（临床检验诊断学专业论文）小鼠foxp3ΔprdΔfkh基因克隆及功能的研究.pdf

l _ - 一 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完 成的，除文中注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体 的研究成果。对本论文做出重要贡献的个人和集体，均在文中作了声 明并表示谢意。 作者签名： - t 卫f z e l 期：扣留、汐占、厂夕 学位论文版权授予书 本学位论文作者同意学校保留该学位论文并向国家有关部门或 机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于保密彳在两年解密后适用本授权书。 不保密口。 学位论文作者签名：甲卫钞 导师签名： 签字e t 期：卯万口b 厂口 碘磊j 冬 签字日期：彳，口 分类号 壁! 1 2 ：堡 密级堡窒 硕士学位论文 u d c6 12 编号10 2 9 9 0 5 1 4 0 1 6 小鼠f o x p 3 - a p r d a f k h 基因克隆及其功能的研究 s t u d yo nt h ec l o n ea n db i o l o g i c a l f u n c t i o n a s s a yo ff o x p 3 - a p r d a i i i m 作者姓名：申卫红 指导教师：邵启祥教授 指导成员：王胜军副教授 夏圣博士 马瑞博士 申请学位：硕士 学科专业：临床检验诊断学 论文答辩日期：2 0 0 8 - 6 - 6 学位授予单位：江苏大学 学位授予日期： 答辩委员会主席：程纯教授 评阅人： 本研究受国家自然科学基金( 3 0 6 7 1 9 8 4 ) 资助 江苏大学硕士学位论文 摘要 目的：克隆小鼠f o x p 3 一a p r d ( n 末端富含脯氨酸区域缺失的 f o x p 3 片段) 和f o x p 3 一a f k h ( c 末端f k h 区域缺失的f o x p 3 片段) 基因， 构建带穿膜序列p t d ( p r o t e i nt r a n s d u c t i o nd o m a i n ) 的原核表达载体，表 达、纯化并复性p t d a p r d 、p t d a f k h 、p t d e g f p a p r d 、 p t d e g f p a f k h 融合蛋白，并初步探讨其生物学功能，为进一步研 究f o x p 3 的免疫抑制机制奠定基础。 方法：( 1 ) 利用p c r 技术扩增获得小鼠a p r d 和a f k h 基因， 将其克隆至p m d l 8 t 载体，进行单、双酶切鉴定及序列分析。 ( 2 ) 将测序正确的a p r d 和a f k h 基因克隆到带穿膜序列的 p e t 2 8 a p t d 和p e t 2 8 a p t d e g f p 原核表达载体中，并在大肠埃希菌 r o s e t t a ( d e 3 ) 中表达，获得带有h i s 标签的融合蛋白，利用b i o r a d 公司的镍柱纯化融合蛋白，并进行蛋白复性。 ( 3 ) 利用w e s t e r n - b l o t 技术检测融合蛋白表达的正确性，流式细 胞术和w e s t e r n b l o t 检测融合蛋白穿膜进入小鼠t 淋巴细胞瘤株e l 4 细胞中的能力，并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白对t 细胞 活化增殖能力的调节。 结果：成功构建了具有穿膜功能的原核表达载体，表达、纯化并 复性了带h i s 标签的融合蛋白，w e s t e r n b l o t 证实了融合蛋白表达的 准确性，流式细胞术和w e s t e r n b l o t 证实p t d 能携带f o x p 3 相关蛋 白有效的进入细胞内，同时经混合淋巴细胞反应证明p t d a p r d 融 合蛋白抑制t 细胞活化增殖的能力高于p t d a f k h 融合蛋白，说明 t 江苏大学硕士学位论文 c 末端的f k h 区域在f o x p 3 的抑制功能中起重要的作用，而n 末端 的富含脯氨酸区域也具有定的抑制功能。 结论：成功表达具有生物学活性的带穿膜序列的f o x p 3 相关融合 蛋白，w e s t e r n b l o t 和流式细胞术证实融合蛋白能有效地进入细胞并 定位于细胞核内，为进一步研究f o x p 3 的其它功能片段及其免疫抑 制机制奠定了基础。 关键词：p t d ，f o x p 3 ，a p r d ，a f k h ，免疫抑制 l i 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oc l o n em o u s ea p r da n da f k ho ff o x p 3g e n e s ；t o e x p r e s s ，p u r i f ya n dr e f o l dp t d a p r d ，p t d a f k h ，p t d - e g f p a p r d ， p t d - - e g f p - a f k hf u s i o n p r o t e i n s ；t oa n a l y s et h e i rb i o a c t i v i t yf o r t h e f u r t h e rr e s e a r c hw o r ko ff o x p 3 m e t h o d s ：( 1 ) t oc l o n em o u s ea p r da n da f k ho ff o x p 3g e n e sb y p c rw i t hs p e c i f i cp r i m e r s ，t h e nt h e yw e r ei n s e r t e di n t op m d l8 - tv e c t o r a n di d e n t i f i e d b ys i n g l e a n dd o u b l er e s t r i c t i o n e n z y m ea sw e l l a s s e q u e n c i n g ( 2 ) a p r da n da f k ho ff o x p 3g e n e s w e r ei n s e r t e di n t o p e t 2 8 a p t d ，p e t 2 8 a p t d e g f p v e c t o ra n d e x p r e s s e d i ne c o l i r o s e t t a ( d e 3 ) t og e tf u s i o np r o t e i n sw i t hh i st a g ；t h ef u s i o np r o t e i n s w e r ep u r i f i e da n dr e f o l d e db yb i o r a dp r o f i n i t yi m a cn i 2 + - c h a r g e d r e s i n ( 3 ) e x p r e s s i o no ff u s i o np r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e db yw e s t e r n b l o t ； f l o wc y t o m e t r ya s s a yw a su s e dt od e t e c tt h ee f f e c to fa p r da n da f k h o ff o x p 3t ot r a n s d u c ei n t om o u s ee l 一4c e l l s ；t h ec a p a b i l i t yo ff u s i o n p r o t e i n sf o ri n h i b i t i n gt h ea c t i v a t i o np r o l i f e r a t i o no ftc e l l sw a sa n a l y z e d b ym i x e dl y m p o c y t e r e a c t i o n r e s u l t s ：p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r so fa p r da n da f k hw e r e s u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d ；t h eh i s t a gf u s i o np r o t e i n sw e r ee x p r e s s e da n d p u r i f i e de f f i c i e n t l y ；t h e r e s u l t so fw e s t e r n b l o ta n df l o wc y t o m e t r y i i i 江苏大学硕士学位论文 i n d i c a t e dt h a tp t df u s i o np r o t e i n sc o u l dt r a n s d u c ei n t oe l 一4e f f i c i e n t l y ； m i x e dl y m p o c y t er e a c t i o na s s a ys h o w e dt h a tp t d - a p r df u s i o np r o t e i n h a dt h eb i o a c t i v i t yt oi n h i b i tt h ea c t i v a t i o np r o l i f e r a t i o no ftc e l l s ；w e h a dc o n f i r m e dt h a tf k hp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nf o x p 3 一m e d i a t e d i n h i b i t i o n ；f u r t h e r m o r e ，w ea l s oi d e n t i f i e daf u n c t i o n a ld o m a i nw i t h i nt h e n t e r m i n a lo ff o x p 3 ，w h i c hi sr e q u i r e df o rf o x p 3 - m e d i a t e dr e p r e s s i o n c o n c l u s i o n ：i ns h o r t ，a p r da n da f k ho ff o x p 3g e n e sw e r ec l o n e d a n de x p r e s s e di ne c o l is y s t e m ；p t df u s i o np r o t e i n sc o u l db et r a n s d u c e d i n t oe l - 4e f f e c t i v e l y ；t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ep t d - a p r df u s i o n p r o t e i n w a sap o w e r f u la n t i - tc e l la c t i v a t i o n p r o l i f e r a t i o nr e g e n t ； m o r e o v e r , t h en - t e r m i n a lo ff o x p 3w a san o v e lf u n c t i o n a ld o m a i n ；i t m a y b eu s e da san e wm e t h o dt ot h e r a p ya u t o i m m u n ed i s e a s ea n dp r e v e n t t r a n s p l a n t a t i o nr e j e c t i o n w o r d s ：p t d ，f o x p 3 ，a p r d ，a f k h ，i m m u n es u p p r e s s i o n i v 江苏大学硕士学位论文 目录 第一章绪论1 1 1 f o x p 3 在免疫调节中的作用1 1 1 1调节性t 细胞及其在免疫调节中的作用1 1 1 2 f o x p 3 的一般特性1 1 1 3 f o x p 3 的生物学功能2 1 1 4f o x p 3 的信号通路3 1 1 5 f o x p 3 在自身免疫性疾病中的作用5 1 2p t d 在蛋白转导中的作用7 1 3 本研究的目的和研究内容8 1 3 1 研究的目的及意义8 1 3 2 研究试验方案的设计9 第二章小鼠f o x p 3 - a p r d a f k h 基因的克隆1 1 2 1 材料方法1 1 2 2 结果1 6 2 3 讨j 沦2 0 第三章小鼠p t d - f o x p 3 相关融合蛋白的表达、纯化及复性2 1 3 1 材料方法2 1 3 2 结果2 6 3 3 讨论3 2 第四章小鼠p t d f o x p 3 相关融合蛋白功能的初步研究3 3 4 1 材料方法3 3 4 2 结果3 5 4 3 讨论j 3 8 第五章主要结论和展望4 1 5 1 主要结论4 1 5 2 展望4 1 参考文献4 3 v 江苏大学硕士学位论文 附录4 9 致谢5 1 攻读硕士期间发表的论文5 3 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1f o x p 3 在免疫调节中的作用 1 1 1 调节性t 细胞及其在免疫调节中的作用 自1 9 9 5 年s a k a g u c h i t lj 等首次报道c d 4 + c d 2 5 + 调节性t 细胞( r e g u l a t o r yt c e l l ， t r e g ) 以来，越来越多的研究证明t r e g 细胞在阻止自身免疫产生的病理损害中起 重要作用。t r e g 细胞主要来源于c d 4 + c d 8 + 胸腺细胞，约占外周c d 4 + t 细胞的 5 1 0 ，是在c d 4 t 细胞的自然选择过程中产生的，以逃避阴性选择方式存活 下来1 2 1 。t r e g ! 细胞具有以下特点：自身免疫防御作用、自然条件下处于无能状念、 抑制其它c d 4 + t 细胞和c d 8 t 细胞的生物活性、抑制活性是抗原非特异性的等 1 3 一钉。f o x p 3 ( f o r k h e a db o xp 3 ) 是目前公认的t r e g 细胞的特异性标志，在t r e g 细胞的 分化中起必不可少地作用。而t r e g 细胞特异表达f o x p 3 ，其它的淋巴细胞如 c d 4 + c d 2 5 。t 细胞、b 细胞和c d 8 + t 细胞仅表达少量的f o x p 3 1 5 - 7 1 。表达f o x p 3 对小 鼠t r e g ! 细胞发育和功能是必需的，也是足够的l & 9 1 。 t r e g 细胞在免疫调节中的主要作用是抑制自身反应性t 细胞，对于维持机体 t 细胞内环境的稳定，调节和保持对自身抗原耐受之间的平衡以及移植免疫耐受 具有重要作用f l m l 刁。t r e g 细胞的免疫抑制机制，目前主要有以下两种模式：1 、 细胞接触的调节作用：活化的t r e g 主要通过表达c t l a 4 接触抑制的方式抑s t j t 细胞的活化和增殖。c n a 4 是一种抑制性膜分子，其跨膜分子胞内段携带免疫 受体酪氨酸抑制基序，与b 7 配接后传递抑制信号，抑制t 细胞的增殖和活化，用 抗c t l a 4 单抗可阻断t r e g 细胞调节的抑制作用1 1 3 】；2 、细胞因子的调节作用：t r e g 细胞可通过分泌i l - 1 0 、t g f - b 等细胞因子发挥免疫抑制作用【1 4 】。i l - 1 0 可通过直 接和间接机制降低抗原特异性t 细胞的增殖，而t g f - b 则可以通过下调自身免疫 反应发挥免疫抑制作用。i l - 1 0 对t 细胞的直接作用机制包括抑制l l l 2 的产生和 延长细胞增殖周期；间接机制包括下调m h c i i 类分子、c d 8 0 、c d 8 6 以及c d 2 8 的配体表达1 1 5 】。 1 1 2f o x p 3 的一般特性 f o x p 3 属于f o r k h e a d w i n g e d h e l i x 转录因子家族中的一员，与t r e g 细胞的发育 江苏大学硕士学位论文 及生物学功能发挥具有密切关系，具有下调免疫应答的功能【1 6 j 。小鼠f o x p 3 基因 位于染色体x a l 1 ，其c d n a 全长1 4 1 1 b p ，基因编码产物( s c u r f i n ) d a 4 2 9 个氨基酸 组成。其蛋白结构( 图1 ) 主要包括：n 术端有一个富含脯氨酸的区域( p r d ) 、一 个c 2 h 2 锌指结构( z i n cf i n g e r ，z n f ) 、一个亮氨酸拉链( 1 e u c i n ez i p p e r ，z i p ) 和一个 蛋白c 端的叉头螺旋一f o r k h e a d 保守区( f o r k h e a dd n a b i n d i n gd o m a i n ，f k h ) 。f k h 是一个由8 4 个氨基酸组成的叉头状d n a 结合区，该区域大部分氨基酸序列高度 保守i l 刀。通过对多个i p e x 家族的f o x p 3 基因分析发现，i p e x 患者f o x p 3 的f k h 、 亮氨酸拉链和富含脯氨酸的n 末端区域突变频率较高( 图1 ) ，提示这三个结构区域 对f o x p 3 生物学功能的发挥具有重要作用1 1 引。f k h 区域氨基酸序列相当保守， 是f o x 转录因子家族所共有的序列。f k h 区域缺失的蛋白既不能定位于核上，也 不能发挥转录抑制功能，说b 凋f o x p 3 蛋白的核定位以及其免疫抑制功能发挥均有 赖于f k h 区域序列的完整性1 1 9 l 。最近有研究发现，s c u r f i n 蛋白n 末端富含脯氨基 酸的区域缺失会导致i l 2 表达受抑制，f o x p 3 丧失了抑链j l j t 细胞细胞因子表达的能 力，说明靠近n 末端的这个区域对其发挥免疫抑制功能具有重要的作用【舡2 。 z n f z p f ，h 釉叫：净o 卜叫= 乏= = = 3 一c釉。吣。一_ ) 。鼍；蠢： 一c 镪 侈薄盘。啦萋骛弼 辩x扫)：城渤黼雠4 ? 图1 s c u r f i n 蛋白结构示意图 f i 9 1 t h es t r u c t u r a ld o m a i n so fs c u r f i n n u m b e r sa l o n gt h eb o t t o mo ft h eg r a p hi n d i c a t ea m i n o a c i dn u m b e r ( i - 4 3 1 ) e a c hc i r c l er e p r e s e n t sam u t a t i o ni d e n t i f i e di nas i n g l ek i n d r e d z n f , z i n cf i n g e r ；z i p ，l e u c i n ez i p p e r ；f k h ，f k hd b d 1 1 3f o x p 3 的生物学功能 经研究发现f o x p 3 - 与t r e g 细胞的发育和功能表达密切相关，在免疫调节中发 挥重要的作用。f o x p 3 突变的小鼠和人分别罹患s c u r f y 和i p e x ( i m m u n e d y s f u c t i o n p o l y e n d o c r i n o p a t h y e n t e r o p a t h yx l i n k e d ) 。s c u r f y 小鼠发生tf o x p 3 基因 的突变，导致c d 4 + t 细胞介导的淋巴细胞增殖疾病，表现为恶病质和多器官淋巴 细胞浸润【2 2 1 。人类同源i 拘f o x p 3 突变可引起i p e x 疾病，表现为全面的免疫失调， 2 江苏大学硕士学位论文 伴有自身免疫性内分泌疾病、早期发作的i 型糖尿病和甲状腺炎等1 2 3 1 。有学者 研究发现，在鼻粘膜中通过花粉可以使表达f o x p 3 的t r e g 细胞数量明显增加1 2 4 】； f o x p 3 敲除的小鼠体内活化的c d 4 t 细胞增多，却缺乏独立的c d 4 c d 2 5 + t 细胞， 因而导致自身免疫性疾病的发生【2 5 l ；f e h e r v a r i 等1 2 6 l 将从正常小鼠分离的t r e g 细胞 过继至l j f o x p 3 缺陷的小鼠体内，结果发现能阻止此小鼠自身免疫疾病的发生； w a l k e r - _ - 等1 ：2 7 j 通过转基因技术人为地使c d 4 + c d 2 5 细胞表达f o x p 3 ，发现这些转染 后的c d 4 + c d 2 5 细胞获得了t r e g 细胞表型和功能。以上这些实验充分表明了 f o x p 3 在t r e g 细胞功能中起决定性作用。 f o x p 3 参与t r e g 细胞在胸腺中的发生，其机制可能是：在胸腺发育过程中，部 分t 细胞能够通过t c r 与胸腺基质细胞m h c 分子以较高亲和力结合，启动这群t 细胞f o x p 3 的基因表达，使其向t r e g 分化，并且只有在胸腺t r e g 上的f o x p 3 改变才 影响到外周t r e g 的数量，而外源导入f o x p 3 不会影响胸腺及外周t r e g 的数量【2 8 。2 9 l 。 f o x p 3 在维持t r e g 细胞的免疫抑制功能中起重要作用，其机制可能包括：1 、f o x p 3 进入细胞核内通过其f k h 与d n a 结合发挥作用，使其成为一种转录抑制因子；2 、 f o x p 3 的f k h 结合位点与活化t 细胞核因子( n f a t ) 位点比较接近，可能与n r 盯 的结合位点部分重叠，因此f o x p 3 n - i 通过竞争性抑制n f a t 的转录活性而间接下 调效应基因的转录1 3 0 1 ；3 、f o x p 3 可以通过招募其它具有抑制功能的效应分子与 目的基因结合，从而发挥免疫抑制功能【3 1 3 2 】；4 、f o x p 3 j 厦_ 过_ k i g l t r e g _ 细t 胞抑制性 效应分子及细胞因子( 如g l t r 、c t l a - 4 、t g f b 等) 表达来介导t r e g l 细胞抑制功 能的发挥1 3 3 3 列。 1 1 4f o x p 3 的信号通路 越来越多的研究结果表明，t c r 、c t l a 4 、t g f - - 1 3 、i l - 2 、n f a t 等信号转 导途径均与f 0 x p 3 的发育和功能有判矧。例如，在胸腺中提供高亲和力的t c r 相 互作用，有利t ：t r e g 细t 胞的产生。类似地，在同时表达某一抗原肽段及识别该抗 原t c r 的转基因小鼠中，分离免疫无能的t c r 转基因c d 4 c d 2 5 - t 细胞能够适度 地上调f o x p 3 表达。体外诱导c d 4 + c d 2 5 t 细胞转变为表达f o x p 3 1 拘t r e g 细胞，同 样离不丌t c r 的刺激，表旺 t c r 的刺激信号对于f o x p 3 表达具有重要的作用【3 7 1 。这 些结果提示，高亲和力的t c r 作用可能与f o x p 3 的诱导产生有关。 3 江苏大学硕士学位论文 许多研究结果表明，t g f b 信号通路对于诱导f o x p 3 的表达具有重要作用。 t g f b 和t c r 刺激的联合使用可以诱导c d 4 + c d 2 5 t 细胞转变为表达f o x p 3 的t r e g 细胞1 3 8 。3 9 l 。另外，t g f 1 3 介导f o x p 3 的表达，可能与t g f b 信号转导的抑制物s m a d 7 ( m o t h e r sa g a i n s td e c a p e n t a p l e g i ch o m o l o g u e 7 ) 有关。在t g f b 刺激初始c d 4 + t 细 胞后，s m a d 7m r n a 表达上调i 删；而在表达f o x p 3 的t 细胞中s m a d 7m r n a 的升高 则受到抑制。f o x p 3 j 通过抑铝l j s m a d 7 ，从而正向调节t g f b 信号通路，使体外诱导 的t r e g 细胞具有免疫抑制功能。上述实验均说明，t g f - b 能通过某些途径调控 f o x p 3 的表达，在t r e g 细胞的发育中起一定的作用。但是，有研究发现，在t g f b 手 的小鼠( 出生后3 7 天) 中存在j 下常的t r e g 细胞，可见t g f b 对于介导天然t r e g 细胞 的产生是可有可无的1 4 。因此，t g f b 可能对于天然t r e g 细胞的发育及其f o x p 3 的表达不是必需的。但是在外周，t g f 6 可以诱导f o x p 3 的表达及t r e g 细胞的产 生，从而维持外周免疫反应的稳态。 c t l a 4 信号通路在f o x p 3 的发育和功能中起非常重要的作用。c t l a 4 与 f o x p 3 缺陷型小鼠具有类似的表型，其分子间功能可能存在一定的联系。l i 等1 4 2 1 研究发现，将f o x p 3 基因导入佣a 4 缺陷小鼠体内，可以延长此小鼠患淋巴细胞 增殖疾病的发生时间及存活期，表明f o x p 3 可能在c t l a 4 信号转导途径的下游。 当然，二者也可能是两条不同的途径，f o x p 3 的表达可以弥补c t l a 4 途径的缺陷。 所以，c t l a 4 与f o x p 3 之间的相互关系需要进步的研究。 最近有研究表明n f a 剧i l 广2 信号通路在调节f o x p 3 的免疫抑制中起一定的作 用。目前，比较公认的f o x p 3 结合位点位于i l 广2 启动子旁的n f a t 附近，f o x p 3 可 能通过阻止n f a t 向i l - 2 启动子的募集来抑制l l 广2 的转录。由于当初始t 细胞中 f o x p 3 转录后，细胞因子i l - 2 、i l 4 及i f n - 1 的表达受到抑制，进而推测f o x p 3 产物 可能是一种细胞因子转录抑制子1 4 3 - 4 4 1 。b e t t e l l i 掣4 5 l 研究表明，f o x p 3 j 恿过阻断 n f a t 和核转录因子r d 3 ( n f 1 c b ) 途径， 因的表达，进而影响机体免疫的内环境； 抑制内源性目的基因及关键细胞因子基 同时与w t ( 野生型) 小鼠比较，s c u r f y 小鼠来源的t 细胞中n f a t 和n f - 1 c b 转录活性明显提高。给s f d 鼠体内补充f o x p 3 后，n f a t $ 1 n f k b 转录活性恢复到正常水平。g r a n t 等1 4 6 l 的研究也表明，f o x p 3 也可以通过n f k b 途径抑错l j h i v 1 和h t l v 1 病毒的逆转录。 4 江苏大学硕士学位论文 1 1 5f o x p 3 在自身免疫性疾病中的作用 自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、重症 肌无力及i 型糖尿病等一大类疾病，其共同表现是自身反应性t 、b 淋巴细胞的过 度激活和紊乱以及对自身个体组织细胞或器官的攻击等，目前发病原因还不是很 清楚。但有研究证实，机体内存在着一系列针对自身反应性t 细胞的免疫调节机 制，除了克隆清除、克隆无能和免疫忽视等被动机制外，胸腺产生的t r e g 细胞所 介导的免疫抑制作用是一种重要的主动机制，可通过与细胞的直接接触或分泌抑 制性的细胞因子( 如i l - 1 0 、t g f - b ) 发挥抑制自身反应性t 细胞、维持自身免疫 耐受的重要作用，一旦去除t r e g 或t r e g 功能障碍t i pn - - - i 导致各种自身免疫性疾病的 产生【4 7 】，而f o x p 3 是t r e g 细胞的特异性的转录因子，其决定t r e g 细胞的发育、表 达和功能维持，因而在自身免疫性疾病中起重要作用。 1 1 5 1f o x p 3 与系统性红斑狼疮 系统性红斑狼疮是一种多系统均受到损害的自身免疫性疾病。不同的研究证 实，f o x p 3 在此病的发生、发展中起重要的作用。例如，有学者研究发现系统性 红斑狼疮患者外周血t r e g 细胞的表达率明显降低，且活动期降低更明显i 矧。还 有学者研究发现与非活动期患者和正常对照相比，活动期系统性红斑狼疮患者 t r e g 细胞明显减少，而且c d 4 + t 细胞中佣a 4 和f 0 x p 3 的表达也减少，与疾病活 动性呈负相关，提示该病可能存在t r e g 细胞缺陷。f o x p 3 和c t l a 4 表达的不同， 可能在系统性红斑狼疮发病机制中起着不同的作用【4 9 1 。 1 1 5 2f o x p 3 与类风湿性关节炎 类风湿性关节炎是以多关节慢性滑膜炎为特征的一种常见的自身免疫病，免 疫功能的紊乱可能是该疾病发生的关键。有研究表明，引起t h l 细胞因子分泌的 c d 4 + t 细胞是诱发类风湿性关节炎疾病的激发细胞，而f o x p 3 能对自身反应性t 细胞发挥免疫抑制作用，因而可能在类风湿性关节炎中起着重要作用。一些国外 学者的研究发现，类风湿性关节炎患者的滑液中c d 4 + t 细胞表达c d 2 5 + 明显增 加，并且此类细胞具有较强的免疫抑制活性，同时高表达f o x p 3 、c t l a 4 等t r e g 相关因子。因此，f o x p 3 可能通过抑制自体同源t 细胞增殖，导致活化的反应性t 5 江苏大学硕士学位论文 细胞对t r e g 敏感性降低，从而在类风湿性关节炎的发生、发展和转归中起 重要的作用1 5 。 1 1 5 3f o x p 3 与多发性硬化症 多发性硬化症是一种以中枢神经系统炎细胞浸润为主的自身免疫性疾病， f o x p 3 介导的针对自身髓鞘蛋白的免疫反应在发病机制中起着重要作用。v i g l i e t l a 等1 5 2 l 研究发现，多发性硬化症患者外周血t t r e g 细胞抑制功能明显降低，首次证明 了多发性硬化症患者中t r e g 细胞功能的改变。同时还发现在多发性硬化症患者中 自身反应性t 细胞更容易被激活，可能由于t r e g 细胞产生缺陷或效应功能降低所 导致。t t u a n 等1 5 3 j 研究发现多发性硬化症患者外周血t r e g 细胞f o x p 3 信号转导和蛋 白表达异常，f o x p 3 蛋白表达水平降低，表明t r e g 细胞免疫调节功能受损。而 v e n k e n 等【5 4 】研究认为，f o x p 3 l 拘表达在多发性硬化症发病的初期起着重要作用， 因此，可以从影响f o x 0 3 蛋白表达和t r e g 细胞功能的角度去治疗多发性硬化症。 以上研究均说明，f o x p 3 在多发性硬化症的发生中起一定的作用。 1 1 5 4f o x p 3 与重症肌无力 重症肌无力是一种t 细胞依赖、抗体介导的神经系统自身免疫性疾病。胸腺 中存在大量激活的自身反应性c d 4 + t 细胞，被认为是重症肌无力发生的重要原 因。f o x p 3 能下调t h l 细胞因子，上调i l l 0 和t g f b 细胞因子的产生，从而对潜在 的自身反应性t 细胞进行调控并预防自身免疫性疾病的发生。s u n 等1 5 5 l 研究发现 病情未能很好控制的重症肌无力患者外周f mc d 4 c d 2 5 + f o x p 3 + t 细胞比率稍微降 低，而病情稳定或缓解的重症肌无力患者c d 4 c d 2 5 + f o x p 3 + t 细胞显著升高，说 明f 0 x p 3 可能与该病的稳定程度有关。另有研究者发现，重症肌无力患者t r e g 细 胞数量虽正常但f o x p 3 表达明显减少，且这些细胞都不具有抑制反应性t 细胞增 殖的能力1 5 6 1 ，提示f o x p 3 在此病中起重要作用。以上研究说n c d 4 c d 2 5 + f o x p 3 + t 细胞数目或功能的异常可能是重症肌无力发生的原因，若能对体内该细胞数目或 功能进行调控将对重症肌无力治疗具有重要意义。 6 江苏大学硕士学位论文 1 1 5 5f o x p 3 与i 型糖尿病 l 型糖尿病是一种器官特异性自身免疫性疾病，目前认为在该疾病中自身反 应性t h l 细胞介导的细胞免疫扮演了至关重要的角色。t r e g 细胞通过抑制自身反 应性t 细胞在l 型糖尿病中起作用。l i n d l e v 等1 5 7 】研究发现，i 型糖尿病初期患者中 t r e g 细胞水平虽正常，但在体外培养中t r e g 细胞抑制自身反应性t 细胞增殖的能 力明显减弱，产生i l - i o 减少，说明t r e g 细胞功能缺陷可导致l 型糖尿病。p o p 等【5 8 渤】 研究表明，由t g f b 介导的t r e g 细胞抑制功能的缺失可能与胰淋巴结表达f o x p 3 和t g f b 1 的t 细胞的数量暂时下降有关。因此，推测t r e g 细胞可能通过t g f b 信 号途径在l 型糖尿病中发挥关键抑制作用。因而，f o x p 3 表达的降低可能在l 型糖 尿病的发病机制中起重要作用。 1 2p t d 在蛋白转导中的作用 许多年来，困扰基础和临床研究工作者的一大难题就是：如何让外源性大分 子高效地进入细胞内应用于疾病的治疗而又不损伤细胞。目前，国内外许多研究 者主要运用脂质体转染等方法介导生物大分子进入细胞。这些方法存在着操作复 杂、效率不高、蛋白转染量难以控制和细胞毒性等问题。因此，需要寻找一种更 为有效和安全的将生物大分子转导细胞的方法。1 9 8 8 年，f r a n k e l 等l 删首次报道 了h i v 基因编码的反式激活蛋白( t r a n s a c t i v a t o rt r a n s c r i p t i o n ，t a t ) 可以跨膜转导 进入细胞，并且转导效率高，细胞毒性较小。到目前为止，人们已发现了四类高 效的蛋白转导域，分别来自于h i v - 1t a t 、果蝇同源异型转录因子a n t p 、单纯 疱疹病毒1 型( h s v - 1 ) 问层蛋i 刍v p 2 2 和碱性h e l i x - l o o p - - h e l i x ( b h l h ) 家族的h l h 结构域【6 1 彤】，其中以h i v - 1 中的t a t 序列最短。研究发现t a t 中一段富含碱性氨基 酸、带较多正电荷的多肽p t d ，与t a t 的跨膜转导有关。p t d 核心序列为 y g r l q r q r r r ，能有效地引导多肽或蛋白质进入细胞，且转导速度快，效率 高，不损伤细胞。p t d 携带外源性分子穿过细胞膜进入细胞内的确切的转导机制 尚未明了，它可以与其它蛋白形成融合蛋白进入包括外周血单个核细胞和原代培 养细胞在内的所有哺乳动物细胞，甚至还可以穿过血脑屏障m 。p t d 可以转运 1 5 1 2 0 k d 的蛋白质、噬菌体等生物大分子进入细胞内【6 5 侧。 由于p t d 序列高效的转导作用，越来越多的研究者利用p t d 携带外源性蛋 白等物质进入细胞内发挥生物学作用。v e l d h o e 等l d 7 j 采用酶缺陷的l c k p t d 转导 7 江苏大学硕士学位论文 初始c d 4 + t 细胞，结果成功阻止了c d 4 + t 细胞活化信号的内传，抑制了t 细胞 活化，导致t 细胞的无能。还有学者在研究p t d p n p ( p u r i n en u c l e o s i d e p h o s p h o r y l a s e ) 融合蛋白生物安全性时发现，频繁注射p t d p n p 融合蛋白不仅没 有使得小鼠产生明显的中毒症状，而且能够明显改善p n p - - 小鼠的症状，延长其 存活时间i 吲。以上研究均说明，p t d 能将生物大分子有效的转导进入细胞内， 从而发挥生物学作用。将p t d 编码基因和外源蛋白基因连接表达融合蛋白，不 仅保留了p t d 蛋白的穿膜能力，而且外源蛋白的生物学活性不受影响。另外， 这种融合蛋白的转导操作简单，反应条件宽松，不受温度等外在条件的影响，只 需要将融合蛋白与需要转导的细胞共培养即可，且所需时间仅为几分钟至几小时 即能进入细胞。因此，p t d 是一种很有应用前景的大分子运载工具，为大分子 类药物治疗临床疾病开辟了广阔的前景。 1 3 本论文研究的目的、意义、方法及试验方案的设计 1 3 1 研究目的： 克隆小鼠f o x p 3 - p r d 和f o x p 3 - af l 基因， 构建带穿膜序列的原核表达 载体，表达、纯化并复性p t d p r d 、p t d af k h 、p t d e g f p ap r d 、p t d e g f p af k h 融合蛋白，并初步探讨其生物学功能，为进一步研究f o x p 3 的免疫抑制机 制奠定基础。 1 3 2 研究意义： f o x p 3 作为调节性t 细胞特异性的转录因子，其决定t r e g 细胞的发育、表达 和功能维持，因而在自身免疫性疾病中起重要作用。本研究通过克隆小鼠f o x p 3 a p r d 矛i f o x p 3 af k h 基因，表达、纯化、复性相关f o x p 3 融合蛋白，并通过转 导e l 4 细胞，初步研究f o x p 3 融合蛋白的功能。本项研究，为今后进一步研究小 鼠f o x p 3 的功能、f o x p 3 与其它基因相互作用的关系以及f o x p 3 在自身免疫性疾病 中的作用，奠定了良好的基础。 1 3 3 研究方法及技术： 分子克隆技术、原核蛋白表达技术、蛋白印迹技术、流式细胞技术等。 8 江苏大学硕士学位论文 1 3 4 试验方案的设计： 试验流程见下图： i p c r 克隆a p r d 基因p c r 克隆a f k h 基因 分别与p m d l 8 - t 载体连接 上j r l a p i m 基因鉴定及序列分析a f k h 基因鉴定及序列分析 土上 1 分别与p e t 2 8 a p t d 、p e t 2 8 a p t d e g f p 载体连接 1r 1 分别转化r 。s t t a ( d e 3 ) 菌，表达、纯化、复性融合蛋白 上土 i i门d e g f p - a p r d 、门d - e g f p a f k h p t d p r d 、p t d a l l l k h i 融合蛋白融合蛋白 1r1r 1 r i流式细胞术鉴定w e s t e r n - b l o t 鉴定混合淋巴反应鉴定 融合蛋白穿膜能力融合蛋白穿膜能力融合蛋白生物学活性 9 江苏大学硕士学位论文 江苏大学硕士学位论文 第二章小鼠f o x p 3 - ap r d af k h 基