（临床检验诊断学专业论文）幽门螺杆菌cagx基因的克隆表达及其功能的初步研究.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 目的：克隆并鉴定幽门螺杆菌( 胁耽d 6 口c 幼刃怕一，h 刃怕一) n c t c1 1 6 3 7i v 型分泌系统c 铅必( 肿0 5 2 8 ) 的全长编码基因，构建原核表达载体，表达并 纯化c 磷蛋白，纯化的c 磷蛋白与s g c7 9 0 1 细胞共培养，初步探讨其生 物学功能。为进一步探讨c 磷蛋白在t 4 s s 中的作用及t 4 s s 的致病机制研 究奠定基础。 方法： 1 将标准菌株h 刃怕订n c t cl16 3 7 涂布在哥伦比亚培养基上，3 7 微需 氧条件下培养4 天，培养物经菌落特征，革兰染色镜检菌体形态，快速尿素酶 试验和氧化酶试验鉴定； 2 用p c r 方法从h p 基因组d n a 中扩增c 删码基因片段，将c 碱隆至 p g e m t 载体，转化大肠杆菌d h 5 a ，再将其定向插入p e t 3 2 a ( + ) 载体中，经 i p t g 诱导表达；s d s p a g e 分析表达结果，并进行序列测定和生物信息学预 测； 3 将原核表达的c a g x 蛋白用n i 2 + n 队柱进行分离纯化，纯化的蛋白经 s d s p a g e 电泳及w e s t e m b 1 0 t 进行鉴定； 4 将纯化的c a g x 蛋白与s g c7 9 01 细胞进行共培养，运用m t t 和形态学观 察c 秘蛋白对细胞增殖的影响。 结果： 1 p c r 扩增获得磷基因全长15 6 9b p 目的片段，g e n b 诎登录号为 e f 6 0 8 1 6 0 。鲴弘基因是一类高度保守的原核型基因，与忍训d 一其他菌株 的同源性在9 6 9 9 ，与真核生物无同源序列。三种标准菌株间氨基酸序 列的差异导致的二级结构有很小的差异，但三种菌株的抗原性完全相同。根 据生物进化树分析发现：n c t c1 1 6 3 7 与n c t c1 1 6 3 8 及c o s m i dc l o n e3 6 的 江苏大学硕士学位论文 序列相似性比2 2 6 9 5 要高； 2 获得p e t 3 2 a i c 口酵原核表达重组质粒，确定终浓度1 m m 0 1 凡i p t g ，温 度3 0 ，诱导时间4 h 为最佳诱导条件，获得原核表达的融合c a g x 蛋白， 大小约为8 1 k d ，并用n i 2 + - n t a 柱进行分离纯化； 3 将纯化的c 磷蛋白与s g c7 9 0 1 细胞进行共培养：通过m t t 和形态 学观察发现c 泌蛋白在一定程度上对s g c7 9 0 1 细胞的增殖存在影响。 结论； 1 成功构建p e t 3 2 a c 昭重组质粒，插入序列经测序证实对码正确，无 移码，与g e n b a n k 公布的基因序列高度同源； 2 成功表达c a g x 蛋白，为研究月：肠一i v 分泌系统蛋白功能奠定基础； 3 c a g x 蛋白一定程度上对s g c7 9 0 1 细胞增值存在影响。 关键词：幽门螺杆菌，t 4 s s ，c 铅序列分析 江苏大学硕士学位论文 a bs t r a c t o b j e c t i v e ： 1 t oc l o n ea n dc l e t e c tc 口暑g e n eo ft y p ei vs e c r e t i o ns y s t e m ( t 4 s s ) i n h e l i c o b a c t e rp y l o r i ； 2 t l oe x p r e s sc a g xp r o t e i nb yp r o k a 巧o t i ce x p r e s s i o ns y s t e mi ne c d 乃 3 7 r oi n v e s t i g a t et h ei n i t i a lb i o l o g i c a lm n c t i o no fp u r i 矽c a g xp r o t e i nb y c o c u l t i v a t e dw i t hs g c7 9 01 c e l l s ，w h i c hp o s e dab a s i sf o r 如r t h e rr e s e a r c h i n go n i t sb i o l o g i c a lm n c t i o na n dp a t h o g e n i cm e c h a n i s m m a t e r i a l sa n dm e t h o d s ： 1 h 刃怕以n c t c1 16 3 7w a si n o c u l a t e do n t oc o l u m b i a - s e l e c t i v ea g a r p l a t e s a t37 f o r4 d a y s ，u n d e rm i c r o a e r o p h i l i cc o n d i t i o n o 略a n i s m sw e r e i d e n t i f i e da s 慰缈幻珂b y l o n ym o 印h o l o g y ，g r a 】m 瓯a i n i n g ，r a p i du r e a s et e s ta n d o x i d a s et e s t ： 2 置j 形d 厂fc 哆差g e n ew a s 锄p l i f i e db yp c ru s i n gt h eg e n o m ed n a t h e p c rp r o d u c tw a si n s e r t e di n t op g e m tv e c t o ra n dm e nt r a n s f o r m e di n t oe c o 厅 d h 5 口t h ep o s i t i v er e c o m b i n a n tc l o n ew a sa n a l y z e db yd i g e s t i o no fr e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e t h e nt h ec 口g g e n e 危l g m e n tw a si n s e r t e dd i r e c t i o n a l l yi n t ov e c t o r p e t 3 2 a ( + ) t oc o n s 仇j c tr e c o m b i n a n tc l o n eo fp a 翟a r e rt h e yw e r ee x p r e s s e db y b l _ 21e c d 疗c e l l s ，t h ep c rp r 0 ( 1 u c t sw e r es e q u e n c e da n da n a l y z e d ； 3 c a g xp r o t e i nw a sp u r i f i e db yn i 2 + 一n t ac o l u 啪a n dd e t e c t e db y s d s p a g ea n dw - e s t e m b l o t ； 4 7 1 1 1 e p u r i f i e dc a g xp r o t e i nw a sc o c u l t i v a t e dw i t hs g c7 9 0 1c e l l si n d i f f e r e n tc o n c e n t 砒o n so fc a g x p r o t e i ni n d u c e da td i f i f e r e n ti n d u c t i o nt i m e s t h e c o n t r i b u t i o n so fc e l lm u l t i p l i c a t i o nw e r eo b s e r v e db ym o 印h o l o g ya n dm t t r e s u l t s ： 1 al5 6 9b a s ep a i r s l o n gc a 廷g e n ew a so b t a i n e db yp c rm e t h o d g e n b a n l ( a c c e s s i o n 肌m b e ri se f 6 0 816 0 1 h ec 孵xg e n ei sas p e c i e sh e i 曲t l y 江苏大学硕士学位论文 c o n s e r v a t i v ep r o k a 拶o ng e n e t h es e q u e n c ea n a l y s i sf o rc 孵xs h o w e dt h a ti t s h a r e s9 9 9 6 h o m o l o g yw i t ho t h e rp r o k a r y o ns t r a i n sb u tn o n ew i t h e u k a 巧o t ei ng e n b a m ( t h er e s u l to fa n a l y s i sr e v e s l e dt h a tt h e r ew e r ec e r c a j n d i f f e r e n c e si n s e c o n d a 巧s t r u c t u r e ，b u tt h ea m i g e n i c i 够w a si d e n t i c a l t h e p h y l o g e n i ct r e es h o w st h a tt h es e q u e n c es i m i l a r i t yo fn c t c1 16 3 7i sh i g h l yw i t l l 2 2 6 9 5t on c t c1 16 3 8a n dc o s m i dc l o n e3 6 ： 2 t h ep r o k a 巧o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 2 a c ( i 舌w a so b t a i n e d t h e 如s i o n c a g xp r o t e i na b o u t8 0 5 k d aw a si n d u c t e du n d e rt h ei n d u c t i o ne n v i r o n m e mw i m i p t gc o n c e n t r a t i o na s1m m o l l ，3 0 f o r4 ha n dp u r i f i e dw i t hn i 2 + n 队 c o l u 咖： 3 t h ep u r i f i e dc a g xp r o t e i nw a sc o c u l t i v a t e dw i ms g c7 9 0 lc e n sa n d f o u n dt h a tt h ec a g xh a v el i t t l ei n f l u e n c et os g c7 9 01m u l t i p l i c a t i o n c o n c i u s i o n s ： 1 7 i h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t 3 2 a c c z g 必w a sc o n s t l m c t e ds u c c e s s 如l l y w h i c hw e r ec o n f i n n e db ys e q u e n c i n g t h eh o m o g e n i c 时o fn u c l e i ca c i da n dt h a t o fa m i n oa c i dw a sh i 曲； 2 7 n l ec a g xp r o t e i nw a se x p r e s s e ds u c c e s s 如1 1 yw h i c hf a c i l i t a t e dm r t h e r r e s e a r c h ： 3 t h ec a g x p r o t e i nh a si n n u e n c eo ns g c 7 9 01 m u l t i p l i c a t i o n k e y w o r d s ：胁眈d 6 口c 纪r 幻以，t 4 s s ，c 铅兄s e q u e n c ea n a l y s i s 江苏大学硕士学位论文 英文缩写 a m p a t t n 乍l e f 砬i e 堪 b l a s t b p c 讲 嘲p a i d h 2 0 d n t p s e c o l i g h h ，硎| o r i h r p l p t g l m a l t m i n m l n c b i n i 2 + n t a o d o p d p b s p c r p e g r p m s s d s p i a g e t e m 匣d t 4 s s 嘶s 此 v a c a 英文缩写索引 英文全称 a m p i c m i n a g r o b 口c t e r i 姗t l t m q 砬i e 瑙 b 嬲i cl o c a la l i g m e n ts e a r c ht o o l b 舔e p a i r c y t 咖x i n 鹊s o c i a t e dg e n ea c y t o t o x i n a s s o c i a t e d g e n ep a t h o g e n i c i t y i s l a n d d i s t i l l e dw a t e r d e o x y n u c l e o s i d en j p h o s p h a t e e s c h e r i c h i ac o l i 鲫 h o u r h e l i c o b 口c t 盯p y l o n h o r s e r a d i s hp e r 0 x i d a s e i s o p 即y l t h i o - p - d g a l a c 9 0 s i d e l i t e r g a s t r i cm u c o s a l - 嬲s o c i a t e di y m p h o i d t i s s u e l y m p h o m a m i n u t e m i l l i l i t e r n a t i o n a lc e n t e rf o r b i o t e c h n o l o g y l n f b n t l a t j o n n i c k e l n i t r i l o a c e t i ca c i d o p t i c a ld e n s 时 0 r t h o p h e n y l e n ed i a i n i n e p h o s p h a t eb u 仃e r e ds a l i n e p o l y m e 豫s ec h a i nr e a c t i o n p o l ye t h y l e n e 西y c o l r e v o l u t i o np e fm i n u ：t e s e c o n d s o d i 啪 d o d e c y i s u i f 2 她p o i y a c 哕l a m i d e g e l e l e c 仃o p h o r e s i s n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y le t h y l e n ed i a m i n e 1 卯ei vs e c r e “o ns y s t e m 2 一a m i n o 2 - h y d r 0 x y m e t h y l - l ，3 一p r o p a i l e d i o l m i c i 0 l i t e r v a c u o l a t i n gc ”o t o x i na 中文译名 氨苄青霉素 根癌农杆菌 同源性搜索工具 碱基对 细胞毒素相关蛋白a c a g 致病岛 蒸馏水 四种脱氧核苷三磷酸 大肠埃希菌 克 小时 幽门螺杆菌 辣根过氧化物酶 异丙基一b d 一硫代半乳糖苷 升 胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤 分钟 毫升 美国生物技术信息中心 镍氮川乙酸 光密度 邻苯二胺 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 聚乙二醇 每分钟转数 秒 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电泳 n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 四型分泌系统 三羟甲基氨基甲烷 微升 空泡毒素a 单位 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的 指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引 用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表 或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和 集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明 的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 萋靠蔡 日期：朋彦年多月i ，d 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的 规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以 将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密0 。 学位论文作者签名：董南庠 指导教师签名：印彬辛呸 卿分年勿月细日钞莎年月f 。日 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论弟一早珀 t 匕 1 1 iv 型分泌系统的结构及其生物学特性 1 1 1iv 型分泌系统的结构 根癌农杆菌的d n a 转移通道( r b r d 系统) 是公认的型分泌系统( t 4 s s ) 的典型。t 4 s s 由1 2 种蛋白组成，包括两个主要结构部分：纤毛和膜结合复合物。该通道 是由v i r b 操纵子所编码的1 1 种蛋白( r b l r b l l 蛋白) 和由v i r d 4 基因编码r d 4 蛋 白装配而成，形成跨膜通道将蛋白直接注入宿主细胞内。r b l 可以在细菌的细胞膜上为 t 4 s s 的装备提供位点；r b 2 和r b 5 在细胞表面形成菌毛；其他8 种r b 蛋白和r d 4 蛋白共同组成跨膜通道，其中r b 4 、r b l l 和r d 4 为t 4 s s 的运输提供能量。 1 1 1 1 r b l 在t 4 s s 中的功能由于r b l 的氨基端部分含有溶菌酶和裂解性的 糖基转移酶之间存在同源区，推测其可能有定位水解酶活性，通过水解肽聚糖层，使多种 蛋白复合物能过穿越细胞内膜，为t 4 s s 提供位点。另一方面，r b l 在合成之后，在n 端 信号肽作用下，被加工成包含c 端7 3 个氨基酸的c 端产物，即r b l ，可以被分泌到 细胞外并连接到外膜上，可能参与t - 菌毛的形成，起到伴侣蛋白的作用；也可能与植物 细胞表面相互作用。 1 1 1 2 菌毛有研究发现，农杆菌在v i r 基因被诱导后可形成菌毛附属丝或称毒力 菌毛。菌毛的形成依赖于r b 蛋白和r d 4 蛋白的表达。r b 2 和r b 5 是组成菌毛的 结构蛋白，其中r b 2 蛋白是构成菌毛的主要亚单位，通过去除4 7 个氨基酸信号肽，氨 基端和羧基端经酰氨键；连结环化而生成t 菌毛蛋白，可能通过识别宿主细胞表面受体 和( 或) 粘附宿主细胞而发挥转运功能。位于内膜的r b 6 对r b 5 的积累具有稳定作用， 从而可以调节t - 菌毛的组装参与菌毛形成过程，有证据表明，r b 6 可能只参与菌毛的形 成而不直接参与t 4 s s 的跨膜转运。r b 6 对r b 3 的积累也具有稳定作用，r b 6 缺失 会导致r b 5 和r b 3 细胞水平降低。位于内膜的r b 3 和位于质膜上的r b 4 是附属菌 毛蛋白，其中r b 3 蛋白为通道组装因子。r d 4 是偶联蛋白，可能与转运的底物蛋白相 互识别，为转运提供信号。r b 3 、r b 4 和r d 4 是形成毒力菌毛所必需的。 1 1 1 3 跨膜通道的组成t 4 s s 的跨膜通道是转运出面d n a 时经过的通道， r b 6 、r b 7 、r b 8 、r b 9 和r b l 0 构成转运系统的核心组分，形成转运蛋白、连接 江苏大学硕士学位论文 内外膜的跨膜通道。r b 6 在农杆菌的内膜上形成一个孔，有多层跨膜螺旋。r b 7 的氨 基末端具有细菌脂蛋白的共同信号肽切割位点特征，r b 7 蛋白是组成跨膜通道的一个 关键组分。成熟的r b 7 脂蛋白通过脂质部分定位于外膜上，与r b 9 通过分子间二硫键 交联形成异源二聚体，组成外膜复合物。r b 8 和r b l 0 是t 4 s s 的重要结构和功能成分。 r b 8 和r b l o 大部分位于胞质中，分别有一个短的胞质n 末端尾，一个单个跨膜双螺 旋，和一个长的保守的胞质羧基末端域。r b 8 与t - 复合物酶作用底物( r d 2 和单链t d n a ) 直接接触，是酶作用底物从细胞质转到跨膜通道所必需的。r b l o 是酶作用底 物从内膜转移到外膜的必需成分，但其不与底物直接接触，它在内外膜之间进行能量的传 递。一般认为r b 8 和r b l 0 形成转运装置的核心，可跨越内外膜形成一个孔道。r b 6 有多层跨膜螺旋，与r b 8 和r b l 0 形成内膜复合体。 r b 4 、r b l l 和r d 4 都是三磷酸腺苷酶( a r p a s e ) ，可能是为t _ 复合物的运输或 t 4 s s 装置装配提供能量。似是由同型二聚体组成；r b l l 蛋白定位于质膜的内表面， 形成六聚体结构，具有核苷酸水解活性，能被脂质激活。r d 4 ( 或t r a g 样) 蛋白的n 端 位于内膜上，c 一端伸向胞质中，发挥偶联蛋白的作用，可能与转运的底物蛋白相互识别， 为转运提供信号。t 4 s s 的结构示意图见图1 1 。 图1 1 根癌农杆菌t - 菌毛的结构示意图 f 遮1 1a m o d e lf o rt - p i l u sa s s e n l b l yi i la m m 乞励c 跑嬲 2 江苏大学硕士学位论文 1 1 2 钟p a i 编码的t 4 s s 的组成 研究表明：幽门螺杆菌的c 昭p 甜是一个约3 7 k b 大小的基因片段，具有较为典型的 致病岛的基因特征，编码包括c a g a 蛋白在内的多种蛋白。其中，c a g a 通过致病岛编码 的其他多个蛋白组成的一个特定的分泌样装置转运进入宿主细胞，发挥其功能。幽门螺杆 菌c a g 致病岛的基因序列分析表明，其中部分与根癌农杆菌( a 加以e 励c f 绷s ) 的，n d n a 转移通道( r b r d 系统) 中的v i r b 基因序列相似。因此，推测其编码的可能是一个 型分泌样装置，转运c 舭蛋白进入宿主细胞。目前，关于c a g a 转运的研究较少，且其 转运机制尚未阐明。 幽门螺杆菌gp 甜编码的t 4 s s 蛋白一般以c a g 奉脚木枣枣乖表示。幽门螺杆菌的t 4 s s 组分包括定位于内膜的m a s e s ( c a g 彤唧0 5 4 4 和c a g 姗口0 5 2 5 ，以及偶联蛋白 c a g p h p 0 5 2 4 ，它们分别是r 】b 4 、r b l l 及r 】d 4 的同系物) ，为转运底物提供能量。 其中c a g p 肿0 5 2 4 在转运c a g a 时是必需的，但对诱导i l 8 却不是必要的。 对幽门螺杆菌的t 4 s s 进行分析时发现其与其他细菌的型分泌装置存在差异，特 别是t 4 s s 菌毛的组分：在am m 咖c f 伽中，r b 2 是菌毛结构蛋白的主要成分；而在幽 门螺杆菌中，c 口g 附中缺乏r b 2 的同系物，几种a 姗咖c f 绷膜相关蛋白代替r b 2 定位到t 4 s s 的菌毛上。a 如挖e 向c f e 凇外膜蛋白r b 3 和、，i r b 5 对于稳固菌毛是非常重要 的，但幽门螺杆菌缺失r b 3 和r b 5 的同源性序列。 在am m 乞励c f 绷s 中，r b 7 和r b 9 位于外膜上；而t 觚a k a 等用免疫金标记扫描电 镜技术发现，r b 7 和r b 9 的同系物c a 舯0 5 3 2 和c a g ) 【i 邛0 5 2 8 沿着菌毛的长度定 植，而r o h d e 等描述c a g t h p 0 5 3 2 在菌毛的基部环形分布。a 加竹咖c f 船中r b l 0 的同 系物c a 舢0 5 2 7 位于内膜，围绕菌毛内部核心形成一个鞘，诱导宿主细胞接触。幽门 螺杆菌c a g 0 5 2 7 蛋白模型比a 觑m 咖l c 玉娜中r b l 0 大，包含许多反转重复序列， 促进编码序列基因重排，很可能引起表面结构的抗原变异逃避免疫。通过单独测序发现， 幽门螺杆菌似乎缺失r b 8 ；但b u l l r d o r f 等通过拓朴结构的分析发现：c a g 、口0 5 3 0 与 r b 8 具有类似的跨膜位点，具有相同的拓扑结构，故推测其功能可能类似于内膜结合蛋 白r b 8 ；根据c a g w ，0 5 2 9 的突变表型和预测存在5 或6 个跨膜螺旋，推测其功能可 能类似于r b 6 。 r o h d e 等研究发现，h p 0 5 2 3 可能与r b l 的功能相似，是一个糖基转移酶，能切断 肽聚糖，使得t 4 s s 装置能够横跨细菌细胞壁。h p 0 5 2 3 不能够互补a 觑肌e 励c f 绷sv i r b l 3 江苏大学硕士学位论文 突变株，但它是菌毛联合的c a g 啪0 5 2 7 ( r b l 0 )和c a g t h p 0 5 3 2 ( r b 7 ) 成熟所 必需的。肿0 5 3 9 可能是这些蛋白的伴侣蛋白。 1 1 3 幽门螺杆菌t 4 s s 的功能 幽门螺杆菌携带的由c 口g 附编码的t 4 s s 己逐渐成为公认的幽门螺杆菌重要的毒力 因子。其功能主要是将c a g a 蛋白转运入胃上皮细胞中，诱导促炎症反应细胞因子如i l 8 的合成和分泌。 在幽门螺杆菌中，由c 口g 蹦编码的c a g a 蛋白是已知的唯一一个通过t 4 s s 转运的蛋 白。目前，t 4 s s 转运c a g a 蛋白的确切机制还不十分清楚。h 0 h l f e l d 等已经鉴定了幽门螺 杆菌c a g a 蛋白的分泌信号是通过t 4 s s 被运送到真核细胞中。幽门螺杆菌2 6 6 9 5 菌株致病 岛的3 2 个基因中，与a 觑m e 励c f e 燃的t 4 s s 中v i r b 操纵子存在7 个同源序列。f i s c h e r 等通过 精确的缺失插入遗传突变将单个基因敲除的研究发现：t 4 s s 所有组分均参与c a g a 的转 运；其中1 8 种基因是转运c a g a 进入宿主细胞所必需的，1 4 种能完全诱导幽门螺杆菌分泌 i 【广8 。基因h p 0 5 2 4 的产物c a g p h p 0 5 2 4 是转运c a g a 的必需成分，但对诱导i l 8 的分泌却不 是必要的。s e l b a c h 等分析了c a g i 和c a 酉i 的阳g 眦的1 2 种基因的功能发现互补的c 鸠a 和 r d 4 能修复野生株的功能；r d 4 是c 删转运所必需的，它的功能可能是作为一个衔接 蛋白，将c a g a 转入t 4 s s 的槽中。通过对型分泌系统蛋白的测定发现：它们的分泌取决 于c 末端信号，但这些信号在不同系统中的保守性和它们的性质还不是很清楚。m a n f r e d 等用两种独立的显微技术检测发现，0 5 2 7 蛋白可能定位于细菌的外膜，并可能是幽门 螺杆菌表面丝状结构的一部分，从外膜上沿着丝状结构的核心延伸形成一个0 【螺旋鞘，将 细菌与a g s 上皮细胞表面连接起来。 幽门螺杆菌的t 4 s s 除了能转运c 矩r a 之外，也能间接诱导宿主细胞的促炎症反应。 c a g a + 的幽门螺杆菌诱导i l 广8 表达的能力远远大于c 私一的菌株，但c 赡a 的敲除并不 影响i l 8 的生成和n f 1 出及m a p k 的激活，这提示在c a g a + 的幽门螺杆菌中还有其他 调控因素可诱发，8 的生成，或者i l 8 的生成从根本上是由t 4 s s 对宿主细胞的影响决 定的，而与分泌内容无关。s e l b a c h 等发现型分泌系统复合物的y f 培基因敲除株( w 腰4 、 访培7 、讥r 础、诎忸9 、访田j d 和讥馏j j ) 及缺失整个gp a j 的突变株不能分泌i l 8 ，据此 认为细菌刺激i l 厂8 的分泌能力在很大程度上与它们转运c a 鐾r a 的能力有关。e a t o n 等报道 失活的v f 巾4 、讲腰j d 和说檀以能增强i l 8 的分泌。t u i l l i n u m 等发现c 口ge 与幽门螺杆菌 诱导i l 8 表达相关。c r a b t r e e 等认为发现幽门螺杆菌野生株诱导i l 广8 的量比h p 0 5 2 4 突变 4 江苏大学硕士学位论文 株高，从而推测哪p 甜的h p 0 5 2 4 基因编码的产物具有下调上皮细胞合成，8 的能力； 但f i s c h e f 等发现h p 0 5 2 4 突变株对- 8 的合成没有效应，却对c 鹋a 的转运具有很强的 效应，因而认为可能存在部分或完全下调i l 8 的自发突变株，并认为c r a b t r e e 等的发现 可能是发生在自发突变株中而不是h p 0 5 2 4 突变株。 近来还发现幽门螺杆菌能通过t 4 s s 向宿主细胞内递送肽聚糖。转运的肽聚糖由细胞 内病原体识别分子n o d l 检测到，n 0 d 1 能够激活信号级联放大，使得真核转录因子如核 因子1 ( n f 1 c b ) 激活，这些转录因子能够刺激许多炎症介质如白细胞介素8 ( i l 8 ) 的合 成和分泌。 1 1 4c a 硝简介 型分泌系统( t 4 s s ) 是革兰阴性菌通常使用的分泌机制，革兰阴性菌通过t 4 s s 将蛋白毒素和其他致病因子转运到宿主细胞内。根癌农杆菌的r b r d 系统或称弧d n a 输送系统被公认为是t 4 s s 的标准，它是由v 曲操纵子的产物( r b l r b l l 蛋白) 和 v i r d 4 基因编码的产物r d 4 装配而成。t 4 s s 的跨膜通道是转运出面d n a 时经过的通道， 跨膜通道本身连接内外膜，由r b 7 、r b 8 、r b 9 和r b l o 组成。 幽门螺杆菌c 础因由c 口gp a j 所编码，a l 【a 等用免疫金标记扫描电镜技术发现， r b 7 和r b 9 的同系物c a 舯0 5 3 2 和c a g ) 【l 口0 5 2 8 沿着菌毛的长度定植，成熟的r b 7 脂蛋白通过脂质部分定位于外膜上，与r b 9 通过分子间二硫键交联形成异源二聚体，组 成外膜复合物。在a 姗乞廊c 而螂中，r b 9 的c y s - 2 6 2 与r b 7 的c y s 2 4 间形成二硫键交联的 异型二聚体，然后与内膜蛋白r b 8 和r b l 0 作用形成一个稳定的跨越内膜和肽聚糖层而 直达外膜内表面的通道。 通过对幽门螺杆菌的c 鳄附基因序列与r b d 中基因序列进行相似性比较后发现， c a g ) ( i 口0 5 2 8 与根癌农杆菌r b 9 的整体序列相似性不高，但c a g ) | m 口0 5 2 8 的3 2 0 a a 巧2 2 a a 的序列与r b 9 ( 2 9 3 砚) 具有高度的同源性，达9 0 以上。这个高度同源的序列结构提示 我们：该区域可能包含分泌装置组分间相互识别的结合位点。 1 2 本研究的目的、意义、方法及实验方案的设计 1 2 1 研究目的 克隆并鉴定幽门螺杆菌( 肌跏施c 而盯p 少z d 一，h 五口一) n c t c1 1 6 3 7 脚，( h p 0 5 2 8 ) 的全长编码基因，构建原核表达载体，并在体外表达c a g x 蛋白，纯化原核表达的c a g x s 江苏大学硕士学位论文 蛋白，w r e s t e m b l o t 鉴定该蛋白的免疫活性。纯化的c a g x 蛋白与s g c7 9 0 1 细胞共培养， 初步探讨其生物学功能。 1 2 2 研究意义 型分泌系统( t 4 s s ) 是革兰阴性菌通常使用的分泌机制，革兰阴性菌通过t 4 s s 将蛋白毒素和其他致病因子转运到宿主细胞内。v i r b 9 是t 4 s s 跨膜通道的重要组分。本 研究通过克隆幽门螺杆菌c n 弘基因、构建原核表达载体，并成功表达c a g x 蛋白、初步 探讨其生物学功能，为今后进一步研究c a g x 蛋白的生物学功能奠定了良好的基础。 1 2 3 研究方法及技术 细菌培养技术、分子克隆技术、蛋白表达技术、蛋白质印迹技术及细胞培养技术等。 1 2 4 实验方案的设计 实验流程图如下： h f d 一的培养及鉴定 ， 提取h 肠r f 标准株n c t c1 1 6 3 7 的总d n a 山 p c r 获得c 口蟛基因 上 将p c r 产物与p g e m t 载体连接 上 进行序列分析 上 将c 口萨与p e t 3 2 a ( + ) 载体连接 上 转化b l 2 1 细菌 0 口t g 诱导目的蛋白表达 上 n i “n r a 柱纯化目的蛋白 上 目的蛋白与s g c7 9 0 1 细胞共培养 jj 观察目的蛋白对细胞增殖的影响 6 江苏大学硕士学位论文 第二章c a g x 蛋白基因的克隆、重组质粒的构建及其生物 2 1材料方法 2 1 1 材料 信息学特征预测 2 1 1 1 实验菌株和质粒 且f d ，fn c t c1 1 6 3 7 、大肠埃希菌d h 5 a 、b l 2 1 ( d e 3 ) 为本室保存；p e t 3 2 a ( + ) 由 本校检验医学研究所提供。 2 1 1 2 主要试剂 哥伦比亚培养基、厌氧袋、酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) 、胰蛋白胨( t 呻t o n e ) 购自 o x o d 公司；琼脂糖、蛋白酶k 购自美国s i 舯a 公司；无菌绵羊血购自江苏金坛生物制 品公司；t - a 克隆试剂盒、p c r 产物及胶回收纯化试剂盒购自p r o m a g a l 公司；t 4 连接酶 试剂购自i 公司；r n a 酶购自晶美生物工程公司；e x t a qd n a 聚合酶、d n 【 p s 、d l 2 0 0 0 d n am a r k e r 、n e c o t l 4id i g e s td n a m a r l 【e r 、蛋白分子量标准( 低) 均购自t a k a r ab i o t e c 公司；d l 3 0 0 0d n am a r k e r 购自上海伯叟生物科技有限公司；限制性核酸内切酶砌ri 及勋zi 购自f e 咖锄t a s 公司；1 k bd n al a d d e r 购自t o y o b o ；质粒提取试剂盒购自q i a g e n 公司；x - g a l 和肼g 购自s i 舯a 公司；a g a r o s e 购自上海y i t o 公司；异丙醇购自上海生 物工程公司；平衡酚购自天津生物工程公司；三羟甲基氨基甲烷( 仃i s ) 、十二烷基硫酸 钠( s d s ) 购自上海生物工程公司；引物合成和测序由上海生工生物技术有限公司承担。 2 1 1 3 主要溶液 细菌保存液：分析天平称取2 8 9 布氏肉汤，甘油3 0 i n l ，加入蒸馏水7 0 i n l 后，高温 高压灭菌后按每e p 管0 5 血分装后，一2 0 保存备用； 哥伦比亚培养基：哥伦比亚培养基7 8 9 ，加1 8 0 1 8 5 1 1 l l 蒸馏水溶解，高温高压灭菌 后，加入2 m l 抗生素和1 6 1 8 i n l 羊血，混匀后浇板，4 保存备用； 氨苄青霉素( a m pl m g m 1 ) ：氨苄青霉素5 9 ，加蒸馏水至总体积5 0 m l ，过滤除 菌，小份分装后，放一2 0 保存备用，使用浓度为1 0 0 g r i l l ； 磷酸缓冲液( p b s ) ：n a a8 9 ，k 础0 2 9 ， n a h 2 p 0 41 4 起， 2 p 0 40 2 7 9 ，溶解 于1 l 蒸馏水中，调p h 值至7 4 。高温高压灭菌后，室温保存； 7 江苏大学硕士学位论文 g e s 溶液：硫氰酸胍6 0 9 ，e d l n 0 5 m o 0 2 0 m l ， 1 0 十二烷基肌氨酸钠5 i i l l ， 用蒸馏水定容至1 0 0 血。高温高压灭菌后，4 保存； t e 缓冲液( 1 0 0 m 1 ) ：1 m o 札嘶s - c h 8 0 ) 1 m l ，o 5 m o 札e d 叫p h 8 0 ) 0 2 m l ，加 蒸馏水至总体积1 0 0 m l ，高温高压灭菌后，4 保存； 快速尿素酶试剂： p h 6 5 的p b s1 0 0 m l 中加入尿素1 0 9 ，酚红0 2 9 ，迭氮钠0 1 9 ，4 保存； 氧化酶试剂：1 盐酸二甲基对苯二胺水溶液，置于棕色瓶中，4 避光保存，每周更 新； l b 培养基：胰蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c l 21 0 9 溶解于1 ld d h 2 0 中，调p h 值至7 0 ，高温高压灭菌后，4 保存备用； l b 平板：胰蛋白胨1 吧，酵母提取物5 9 ，n a c l 21 0 9 ，琼脂粉1 5 9 溶解于1 l 蒸馏水 中，调p h 值至7 0 ，高温高压灭菌后浇板，4 保存备用； 5 0 t a e 缓冲液( 1 l ) ：t r i s 碱2 4 2 9 ，冰醋酸5 7 1 m l ，0 5 m m o l le d l a ( p h 8 o ) 1 0 0 i i i l l ，定容至1 l ，室温保存； i 门g ( 2 m g m l ) ：口t g2 9 溶解于8 m l 无菌d d h 2 0 中，将溶液体积调至1 0m l 通 过0 2 2 m 滤膜过滤除菌。将溶液均分成1 m l 的等份，于2 0 保存； 1 0 0m m o i i 。m g c l 2 ：m g c l 2 6 h 2 02 0 3g 溶解于8 0 0m ld d h 2 0 ，定容至1 0 0 0m l ，分 装，高温高压灭菌2 0 m i n ，贮存于4 ； 5 0m m o l lc a c l 2 ：无水c a c l 25 1 9 溶解于8 0 0m ld d h 2 0 中，定容至1 0 0 0m l ，分 装，高温高压灭菌2 0 m i n ，贮存于4 ； 1 m m o l lc a c l 2 ( 含有1 5 的甘油) ：无水c a c l 21 0 2 9 溶解于8 0 0 m ld d h 2 0 中， 加入1 5 0 m l 甘油，定容至1 0 0 0 m l ，分装，高温高压灭菌2 0 m i n ，贮存于4 ： 1 0 m m lr n a s e a ：r n a s e a0 1 9 ，吖s 。h a ( p h 7 5 ) 1 0 m m o 札，n a c l1 5 m m o 扎， 终浓度为1 0 m 咖l ，1 0 0 加热1 5m i i l ，缓慢冷却至室温，分装、贮存于2 0 ； 质粒提取试剂i ：1 mt r i s - h c l ( p h8 0 ) 2 5 m l ，0 5 m e d t a ( p h8 0 ) 2 0 m l ， 2 0 g l u c o s e4 5 i n l ，加蒸馏水至总体积1 l ，高温高压灭菌后，4 保存； 质粒提取试剂：0 4 m o n a o h 和2 s d s 等体积充分混匀( 现配现用) ； 质粒提取试剂：醋酸钠，1 4 强，乙酸5 7 5 i n l ，加入3 0 0 i n l 蒸馏水后搅拌溶解，加蒸 馏水至总体积5 0 0 i n l ，高温高压灭菌后，4 保存； 溴化乙锭( e b ) ：溴化乙锭0 1 9 溶于1 0 m ld d h 2 0 ，然后用铝箔包裹容器，或转移至 r 江苏大学硕士学位论文 棕色瓶中，室温下避光保存。 2 1 1 4 主要仪器 p c r 仪：m a s t e r c y d e rp e 璐o n a l ，e p p e n d o r f 公司； 高速冷冻离心机：m e g a f u g e1 0 r ，髓r a e l 7 s 公司； 凝胶成像及分析系统：s y n 咖，啪公司； 空气浴摇床：1 h 1 5 ，j o h a n a n0 t r o 公司； 核酸检测仪：b i o p h o t | d m e t e