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扬州大学生物科学与技术学院,荧光蛋白标记亚细胞定位,1,扬州大学生物科学与技术学院生物化学精品课程,问题的提出,一直以来，人们已经掌握一些方法以评价蛋白的化学和物理状态,但是存在一些基础的问题，如何直接理解蛋白在细胞内的的生物活性，因此，我们需要在活细胞体内检测这些蛋白，以利用了解以下信息,2.目的蛋白与哪些其他蛋白相互作用,1.目的蛋白定位在什么地方?,这些问题能够通过以下实验揭示,(1)蛋白荧光细胞定位,(2)酵母双杂交，免疫共沉淀，荧光共振能量转移,2,扬州大学生物科学与技术学院生物化学精品课程,荧光蛋白标记细胞定位,将目的基因与绿色荧光蛋白基因（EGFP）融合，通过绿色荧光蛋白的荧光效应以对目的蛋白进行亚细胞定位,P,Target,启动子,目的蛋白基因,终止子,P,Target,EGFP,限制性内切酶位点,Linker(poly-G),3,扬州大学生物科学与技术学院生物化学精品课程,荧光亚细胞定位的设备:激光共聚焦显微镜,激光共聚焦显微镜所发射的光能聚焦在样品的一个非常薄的切面上。,激光共聚焦显微镜的优点是其能剔除非焦平面来源的任意光线。,4,扬州大学生物科学与技术学院生物化学精品课程,实验方法,克隆目的基因的开发阅读框将目的基因与EGFP基因融合（在哺乳动物细胞中，一般选用pEGFP系列质粒载体）将质粒转染细胞在不同的时间点在激光共聚焦显微镜下观察EGFP在细胞中的定位，如有必要需进行亚细胞组分的染色，例如细胞核染色（一般可用PI,DAPI或Hochist);内质网染色或线粒体染色。,5,扬州大学生物科学与技术学院生物化学精品课程,荧光亚细胞定位的应用,荧光是最常用的工具用于蛋白的亚细胞定位,Actin,Debrin,Apoptosis12(7):1155-1171,2007,endoG-YFP(apoptoticendonuclease),Mitochondr
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