（作物学专业论文）拟南芥盐胁迫环境下的转录调控网络构建与分析.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 摘要 盐胁迫是影响植物生长发育的重要因素，它通过渗透压和离子毒害两方面对 植物产生胁迫危害。近年来，以拟南芥为材料所开展的植物耐盐机理研究已获得 一些重要的成果，如s o s ( s a l to v e r l ys e n s i t i v e ) 信号途径、m a p k ( m i t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e ) 级联反应途径和植物激素( a b a 、j a ) 诱导的信号途径等都是近年来 研究较为广泛的植物耐盐机理。目前，已鉴定出部分重要的盐胁迫响应基因，如 s o s 核心基因s o s l 、s o s 2 、s o s 3 等，但是各信号途径内部的转录调控机理仍 不清楚，因此需进一步构建拟南芥盐胁迫环境下的转录调控网络。 本研究通过反向工程方法，整合公共数据库中盐胁迫相关的基因组表达谱数 据，首次构建了拟南芥在盐胁迫状态下的转录调控网络。其中，s o s 途径相关转 录调控网络包含7 0 个盐胁迫相关基因，基因间存在高度的互作关系，在这当中 2 7 个转录因子为主要调控节点，多数转录因子都是首次预测参与s o s 信号途径。 进而根据s o s 核心基因的表达特性，所得调控网络的不同时间阶段的动态表达 模式得到鉴别。 在全局性的盐胁迫转录调控网络中，通过结合其他胁迫响应条件下芯片表达 数据进行聚类，分析了分属于1 3 个不同聚类的基因。最为关键的是，本研究构 建出较为完整的盐胁迫环境下三条重要信号途径，即m a p k 级联途径、s o s 信 号途径和植物激素信号途径，并找到3 1 个最为可能的核心转录因子( h u b 基因) 及其下游靶基因，这些h u b 基因在各信号途径中起到了关键调控节点作用，并以 此展现出不同信号途径间的交互作用。此外，还根据h u b 基因间的复杂调控关系， 整理出h u b 基因不同时间段的动态表达模式。 本研究所构建的盐胁迫转录调控网络，为进一步实验验证相应的调控网络关 系和关键基因提供了有效的参考，对完整揭示拟南芥适应盐胁迫过程中的基因表 达调控机理具有重要意义，并为今后深入剖析其耐盐机理提供了方向。 关键词：拟南芥；盐胁迫；转录调控网络；转录因子；基因表达；信号传导途径； 基因芯片 v a b s 仃a c t h i g hs a l i n i t y i so n eo ft h em o s ts e v e r ea g r i c u l t u r a lc o n t a m i n a n t w i mt h e o s m o t i cs t r e s sa n dn a + t o x i c i t y , h i g hs a l i n i t ya f f e c t sa l m o s ta l la s p e c t so fp l a n t d e v e l o p m e n ta n da g r i c u l t u r a lp r o d u c t i v i t y e l u c i d a t i n gg e n er e g u l a t o r yn e t w o r ki s c r u c i a lf o ru n d e r s t a n d i n gt h ed e f e n s em e c h a n i s mw h i c ha r a b i d o p s i st h a l i a n a d e v e l o p e d t om a i n t a i ni t ss t a n d a r do fg r o w i n g a l a r g es e t so fs t u d i e sh a v eb e g u nt oe x p l o r es a l tr e s p o n s ei na t h a l i a n a ，a m o n g w h i c ht h em o s ta d v a n c e du n d e r s t a n d i n gi sb a s e do nt h es a l to v e r l ys e n s i t i v e ( s o s ) s i g n a l i n gp a t h w a y ，m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ( m a p k ) c a s c a d e sa n dp l a n t h o r m o n er e g u l a t o r yp a t h w a y h o w e v e r , l i t t l ei sk n o w na b o u tt h ed y n a m i cn e t w o r ko f s i g n a l i n gf r o mp e r c e p t i o nt od o w n s t r e a mg e n ee x p r e s s i o nu n d e rh i g hs a l i n i t ya n d i n t e r a c t i o n sb e t w e e ns a l ts t r e s sa n do t h e rs t i m u l u s i n t h i ss t u d y , at r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o r yn e t w o r kw a sc o n s t r u c t e db ya p p l y i n g t h er e v e r s ee n g i n e e r i n gm e t h o dw i t ha v a i l a b l ep u b l i c g e n o m e - w i d ee x p r e s s i o n m i c r o a r r a yd a t a s e t so fa t h a l i a n ac e l lu n d e rs a l ts t r e s s t h es o sp a t h w a y r e l a t e d r e g u l a t o r yn e t w o r kc o n t a i n s7 0g e n e s o ft h e m ，2 7t r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa r eh i g h l y i n t e r c o n n e c t e d a c c o r d i n gt ot h ek e yh u b so fs o ss i g n a l i n gp a t h w a y , t h er e s p o n s e g e n e sa r ec a t e g o r i z e du p o nt h e i rd i s t i n c te x p r e s s i o np a t t e r n s f u r t h e r , at i m e 。c o u r s e a n a l y s i si n d i c a t e st h er e s p o n s eo f r o o t sc h a n g eo v e rt i m e t h es a l ts t r e s sc o m p r e h e n s i v er e g u l a t o r yn e t w o r kp r e s e n t sah i e r a r c h i c a l s c a l e f r e ea r c h i t e c t u r e 31m a j o rh u bt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ( t f s ) w e r ea n a l y z e da n d t h e i rp o t e n t i a li n t e r a c t i o n sa n dp o s s i b l yi n v o l v e dp a t h w a y sw e r ei d e n t i f i e d w ea l s o i n v e s t i g a t et h er o l e so fh o r m o n ep l a y e di n0 1 , 1 1 n e t w o r ka n dt h ec r o s s t a l kb e t w e e n a b s c i s i ca c i da n dj a s m o n i ca c i d i n t e g r a t i n gw i t hp r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o n i n f o r m a t i o na n das e to ft i m ec o u r s eo fe x p r e s s i o nd a t au n d e rt h ed i f f e r e n tt r e a t m e n t s ， t h ep o t e n t i a lm o d e lo fs a l ts t r e s ss i g n a l i n ga n dt r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o r yn e t w o r k w e r ec o n s t r u c t e d m o r e o v e r , n o v e lc i s - e l e m e n t c a n d i d a t e sf o rh u bt f sw e r e i d e n t i f i e d o u rs t u d ys h o w e dt h a ta t h a l i a n ah a se v o l v e dac o m p l e xi n t e r a c t i o na n d v i 浙江大学硕士学位论文 d y n a m i cc h a n g en e t w o r kb e t w e e ns a l ts t r e s sa n dh o r m o n er e g u l a t o r yp a t h w a y s t h i s s i g n a l i n gm o d e lc a nb eu s e df o ru n c o v e r i n gt h es a l ts t r e s sa d a p t a t i o ns y s t e ma n df o r f u t u r eh y p o t h e s i st e s t i n g k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ；s a l i n i t ys t r e s s ；t r a n s c r i p t i o n a r e g u l a t o r yn e t w o r k ； t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ；g e n ee x p r e s s i o n ；s i g n a l i n gp a t h w a y ；m i c r o a r r a yd a t a v 浙江大学硕士学位论文图表清单 图表清单 图2 1 转录调控网络的图示模型1 3 图3 1 拟南芥盐胁迫环境下的s o s 转录调控网络2 6 图3 2 拟南芥盐胁迫环境下s o s 核心基因的调控模式3 0 图3 3 拟南芥盐胁迫环境下s o s 3 子网络的动态表达模式3 2 图4 1 ( a ) 转录调控网络在不同时间点的动态变化趋势；( b ) 2 0 s 0 个基因构成的 1 3 个聚类3 7 图4 2h u b 基因的动态表达模式及内部调控关系4 7 图4 3 三条重要的盐胁迫信号传导途径5 2 表3 1s o s 转录调控网络1 9 表3 2 参与s o s 转录调控网络基因的注释2 7 表4 1h u b 基因的注释3 8 表4 2t f b s 分析结果4 0 表4 3h u b 基因和重要信号传导基因间的蛋白质互作4 5 表4 4h u b 基因的内部调控网络4 8 x 浙江大学硕士学位论文 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特i i i i 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解一浙江大学有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江大学 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年月日签字日期：年月日 m 浙江大学硕士学位论文 致谢 致谢 本研究从选题、方案设计到最后的论文写作，自始至终都得到了导师朱军教 授的无私帮助。朱老师在学术上对我的严格要求与悉心指导，为课题的顺利完成 给予了很大支持。同时，朱老师忘我的工作精神，求实的学术作风和全局性的科 学眼界，一直鼓舞着我，让我永远铭记。在实验室与朱老师交谈时，朱老师经常 从科学研究谈到为人处事和工作生活，每次都受益匪浅，难以忘怀导师父母般的 关怀，让我的研究生生涯倍感温暖。值论文完成之际，我怀着深切的感佩之情， 谨向朱老师致以最真挚的敬意和深深的感谢。 感谢农业与生物技术学院的赵建明书记、樊龙江教授、王人民教授、徐海明 副教授，林良夫副教授、陈进红副教授、宋文坚副教授和洪彩霞老师的热情指导 和无私关怀。特别感谢六年多来林良夫老师对我在求是园中的诸多帮助与鼓励， 也感谢徐海明老师对我两年多研究生生活的热心帮助和论文写作指导，学生一定 将你们的教导铭记于心。 衷心感谢同门众师友的热心关怀，感谢汪旭升、韩立德、吴家胜、杨剑、 y o u s a fh a y a t 、刘海岚、陈国波、龚云国、徐飞、金谷雷、沈炎峰、朱智宏、夏 真、叶成荫、郑妍、曹培健、徐利峰、詹宇、郑文俊、胡晗、张福涛、朱志翔、 张陈浩、魏长帅、徐易、梁媚媚、马亚楠、周佳萍、魏恒玲。感谢金谷雷师兄在 生物信息学方法上给予我的帮助，并为本研究提供了诸多宝贵意见，让我在试验 设计和文章写作上得到了很多启示。 另外，感谢我的同学张彤、黄鹏宇、孑l 建明、黄贤清、王朋、邵科在六载多 求是园生活中给予我学习、工作、生活上的帮助与支持。感谢所有给予我帮助和 关怀的师长与朋友们，在未来的日子里，我将继续奋斗! 谨以此文献给我的亲人们，特别感谢家人多年来对我各方面的默默支持与无 微不至的关怀，正是他们的支持与付出，才让我顺利完成今天的学业，感谢你们! i v 谢崇波 2 0 1 0 1 于浙大华家池 浙江大学硕士学位论文 引言 1 引言 由于受到全球气候变化和生态环境恶化的影响，土壤盐渍化程度日趋严重。 土壤盐渍化产生的盐胁迫是植物面临的重要环境胁迫之一，目前已严重影响世界 范围内的农业生产和农业生态环境( m u n n sa n dt e s t e r2 0 0 8 ) 。在盐胁迫环境下， 植物从生理代谢到整体的生长发育都会发生一系列物理化学变化，如光合作用、 呼吸作用等都会受到不同程度的影响。盐胁迫的这些影响主要来源于两方面 ( m u n n s2 0 0 2 ；t e s t e ra n dd a v e n p o r t2 0 0 3 ；w a n ge ta 1 2 0 0 3 ) ，一是土壤中盐分浓 度过高会造成土壤水势下降而渗透压升高，这将导致植物根部水分减少并影响植 物生长速率；二是土壤中的n a + 大量涌入植物细胞，n a + 积累过多势必会对植物 细胞造成离子毒害作用，并影响其他必需元素的吸收，从而进一步影响到植物的 生长发育。 大田作物大多为盐胁迫敏感性植物，因此，合理开发和利用盐渍化土壤资源 的根本途径，便是利用基因工程技术培育耐盐性作物品种。而植物的盐胁迫响应 属于多基因控制的复杂性状( f l o w e r s2 0 0 4 ) ，其生理生化反应是基因间相互作 用、共同调节的结果，只有深入、全面地了解植物耐盐基因，掌握耐盐机理，才 能顺利进行基因工程育种，提高作物抵抗盐胁迫的能力。 随着分子生物学、基因组学、生物信息学等各种生物学技术的发展，植物耐 盐机理的研究由传统的生理学水平逐渐上升到今天的分子水平。近年来，以拟南 芥为对象所开展的植物耐盐机理研究已获得一些重要的研究成果，尤其是在信号 传导途径上的研究( d o r o t h e a b a r t e l s2 0 0 5 ；t u t e j a2 0 0 7 ；z h u2 0 0 2 ) 。目前，研 究较为深入的盐胁迫信号传导途径主要有m a p k 级联反应、s o s 信号传导途径、 c a 2 十信号通路和植物激素信号途径( 如a b a 、j a ) 等。尽管如此，这些信号通路内 部的基因调控关系及其相互间的交互作用仍不清楚，因此，构建相应的盐胁迫转 录调控网络有利于找出各信号途径内部的基因表达调控关系，走通盐胁迫环境下 的关键信号传导途径，并有助于揭示植物的耐盐胁迫机理。 近年来，高通量技术的发展( 如，基因芯片技术) 与应用为研究植物基因组的 表达变化和构建基因调控网络提供了可能。目前，国内外学者根据公共数据库中 ( 如n c b i 、t a i r 、n a s c 、g e n e v e s t i g a t o r 等) 已有的大量拟南芥表达谱芯片数据， 对植物环境胁迫的综合表达网络开展了初步的研究，如，c a r r e r a 等人利用大量 浙江大学硕士学位论文 引言 的拟南芥环境胁迫基因芯片( c a r r e r ae ta 1 2 0 0 9 ) ，初步构建了基因组转录调控网 络，n e m h a u s e r 等人也根据拟南芥基因组对不同激素的响应( n e m h a u s e re ta 1 2 0 0 6 ) ，分析了a b a 、j a 等植物激素的信号通路。但是，目前仍缺乏全面的拟南 芥盐胁迫转录调控网络研究。 本研究通过对现有拟南芥耐盐性研究的整合，以反向工程方法深入分析拟南 芥盐胁迫处理基因芯片，首次构建了拟南芥盐胁迫环境下的转录调控网络，即 s o s 途径相关调控网络和全局性的盐胁迫转录调控网络。在s o s 调控网络中， 笔者预测出2 7 个转录因子，作为调控s o s 信号途径主要基因的关键节点。在全 局性的综合转录调控网络中，走通了盐胁迫下的三条重要信号途径，即m a p k 级联途径、s o s 信号途径和植物激素信号途径，此外还找出31 个最为关键的转 录因子及其下游基因，这些关键转录因子在各信号途径中起到了调控节点作用， 并以此展现不同信号途径间的交互作用。本研究所构建的盐胁迫转录调控网络， 有助于揭示拟南芥盐胁迫信号传导途径的内在调控关系，并为今后进一步剖析其 耐盐机理提供借鉴。 2 浙江大学硕士学位论文文献综述 2 文献综述 2 1 拟南芥耐盐性研究进展 近年来，随着全球环境气候的变化，土壤盐渍化问题日趋严重，并不断影响 农业生产和农业生态环境。据联合国粮农组织( f a o ) 统计，全球已超过8 亿公顷 陆地受到盐渍化的影i i 向j ( m u n n sa n dt e s t e r2 0 0 8 ) ，已超过了全球陆地总面积的 6 。在我国，有近三分之一的可用耕地受到不同程度的盐渍化影响，随着城市 化进程的加快和工业污染的加剧，我国土壤次生盐渍化还在不断扩大。 土壤盐渍化对作物的危害主要有两方面( m l 肿, t s2 0 0 2 ；n i oe ta 1 1 9 9 5 ； t e s t e ra n dd a v e n p o r t2 0 0 3 ；w a n ge ta 1 2 0 0 3 ) ：一是土壤中过高的盐分浓度会对 植物根部产生渗透压胁迫，使植物细胞脱水，并导致营养物质缺失；另一方面， 植物组织内部盐浓度积累过高后会对细胞产生n a + 毒害作用，影响植物的生长和 发育，甚至导致植物死亡。因此，研究植物的耐盐性机理，提高植物在盐渍土壤 中的耐盐适应性具有非常重要的现实意义。 拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 医 其独特的遗传学和生物学特。陛( s o m e r v i l l e a n dk o o r n n e e f2 0 0 2 ) ，被广泛应用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的 研究。近几十年来，随着分子生物学和基因工程技术的发展，对拟南芥响应盐胁 追的研究，已有突破性进展并逐渐形成体系。本文针对目前拟南芥耐盐性的研究 进展，分别从盐胁迫信号感受体、信号传导途径和基因表达三方面进行概述。 2 1 1 盐胁迫信号的感知 植物对盐胁迫信号的感受首先由细胞膜上的感受因子感知，进而对胁迫信号 进行转化传递，胁迫信号的感受能力直接关系到植物的耐盐性能。但到目前为止， 仍没有任何蛋白质或生物分子被确定为渗透压或盐离子胁迫的感应因子。 很多学者对酵母渗透压胁迫的感受因子进行深入分析，并从中寻找植物胁迫 感受因子的相关答案。在酵母中，s l n i 矛n s h 0 1 这两种蛋白能感受到渗透压胁迫 信号( r e i s e re ta l2 0 0 3 ) ，并通过h o g ( h i g h 。o s m o l a r i t yg l y c e r 0 1 ) 的m a p 麟径进 行信号传导。拟南芥的a t h k l 是s l n l 的同源蛋白，它属于跨膜蛋白激酶，含有 膜相关激活通道( m e m b r a n e a s s o c i a t e ds t r e t c ha c t i v a t e dc h a n n e l ) ，被认为是拟南芥 渗透压胁迫的假定感受因子。有学者为此进行了实验，证实了a t h k l 能在酵母 3 浙江大学硕士学位论文 文献综述 s l n i 缺陷的突变体中感受渗透压胁迫( u r a oe ta 1 1 9 9 9 ) 。拟南芥的细胞分裂素接 受体c r e l ( c y t o k i n i nr e s p o n s e1 ) ，在结构上与s l n l 存在相似之处，有相同的结合 区域，也被假定为胁迫的感受因子( r e i s e r e ta 1 2 0 0 3 ) 。不过，拟南芥的这些假定 渗透压感受蛋白目前仍未得到确切的实验证明。 对于盐离子胁迫的感受因子，目前的研究更少。n a + 可能在细胞外被跨膜蛋 白感知，也可能在细胞质内被n a - 敏感活性酶感知。z h u 等人认为质膜上的n a + h t + 反转运子s o s l 可能是n a + 胁迫的感受因子( s h ie ta 1 2 0 0 0 ) 。s o s l 是拟南芥在离子 毒害作用中外排n a + 的功能蛋白，它含有1 0 1 2 个跨膜功能域和一个较长的亲水性 尾基。较长的尾基往往被认为是信号感受蛋白的重要组成部分，如在酵母中，s n f 3 和r g t 2 蛋白含有与s o s l 相似的尾基，它们是葡萄糖转运的感受体蛋白( o z c a ne t a 1 1 9 9 8 ) 。但s o s l 作为n a + 感受蛋白的功能仍需进一步的实验验证。 2 1 2c a 2 + 信号通路 在盐胁迫环境下，植物细胞的c a 2 + 作为第二信使传递外界胁迫信号并调整细 胞代谢( k n i g h te ta 1 1 9 9 7 ；s a n d e r se ta l19 9 9 ) 。目前c a 2 + 信号感受和传递分子可 分为三类，分别是钙调蛋白( c a l m o d u l i n ，c a m ) ，钙依赖的蛋白激酶 ( c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ，c d p k ) 和类钙调蛋白b ( c a l c i n e u r i nb 1 i k e p r o t e i n ，c b l ) ( y a n ga n dp o o v a l a h2 0 0 3 ) ，这三类c a 2 + 感受体在盐胁迫的信号传 导中都起到非常重要的作用( z n u2 0 0 0 ) 。拟南芥在盐胁迫诱导下细胞质内c a 2 + 浓度迅速增加，并引发多条信号传递途径，包括酶活性的调节，离子通道的激活， 以及一系列基因表达的调控。 拟南芥细胞内的c a 2 + 水平往往受到钙结合蛋白的调节。钙结合蛋白在受到外 界信号刺激时被钙调蛋白酶激活，并向下游传递胁迫信号以产生磷酸化或去磷酸 化作用，在拟南芥细胞内对胁迫响应基因进行表达调控。拟南芥中响应胁迫的钙 结合蛋白主要有c a m1 、c a m 7 、a t c p1 、r d 2 0 、a t c a m b p 2 5 等( f r a n d s e ne ta 1 1 9 9 6 ；j a n ge ta 1 1 9 9 8 ；t a k a h a s h ie ta 1 2 0 0 1 ) 。有趣的是，a t c a m b p 2 5 基因在受 到渗透压胁迫后呈上调表达，但当a t c a m b p 2 5 过量表达后，拟南芥对盐胁迫反 而更为敏感，相反y c 寸a t c a m b p 2 5 进行抑制表达，会增强拟南芥的耐盐陛( p e r r u c e ta 1 2 0 0 4 ) 。这表明，a t c a m b p 2 5 是拟南芥盐胁迫过程中的负调节因子。 c b l s 也是拟南芥盐胁迫过程中c a 2 + 感受体，它们的编码蛋白往往与c i p k s 互 4 浙江大学硕士学位论文文献综述 作并影响下游响应基因的表达激活，例如，拟南芥c b l 4 ( s o s 3 ) 与c i p k 2 4 ( s o s 2 ) 之间存在蛋白质互作，结合形成复合体后调控s o s l 的表达。拟南芥中大约含有 1 0 个c b l 基因，它们有些含有e f h a n d 结构域，e f h a n d 个数的不同会影响c b l 基 因的c a 2 + 结合能力。拟南芥a t c b l l 基因能被高盐、干旱和冷害等多种胁迫信号 诱导激活( k u d l ae ta l1 9 9 9 ) ，如果把c b l l 基因敲除，植物将呈现超盐敏感性 ( a l b r e c h te ta t2 0 0 3 ) 。与其他c b l 基因不同的是，c b l io 虽然也响应盐胁迫， 但它的表达仅限于拟南芥的绿色组织，不在根部细胞表达( k i me ta 1 2 0 0 7 ；q u a n e l a l2 0 0 7 ) 。c b l l 0 也能与s o s 2 - 百作形成复合体，对细胞中的n a + 形成隔离作用。 由此可见c a 2 + 在s o s 信号转导途径中也起到了重要的作用。 在真核生物细胞中，c a 2 + a t p 酶的主要生理功能是将额外的c d + 排到细胞质 外以维持细胞内离子平衡同时终止体内信号传导( s z ee ta 1 2 0 0 0 ) ，起到离子泵的 作用。在烟草、番茄和大豆中，盐胁迫可以诱导i i a 型c a 2 + 运输泵( c h u n ge ta l2 0 0 0 ； w i m m e r se ta l1 9 9 2 ) 。有学者从拟南芥中克隆了编码c a 2 + _ a t p 酶的基因a c a 4 ， 在拟南芥幼苗置于不同浓度的n a c l 溶液2 4 d x 时后，该基因表达水平显著增加， 此外，将n 末端修饰过的a c a 4 植入酵母中并激活表达，酵母对盐胁迫的耐性也 显著增强( g e i s l e re ta 1 2 0 0 0 ) 。 2 1 3m a p k 级联反应途径 蛋白质的磷酸化和去磷酸化是植物细胞响应外界环境刺激的重要信号传导 途径。在拟南芥细胞中，促分裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ， m a p k ) 联级反应是最为重要的蛋白质磷酸化信号途径。m a p k 是丝氨酸苏氨酸 蛋白激酶的特殊家族，所有m a p k 联级反应都由三层相互关联的蛋白激酶组成。 首先，m a p k k 酶( m a p k k k ) 会对m a p k 酶( m a p k k ) 的苏氨酸丝氨酸残基进行磷 酸化激活；然后，被激活的m a p k 酶进一步对m a p 酶( m a p k ) 的苏氨酸和络氨酸 残基进行磷酸化，最终激活了整个m a p k 级联反应途径。拟南芥中大约存在2 0 个m a p k ，1 0 个m a p k k - 币n 8 0 个m a p k k k 基n ( m a p k g r o u p s2 0 0 2 ) 。在m a p k 联 级反应的下游，被激活的m a p k 元件可以进入到细胞核内，通过磷酸化激活转录 因子( t r e i s m a n1 9 9 6 ) ，兹荫些m a p k 元件也会转移到细胞质的其他位置并激活一 些特定的蛋白激酶( r o b i n s o n a n dc o b b1 9 9 7 ) 。在酵母中，约占全基因组7 的基 因在受到渗透压胁迫后。表达水平受到m a p k 途径的调控( d en a d a l e ta 1 2 0 0 2 ) 。 浙江大学硕士学位论文 文献综述 m a p k 级联途径对信号的传递首先需要对上游信号进行感知和整合，如 r o s ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) 信号( a p e la n dh i r t2 0 0 4 ；l a l o ie ta 1 2 0 0 4 ) 。m a p k 途径的激活需要通过m a p k 激酶与细胞质膜上的蛋白互作，或通过g 蛋白进行信 号感知( r o b i n s o na n dc o b b1 9 9 7 ) ，上文所提及的酵母s l n l 和s h 0 1 胁迫感受蛋 白，在接受外源胁迫信号后便通过m a p k 激酶进行下游信号传递。在酵母和哺乳 动物内，g 蛋白已被证实可以调节细胞内的m a p k k k s ( k y r i a k i sa n da v r u c h 2 0 0 1 ) 它是质膜上的感受蛋白与m a p k 信号蛋白间的偶联剂。m a p k s 在整合上 游胁迫信号后，再激活下游的响应基因，从而调整拟南芥对盐胁迫的适应。 在拟南芥中a t m e k k l 、a t m k k 2 和若干m a p k s ( a t m p k 3 ，a t m p k 4 和a t m p k 6 ) 都受到盐胁迫的激活( i c m m u r ae ta 1 1 9 9 8 ；i c h i m u r ae ta l2 0 0 0 ；m i z o g u c h ie ta 1 1 9 9 6 ；t e i g ee ta 1 2 0 0 4 ) 。有学者对拟南芥4 t m k k 2 基因进行过量表达，结果显示 a t m p k 4 和a t m p k 6 被大量激活，同时耐盐性增强( t e i g ee ta 1 2 0 0 4 ) 。此外，转录 因子c b f 2 、r a v l 、r a v 2 、m y b * nw r k y 等也都枷t m k k 2 下游被激活表达。但 如果x 寸a t m k k 2 基因进行抑制表达，相励t m p k 4 币h a t m p k 6 两个基因无法得到激 活，耐盐性也会随之降低。拟南芥盐胁迫过程中产生的r o s 信号，如h 2 0 2 ，可以 激活编码丝氨酸苏氨酸蛋白激酶的o x l l 基因，o x l l 则可以激活下游基因 a t m p k 3 和a t m p k 6 ( m o o ne ta 1 2 0 0 3 ；r e n t e le ta 1 2 0 0 4 ) 的表达。对动t m p k 3 和 a t m p k 6 的表达，也有人预测是通过，4 ，p ，( 即a 纠尸：k k 目在r o s 信号下激活而产生 ( k o v t u ne ta 1 2 0 0 0 ) 。当拟南芥转入彳p 基因并过量表达时，还能找到两个重要 下游基因g s 巧和月印j 8 2 被激活表达。但如果a n p l 蛋白的a t p 结合位点处任何 一个氨基酸发生突变，都无法激活这g s t 6 或h s p l 8 2 基i 因( k o v t t me ta 1 2 0 0 0 ) 。 迄今为止，拟南芥中的m a p k 蛋白激酶仅有一半功能已知，被广泛关注的 m p k 3 、m p k 4 和m p k 6 蛋白在多种环境胁迫下都能响应，如，m p k 6 参与了 h 2 0 2 、a b a 、j a 等多条信号通路的基因表达。有酵母双杂交实验证明，m p k 3 、 m p k 4 和m p k 6 与m k p l 之间存在蛋白质互作。对拟南芥m 助j 突变体进行研究 发现m k p l 可以负调节n 矿旷的反向转运蛋白a t c h x l 7 ( u l me ta l2 0 0 2 ) ，但正 常环境下，a t _ m k p l 对植物体没有伤害作用或其他负面影i i 晌j ( u l me ta l2 0 0 1 ) ，因 此有人进一步认为，m k p l 可能通过m p k 4 对盐胁迫存在负调控。 a t n d p k 2 是清除r o s 信号的重要基因( m o o n e ta 1 2 0 0 3 ) ，它的编码蛋白与 6 浙江大学硕士学位论文 文献综述 a t m p k 3 、6 间存在互作关系。在盐胁迫环境下，拟南芥a t n d p k 2 基因过量表达 的突变体r o s 量明显少于野生型，且耐盐性以及其他环境胁迫的耐性都明显增 强。但如果a t n d p k 2 缺失，会影响到a t m p k 3 和a t m p k 6 的功能，因此，a t n d p k 2 是植物环境胁迫下m a p k 级联途径的重要调控元素。 由以上所述可知，m a p k 级联反应途径是植物盐胁迫环境下调节生理代谢 过程中非常重要的信号传导途径之一。 2 1 4s o s 信号转导途径和离子平衡体系 2 1 4 1n a + 毒害作用和离子平衡 植物对盐胁迫的响应过程非常复杂，原因之一是高浓度盐溶液既对植物细胞 产生渗透压胁迫，又产生离子毒害作用( h a s e g a w ae ta 1 2 0 0 0 ；n i ue ta 1 1 9 9 5 ) 。 n a + 积累过多，对大多数生物体都是有害的( p a r d oe ta l2 0 0 6 ) ，除个别耐盐性极 强的生物外，如盐杆菌、盐土植物。植物生理学研究表明，n a + 积累过多不仅对 细胞质产生毒害作用，同时还会影响其他离子的吸收( t e s t e ra n dd a v e n p o r t 2 0 0 3 ) ，如k + ，从而打破细胞内n a + k + 的平衡比例，影响植物的正常生理代谢。 此外，n a + 还会抑制细胞内绝大多数酶的活陛( h a s e g a w ae ta 1 2 0 0 0 ) 。 z h u 等人提出的s o s ( s a t to v e r l ys e n s i t i v e ) 信号传导途径( z w o2 0 0 2 ) ，是目前 研究较为广泛的离子平衡系统。他们通过s o s 盐超敏感突变体的方法，找到拟南 芥中s o s l 、s o s 2 、s o s 3 等重要耐盐基i 困( l i ue ta 1 2 0 0 0 ；l g ja n d z h u1 9 9 8 ；s h ie t a 1 2 0 0 0 ) 。拟南芥通过s o s 信号转导途径调节体内n a + 浓度，维持离子平衡。s o s 信号转导途径有三种不同的作用方式，分别为：( 1 ) n a + 限制吸收；( 2 ) n a + 外排作 用；( 3 ) n a + 隔离作用。 2 。1 4 2n a + 限制吸收 n a + 进入植物细胞有两种方式，分别是非选择性阳离子通道( n o n s e l e c t i v e c a t i o nc h a n n e l s ) 和离子转运蛋白的运输( m a s e re ta l2 0 0 2 ；r u se ta 1 2 0 0 1 ) 。n a + 在通过非选择性阳离子通道时受至u c a 2 + 信号的调节，但具体的调节机理和离子通 道的感受蛋白至今尚不明确。n a + 的转运蛋白主要有f i k t l 、k u p 和h a k 等，它 们通过k + 通道将n a + 转运至细胞内。由于h k t l 、k u p 和h a k 同样也是k + 转运蛋 白，当n a + 浓度的增加时将抑制这些蛋白对k + 的运输，从而影响到体内n a + k + 平 衡( f ua n dl o a n1 9 9 8 ；s a n t a m a r i ae ta 1 1 9 9 7 ) 。z h u 等人预测，s o s 体系中的 7 浙江大学硕士学位论文 文献综述 s o s 3 或其他蛋白会对h k t l 等运输蛋白起到抑制作用，从而降低细胞内n a + 的浓 度( z h u2 0 0 3 ) 。此外，c 转运蛋白在盐胁迫过程中被转录因子上调表达，使得细 胞内k + 比例回升。 2 1 4 3n g c b 排作用 在盐胁迫环境下，拟南芥n a + 的外排作用主要依靠质膜上的n a + h + 反转运子。 在拟南芥中，质膜上的n a + h + 反转运子由s o s l 基因编码( s h ie ta l2 0 0 0 ) ，它的重 要功能就是将细胞质中的额c b n a + 排出，且活性受n s o s 2 s o s 3 复合体的调节。 质膜上的h + - a t p 酶在n a + 外排过程中提供能量来源，如a h a 4 ( v i t a r te ta l2 0 0 1 ) 。 s o s l 含有一段保守功能域，与细菌和真菌中的n 棚反转运子相似。拟南芥s o s l 突变体在1 0 0m mn a c i 溶液中表现出超盐敏感性( s i ne ta 1 2 0 0 0 ) ，且在细胞内积 累的n a + 远多于野生型植株。当拟南芥s o s l 基因过量表达时，它的耐盐性能显著 增强，茎部细胞内的n a + 积累明显少于野生型植株。s o s 2 基因编码一个丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶，它的n 末端有一个催化结构域，c 末端含有一段f i s l 基序的调 控结构域。s o s 2 的主要功能是维持体内离子平衡，它能通过c 末端的f i s l 基序与 s o s 3 结合( l i ue ta l2 0 0 0 ) 。s o s 3 ( a t c b l 4 ) 编码类钙调蛋b ( c a l c i n e u r i nb l i k e p r o t e i n ) ，能够感受细胞中的c a 2 + 信号，并向下游传递盐胁迫信号。酵母双杂交实 验显示，s o s 3 激活s o s 2 蛋白酶后，与其结合形成s o s 2 s o s 3 复合体，并通过磷 酸化作用，激活s o s l 自q 表达( q i ue ta 1 2 0 0 2 ) 。拟南芥s o s 2 或s o s 3 突变体在盐胁迫 环境下，s o s l 的表达量明显减少，这进一步证明了s o s l 的表达受至u s o s 2 s o s 3 的激活。因此，在拟南芥n a + 的外排过程中，离子反转运体起到了不可替代的作 用。 2 。1 。4 4n a + 区域隔离作用 在植物体中，液泡对细胞质的离子平衡有着重要的影响。在盐胁迫环境下， 植物除了将额外的n a + 排除到原生质体外，还可将n a + 隔离至细胞的液泡中。在 拟南芥细胞内，对n a + 起隔离作用的是液泡膜n a + h + 反转运子( a p s ee ta 1 1 9 9 9 ) 。 通过h + 位移酶( h + - t r a n s l o c a t i n ge n z y m e s ) 、一a t p 酶和旷无机磷酸酶 ( h + i n o 唱a n i cp y r o p h o s p h a t a s e ，矿p p i a s e ) 等作用产生质子原动力( f u k u d ae ta t 2 0 0 4 ) ，n a + h + 反转运子将细胞质中的n a + 转运到液泡中，并将h + 排至细胞质中 以维持液泡膜内外的电势平衡。矿a t p 酶、h + - p p i a s e 等在n a + 隔离过程中也起 浙江大学硕