（作物遗传育种专业论文）淀粉合成相关基因转化籼型杂交稻亲本及育种利用研究.pdf

摘要 淀粉是稻米的最主要成分，包括直链淀粉和支链淀粉，其比例是决定稻 米食昧品质最重要的因素。研究表明：在淀粉生物合成过程中，决定淀粉组 成和比例的关键酶有3 种，分别是结合型淀粉合成酶( 6 b s s ) 、可溶性淀粉 合成酶( s s s ) 和淀粉分支酶( r b e ) ；g b s s 控制直链淀粉合成、由w a x y 基因 编码、s s s 、r b e 协同控制支链淀粉合成，分别由s s s 基因和r b e 基因编码。 本项目分别将s s s 基因和r b e l 基因导入籼型杂交稻恢复系明恢8 6 和保持系 珍汕9 7 b ，并研究其遗传表达及其在杂交稻配组上的利用。主要结果如下： 1 、建立了籼稻恢复系明恢8 6 和保持系珍汕9 7 b 的根农杆菌介导的遗传 转化体系。以水稻花后1 5 天的幼胚为材料，诱导胚性愈伤，以3 - 6 代的胚性 愈伤为转化受体材料，经4 天预培养，高浓度农杆菌( o d 。2 0 ) 侵染3 0 分 钟，共培养3 天后进行选择筛选，约一个月后长出抗性愈伤，抗性愈伤经进一 步筛选，存活的愈伤转入分化培养基中，2 0 - 3 0 天分化成小苗； 2 、将s s s 基因、r b e l 基因导入明恢8 6 和珍汕9 7 b ，共获得转基因克 隆3 6 1 个。其中：转r b e l 明恢8 6 有6 0 个克隆、转s s s 明恢8 6 有1 0 1 个克 隆、转r b e l 珍汕9 7 b 有3 0 个克隆、转s s s 珍汕9 7 b 有2 8 个克隆； 3 、转基因水稻后代中，约2 5 的转化克隆呈现单基因分离，其余为高比 率分离或偏分离；分子杂交结果证明：异常分离的克隆为多拷贝整合；外源 基因一旦稳定整合在水稻基因组中，其后代能够稳定遗传； 4 、r t - p c r 检测结果表明，转r b e l 基因纯合株系灌浆期m r n a 转录水平 增强：转基因水稻灌浆期胚乳s s s 酶活性、r b e 酶活性增强，进一步验证外源 基因在水稻胚乳中的特异表达： 5 、研究筛选出直链淀粉含量显著降低的转基因株系，从转r b e l 基因的 明恢8 6 中，筛选出7 个直链淀粉含量显著降低的纯合株系，降幅最大的株系 为8 6 r f 3 8 3 一卜1 直链淀粉为8 8 ，比对照的1 6 8 相对下降了3 1 2 ； 从转s s s 基因的明恢8 6 中筛选出1 0 个直链淀粉含量显著降低的纯合株 系，其中降幅最大的株系8 6 s f 5 3 - 1 - 1 1 直链淀粉含量为8 2 ，比对照的1 2 8 相对下降了3 5 9 ； 从转r b e l 基因的保持系珍汕9 7 b 中，筛选出9 个直链淀粉含量显著降低 的纯合株系，降幅最大的株系z b r f 5 5 4 3 - 1 直链淀粉为1 7 8 ，比对照的 2 5 5 降低了2 9 8 ； 从转s s s 基因的保持系珍汕9 7 1 tl j 】，筛选出1 2 个直链淀粉含量显著下降 的纯合株系，降幅最大的株系z i i s f 4 1 - 3 - 1 - 1 直链淀粉为1 8 8 ，比对照的 2 7 3 1 下降了3 1 1 。 6 、研究筛选出胶稠度较软的转基因水稻株系 从转r b e l 基因的明恢8 6 中筛选出胶稠度显著低于对照的8 个株系，变 幅最大的株系为8 6 r f 7 3 一卜1 ，米胶长度为9 4 m m ，比对照的5 1 岫相对长8 4 3 ； 从转s s s 基因的明恢8 6 中筛选出胶稠度显著低于对照的8 个株系，变幅 最大的株系为8 6 s f 5 3 一卜1 ，其米胶长度为7 3 r a m ，比对照的4 8 m m 相对长5 2 o ： 从转r b e l 基因的保持系珍汕9 7 b 中未筛选出稻米淀粉胶稠度显著软于对 照的株系； 从转s s s 基因保持系珍汕9 7 b 中筛选出胶稠度显著低于对照的1 0 个株 系，变幅最大的株系为z b s f l 卜2 - 1 ，其米胶长度为6 7 m m ，比对照的3 4 n u n 相 对长9 7 o 。 7 、转基因水稻产量性状的研究 在转r b e l 基因明恢8 6 的7 个直链淀粉含量显著降低的纯合株系中， 有6 个栋系的产量性状显著高于对照； 在转s s s 基因明恢8 6 的1 0 个直链淀粉含量显著降低的纯合株系中， 有5 个株系的产量性状显著高于对照； 在直链淀粉含量显著下降的转r b e i 基因珍汕9 7 b 和转s s s 基因珍汕9 7 1 3 纯合株系中，未筛选出产量性状优于对照的转基因株系： 8 、转基因明恢8 6 的配组研究 与珍a 配制的1 2 个组合中，有7 个组合直链淀粉含量显著低于对照； 降低幅度最大的组合( 珍a 8 6 r f 6 8 1 2 2 ) 为1 7 8 ，比对照的2 2 5 相对 降低2 0 8 ；11 个组合的理论产量显著高于对照： 与i i 一3 2 a 配制的1 9 个组合中，测定了1 3 个组合的直链淀粉含量，有 1 0 个组合直链淀粉显著低于对照；降低幅度最大的组合 ( i i 一3 2 a 8 6 s f 3 5 2 2 2 ) 为8 5 ，比对照的2 1 9 相对降低6 1 1 ；9 个组 合的理论产量显著高于对照； 与d 6 2 a 配制的1 6 个组合中，测定了9 个组合的直链淀粉含量，有5 个 组合直链淀粉显著低于对照；降低幅度最大的组合( d 6 2 a 8 6 r f 5 0 2 2 2 ) 为1 4 2 ，比对照的1 7 1 相对降低1 6 9 ：3 个组合的理论产量显著高于对 照： 与粤a 配制的5 个组合中，测定了4 个组合的直链淀粉含量，4 个组合 直链淀粉显著低于对照：降低幅度最大的组合( 粤a 8 6 s f 3 5 2 2 - 1 ) 为9 7 ， 比对照的1 6 7 相对降低4 1 9 ；所有组合理论产量均不如对照。 综上所述，从转明恢8 6 配制的5 2 个组合中，产量性状显著高于c k ，同 时直链淀粉含量又显著低于c k 的组合有1 3 个。其中以“珍 a ，8 6 r f 6 8 1 2 - 2 ”、“1 i 3 2 a ，8 6 s f 7 0 1 】2 ”、“i i 一3 2 a 8 6 s f 5 3 2 2 一l ”三个 组合最为突出。 关键词：籼稻：转基因；直链淀粉：可溶性淀粉合成酶基因( s s s ) 支链淀粉合成酶基因( r b e i ) a b s t r c t s t a r c hi st h em a j o rc o n s t i t u e n ti nm i l l e dr i c e i ti n c l u d e s a m y l o s ca n d a m y l o p e c t i n ，t h ep r o p o r t i o no fw h i c hd e t e r m i n e st h ec o o k i n ga n de a t i n gq u a l i t yo f m i l l e dr i c e d u r i n gs t a r c hb i o s y n t h e s i s ，t h ek e ye n z y m e st h a tc o n t r o lt h e p r o p o r t i o no fa r n y l o s et oa m y l o p e c t i na r eg r a n u l e b o u n ds t a r c hs y n t h a s ei ( g b s s ) s o l u b l es t a r c hs y n t h a s e ( s s s ) a n ds t a r c hb r a n c h i n ge n z y m e ( s b e ) o ft h et h r e e e n z y m e s ，g b s si s c o d e db yw a x ya n dd i r e c t sa m y l o s eb i o s y n t h e s i s ；s s sa n d r b e c o d e db ys s sa n dr b er e s p e c t i v e l y , t o g e t h e ra r ei nc h a r g eo fa m y l o p e c t i n b i o s y n t h e s i s t h i sr e s e a r c ht r a n s f e r r e dt h es s sa n dr b e lt oi n d i c ah y b r i dr i c e ( o r y z as a t i v al ) r e s t o r e rl i n em i n g h u i 8 6a n dm a i n t a n c el i n ez h e n g s h a n 9 7 b ，a n d s t u d i e dt h e i ri n h e r i t a n c e e x p r e s s i o na n dr e l e v a n tu t i l i z a t i o ni n h y b r i d r i c e c o m b i n a t i o n s t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l i o w s ： ( 1 ) e s t a b l i s h e da g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o ns y s t e m sf o rb o t h m i n g h u i 8 6 a n d z h e n g s h a n 9 7 b s e l e c tj u v e n i l ee m b r y o 15 d a y s a f t e rr i c e f l o w e r i n ga se x p l a n t st oi n d u c ee m b r y o g e n e s i sc a l l i ；f o l l o w i n g3t o6g e n e r a t i o n s o fc u l t u r e s ，t h ee m b r y o g e n i cc a l l ia r eu s e da st r a n s f o r m a t i o nm a t e r i a la n d p r c c u h u r e d f o r4 d a y s i m m e r s e d i n h i g h c o n c e n t r a t i o no f a g r o b a c t c r i a ( o d 6 0 0 2 0 ) f o r3 0m i n u t e s ，a n dc o c u l t u r e df o r3d a y si nc o c u l t u r em e d i a ，t h ec a l l i a r es c r e e n e db yh y g r o m y c i n a f t e ra b o u to n em o n t h ，r e s i s t a n tc a l l ic o m eo u ta n d t h e y a r ef u r t h e rs c r e e n e dh i i g hc o n c e n t r a t i o no fh y g r o m y c i n t h ec a l l it h a t s u r v i v e df i n a l l ya r et h u st r a n s f e r r e dt od i f f e r e n t i a t i o nm e d i at og r o wp l a n t l e t ( 2 ) t r a n s f e r r e ds s sa n dr b e lt om i n g h u i 8 6a n dz h e n g s h a n 9 7 ba n do b t a i n e d 2 19t r a n s g e n i cc l o n e s o ft h e s et r a n s g e n i cc l o n e s ，6 0w e r em i n g h u i 8 6t r a n s f e r r e d w i t hr b e l 1 0 1m i n g h u i 8 6t r a n s f e r r e dw i t hs s s 、3 0z h e n g s h a n 9 7 bw i t hr b e la n d 2 8z h e n g s h a n 9 7 bw i t hs s s ( 3 ) i nt h ep r o g e n yo f t r a n s g e n i cr i c e ，a b o u t2 5 e x h i b i t e dm o n o g e n i c ( 单基因 分离1s e g r e g a t i o n ，a n dt h er e s ts e g r e g a t e do nt h eb a s i so fh i g hr a t es e p a r a t i o no r d i s t o r t i o n t h em o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o nr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec l o n e sw h i c h s e g r e g a t e da b e r r a n t l yw e r em u l t i c o p yi n t e g r a t i o na n dt h a t i fi n t e g r a t e di n t or i c e g e n o m e ，t h eg e n e sc o u l db es t a b l yi n h e r i t e di np r o g e n y ( 4 ) r t - p c rd e t e r m i n a t i o nr e s u l t si n d i c a t e dt h a tr b e lt r a n s c r i p t i o nl e v e lw a s e n h a n c e di nt r a n s g e n i cp u r el i n e sd u r i n gs e e df i l l i n gs t a g e ，a n dt h a ts s sa n dr b e h a dg r e a t e re n z y m ea c t i v i t yi nt r a n s g e n i cr i c ef o rt h ep e r i o do ff i l l i n gs t a g e ， f u r t h e rv e r i f y i n gb o t ho f g e n e ss p e c i f i ce x p r e s s i o ni nr i c ee n d o s p e r m ( 5 ) s c r e e n e da n dr e s e a r e h e d t r a n s g e n i c l i n e sw i t ha m y l o s ec o n t e n t s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d 7p u r el i n e sw i t hs i g n i f i c a n t l yl o w e r e da m y l o s ec o n t e n t w e r es c r e e n e di nm i n g h u i 8 6t r a n s f e r r e dw i t hr b e l 8 6 r f 3 8 3 1 - 1 ，t h ep u r e1 i n e t h a tr e d u c e da m y l o s ec o n t e n tm o s tm a r k e d l y , h a saa m y l o s ec o n t e n to f8 8 d e c r e a s i n g31 2 r e l a t i v e l yc o m p a r e dt oc o n t r o l sc o n t e n t ( w h i c hi s16 - 8 1 10p u r el i n e sw i t hs i g n i f i c a n t l yl o w e r e da m y l o s ec o n t e n tw e r es c r e e n e di n m i n g h u i 8 6t r a n s f e r r e dw i t hs s s 8 6 s f 5 3 一l - 1 1 t h ep u r el i n et h a tr e d u c e da m y l o s e c o n t e n tm o s tm a r k e d l y , h a sa a m y l o s ec o n t e n to f8 2 ，d e c r e a s i n g 3 5 9 r e l a t i v e l yc o m p a r e dt oc o n t r o l sc o n t e n t ( w h i c hi s12 8 、 9p u r el i n e sw i t hs i g n i f i c a n t l yl o w e r e da m y l o s ec o n t e n tw e r es c r e e n e di n z h e n g s h a n 9 7 bt r a n s f e r r e dw i t hr b e l z b r f 5 5 4 3 1 t h ep u r e1 i n et h a tr e d u c e d a m y l o s ec o n t e n tm o s tm a r k e d l y , h a saa m y l o s ec o n t e n to f17 8 d e c r e a s i n g 2 9 8 r e l a t i v e l yc o m p a r e dt oc o n t r o l sc o n t e n t f w h i c hi s2 5 5 1 12p u r el i n e sw i t hs i g n i f i c a n t l yl o w e r e da m y l o s ec o n t e n tw e r es c r e e n e di n z h e n g s h a n 9 7 bt r a n s f e r r e dw i t hs s s z b s f 4 1 3 1 1 t h ep u r el i n e t h a tr e d u c e d a m y l o s ec o n t e n tm o s tm a r k e d l y , h a saa m y l o s ec o n t e n to fl8 8 d e c r e a s i n g 3 1 1 r e l a t i v e l yc o m p a r e d t oc o n t r o l sc o n t e n t ( w h i c h i s2 7 3 1 、 ( 6 ) s c r e e n e da n dr e s e a r c h e dt r a n s g e n i cl i n e sw i t hs o f t e rg e lc o n s i s t e n c y 8 p u r el i n e sw i t hs i g n i f i c a n t l ys m a l l e rg e lc o n s i s t e n c yw e r es c r e e n e d i n m i n g h u i 8 6t r a n s f e r r e dw i t hr e b l 8 6 r f 7 3 1 1 t h ep u r e1 i n e st h a tr e d u c e d a m y l o s ec o n t e n tm o s tm a r k e d l y , h a v eag e lc o n s i s t e n c yo f9 4 m m ，r e l a t i v e l y 8 4 _ 3 l o n g e rt h a nc o n t r o l sg e l c o n s i s t e n c y rw h i c hi s5 1 m m ) 8p u r el i n e sw i t hs i g n i f i c a n t l ys m a l l e rg e lc o n s i s t e n c yw e r es c r e e n e di n m i n g h u i 8 6t r a n s f e r r e dw i t hr e b l 8 6 s f 5 3 1 1 t h ep u r el i n et h a tr e d u c e da m y l o s e c o n t e n tm o s tm a r k e d l y , h a sag e lc o n s i s t e n c yo f7 3 m m r e l a t i v e l y 5 2 o l o n g e r t h a nc o n t r o l sg e l c o n s i s t e n c y ( w h i c hi s4 8 m m ) n op u r el i n eo fs i g n i f i c a n t l ys m a l l e r g e lc o n s i s t e n c yw a ss c r e e n e d i n z h e n g s h a n 9 7 bt r a n s f e r r e dw i t hr b e l 1 0p u r el i n e sw i t hs i g n i f i c a n t l ys m a l l e rg e l c o n s i s t e n c yw e r es c r e e n e di n z h e n g s h a n 9 7 bt r a n s f e r r e dw i t hs s s z b s f l l 2 i - t h ep u r e1 i n et h a tr e d u c e d a m y l o s ec o n t e n tm o s tm a r k e d l y ，h a sag e lc o n s i s t e n c yo f6 7m m ，r e l a t i v e l y 10 9 3 l o n g e rt h a nc o n t r o l sg e l c o n s i s t e n c y ( w h i c hi s3 4 m m ) ( 7 ) r e s u l t so f y i e l di n v e s t i g a t i o nf o r t r a n s g e n i cr i c ei n d i c a t e d ： 6o ft h e7p u r el i n e sw i t hs i g n i f i c a n t l yl o w e r e da m y l o s ec o n t e n ti nm i n g h u i 8 6 t r a n s f e r r e dw i t hr b e lh a dh i g h e ry i e l dt h a nt h ec o n t r 0 1 5o ft h e10 p u r e l i n e sw i t h s i g n i f i c a n t l y l o w e r e da m y l o s ec o n t e n t i n m i n g h u i 8 6t r a n s f e r r e dw i t hs s sh a dh i g h e ry i e l dt h a nt h ec o n t r 0 1 n op u r el i n eo fs i g n i f i c a n t l yh i g h e ry i e l dw a ss c r e e n e di n z h e n g s h a n 9 7 b t r a n s f e r r e dw i t hr b e lo rz h e n g s h a n 9 7 bt r a n s f e r r e dw i t hs s s ( 8 ) r e s u l t so f c o m b i n a t i o nr e s e a r c ho f t r a n s g e n i cm i n g h u i 8 6i n d i c a t e d ： c o m b i n e dw i t hz h e n s h a n 9 7 a 。7o ft h e12c o m b i n a t i o n sh a ds i g n i f i c a n t l y l o w e r a m y l o s e c o n t e n ti n f i g r a i n z h e n g s h a n 9 7 a 8 6 r f 6 8 1 - 2 2 t h e c o m b i n a t i o nt h a tr e d u c e da m y l o s ec o n t e n tm o s tm a r k e d l y , h a daa m y l o s ec o n t e n t o f17 8 ，d e c r e a s i n gr e l a t i v e l y2 0 8 c o m p a r e dt ot h ec o n t r o l ( w h i c hi s2 2 5 ) 1 lc o m b i n e r sh a dh i g h e ry i e l dt h a nt h ec o n t r 0 1 c o m b i n e dw i t hi i 一3 2 a 1 3o ft h e 1 9c o m b i n a t i o n sh a ds i g n i f i c a n t l yl o w e r a m y l o s ec o n t e n ti nf lg r a i n i i 3 2 a 8 6 s f 5 3 2 2 1 t h ec o m b i n a t i o nt h a tr e d u c e d a m y l o s ec o n t e n tm o s tm a r k e d l nh a daa m y l o s ec o n t e n to f8 5 d e c r e a s i n g r e l a t i v e l y2 1 o c o m p a r e dt ot h ec o n t r 0 1 ( w h i c hi s 2 1 9 、9c o m b i n e r sh a d h i g h e ry i e l dt h a nt h ec o n t r 0 1 c o m b i n e dw i t hd 6 2 a 5o ft h e16c o m b i n a t i o n sh a ds i g n i f i c a n t l yi o w e r a m y l o s ec o n t e n ti nf lg r a i n d 6 2 a 8 6 r f 5 0 2 2 2 t h ec o m b i n a t i o nt h a tr e d u c e d a m y l o s ec o n t e n tm o s tm a r k e d l y , h a da na m y l o s ec o n t e n to f14 2 d e c r e a s i n g r e l a t i v e l y1 6 9 c o m p a r e dt ot h ec o n t r o l ( w h i c hi s 1 7 1 、3c o m b i n e r sh a d h i g h e ry i e l dt h a nt h ec o n t r 0 1 c o m b i n e dw i t hy u e a ，4o ft h e5 c o m b i n a t i o n sh a ds i g n i f i c a n t l y1 0 w e r a m y l o s ec o n t e n ti nf ig r a i n y u e a 8 6 s f 3 5 2 2 一l ，t h ec o m b i n a t i o nt h a tr e d u c e d a m y l o s e c o n t e n tm o s tm a r k e d l y , h a da m y l o s ec o n t e n to f9 7 d e c r e a s i n g r e l a t i v e l y4 1 9 c o m p a r e dt ot h ec o n t r o l ( w h i c hi s 1 6 7 1 a l lc o m b i n e r sh a d 1 0 w e ry i e l d 也a nt h ec o n t r 0 1 i ns u m o ft h et o t a l5 2c o i n b i n a t i o n st h e r ew e r e13c o m b i n a t i o n sw i t hh i g h e r y i e l d a n dl o w e ra n a y l o s ec o n t e n ta sw e l l c o m p a r e d t ot h ec o n t r 0 1 t h r e e c o m b i n a t i o n si e z h e n g s h a n 9 7 a 8 6 r f 6 8 1 2 2 i i 一3 2 a 8 6 s f 7 0 一 一1 2 i 一3 2 a 8 6 s f 5 3 2 2 一l ”h a db e s tp e r f o m a a n c ei nb o t hr e s p e c t s k e ww o r d s ：l n d i c ad e e ，t r a n s g e n e ，a m y l o p e c t i n ，b r e e d i n gu t i l i z a t i o n ，s o l u b l e s t a r c hs y n t h a s eg e n e ( s s s ) ，s t a r c hb r a n c h i n ge n z y m eg e n e ( r b e ) s s t 。 t l t e s t a r c hs y n t h a s e 淀粉合成酶 r e g e n e r a t i o np l a n t so ft r a n s f o r m s 转基因当代植株 f i r s tp r o g e n i e so ft r a n s g e n i c p l a n t s 转基因后代痢一1 - 4 t 。i s b o r a t ee l e c t r o p h r o s i sb u f f e r t r is e d t a 缓冲液 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文j 是在指导教师的指导下、 通过我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作 了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写 过的研究成果与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明 确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为由本人承 担应有的责任 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 论文使用授权的说明 日瓤盯上 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规 定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅彝借河：擎覆可以 公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或葬他复制手襄保存 论文 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名 指导教师亲笔签名 日期：0 3 ； 日甥：。j 6 ； 引言 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界有近一半的人口以大米为 主食。联合国粮农组织明确提出“稻米就是生命( r i c ei sl if e ) ”。稻米 也是我国最重要的粮食作物，稻米的产量和品质关系到我国经济生活的弘 ：多 方面，也关系到我国社会的稳定。 产量、品质、抗性是水稻育种的三大目标。相对于产量和抗性，品质所 包含的内容多，稻米的品质包含加工品质、外观品质、蒸煮和食昧品质以及 营养品质等四个方面，其中蒸煮和食味品质是品质中最重要的内容。而评价 蒸煮和食昧品质最重要的指标是直链淀粉含量、胶稠度和糊化温度等( 图1 ) 。 由于品质包含的性状多、遗传复杂、涉及的影响因素多，常规育种技术进行 水稻品质改良针对性差、周期长、效率低。 图1 水稻育种目标及品质构成因素 f i 9 1 r i c eb r e e d i n gt a r g e ta n dq u a l i t yc o n s t r u c t u r e 近年来分子生物学的迅速发展，对影响稻米品质眭状的主要基因相继发 现和克隆，国内外许多遗传育种学家以及分子生物学专家纷纷提出将现代生 物技术应用于稻米的淀粉品质改良，以克服传统育种技术改良品质的局限性。 品质改良基因工程相对于其它如抗病虫基因工程育种来讲，研究更为困 难，因为其涉及性状较多，每一性状涉及的基因数也多。如水稻灌浆期胚乳 中与淀粉合成的酶就有1 8 种( n a k a r n u r a ，e ta l1 9 8 9 ) ；其中关键酶有4 种， 分别为腺苷酸葡萄糖磷酸化酶、结合型淀粉合成酶、可溶性淀粉合成酶和淀 粉分支酶；腺苷酸葡萄糖磷酸化酶合成淀粉的底物、结合型淀粉合成酶控制 直链淀粉合成由w a x y 基因控制、可溶性淀粉合成酶和淀粉分支酶协同合成 支链淀粉分别由s s s 基因和r b e 基因控制。近年来利用转基因技术改良稻米等 粮食作物的研究已逐步成为继植物抗病虫基因工程之后的一个重要的研究方 向和研究热点。 本研究主要针对我囡水稻特别足籼型杂交稻米品质差、直链淀粉含量高、 改良难度大的实际情况，通过转基因技术，将2 个控制支链淀粉合成关键酶 基因导入籼稻重要亲本，探讨外源基因对水稻品质及产量的影响，探索改良 高产水稻品种品质的方法和途径。 第一章文献综述 1 稻米淀粉品质及遗传 1 1 稻米品质的概念及内涵 从育种学角度，稻米的品质一般分为加工品质、外观品质、蒸煮和食味 品质以及营养品质等四个方面，加工品质主要指糙米率、精米率和整精米率 等；外观品质主要指粒型、长宽比、垩自和透明度等；蒸煮食味品质主要包 括香味、适口性、米饭粘陛、软硬度和光滑性、米饭吸水性、膨胀性、饭裂 性、结块性等；营养品质包括直链淀粉含量、蛋白质含量、必需氨基酸含量、 油份含量和香味有效成分含量等。 1 2 稻米品质评判标准 自从2 0 世纪7 0 年代后期以来，我困先后颁布了一系列有关稻谷和稻米的 评价标准，其中全国性标准主要有稻谷( g b l 3 5 ( 卜- 7 8 、g b l 3 5 0 一1 9 8 6 、 g b l 3 5 0 1 9 9 9 ) 、大米( g b l 3 5 仁1 9 8 6 ) 、优质食用稻米( n y l 2 2 8 6 ) 、优 质稻谷( g b t 1 7 8 9 1 - - 1 9 9 9 ) 等。目前采用的稻米品质评判标准主要有2 套， 一套是1 9 8 6 年由农业部颁布的稻米标准n y l 2 2 8 6 ( 简称部标) 。部标将稻米品 质指标分为水稻品种特性和商品品质两个部分。品种特性由碾米品质、外观 品质、蒸煮品质、营养品质4 个方面共1 2 项理化指标和食味品质进行综合评定： 品种特性部分按百分制综合评分，其中碾米品质1 6 分( 糙米率4 分，精米率5 分，整精米率7 分) ，外观品质2 5 分( 透明度和光泽8 分，至白粒率8 分，垩白大 小4 分，粒长2 分，粒形3 分) ，蒸煮品质2 6 分( 直链淀粉含量1 4 分，胶稠度8 分， 糊化温度4 分) ，营养品质( 蛋白质含量) 3 分，食味品质3 0 分( 气味3 分，色泽5 分、饭粒粒形和食味1 7 分，冷饭柔软性5 分) 。各项指标得分之和即为品质综 合评分，是优质米评比的主要依据。 另一套是2 0 0 0 年4 月开始实施的国家标准( 简称新国标) ，新国标规定了1 4 个优质稻谷质量指标，其中品种特性指标8 个，市场品质指标6 个。8 个品种特 性指标中，整精米率、垩白度、直链淀粉含量和食味品质( 采用百分制评分， 其中气味1 5 分、外观1 5 分、适口性6 0 分、冷饭质地1 0 分) 作为定级指标。 2 套评价标准的共同特点是：强调蒸煮食味品质，部标的蒸煮( 2 6 分) 食 昧( 3 0 分) 品质共5 6 分，新国标则将直链淀粉含量和食味品质作为定级指标。 与部标相比，新国标适度降低了加工品质( 糙米率) 和外观品质( 垩白粒率) 标 准，进一步提高了蒸煮品质( 直链淀粉含量和胶稠度) 标准，放弃了营养品质 标准。由此也显示：蒸煮食味品质的重要性日益突出，因为食味品质是稻米 最重要的特性( 杨益善等，2 0 0 4 ) 。 1 3 稻米淀粉的组成与结构 淀粉足稻米的主要成分，占精米的7 6 7 - - , 7 8 4 ，淀粉是由许多葡萄糖 分子聚缩而成的高分子聚体，分子式为( c 6 h i 0 0 5 ) n ，依分子大小和结构不 同分为直链淀粉和支链淀粉两种。直链淀粉是由a ( 1 - 4 ) 糖苷键连接的线性多 糖，其分子量一般为l 1 0 4 2 5 1 0 5 ，在稻米中的比例为o 3 5 。支链淀粉 由q d 葡萄糖通过q 。1 ，4 糖苷键形成主链，然后通过a 1 ，6 糖苷键连接的 葡萄糖形成支链，分子量一般为5 1 0 6 一lx 1 0 8 。支链淀粉根据支链的聚合度 和支链的长短又分为a 链、b 链和c 链( 顾正彪等，2 0 0 4 ) 。事实上淀粉并不完 全由直链淀粉和支链淀粉这两种极端的结构构成，淀粉分子的链是连续地从 一种状态过渡到另种状态( k a s e m s u w a nte t a l ，1 9 9 4 ) 其中还包括了一系 列轻度分支的直链淀粉、轻度分支的支链淀粉和链长极短的直链淀粉( 杨泽 敏等，2 0 0 3 ；二国二郎，1 9 9 0 ) 。也正是出于淀粉分子的多态性，给淀粉的理 化性质的准确反映增加了难度。 大部分稻米直链淀粉呈线性状态，部分直链淀粉有2 ，3 4 5 个分枝，每个 分枝链长约为1 7 3 2 0 9 个葡萄糖单位。淀粉颗粒中直链淀粉含量因品种不同 而有所差异，籼米的直链淀粉含量为2 5 4 士2 0 5 ，粳米的直链淀粉含量为 1 8 4 士1 2 7 ：糯米的直链淀粉几乎为零( o 9 8 士1 5 1 ) ( 张燕萍等，1 9 9 7 ) 。 稻米淀粉粒呈不规则的多角形，直径约为3 9 i n 8 u m 。每一个淀粉粒是由 两部分组成，由支链淀粉的分支链组成半晶体片层，支链淀粉的支链分支点 组成无定型层，直链淀粉以单螺旋结构掺入支链淀粉形成的疏密相间的半晶 体片层和无定形层问，半晶体片层和非定型层相交错形成淀粉粒中心区。组 成这些片层结构的主要是三种不同链长的支链淀粉，分别是1 2 1 6 个葡萄糖单 位的分子，4 0 个葡萄糖单位的分子和7 0 个葡萄糖单位的分子。 稻米的淀粉粒形态，与稻米的品质有关，品质较好的水稻品种，籽粒中 淀粉粒较小，呈明显的多面体晶形，棱角明显且清晰可见，排列整齐且紧密， 粒间隙极小：而品质较差的籽粒及垩白部位的淀粉粒，颗粒较大，多面体的 棱角不明显，粒间疏松，淀粉粒的大小不均匀( 季清娥等，1 9 9 8 ；符文英等， 】9 9 7 ) 。 1 4 稻米淀粉的理化性质 直链淀粉和支链淀粉比例不同，对淀粉特性产生不同的影响，淀粉的理 化特性如：淀粉的分子特性、晶体特性、热特性、粘性等主要取决于分子量 的大小、分子的形状、支链淀粉的分支度、外链长以及直链淀粉与支链淀粉 的比例等( 熊善柏等，2 0 0 3 ：赵思明等，2 0 0 2 a ，2 0 0 2 b ) 。其中与米饭质地和 食昧品