（作物遗传育种专业论文）国槐DNA导入花生（Arachis+hypogaea+L）变异株系的鉴定及其AFLP分析.pdf

英文缩略表 y9 0 3 8 9 2 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学 研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出 重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责 任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸 质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学 位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：蕉垄丛： 导师签名：丞：i 垫骘 日期：竺堑修 山东农业大学硕士学位论文 国槐d n a 导入花生臼，口曲妇切噌p 口l ) 变异 株系的鉴定及其a f l p 分析 摘要 本实验使用的花生材料是由国槐d n a 导入花生栽培种7 9 2 6 6 产生的 d ，代变异单株经过连续自交获得的8 个d 8 代株系。于2 0 0 5 年考察8 个 株系和受体7 9 2 6 6 ( 对照) 的主要农艺性状，并提取叶片d n a 进行a f l p 分析。获得主要研究结果如下： 1 花生变异株系与受体品种的农艺性状存在差异 受体品种的内种皮颜色为黄色，8 个变异株系均为白色；受体品种的 丌花习性为连续开花型，8 个变异株系中有5 个为连续开花型，1 个株系 为交替开花型，2 个株系仍存在性状分离：受体品种的株型为直立型，8 个变异株系中，4 个株系为匍匐型，4 个株系为半直立型，无直立型株系。 变异株系与受体品种相比较，数量性状也存在较大差异。有些性状的 变异是有益的，有些变异是不利的。8 个变异株系中，有3 个株系的主茎 高极显著降低，分别比受体降低了3 7 、4 7 8 和4 0 ；两个株系的侧 枝长极显著降低，分别比受体降低了5 8 和4 5 ；7 个株系的单株结果 数有极显著降低；4 个株系的单株果重极显著降低：8 个株系的荚果均明 显大于受体7 9 2 6 6 ，株系5 的单果重最大，比受体增大了7 9 2 ，株系的 荚果最长，比受体增大了1 7 2 ：8 个株系的果皮厚度显著增加，8 个株 系的单粒重均显著大于受体，株系6 的单粒重最高，比受体7 9 2 6 6 增大了 7 3 。 2 变异株系数量性状的聚类分析 株系l 6 和受体7 9 2 6 6 共7 个株系聚为i 类，株系7 和株系8 聚为 i i 类；在i 类中又可以分为三个亚类：1 和3 两个株系聚为a 类，2 、4 和5 三个株系和受体7 9 2 6 6 聚为b 类，株系6 单独聚为c 类。聚类分析结 果表明不同株系变异幅度不同，1 5 五个株系变异幅度较小，6 8 三个 株系变异幅度较大。 国槐d n a 导入花生“m c 打忉。弘印l ) 变异株系的鉴定及其a f l p 分析 3 变异株系的a f l p 分析 本实验探索并建立了一套从花生d n a 提取到银染、显影在内的完善 的、适合于花生a f l p 分析的技术体系，并利用该技术体系对国槐d n a 导入花生变异体后代进行了检测。 实验采用1 2 对引物组合进行a f l p 扩增，检测到具有多态性的引物 组合3 对( e p a c a m ：p c t a 、e p a c t m p c t a 、e p a a g 【p c t a ) ， 多态性检出率为2 5 。所筛选的3 对引物组合共在9 0 个位点上扩增出清 晰可辨的条带，并且主要集中在1 0 0 b p 一7 0 0 b p 之间，平均每对引物组合 扩增出3 0 条带；其中多态性条带2 2 条，平均每对引物组合7 条，平均多 态性带比例为2 24 。扩增出条带最多的是引物组合e p a c t m p c t a ， 共有3 4 条清晰可辨的带，其中7 条是多态性带，多态性比例2 0 6 ；多 态性比例最高的是引物组合e p a a g ，m p c t a ，其扩增出清晰可辨的条 带2 7 条，其中多态性带9 条，多态性比例为3 3 3 。以上结果表明：a f l p 技术在亲缘关系较近的花生株系间具有较高的d n a 多态性检出率。 变异株系的a f l p 聚类分析和主坐标分析结果表明：株系1 、2 、3 、 6 、7 和8 共6 个株系与受体7 9 2 6 6 被聚为i 类，株系4 和5 被聚为i i 类； 在i 类中，又可分为两个亚类：株系1 、2 、3 和受体7 9 2 6 6 被聚为a 类， 株系6 、7 和8 三个株系被聚为b 类。 国槐d n a 导入花生栽培品种引起后代性状变异效果明显：变异株系 有多个性状与受体存在差异，a f l p 分析结果也表明变异株系与受体间在 d n a 水平上也存在差异。以上研究表明：外源d n a 导入技术是创造花 生新种质的一种有效手段。 关键词：花生口m c 括忉。伊g l ) ， 变异体，农艺性状 a f l p 分析，主坐标分析 山东农业人学颂j 学位论义 i d e t i f i c a t i o na n da f l p a n a l y s i s0 f v a r i a n ts t r a i n s d e v e l o p e dt h r o u g hi n t r o d u c i n gc h i n e s es c h o l a 卜t r e e d n ai h t op e a n u t 口r c 括幻尹口蓦p l ) a b s t r a c t h 1t h ee x p e r i m e n t ，e i g h tp e a n u tv a r i a n ts t r a i n s ( d 8g e n e r r “o 玎) w e r eu s e d a sm a t e r i a l s ，w h i c hw e r e g e n e r a t e df b mo n ep l a n to fd 3g e n e r r a t i o n d e v e l o p e dt h r o u 曲i n t r o d u c i n gc h i n e s es c h o l 盯一订e ed n ai n t op e a n u t t h e m a i na g r i c u l t u r a lc h a r a c t e r so ft h ev a 五a n ts t r a i n sa n dm ea c c 印t o r ( 7 9 2 6 6 ) h a db e e ns t u d i e di n2 0 0 5 d n ah a db e e ni s o i a t e d 舶mt h ep e a i l u tv 撕a n t s t r a i n sl e a v e sf o ra f l pa n a l y s i s t h em a i nr e s u l t so ft h ee x p e r i m e n ta s f o l l o w s ： 1 m a n yd i v e r s i t yw e r ee x i s t e db e t w e e nt h ev a r i a l l ts t r a i n sa 工1 dm ea c c e p t o r ( 7 9 2 6 6 ) i na g r i c u l t l l r a lc h 盯a c t e r s t h ee n d o p l e u r ac 0 1 0 ro ft h ea c c e p t o rw a sy e l l o w ，t h a to ft h ee i g h tp e a j l u t v a r i a n ts t r a i n sw e r ew h t h ea b l o o mt y p eo ft h ea c c 印t o rw a sc o n t i n u o u s i y b u tt h a to f5v a r i a n ts t r a i n sw e r ec o n t i r m o u s l y ，m a to f1v a r i a ms t r a i nw a s a l t e m a t ea 1 1 d2v a r i a n ts t r a i n sw e r es t i l ls e p a r a t i n go nt h ec h a r a c t e lp l a n tt y p e o fm ea c c e p t o rw a se r e c t i o n ，m a to f4v a r i a n ts t r a i n sw e r ec r e e p ，t h a to fm e o t l l e r4v 撕a n ts t r a i n sw e r eh a l f c r e e p g r e a td i s t i n g u i s hw e r ee x i s t e db e 觚e e nm ev 撕a 1 1 ts t r a i n sa 1 1 dm e a c c e p t o ri nq u a l l t i t yc h a r a c t e r s i nt h ev a n a t i o n ，s o m ew e r eb e n e f l c i a l ，b u tt h e o t h e r sw e r ea d v e r s e i nm ee i g h tv a 五a i l ts t r a i n s ，m a i ns t e m h e i g h to ft h r e e s t r a i n sd e c r e a s e db y3 7 ，4 7 8 a n d4 0 ，r e s p e c t i v e l y ，a sc o m p a r e dw i t ht h a t o ft h ea c c 印t o ll a t e r a lb r a n c h e s1 e n g t ho f t w os 仃a i n sd e c r e a s e db y5 8 a 1 1 d 国槐d n a 导入花生“m c h 忉。驴p al ) 变异株系的鉴定段其a f l p 分析 4 5 ，r e s p e c t i v e jy a sc o m p a r e dw i t ht h a to f t h ea c c 印t o lp o d so fo n e p i a n to f s e v e ns t r a i n sw e r ef 嘶e rt h a nt h a to f t h ea c c e p t o r p o dw e i 曲to fo n ep l a n to f f o u rs t r a i n sw a s1 0 w e rt h a nt h a to ft h ea c c e p t o lt h ep o ds i z eo fa l lv a r j 柚t s t r a i n sw a sb i g g e r 血a nt h a to f 恤ea c c e p t o lt h ep o ds i z eo fn o5s 廿_ a i nw a s t h eb i g g e s t ，i t sp o dw e i g h ti n c r e a s e db y7 9 2 ，a n di t sp o dl e n g t hi n c r e a s e d b y17 2 ，a sc o m p a r e dw i t hm ea c c 印t o lt h ep o df a v o ro fa 1 1v a r i a n ts t r a i n s w a st h i c k e rt h a nt h a to f t h ea c c 印t o r a n dp e rs e e dw e i 曲to ft h ee j 曲tv 撕a i 】t s t r a i n sw a sm o r ew e i g h tt h a nt h a to fm ea c c e p t o lp e rs e e dw e i g h to fn o 6 m a i n sw a st 1 1 em o s tw e i g h t ，i n c r e a s e db y7 3 t h a nt h a to f 也ea c c e p t o r 2 d e n d l 0 9 r a mo fc l u s t e ra n a l y s i so ft h ev a a n ts 蛳n sb a s e do nm eq u a n t i t y c h a r a c t e r s n o 1 ，2 ，3 ，4 ，5a i l d 6s t r a i n st o g e t h e rw i 也m ea c c e p t o rw e r ec l u s t e r e d a si n o 7a n dn o8 s t r a i n sw e r ec l u s t e r e da s1 i nc o u l db ec l u s t c r e dt 1 r e e s u b s p e c i e si nm ec l u s t e ri ，n o 1a n dn o 3s 廿a i n sa sa ，n o 2 ，4a 1 1 dn o 5 s t r a i n sa n dt h ea c c 印t o ra sb ，n o6 s t r a i n sa sc t h er e s u i ts h o w e dt h a t d i 鼠r e n tv 撕a n ts t r a i n sh a dd i 仃e r e n tv 撕a c i o nd e g r e e n o 1 ，2 ，3 ，4a n dn o 5 s t r a i n sh a dl i t t l ev a r i a t i o nd e 护e et h a nt h a to f n o 6 ，7a n dn o 8s t r a i n s 3 a f l pa 1 1 a l y s i so f m ev 撕a t l ts 乜a i n s a f l pt e c h n i q u e s y s t e mw a se x p l o r e da n de s t a b l i s h e d ，w h i c hw a s s u i t a b l ef o rp e a l l u t ，疗o md n ai s 0 1 a t i o nt os i l v e rs t a i ni nt h ee x p e r i m e m o f f s 研n g ，e v e 】o p e dt 瑚u 曲i n 仃0 d u c i n gc h i n e s es c h o l 扑打e ed n ai n t o p e a n u tw a ss t u d i e db ye m p i o y e dt l l i ss y s t e m t w e l v ep 五m e rc o m b i n a t i o n s w 8 r ee m p l o y e di 王1n l ee x p e r i m e n t ，i nw h j c ht h r e ep r i m e rc o m b i n a t i o n sw e r e p 0 1 ) 仰。巾协s m ( e p a c a m p c t a 、e p a c t ，m p c t a 、e p - a a g m p - c i a 】， 2 5 p 打m e rc o m b i n a t i o n sw e r ep 0 1 y m o i p h i s m at o t a lo f9 0b a l l d sw e r e d e t e c t e db y3p r i m e rc o m b i n a t i o n so fi n f o m a t i v ea f l pp r i m e r s t h eb a l l d s w e t eb e t w e e n10 0 b p _ 一7 0 0 b p ，3 0b a n d sw e r ed e t e c t e dp e rp r i m e rc o r n b i n a t i o n o na v e r a g e 2 2b a l l d sw e r ep 0 1 y m o r p “s ma sat o t a lo f3p r i m e rc o m b i n a t i o n s ， 7b a n d sw e r ep o i y m o r p 蛐s mo na v e r a g e 2 2 4 b 孤dw a sp o l y m o r p h i s mo n a v e r a g e t h ep r i m e rc o n l b i n a t i o no fe p a c t p 皿一c t ad e t e c t e d3 4 4 山东农业大学硕匕学位论文 b a n d s w h j c hw a st h em o s t _ i nw h i c h2 06 w e r ep o l y m o r p h i s m ( 7b a n d s w e r ep 0 1 y m o 叩h i s m ) t h ep r i m e rc o m b i n a t i o no fe p a a g m p c t ad e t e c t e d 2 7b a n d s ，i nw h i c h3 3 3 w e r ep o l y m o 印h j 姗( 9b a n d sw e r ep 0 1 弘n o 巾h i s m ) ， w h i c hw a st h em o s tp o l y m o r p h i s mp e r c e n t a g e t h ee x p 舐m e n tc o n 五m e dt h a t t h ep o b ，m o r p h i s mi nt h ev a a j l ts t r a i n so fp e a n u tc o u l db ed e t e c t e db yt h e t e c h n i q u eo fa f l p ，w h i c hr e l i t i o n s h i po fg e 九e t i cw e r ec 】o s e rf h a nt h a to f c u l t i v a t e dp e a l l u t d e n d r o g r a mo fc l u s t e ra n a l y s i sa 1 1 dp r i n c i p a lc o o r d i n a t e sa 1 1 a l y s i so ft h e v a r i a n ts t r a i n sb a s e do na f l pm a r k e r ss h o w e dt h a t ：n o 1 ，2 ，3 ，6 ，7a n dn o 8 v a r i a l l t s t r a i n s ，t o g e t h e rw i t ht h ea c c e p t o rw e r ec l u s t e r e da s i ，n o 4a n d n o 5w e r ec l u s t e r e da s1 i i tc o u l db ec l u s t e r e da st w os u b s d e c i e si nt h e c l u s t e ri ，n o1 ，2 ，3a n dt h ea c c 印t o rw e r ec l u s t e r e da sa ，n o6 ，7a n dn o8 w e r ec l u s t e r e da sb d i v e r s i t ya n dc o m p l e x i t yw e r es h o w e db yt h ev a a t i o n so ft h eo f e p r i n g a r e r 也ec h i n e s es c h o l a 卜t r e ed n ai n t r o d u c e di n t oc u l t i v a t e dp e a n u t m a n v c h a r a c t e r so fv a r i a j l ts t r a i n sh a dd i s t i n g u i s h e dw i t ht h ea c e p t o lt h er e s u l t so f a f l pa n a l y s i sc o n f i r i n e dt h a tt h e r ew e r ed i s t i n g u i s hb e t w e e nv 抓a n ts t r a i n s a n dt h ea c 印t o ra td n al e v e l t h er e s u l t si n d i c a t e dm a tt h et e c h n i q u eo f i n t m d u c i n ge x o t i cd n a i n t op e a n u tw a sa ne a e c t i v em e t h o do fc r e a t i n gn e w p e a j l u tg e m l p l a s m k e yw o r d s ： p e a n u t 似阳c 括协p d g 口l ) ，v a r i a n ts t r a i n s ，a 鲥c u l t u r a l c h a r a c t e r ，a f l pa n a l y s i s ， p r i n c i p a lc o o m i n a t e sa n a l y s i s 固槐d n a 导入花生“阳“s 舻o g 。l ) 变异株系的箍定及其a f l p 分析 1 引言 花生r 口幽曲 炉昭n g dl ) 属于豆科( i e g u m i n o s a e ) 中的蝶形花亚科 ( p a 口i l i o n o i d e a e ) 花生属臼阳c 拈l ) ，起源于玻利维亚南部和阿根廷北 部地区，约在南纬2 5 度附近( 幻a p o v i c k a s ，a 1 9 6 9 ) 。花生是世界范围内 广泛栽培的油料与经济作物，是2 0 世纪全球最大的四大油料作物之一 ( f r e e m a n ha e ta 1 1 9 9 9 ) 。主要分布在亚洲、非洲和美洲地区，这三个 地区的花生产量约占世界总产量的9 9 。自1 9 9 3 年以来，中国花生总产 持续超过印度而居世界首位( 廖伯寿，2 0 0 3 ) ，占世界花生总产量的4 0 左右( 门爱军等，2 0 0 3 ) ；同时中国也是世界最大花生出口国，出口花生 占世界花生总贸易量的3 0 以上。在我国五大油料作物中，花生种植面 积仅次于油菜，而单产、总产及出口量在五大油料作物中一直居首位( 汤 松，2 0 0 3 ) 。花生营养成分丰富而全面，据科学分析，花生含有脂肪、蛋 白质、氨基酸、卵磷脂、嘌呤及花生碱、胆碱、淀粉、纤维素、无机盐和 维生素a 、b 、c 、k ，生物素、生育酚等；还含有钙、钾、磷、铁、镁 等多种营养元素。花生所含的脂溶性维生素e 与生育、长寿有密切关系， 所含维生素k 有保护血管壁和止血作用，故民间有“常食花生能养身， 吃了花生不想荤”的说法。在国外，花生的营养保健价值备受人们的青睐， 被誉为“植物肉”和“绿色牛乳”。此外，花生中还富含一种抗癌物质一 一白藜芦醇。美国最新研究发现，白藜芦醇可以抑制合成“保护”癌细胞 的蛋白质的基因，达到抗癌效果，并能使癌细胞被化疗杀死。2 0 0 1 年， 美国伊利诺伊大学科学家发现白藜芦醇能够防止细胞癌变，抑制肿瘤细胞 的扩散和与关节炎等有关的细胞炎症。 因此，基于花生在国民经济和人民生活中所占的重要地位，其遗传研 究直受到广泛重视。但是，尽管人们对其进行了长时间和大量研究，由 于花生遗传基础材料缺乏，有关基因连锁重组的报道很少，染色体小、数 目多，建立遗传图谱难度很大( m u n h y g k e ta l1 9 9 3 ) 。与其它作物 如玉米( s i m c o xk d e ta 1 1 9 9 3 ；z a i t l i nd e ta 1 1 9 9 3 ) 、水稻( n a i rs e t a 1 1 9 9 6 ；y o s h i m u r as e ta 1 1 9 9 5 ) 、小麦( e a s t w o o dr f e ta 1 1 9 9 4 ：h a r t ll e ta 1 1 9 9 5 ) 、大麦( b o r o v k o v a i ge ta 1 1 9 9 5 ：l i a n a e ta 1 1 9 9 4 ) 、大豆 ( a s b f i e l dj e ta 1 1 9 9 8 ；c o n e i b i d ovc e ta 1 1 9 9 7 ；i m s a i l d em e ta 1 1 9 9 8 ) 、 山东农业人学硕上学位论文 棉花( i q b a lm j e ta 1 1 9 9 7 ；s h a p p l e yz we ta 11 9 9 8 ；w a j a h a 扎1 l a hmk e t a 1 1 9 9 7 ；) 、马铃薯( n i c n h n i sje ta 11 9 9 3 ) 等主要农作物相比，其遗传研 究进展十分缓慢。1 9 8 7 年以来，由于p c r 技术( c h a r l i e uj ，e ta l1 9 9 4 ) 的发 明发展，一系列以扩增为基础的分子标记应运而生。r f l p ，r a p d ，a f l p ，s s r 等新型d n a 分子标记( l i ubh1 9 9 7 ) 克服了传统遗传标记易受环境影 响、标记材料的建立需花费大量人力、物力和时间培育、选择的缺陷( 徐 云碧等，1 9 9 4 ) 在生命科学研究中得到迅速而广泛的应用。生物技术特别 是d n a 分子标记技术相对于传统的遗传育种研究中的形态性状评价具有 无可比拟的优越性( 郑伟文，2 0 0 2 ) 。分子标记技术给各种生物，特别是 象花生这种难以用传统方法进行深入遗传研究的作物带来了极大的方便。 许多以前无法进行的研究在分子标记的帮助下已经开展。新技术与传统方 法结合，有可能解决目前育种中的难题，大大加快育种工作的进程。 1 1 外源d n a 导入技术 1 1 1 外源d n a 导入理论的提出 利用品种间的有性杂交等常规方法来改良农作物，由于遗传基础比较 狭窄，品种间的亲缘关系较近，具有很大的局限性，且常规育种处在多组 合、大群体、长周期的低效率状况，有的农作物品种选育研究长期徘徊不 前，社会及生产的发展对作物品种提出更高和更紧迫的要求，使育种技术 也不断发展和进步，继系统选育、杂交育种、诱变育种之后，出现了胚胎 挽救、细胞诱变、原生质体融合、染色体工程等植物组织与细胞水平上的 育种技术。伴随2 0 世纪7 0 年代基因工程理论和技术的产生，分子生物学 工作者提出了植物基因工程的研究课题，以探索作物育种的新途径植 物分子育种。植物分子育种包括两个层次的生物工程技术，其一为植物基 因工程技术；其二为外源d n a 直接导入技术。植物基因工程技术是高技术， 可使人们达到人工操纵遗传的最高境界。但由于基因工程技术的复杂，需 要有掌握高技术的人才和足够的财力和物力，因此这项技术的发展在一定 时期内，特别是在其发展应用的初期和第三世界只能局限于少数实验室研 究解决少数问题，距离生产需要和广大育种者的要求尚属遥远。针对这一 难题，著名分子生物学家周光宇提出了将外源d n a 直接导入植物进行分子 育种的理论。1 9 7 4 年，在调查了作物的远缘杂交实例后，提出了染色体 图枕d n a 导入花生“m c z s 忉d g d 阳l ) 变异株系的器定及北a f l p 分析 水平以下的肌a 片段杂交假院( 周光宇，1 9 7 9 ) ，并根据这个理论设计了 外源d n a 直接导入植物的方法。 1 1 2 外源d n a 导入植物的方法 根据遗传转化的原理，植物遗传转化系统可分为三种：载体型遗传 转化系统、d n a 直接转化系统和种质转化系统。载体型遗传转化系统是将 不同的d n a 片段( 目的基因) 分离出来，按人们的设计方案把目的基因与适 当的载体相连接形成重组d n a ，然后通过载体将目的基因引入到植物的组 织、细胞，并在特异的受体细胞中与载体一起得到复制与表达，使受体细 胞获得新的遗传特性，再通过人工离体培养筛选获得目的基因表达的后代 来培育新品种的技术。d n a 直接转化系统是指依赖农杆菌载体和其他生物 载体，将经处理的外源d n a 直接导入植物细胞实现遗传转化的技术。种质 转化系统是指将外源基因以植物自身的种质细胞为媒体从而实现外源基 因转移的技术，是种在植株整体水平上进行目的d n a 导入的技术。它既 不同于载体转化的基因工程技术，无需抗生素标记和d n a 体外重组，也有 别于通过有性杂交实现植物间基因交流的传统育种方式。而是以整体植物 为受体，在植物整体水平直接将带有目的性状的供体遗传物质( 总d n a ) 或目的基因d n a 片断的导入，创造出大量的变异材料以获得转化种子并不 断繁育和选择，从而达到改良和培育品种的目的。包括花粉管通道导入法， 种子浸渍法和子房、幼穗、幼胚注射法等。 】1 2 1 花粉管通道法 花粉管通道法是利用植物受精过程中形成的花粉管通道，将外源d n a 导入植物的技术。花粉管深入胚珠的过程中可形成花粉管通道，使外源 d n a 能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞 壁的卵、合子或早期胚胎。此方法无需细胞、原生质体等组织培养和诱导 再生植株等一整套人工培养过程，避免了原生质体再生以及组织培养过程 中可能导致的染色体变异或优良农艺性状的丧失。且此方法不受植物种属 的限制，在具各有性生殖过程的任何植物上都能应用。转化速度快，方法 简单有效，成本低廉，并可与常规育种紧密结合，取得了较好效果。段晓 岚等( 1 9 8 7 ) 将外源d n a 导入栽培水稻，出现了一种新的变异类型，与受 体相比种子粗蛋白和1 6 种氨基酸含量均显著提高。近年来，花粉管通道 山东农业大学颂上学位论文 法被用来向受体导入目的基因。1 9 8 8 年，l u o 等首次利用花粉管通道法将 质粒d n a 导入水稻，并经s o u t h e r n 杂交和酶学鉴定证实了被转基因的整 合和表达。曾君祉等( 1 9 9 3 ) 用此法将g u s 基因转入小麦，并证明该基因 已整合到小麦基因组上。该方法工作时间受自然花期限制，田间操作时受 环境的影响较大，且由于转基因以随机的方式整合进入受体染色体基因组 中，故转基因植株后代的遗传情况较为复杂，在对后代的选择上需一定的 实践经验。 1 1 2 2 浸渍法 浸渍法是指将植物的种子、胚、子房、花粉粒、幼穗、悬浮细胞甚至 幼苗等直接浸泡在外源d n a 溶液中，利用渗透作用把外源基因导入受体细 胞并得到整合与表达的一种转化方法。h e s s ( 1 9 8 0 ) 报道了用外源d n a 浸泡矮牵牛的萌动种子而出现变异性状的结果，并进一步得到了外源d 导入转化植株的分子证据。傅荣昭( 1 9 9 2 ) 通过电镜观察到成熟种子胚在 浸泡后内部细胞的胞壁之间出现有断裂，从而为外源d n a 的导入提供了进 入细胞的证据。朱生伟( 2 0 0 1 ) 和朱祥春等( 1 9 9 9 ) 用此法进行了烤烟的 转化研究，蒋建雄等( 2 0 0 0 ) 通过超干胚浸泡法将棉花d n a 导入苎麻引起 了后代变异，并对变异后代进行了r a p d 验证。浸渍法是高等植物遗传转 化技术中最简单、快速、方便的一种方法，容易推广普及。 1 1 2 3 子房、幼穗、幼胚注射法 子房、幼穗、幼胚注射法是使用注射仪将外源d n a 溶液直接注入到植 株的子房或胚囊中，由于子房或胚囊中产生高的压力卵细胞的吸收使外源 d n a 进入受精的卵细胞中，从而获得经遗传转化的植株。丁群星( 1 9 9 3 ) 、 王国英等( 1 9 9 6 ) 使用子房注射法将b t 毒蛋白基因导入玉米自交系，获 得了抗虫的转基因玉米。黄骏麒( 1 9 8 1 ) 、z h o u ( 1 9 8 3 ) 、倪万潮( 1 9 9 8 ) 和张震林( 2 0 0 0 ) 先后在棉花上利用子房注射法进行了研究并取得了成效。 1 1 3 外源d n a 导入的技术特点 ( 1 ) 实现超远缘生物问遗传物质的交流。外源d n a 导入可打破物种 分类的界限，充分利用自然界丰富的遗传资源，使遗传物质能在不同种、 属、科间，甚至在不同生物间进行交流，丰富其遗传基础，为植物的种质 创新和品种改良开创了新的有效途径。 胃槐d n a 导入花生“r d c 岱如印伊印l ) 变异株系的鉴定及扎a f l p 分析 ( 2 ) 技术环节筒捷，成本低。外源d n a 导入利用整体植株的特定细 胞如卵细胞、受精卵、早期胚细胞或幼胚、幼苗、芽丛等分裂旺盛的器官 作为受体进行遗传转化，它们不需要人工进行培养，随着整体生长发育的 进程而完成外源d n a 整合与转化过程。其优点是减少了人工操作的环 节，降低其成本；二是不需抗生素等标记基因，减少基因污染：三是操作 简单，便于推广。 ( 3 ) 操作简单，适应面广。外源d n a 导入的受体可是体细胞或性细 胞，适合于单、双子叶植物的改良。 ( 4 ) 变异体稳定快，可缩短育种年限。外源d n a 导入是在自花授粉 的基础上进行，只有部分外源d n a 片段进入受体基因组，避免了供体基因 组与受体基因的全面重组，后代易稳定，变异体一般在3 4 代稳定。 1 2 作物遗传育种中常用的分子标记技术 1 2 1r f l p 的原理、方法及其特点 限制性片段多长度态性( r e s 砸c t i o nf r a g m e n tl e n g mp o l y m o r p h j s m s ， 简称r f l p ) 标记( 车永和，2 0 0 3 ：罗林广等，1 9 9 7 ；贾继增，1 9 9 6 ) ， 作为遗传分析的工具，始于1 9 7 4 年。1 9 8 0 年，b o s t e i n 等率先提出r f l p 可用作遗传标记，是较早应用于基因标记的一项分子标记技术；其基本原 理是将基因组d n a 用已知的限制性内切酶消化后产生大小不同的d n a 片段，电泳经s o u t h e m 印迹后，用放射性同位素( 通常用3 2 p ) 或非放 射性物质( 如地高辛、生物素等) 标记探针，与转移于支持膜( 硝酸纤维 膜或尼龙膜) 上的基因组d n a 杂交，经放射自显影显示出基因组d n a 中与探针同源的d n a 序列片段的大小，来检测不同遗传位点等位变异( 即 多态性) 。 与传统的遗传标记相比，r f l p 标记具有如下优点( 车永和，2 0 0 3 ： 贾继增，1 9 9 6 ；黄荣华，1 9 9 7 ) ：( 1 ) r f l p 标记具有共显性的特点，它 可以区别纯合基因型和杂合基因型，能够提供单个位点上较完整的资料： ( 2 ) 无表型效应，其检测不受环境条件和发育阶段的影响；( 3 ) 可利用 的探针很多，可以检测到很多遗传位点；( 4 ) 非等位的标记之间不存在上 位效应，因而互不干扰。但是r f l p 标记的应用也有一些限制性因素的存 在( 郑伟文等，2 0 0 2 ；车永和，2 0 0 3 ；罗林广等，1 9 9 7 ) ：此技术需要的 山东农业人学坝。l + 学位论文 d n a 量较大( 5 一1 0ug ) ，质量要求高，检测步骤多，周期长，成本高， 有时需要同位素的介入，且r f l p 标记不能区别距离很近的易位片段，因 而难以全面推广。 1 2 2r a p d 的原理、方法及其特点 随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l 币e dp o l y m o r p h i cd n a ，简称 r a _ p d ) 技术是由w i l l i 锄s ( 1 9 9 0 ) 和w e l s h ( 1 9 9 0 ) 于1 9 9 0 年几乎同 时提出和建立的。主要用于研究生物的遗传多样性、亲源关系的分析、基 因组比较、生物的遗传作图以及某些特定基因的分子标记等。它以基因组 d n a 为模板，以一个富含g 、c ( g 十c 含量一般为5 0 7 0 ) 的随机 寡核甘酸序列( 通常为1 0 个碱基对) 作引物通过p c r 扩增反应，产生不 连续的d n a 产物，用以检测d n a 序列的多态性。 r a p d 标记技术具有无须知道所要检测的生物材料基因组的d n a 序 列的信息、简单易行、需要的d n a 量极少( 1 5 2 5 n g ) 、无放射性、实 验设备简单、周期短、遵从孟德尔遗传规律、引物具有广谱性等特点( 郑 伟文等，2 0 0 2 ；叶冰莹等，2 0 0 0 ) ，是目前较为流行的分子标记手段之一。 但是，绝大部分r a p d 标记是显性标记，不能区分基因型是纯合或是杂 合的，每个标记提供的信息量少，且受反应条件影响较大，最主要的是该 方法在一些作物上扩增产物的稳定性差。 1 2 _ 3s s r 的原理、方法及其特点 简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er 印e a t ，简称s s r ) ，又称为微卫星 d n a ( m i c m s a t e l l i t ed n a ) 或简短串联重复序列( s h o r t d e mr e p e a t s e q u e n c e ，简称s t r s ) 。它是由几个核苷酸( 2 5 个) 为重复单位组成的 长达几十个核苷酸的重复序列，广泛分布于整个基因组的不同位置上，由 于重复次数的不同及重复程度的不完全造成了每个位点的多态性( 车永 和，2 0 0 3 ) 。可以根据某个微卫星d n a 两端的保守序列设计一对特殊引 物，进行p c r 特异性扩增，经聚丙烯酰胺电泳，就可显示不同基因型个 体在每个微卫星位点上的多态性。s s r 最早是在人类基凼组研究中发现 的( h 锄a de ta l ，1 9 8 2 ) 。目前，s s r 已被认为是一种建立遗传图谱、分 子标记辅助选择育种和基因定位的标准方法( z a n e le ta l ，2 0 0 0 ) 。 与r f l p 相比，s s r 检测的多态性频率要高很多，d n a 用量少，可 固槐d n a 导入花生“阳曲盯伽。私础l ) 变异株系的箍定挺j # a f l p 分析 靠性高；并且由保守序列确定的s s r 可以检测出复等位基因的差异，常 表现为共显性、结果重复性高、稳定可靠等优点。缺点是必须依赖每类微 卫星两端序列测序设计引物，而不像r a p d 引物可随机合成。 1 2 4a f l p 的原理、方法及其特点 扩增片段长度多态性( a m p l m c a t i o nf r a g m e n tl e n g t hp 0 1 y m o r p h i s m ， 简称a f l p ) 技术由荷兰人z a b e a l l 和v o s 于1 9 9 2 年发明，并于1 9 9 3 年 获得欧洲专利局专利，专利权属k e y g e n e 公司( z a b e a um ，v o sp1 9 9 3 ) 。 但是很快被人知道了并迅速传播开来，因此两人小得彳i 于1 9 9 5 年以论文 形式发表出来，又称选择性限制片段扩增标记( s e l e c t i v er e s m c t i o n f r a 毋n e n t a m p l i n c a t i o n ，简称s r f a ) ( v b s p1 9 9 5 ) 。 图1a f l p 技术路线示意图 f i g 1t h op r o c e s so f a f l pt e c h n i q u e 山东农业大学颂l 学位论文 a f l p 技术是r f l p 和”d 相结合的一种分子标记技术，其基本原 理是先将用内切酶降解的d n a 连上一个接头，再根据接头的核昔酸序列 和酶切位点设计引物( 即：引物= 接头序列+ 酶切位点序列+ 2 3 个核营 酸) ，然后进行p c r 特异性扩增，扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离检测( 图1 ) 。a f l p 技术的主要优点是具较高的可靠性和高效性、具 有共显性和显隐性、多态水平最高、检测位点最多、操作简便、分子认别 率最高、速度快、t m 值高、d n a 用量少等：缺点是相对比较费时耗财， 技术难度也高( 王和勇等，1 9 9 9 ；赵广才等，2 0 0 2 ) 。 1 3 分子标记在花生中的应用研究 1 3 1 遗传多样性的研究 对花生育种工作者而言，种质资源的遗传多样性及