（作物遗传育种专业论文）小麦抗白粉病相关基因的克隆与分析.pdf

学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者： 徐勿毽 日期：p o o 年月日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门 或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学 可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文本人离校后发表、使用学位论文 或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学 保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者：衿红酬日期：, 2 0 o 年月1 日 摘要 摘要 小麦白粉病是由专性寄生菌禾布氏白粉菌 b l u m e r i ag r a m i n i s ( d c ) s p e e r s p t r i t i c ie m m a r c h a l ( b g t ) 引起的真菌性病害，在全世界范围均有发生。随着 施肥、灌溉等条件的改善，小麦白粉病的发病范围有蔓延的趋势，特别是在湿 度大的地区发病尤为严重。小麦从一叶期到衰老都会受到白粉菌的威胁，在生 长早期被侵染可以使小麦的分蘖大为减少，生长后期叶部或穗部被侵染会直接 影响籽粒数。改变耕作方式在一定程度上可以降低白粉病的发生，但易受到气 候等条件的影响。使用农药等化学手段虽有成效，但大面积的使用不但会增加 人力、财力和物力，更重要的是会给环境造成严重的污染，最终影响人类的健 康，所以推广抗性品种成为目前最为经济和有效的措施，但由于白粉菌生理小 种的变异速度快，单一抗性品种的抗病性很容易丧失，因此通过传统或基因工 程育种等方法培育具有多个抗病基因聚合的持久抗病品种成为抗病育种的主要 方向，而加强抗病机制的研究成为实现这一目标的工作重点。 小麦农家品种红蚰麦( 刖m ) 对本实验室所保存的白粉菌具有良好的抗病 性，表现为免疫。在前期工作中，利用红蚰麦和感病品种豫麦1 3 ( y u l 3 ) 杂交 后的f 3 代纯合抗病、感病单株分别构建抗、感池，同时设置了经白粉菌诱导和 未诱导两种处理，通过与a f f y m e t r i x 基因芯片杂交，经数据处理获得大量与抗病 反应相关的转录本。本研究以基因芯片提供的探针序列为基础，利用电子克隆 和定量p c r 等技术对其进行初步分析，得出以下结果： 1 小麦抗白粉病相关基因的克隆 选择与植物抗病反应紧密相关基因的探针序列，通过电子克隆获得目标基 因的全长d n a 序列，并根据此序列设计引物，分别在小麦感病品种豫麦1 3 和 抗病品种红蚰麦中同时成功的克隆了富含亮氨酸结构域、类受体激酶、丝氨酸 苏氨酸激酶、病程相关蛋白1 、病程相关蛋白2 和三种草酸氧化酶基因。白粉病 抗病同源基因m l o 在h y m 和y u l 3 中均被成功克隆，序列分析表明，这两条 d n a 序列只有一个核昔酸的差异，与大麦m l o 的d n a 序列相似性均高达9 0 。 氨基酸序列分析显示，二者的前1 8 个氨基酸是信号肽序列，是具有7 次跨膜结 构域的膜蛋白，4 5 1 、4 5 9 、4 6 2 、4 7 5 、4 8 3 位点为糖基化位点，在4 1 4 - - 4 3 5 位 置上的氨基酸是整个蛋白的活性中心蛋白质三维结构预测进一步表明，由于 摘要 二者具有一个核苷酸差异导致在y u l 3 中4 4 6 位上的g l y 而在h y m 中变为s e x ， 这一微小变化导致三级结构的显著差异。同时在红蚰麦中成功克隆了小麦白粉 病p m 3 b 抗病同源基因( p m 3 h y m ) ，扩增长度为4 2 0 8 b p ，具有长度为3 7 7 7 b p 的完整o r f ，编码1 2 5 8 个氨基酸，蛋白结构分析表明它具有抗病蛋白必须的 p 1 0 0 pn t p a s e 和l r r 结构域，聚类分析揭示其在所有小麦同源序列中的独特位 置，可能预示着其具有特殊的功能。以上克隆的这些基因都是与植物抗病反应 密切相关的基因，这些结果为下一步的分析奠定基础。 2 小麦抗白粉病相关基因的表达模式分析 选择p a t h o g e n e s i s r e l a t e dp r o t e i n1 2 ( p r l 2 ) 、r e c e p t o r - l i k ek i n a s ep r o t e i n ( 尉x ) 、s e r i n e t h r e o n i n ok i n a s e ( 册x ) 、与大麦同源的m l o 、与p m 3 b 同源的 p m 3 h y m 等五个基因作为研究对象，根据克隆的基因的d n a 序列设计引物，应 用定量p c r 技术分析它们在白粉菌诱导的7 2h 或9 6h 的表达趋势。结果显示 p r j 2 在h y m 中表达高峰出现在1 2h ，而在y u l 3 中的表达高峰出现在1 8h ； r l k 在h y m 中没有明显的表达高峰，在y u l 3 中表达高峰出现在2 4h ；h y m 中的s t k 在2 4h 时就出现表达高峰，而在y u l 3 中没有明显的上调表达；m l o 在y u l 3 中7 2h 时有较强的上调表达，而h y m 在1 2h 时即有上调表达；砌鲋疗m 受到白粉菌诱导后立即出现上调表达，并在1 2h 时达到表达高峰。除了p r l 2 、 r l k 的表达模式与芯片结果不一致外，其它的均与芯片一致。从以上结果可以 看出，这些基因是否被诱导表达以及表达高峰出现的早晚与抗病反应有着密切 关系。 3 小麦p m 3 b 同源基因( p m 3 h y m ) v i g s 载体的构建 为了进一步确定克隆的抗病相关基因在抗病反应中的作用，本研究拟利用 大麦条斑病毒介导的单子叶植物高效基因沉默系统对目标基因进行沉默，从而 达到验证基因功能的目的。以p m 3 h y m 作为功能验证的目标，将连接有p m 3 h y m 基因的p m d l 9 t 载体为p c r 扩增的模板，并分别扩增两个不同的d n a 区段作 为两个沉默目标，一个在编码区中间位置，另一个在m r n a 的3 端非翻译区。 随后通过酶切和连接将目标片段成功连接在v i g s 系统中的y 载体上，随后经 p c r 和酶切鉴定均正常，说明载体构建无误。本试验的主要目的是探索v i g s 操作的整个过程，从而为后续的研究工作奠定基础。 关键词：小麦白粉病抗病基因功能分析 a b s t r a c t a b s t r a c t w h e a tp o w d e r ym i l d e w ，c a u s e db yb l u m e r i ag r a m i n i s ( d c ) s p e e r s p t r i t i c i ( b g t ) ，i sf u n g a ld i s e a s eo c c u r r e da l lo v e rt h ew o r l d t h ed i s t r i b u t i o no fp o w d e r y m i l d e ww a f te n l a r g i n gb e c a u s eo ft h ei m p r o v e di r r i g a t i o na n df e r t i l i z a t i o n ，m o r e o v e r , i tw a sm o r es e v e r e l yi nt h em o i s ta r e a s t h ew h e a tc o u l db ei n f e c t e db yb g tf r o m o n e - l e a fp h a s et oo l d t i l l e r so fw h e a td e c r e a s e dw h e ni tw a si n f e c t e di nt h ee a r l y d e v e l o p m e n tp h a s e ，a n dt h en u m b e ro fs e e dr e d u c e dw h e nt h el e a v e sa n de a rw e r e i n f e c t e d p o w d e r ym i l d e wc a nb ec o n t r o l l e dt oac e r t a i ne x t e n tb yc h a n g i n gt i l l a g e p a t t e r nw h i c hw a su s u a l l yl i m i t e db yc l i m a t ea n d s oo n e f f e c t i v e l yc h e m i c a lm e t h o d s u s u a l l yi n c r e a s et h ei n p u t si n c l u d i n gm a n p o w e r , m a t e r i a la n df i n a n c i a lr e s o u r c e s ，a n d r e s u l ti ns e v e r ee n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o na n dd a m a g et oo u rh e a l t h yf o ral o n gt i m e r w a sav e r ye f f e c t i v ea n de c o n o m i c a lm e t h o df o rc o n t r o l l i n gt h ed i s e a s et op l a n t r e s i s t a n c ec u l t i v a r s b u tt h er e s i s t a n c ew a se a s i l yl o s tb e c a u s eo ft h ev a r i a t i o no fb g t p h y s i o l o g i c a lr a c e d u r a b l er e s i s t a n c ee u l t i v a r sw i t hm a n yp i ng e n e sc u l t i v a t e db y t r a d i t i o n a lo rg e n e - e n g i n e e r i n gm e t h o d sw a sm a j o rr e s e a r c h e dp u r p o s e , w h i l e ，t h e s t u d yo f r e s i s t a n c em e c h a n i s mw a st h ef o u n d a t i o n a lw o r kt oa c h i e v et h ea i m w h e a tl a n d r a c eh o n g y o u m a is h o w e d9 0 0 dr e s i s t a n c et ob t gp r e s e r v e db yt h e l a ba n dd i s p l a y e di n l n l u n e f 3h o m o g e n e o u sr e s i s t a n ta n ds u s c e p t i b l eg e n e r a t i o n s f r o mt h ec r o s so fh o n g y o u m a ixy u m a il3 ( r e s p e c t i v e l y , r e p r e s e n t e dr e s i s t a n ta n d s u s c e p t i b l ep o o l s ) w e r eu s e dt oh y b r i d 谢l 螂e n 奴g e n ec h i pa n dt w ot r e a t m e n t s w e r es e tp r e - i n d u c e dc o n t r o la n d2 4h o u r sa t t e ri n o c u l a t i o n al o to ft r a n s c r i p t sw e r e o b t a i n e dt h r o u g hc o m p a r i s o n so fg e n e c h i pd a t a t h ep r o b e so fg e n e c h i pw e l e p r i m a r i l ya n a l y z e db yi ns i l i c o nc l o n i n ga n dr e a lt i m ep c r i nt h i ss t u d y , a n dr e s u l t s a sf o l l o w s ： 1 c l o n i n go fr e s i s t a n c e - r e l a t e dg e n e si nw h e a t p r o b e so ft h er e s i s t a n c e - r e l a t e dg e n e sw e r es e l e c t e da c c o r d i n gt ot h er e s u l t so f g e n e c h i p t h ep r i m e r sw e r ed e s i g n e do nt h eb a s i so f t h ef u l l - l e n g t hd n a s e q u e n c e s o fg e n e so b t a i n e db yi ns i l i c oc l o n i n g l e u c i n e - r i c hr e p e a tp r o t e i n ，r e c e p t o r - l i k e k i n a s e p r o t e i n , s e r i n e t h r e o n i n e k i n a s e ，p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n 1 ， m a b s t r a c t p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n2a n dt h r e ep s b g e rp r o t e i n sw e r es u c c e s s f u l l yc l o n e di n s u s c e p t i b l ee u l t i v a ry u m a i l3a n dr e s i s t a n th o n g y o u m a ia tt h es a m et i m e m l ow a s a l s oc l o n e di ny u m a il3a n dh o n g y o u m a i ，s e q u e n c e sa n a l y s i ss h o w e dt h a tj u s to n l y o n en u c l e o t i d ea c i dw a sd i f f e r e n tb e t w e e n t w od n a s e q u e n c e sa n d9 0 i d e n t i a lw i t h m l of r o mb a r l e y a m i n oa c i d ( a a ) a n a l y s i si n d i c a t e dt h a to r i g i n a l18a aw e r es i g n a l p e p t i d ea n dc o n t a i n e d7t r a n s - m e m b r a n ed o m a i n s t h ea ad u r i n g4 1 耷4 3 5w a sa c t i v e s i t ea n d4 51 ，4 5 9 ，4 6 2 ，4 7 5a n d4 8 3a aw e r eg l y c o s y l a t e d t h r e e d o m e n s i o n a l s t r u c t u r ep r e d i c t e di nt h en e x ta n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ea ao f4 4 6s i t ei ss e ri n h o n g y o u m a ia n dg l yi ny u m a i l3 ，b e c a u s eo ft h ed i f f e r e n c eo fo n en u c l e o t i d ea c i d b e t w e e nt h e s ec u l t i v a r s p m 3 h y m , o n er e s i s t a n c eg e n eh o m o l o g o u st op m 3 b ，w a s o n l yc l o n e di nh o n g y o u m a i 1 1 圮4 2 0 8 b po fd n as e q u e n c ew a so f3 7 7 7 b po r f a n d e n c o d e d1 2 5 8a a a m i n oa c i ds t r u c t u r ea n a l y s i ss h o w e dt h a ti tc o n t a i n e dp l o o p n t p 嬲ea n dl r rd o m a i n p m 3 h y mm a y b eh a v es p e c i a lf u n c t i o nb e c a u s ei tw a s p a r t i c u l a rs t a t u sb yc l u s t e ra n a l y s i si na l lh o m o l o g i c a ls e q u e n c e s a b o v eo b t a i n e d g e n e sw e r er e l a t e dt or e s i s t a n c er e a c t i o ni np l a n t t h e s er e s u l t sw i l ll a yf o u n d a t i o nf o r t h en e x ta n a l y s i s 2 e x p r e s s i o na n a l y s i sb yr e a l t i m ep c r f i v eg e n e s ：p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n1 2 ( p r l 2 ) ，r e c e p t o r - l i k ek i n a s ep r o t e i n ( 兄) ，s e r i n e t h r e o n i n ek i n a s e ( - s ) ，h o m o l o g i c a lm l oi nb a r l e ya n dp m 3 h y m w e r ea n a l y z e db yr e a l - t i m ep c rf o rt h eg e n ee x p r e s s i o np a t t e r n t h ep r i m e r sw e r e d e s i g n e da c c o r d i n gt ot h es e q u e n c e so fg e n e s ，a n dt h ee x p r e s s i o na n a l y s i si n d u c e db y b g td u r i n gp a t h o g e n e s i s ( 7 2ho r9 6 ”w a sa n a l y z e db yr e a l t i m ep c i l1 1 l e e x p r e s s i o np e a ko f 咫j 2i nh y ma p p e a r e di nt h et i m e - p o i n to f18h w h i l e ，7 2hi n y u l 3 1 1 托e x p r e s s i o np e a ko f r l k w a s2 4hi ny u l 3 ，b u tn o to b v i o u sp e a ki nh y m m e x p r e s s i o np e a l 【o f s t ki nh y ma p p e a r e di nt h et i m o - p e i n to f18h b u tt h er i s i n g c u r r e n ti ny u l 3w a si n v i s i b l e n em oi ny u l 3 h i g h l ye x p r e s s e di n7 2hw h i l e , t h e e x p r e s s i o np e a ka p p e a r e d12hi nh y m p m 3 h t mw a si n d u c e da n da s c e n d e df i g h t n o wi nh o n g y o u m a i ，a n dt h ep e a ka p p e a r e di n12h e x c e p tf o rg e n ep r l 2a n dr l k t h ee x p r e s s i o np a t t e r n so ft h eg e n e sw e r ec o n c o r d a n tw i mg e n e c h i p i tw a ss h o w e d t h a tt h ee x p r e s s i o np a t t e r n so fg e n e sa n dt h et i m ep e a ko fe x p r e s s i o nw a sd i r e c t l y r e l a t e dt or e s i s t a n tr e a c t i o n a b s t r a c t j 3 c o n s t r u c t i o no t sv e c t o rp m 3 h y m i no r d e rt oc o n f i r mt h ef u n c t i o no fc l o n e dg e n e si nt h er e s i s t a n c er e a c t i o n ，t h e t a r g e tg e n en e e db es i l e n ti ns i l e n c i n gs y s t e mi no r d e rt ov a l i d a t et h eg e n ef u n c t i o n t h a ti s e f f e c t i v e l yi n d u c e db yb a r l e ys t r i p em o s a i cv i r u si nm o n o c o t y l e d o n p m 3 h y mw a st h et a r g e tg e n ei nt h i se x p e r i m e n t t w od n a f r a g m e n t ss i l e n c e dz o n e w e r ec l o n e df r o mt h ep m d 19 tv e c t o rc o n n e c t e dt op m 3 h y m g e n e sb yp c r t h e n s i l e n c i n gf r a g m e n t sw e r el i n k e dt o 丫v e c t o rb yi n c i s i o ne n z y m ea n dl i g a s e t h e c o n s t r u c t i o no fv i g sv e c t o rw a sc o r r e c tb yp c ra n dd o u b l ed i g e s t s t h ep u r p o s eo f t h ee x p e r i m e n tw a st oe x p l o r et h ep r o c e s so fv i g sc o n s t r u c t i o na n dp a v e dt h ew a yt o t h ef u r t h e rs t u d y k e y w o r d ：w h e a t ；p o w d e r ym i l d e w ；r e s i s t a n c eg e n e ；f u n c t i o n a la n a l y s i s v 符号说明 符号说明 英文缩写 英文全名 a na m i n oa c i d a m p a m p i e i l l i n b g t b l u m e r i ag r a m i n i s s p t r i t c b p b a s e p a i r e d n a c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u e l i e i ea c i d d d h 2 0 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d n a d e o x y r i b o n u e l i e i ea c i d d n t p d e o x y n u e l e o t i d et r i p h o s p h a t e s ( u s u a l l yam i xo fd a t p d t t p d c t p d g t p ) h o u r i s o p r o p y l 3 - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k i l o - b a s ep a i r l u r i a b e r t a n im e d i e m i n u t e s o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m c r a s cc h a i nr e a c t i o n r e s i s t a n c eg e n e r e s i s t a n c eg e n ea n a l o g s r i b o n u c l e i ca c i d r o t a t i o n sp e rm i n u t e r i b o s o m er i b o n u e l c i ca c i d s e c o n d v i r u si n d u c e dg e n es i l e n c i n g 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 1 n d o l y l - 3 d - g a l a c t o s i d e v l 中文全名 氨基酸 氨苄青霉素 禾布氏白粉菌 碱基对 互补d n a 双蒸水 脱氧核糖核酸 脱氧核苷三磷酸( 通常 也j i 勰| 强a | 撼y 瞻镪 混合物) 小时 异丙基硫代半乳糖苷 千碱基对 l u r i a - b e r t a n i 培养基 分钟 吸光值 开放阅读框 聚合酶链式反应 抗病基因 抗病基因类似物 核糖核酸 每分钟转数 核糖体r n a 秒 病毒介导的基因沉默 5 溴4 氯3 吲哚基争d 半 乳糖甘 h藿圣勋m蓦吣腿r枞眦驴一瞄吣一 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 符号说明v i 目录v i i 第一章引言1 第二章文献综述3 2 1小麦白粉病3 2 2 植物抗病基因及作用机制4 2 2 1 根据保守结构域将抗病基因分类5 2 2 2 抗病基因的作用机制6 2 3 小麦抗白粉病基因的定位与抗病基因克隆7 2 3 1 抗白粉病基因的定位7 2 3 2 小麦白粉病抗病基因7 2 4 与植物抗病相关的信号转导途径8 2 4 1s a - 依赖性途径9 2 4 2s a _ 非依赖性途径9 2 4 3 各信号途径的交叉9 2 5 抗病基因克隆技术和电子克隆技术1 0 2 5 1 抗病基因克隆技术1 0 2 5 2 电子克隆技术1 3 2 6r e a l t i m ep c r 技术1 3 2 6 1r e a l - t i m ep c r 技术原理1 4 2 6 2r e a l - t i m ep c r 分类1 4 2 6 3 内参基因的选择2 0 2 6 4r e a l - t i m ep c r 的应用2 0 v 目录 2 7 病毒介导的基因沉默( v i r u si n d u c e dg e n es i l e n c i n g ，v i e s ) 2 0 第三章小麦抗白粉病相关基因的克隆2 3 3 1 材料与试剂2 3 3 1 1 主要仪器与生产厂家2 3 3 1 - 2 实验材料2 4 3 1 3 载体质粒与菌株2 4 3 1 4 生化试剂与试剂盒2 4 3 2 实验方法2 4 3 2 1 探针的选择2 4 3 2 2 电子克隆及引物设计2 5 3 2 3 材料处理2 8 3 2 4r n a 提取及检测2 8 3 2 5 反转录c d n a 第一条链及检测2 8 3 2 6 目标基因的p c r 扩增2 9 3 2 7 目标d n a 片段的回收2 9 3 2 8p c r 产物加a 3 0 3 2 9 大肠杆菌( j m l 0 9 ) 感受态的制备3 0 3 2 1 0 连接、快速转化、菌液p c r 检测和测序3 1 3 2 1 1 两个重要基因( m l o 和尼的信息学分析3 l 3 3 实验结果3 2 3 3 1 材料接菌处理3 2 3 3 2r n a 提取与反转录3 2 3 3 3目标基因克隆3 3 3 3 4m l o 的相关信息学分析3 5 3 3 5p m 3 t t d ! 的相关信息学分析3 8 3 4 讨论3 9 第四章小麦抗白粉病相关基因的表达模式分析4 2 4 1 材料与试剂4 3 4 1 1 主要仪器与生产厂家4 3 v i i i 目录 4 1 2 实验材料4 3 4 1 3 生化试剂与试剂盒4 3 4 2 实验方法4 3 4 2 1 定量p c r 引物设计4 3 4 2 2r n a 提取及检测4 4 4 2 3 反转录c d n a 第一条链及检测4 4 4 2 4 定量表达分析4 4 4 3 实验结果4 5 4 3 1r n a 提取及c d n a 合成4 5 4 3 2 定量p c r 引物检测结果4 6 4 3 3 表达模式分析4 8 4 4 讨论5 l 第五章小麦抗白粉病同源基因忍鳓啷的v i g s 载体构建5 4 5 1 材料与试剂5 4 5 1 1 主要仪器与生产厂家5 4 5 1 2 实验材料5 5 5 1 3 载体质粒与菌株5 5 5 1 4 生化试剂与试剂盒5 5 5 2 实验方法5 5 5 2 1 b 3 y n 沉默区域d n a 片段的扩增5 5 5 2 2v i g s 载体构建5 6 5 3 实验结果5 9 5 3 1 忍删沉默区域d n a 片段的克隆5 9 5 3 2v i g s 载体的构建5 9 5 4 讨论6 1 第六章结论6 3 参考文献6 4 致谢7 0 i x 目录 附录a 主要试剂和培养基配方7 1 附录b 载体图7 2 附录cd n am a r k e r 7 3 个人简历7 4 在学期间发表的学术论文7 4 x 第一章引言 第一章引言 小麦白粉病是由专性寄生菌禾布氏白粉菌 b l u m e r i ag r a m i n i s ( d c ) s p e e r s p t r i t i c ie m m a r c h a l 弓l 起的真菌性病害，是小麦生产中发生比较严重的三大病 害之一，严重影响小麦的产量与品质。使用农药和改变耕作方式等方法虽然在 一定程度上遏制了白粉病的发生，但是前者会对环境造成严重的危害并且最终 还会威胁到人类的健康，后者由于受到气候等多种客观条件的影响也限制了它 的应用范围。到目前为止，推广抗病品种仍然是防治白粉病最为经济、有效的 方法，但由于白粉菌的变异速度快导致品种的单一抗性很容易丧失，所以对加 快新的抗病品种的选育提出了更高的要求。 目前已经在小麦的多条染色体上鉴定出4 0 多个抗病基因位点，这些基因对 白粉菌表现不同程度的抗病反应，其中我国遗传学家鉴定的p r 0 2 1 对我国现存的 所有白粉病菌均表现免疫，是一个比较好的抗病材料。通过传统的育种方法可 以实现多个抗病基因的聚合，将小麦对白粉菌的垂直抗性逐渐向水平抗性转变 已经成为目前解决小麦白粉病的重要方法之一，所以现在有许多科学工作者把 大量的精力放在新抗性品种的寻找方面。 小麦抗病基因工程育种的瓶颈主要是对植物抗病机理的了解不够深入，因 为植物抗病反应涉及到复杂的信号转导和代谢调控，一般认为抗病品种有一个 关键基因在抗病反应发挥着重要作用，即r e s i s t a n c eg e n e ( r ) 。该基因的编码产 物能够与病菌的无毒基因产物( a v r ) 相互识别，经过一系列的信号转导过程启 动抗病物质的表达而表现为抗病性。目前，在小麦白粉病抗病基因克隆方面只 有p r 0 3 位点上的等位基因被成功的克隆，该基因是通过构建高密度的遗传图谱 获得共分离的分子标记，再通过染色体步移技术克隆得到的，并通过转基因技 术对功能进行了验证。p r 0 3 位点上抗病基因的成功克隆对小麦白粉病抗病机制 研究有着重要的意义，也为其它抗病基因的克隆提供了依据。 在前期研究中，本实验室使用的抗病品种红蚰麦对实验保存的小麦白粉病 菌表现为免疫，设置的感病对照为豫麦1 3 ，利用基因芯片技术对病菌诱导前后 f 3 代抗病单株和感病单株的转录组进行全面地分析，以从宏观角度探索感抗不 同反应的基因表达情况，并为后续研究提供了丰富的基因表达的信息。 本实验用基因芯片中指示特定基因的探针序列作为种子序列，利用强大 第一章引言 d n a 序列处理软件和庞大的生物信息资源对选定的目标基因进行电子克隆( i n s i l i c oc l o n i n g ) ，该技术在本实验中被用于与抗病反应密切相关的基因进行克隆， 并从选择两个重要基因m l o 和p m 3 b 同源基因进行了综合分析，前者是在大麦中 克隆的抗病基因，它的隐性突变对白粉菌具有广谱且持久的抗病性，而后者是 第一个在小麦中克隆白粉病抗病基因。然后利用丰富的网络数据库资源对克隆 得到的基因的同源性进行分析，并对编码蛋白的结构以及功能进行预测，从而 为进一步分析提供依据。 r e a l t i m ep c r 技术是近几年来被广泛应用于基因表达分析的一种技术，本 实验将感抗亲本分别接种白粉菌并设置同期未接菌处理的对照，对经诱导后9 6 小时或7 2 小时内的目标基因的表达情况进行分析，确立它们的诱导表达趋势， 进而推测它们与抗病反应可能存在的关系。 基因沉默技术主要被用于研究某个或某些基因在整个基因表达系统中的作 用，因为它的高效沉默效果使该技术得到普遍应用。但由于农杆菌在单子叶植 物中的基因转化效率很低，使许多方面的研究均受到了限制，比如r n a i 。而病 毒介导的基因沉默( v i r u si n d u c e dg e n es i l e n c i n g , v i g s ) 同样可以使目标基因得到 高效沉默，大麦条斑病毒经过人工改造后可以有效的应用于单子叶植物的基因 沉默，本研究利用v i g s 技术从反向遗传学角度进一步验证目标基因的功能。 通过克隆与抗病反应紧密相关的基因并对其进行初步分析，旨在了解小麦 抗白粉病的作用机制，并为以后的转基因育种工作提供一定的理论基础。 2 第二章文献综述 第二章文献综述 2 1 小麦白粉病 小麦是重要的粮食作物，在我国的生产面积仅次于水稻，2 0 0 9 年的小麦总 播种面积高达2 4 0 1 万公顷( h t t p ：w w w c h i n a g r a i n c n ) ，小麦的生产直接关系 着我国粮食安全问题。在小麦生产过程中，有许多生物和非生物因素影响着小 麦的产量和质量，其中锈病、白粉病和赤霉病是小麦的主要病害。 6 0 年代以前，小麦白粉病主要发生在降水条件较好的海洋性气候和半大陆 性气候的地区。6 0 年代后，伴随的水肥条件的改善、矮秆和半矮秆品种的推广、 种植密度的加大，以及由于品种多样性降低导致的抗病品种的抗性“丧失”等 因素，使白粉病的发生面积迅速扩大，在北美东部、北欧、北非、东非以及亚 洲等许多地区均有大面积发生。7 0 年代以前，小麦白粉病在我国主要发生在四 川、云南、贵州等山区，8 0 年代初期首次出现显著北移，在黄淮和江淮地区造 成严重危害，8 0 年代中期已经北移至山东、河南、陕西、甘肃、河北、山西、 北京、天津等多个省市，9 0 年代初小麦白粉病大面积流行，进一步扩展到黑龙 江、吉林、辽宁等春麦区。在2 0 0 1 年至2 0 0 6 年，我国的白粉病发病面积在5 9 0 - - - - 9 4 0 万公顷以上，造成的产量损失在2 6 - - - - 3 2 万吨以上( h t t p ：w w w p p q g o v c r d n o n g q i n g _ x i a o m a i a s p ) ，已成为当前影响我国小麦生产的主要病害。 图2 1 白粉菌形态 小麦白粉病是由禾本科布氏白粉菌( b l u m e r i ag r a m i n i sf s p