 o s 2 4 2 6 9 o 8 2 4 7 8 6 1 3 3 7 3 0 2 4 - o 5 4 + 3 l 0 2 1 2 2 5 0 4 1 】0 5 1 4 2 8 1 4 3 ” 5 9 8 8 1 d 3 3 0 5 4 2 0 7 3 6 9 7 4 - 1 4 5 ” 1 9 2 6 1 4 3 0 9 8 5 l 。2 0 3 1 2 6 o 9 2 1 1 9 6 o 7 7 1 5 9 2 4 - o 。6 1 + 1 2 8 4 o 8 2 “ 1 1 3 4 4 - 1 。0 3 + 2 6 3 3 1 1 2 5 2 7 1 3 6 ” 4 3 9 l ，1 4 ” 9 0 5 1 3 6 + 4 7 4 o ，8 5 2 6 1 5 1 6 7 1 3 7 2 o 7 7 * 8 1 7 1 3 3 * 7 ，5 6 n 9 4 4 8 3 1 3 3 2 5 8 3 2 5 7 4 0 4 】j 2 3 1 1 4 3 1 1 6 6 2 4 士1 4 3 2 7 2 1 0 5 注：料ko o l ，与c k 比较； 2 0 0 5 ，与c k 比较 弱趵垢加5 o 一*5嘲帮睾辩 坶啦 呶 鹕 呐 呶哦 哦 哦 一呱扎写土土土土 扬州大学硕士论文 0 d2 d4 d6 d8 d1 0 d1 2 d 图2 不同洛克沙肿残留对土壤氨化作用的影响 2 3 洛克沙肿对土壤硝化作用的影响 不同浓度洛克沙胂残留对土壤硝化作用的影响，培养液中n 0 2 - n 含量测定结果 见表3 和图3 。结果表明：不同浓度洛克沙胂均使试验期土壤培养液中的n o r n 含量降低，8 0 、1 5 0 i n g , k g 土组在试验期内均明显低于c k 组口 o 0 s ) ；2 0 、 5 0 m g k , g 土组在培养后期n 0 2 - n 含量显著低于c k 组( p o 0 5 ) 。说明洛克沙肿残 留在低浓度时对土壤硝化作用有抑制作用，在高浓度时有很明显的抑巷4 作用。 表3 硝化作用培养液中哟r 制含量( 单位：- i g 1 1 ) 组别 髓 3 d 6 d9 d1 2 d1 5 d 1 8 d 0 m g k g 土( c k ) 2 0 m g k g 土 5 0 m g k g 土 8 0 m 窖k g 土 1 4 每田2l & 6 d ：0 62 6 8 0 4 1 22 5 ，9 士1 02 2 6 士i ，l2 2 o 圭o 82 3 2 4 1 ，l 1 4 6 = t ：0 21 7 瓜b 0 s2 5 3 ：t | ：0 42 2 6 士1 i2 0 4 士1 1 2 0 0 ：t ：0 6 1 7 1 士0 4 1 4 6 ：1 = 0 21 7 8 , 4 1 1 2 2 7 士1 22 1 y j ：i o +1 9 啦2 1 8 0 ：k 1 5 1 8 4 - 4 - 1 2 1 4 6 ：t ：0 r 21 2 9 生0 3 2 1 1 士0 7 1 6 9 士0 6 +1 8 6 d ：1 2 1 7 , 6 主1 10 6 ：t ：0 3 l s 0 m g k g 1 4 ，6 ：x 0 21 2 7 士0 6 + 2 1 0 a ：1 1 + 1 6 7 ：e 0 6 1 7 9 土1 1 + 1 8 7 士o 4 0 6 ：e 0 2 注： 严 o 0 5 ，与傩比较。 舳加加加o hs等一嘲如鞲柏坛 陈冬梅：洛克沙肿残留对土壤的生态毒性研究 o d3 d6 d 9 d1 2 d1 5 d1 8 d2 1 d 时间( 天数) 图3 不同浓度洛克沙髀残留对壤硝化作用的影昀 3 讨论 土壤的呼吸作用，一般指土壤释放c 0 2 和吸收氧的强度。很早以前，人们把 测定土壤呼吸作用强度看作是衡量土壤微生物总的活性指标f 4 5 】。洛克沙胂对土壤 的呼吸作用总体上没有明显影响，也说明洛克沙肿对土壤微生物总的活性影响较 小。 土壤氨化作用，指土壤中含氮有机物经过微生物的各种分解作用，使大部分氮 素转化为无机态氮( 氨) 的过程。因此，土壤氮化作用是土壤氮循环的重要环节， 高浓度的洛克沙胂对土壤氨化作用有较明显的抑制。这会直接影响到土壤的肥力。 土壤的硝化作用是使氨氧化成硝酸的过程，对反应土壤的理化性状有很大意 义。硝化作用和氨化作用一样都是土壤中氮循环的重要环节。洛克沙胂对土壤的硝 化作用有着较明显的抑制，这也会对土壤的肥力产生直接影响。 如弱如坫如0 0 一【j一血w如znoz 扬州大学硕士论文 第二章洛克沙胂对土壤中植物生长发育和残留的研究 洛克沙肿大多数以原形随畜禽粪便排入到环境中，在我国畜禽粪便一般作为有 机肥用于农田施肥，这势必污染土壤、给农作物带来潜在危害，国内外这方面研究 还很少，已有学者研究了无机砷对土壤中青菜、水稻的生物学效应和富集规律睁 4 刀。青菜和番茄是我国常见的蔬菜品种，市场上有着很大的消费需求，本实验通过 盆栽试验，旨在探讨洛克沙胂对青菜和番茄的生长发育的影响及富集的规律，为洛 克沙胂残留的生态毒性研究提供基本依据。 1 材料与方法 1 1 材料 试药：洛克沙胂原料药同上。 土壤：扬州大学花园土，平均含水率2 6 1 2 。 青菜：苏州青，宜兴市蔬菜种子实业公司 番茄：陌光9 0 6 f i ，西安阳光种业有限公司 盆钵：普通栽花瓦盆，直径约2 3 c m ，高2 2 c m 左右。 b p ii o s 电子分析天平，德国赛多利斯天平公司 砷标准贮备液，含砷1 0 0 0 m g l ，国家标准物质研究中心。砷标准使用液，含砷 l m g l ，用盐酸溶液( 1 0 ) 配制而成；硼氢化钠、硫脲、抗坏血酸、浓盐酸、浓硝 酸、高氯酸、硫酸等均为国产优级纯试剂，水为去离子超纯水。 仪器：a f s - - 2 2 0 2 a 型双道原子荧光光度计，北京海光仪器有限公司生产。电热 板：3 5 0 m m x 4 5 0 饷n , 型号s c 4 0 4 - - 2 4 4 ，江苏东台电器厂。所用玻璃器具均用硝酸 ( 1 0 ) 浸泡过夜，用超纯水冲洗干净，ii o c 电热恒温干燥箱中烘干，备用。 1 2 方法 1 2 1 青菜番茄的播种、采集与处理 扬大花房处的花园土，挑去石块，洛克沙胂按照2 0 、5 0 、8 0 、1 5 0 、2 5 0 m 眺g 的浓度均匀拌入土壤中，每一个浓度3 0 k g 土壤，分装到2 0 个花盆中。同时 设不加洛克沙胂的空白对照组。将青菜和番茄种子播种于花盆中，每个剂量青菜、 堕鱼塑! 塑壅鲨婶建鱼型主堡堕生查童丝魈旦 番茄各l o 盆，每盆中约1 5 粒种子，尽量均匀分布。保持湿润，自然环境中培养。 青菜样品分别在播种后2 0 d 、3 0 d 、4 0 d 、5 0 d 、6 0 d 采集；番茄秧苗为2 0 d 、 3 0 d 、4 0 d 、5 0 d 、6 0 d 、1 0 0 d 采集。每次采集不少于1 0 株。植物样品采集后平铺于 实验桌面，测量植株株长，洗净，自然吹干后测定每株鲜重，室温风干，粉碎备 用。 精确称取粉碎过筛后的植物样品o 2 9 于1 5 0 m l 三角瓶中，加浓h n 0 3 ： h c l 0 4 ( 6 ：1 ) 1 5 m l ，在电热板上加热消解，直至消化液澄清无白色高氯酸烟雾 为止。放冷，转移入2 5m l 容量瓶中，加入2 5l n lh c l 、5m l5 硫脲一抗坏血酸 混合溶液，去离子水稀释至刻度，混匀，放置3 0 m i n 以上，上机测定。 1 2 2 原子荧光光度计工作条件 还原剂