（内科学专业论文）cd4cd25t细胞与移植物抗宿主病关系研究.pdf

郑州大学2 0 0 5 垴硕士学位论文c d 4 + c d + t 细胞与移植物抗宿主病关系研究 c d 4 + c d m + t 细胞与移植物抗宿主病关系研究 背景与目的 研究生 导师 仓顺东 宋永平 郑州大学第一附属医院血液科 郑州4 5 0 0 5 2 摘要 异基因造血干细胞移植( a l l o g e n e i ch e m a t o p o i e t i cs t e mc e l lt r a n s p l a n t a t i o n ，a l l o h s c t ) 成为近年来治疗恶性血液病、再生障碍性贫血、自身免 疫性疾病、某些遗传性疾病及实体肿瘤的种重要的手段。而移植物抗宿 主病( g r a f t - v e r s e h o s td i s e a s e ，g v h d ) 是a l l o h s c t 后主要并发症和死亡 的原因之一。g v h d 的发生分为3 个过程：由于预处理方案毒性、感染 或原发病引起细胞因子释放，使h l a 抗原在靶组织上表达增加。在受者 体内，成熟的供者t 淋巴细胞识别组织相容抗原并被激活，然后活化的供 者t 淋巴细胞增殖，并表达i l 2 受体( c d 2 5 ) 、分泌i l 一2 。( 要) i l - 2 激活供 者骨髓中新植活的单个核细胞分泌更多的炎性细胞因子，引发细胞因子瀑 布式暴发，直接导致g v h d 的各种病理损害。其中c d 。1 细胞介导严重的 急性( a ) g v h d 。c d 4 + t r e g 细胞也表达c d 2 5 ( i l - 2 a 链) ，能阻止异基因和 自体抗原反应性t 细胞的激活和扩增，具有能减轻g v h d 和自身免疫病的 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文c d 4 + c d 2 5 1 细胞与移植物抗宿主病关系研究 潜能，即可控制g v h d 同时又保留移植物抗白血病( g r a f t v e r s el e u k e m i a ， g v l ) 效应。f o x p 3 是编码s c u r f i n 蛋白的叉头螺旋转录因子，对 c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞生长及功能发挥起重要作用。f o x p 3 的基因转移，可使 c d a + t 细胞具有t r e g 细胞表型并能减轻自身侵袭性。c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞优 先表达f o x p 3 ，并产生调节细胞因子。基于c d 4 + t 细胞、c d 2 s + t 细胞在a g v h d 发生、发展中的作用，如能寻找到检测供者移植物中以及受者外周 血中的c d 4 + c d 2 5 1 细胞的水平的方法，并发现其与a g v h d 甚或慢性 ( c ) g v h d 的关系，对g v h d 的预测、早期诊断和治疗具有重大的意义。 材料与方法 选取2 8 例h l 完全相合的异基因外周造血干细胞移植( p e r i p h e r a l b l o o ds t e mc e l lt r a n s p l a n t a t i o n ，p b s c t ) 的患者。采用双色标记法应用流式 细胞仪检测采集的供者外周造血干细胞( p e r i p h e r a lb l o o ds t e mc e l l s ，p b s c s ) 中、发生g v h d 者及用c d 2 5 m a b 治疗后外周血中c d e s + t 细胞、c d 4 + c d 2 5 + t 细胞含量；实时定量p c r 检测仪同时检测以上标本中f o x p 3 m r n a 的表达。 统计学分析：所有资料采用s p s s1 2 0 软件处理，a = 0 0 5 为显著性检验水 准。 结果 1 发生a g v h d 者其供者移植物中c d 2 5 * t 细胞、c d 4 + c d 2 5 + t 细胞含 量较未发生a g v h d 者高。 2 发生a g v h d 者外周血中c d 2 5 + t 细胞、c d 4 + c d 2 5 + t 细胞表达较没 有发生a g v h d 者显著增高。 3 用c d 2 5 m a b 治疗后a g v h d 病人不但临床症状获得缓解，其外周血 郑州大学加0 5 届硕士学位论文 c d 4 + c d 2 5 1 细胞与移植物抗宿主病关系研究 中的中c d 2 5 + t 细胞、c d c d 2 5 + t 细胞表达也显著降低。 4 发生g v h d 者p b m c s 中f o x p 3 m r n a 表达水平比未发生g v h d 者 低。 结论 1 发生g v h d 时患者外周血中c d 4 + c d 2 5 + t 细胞应该是激活的t 细 胞，在g v h d 发生、发展中起重要作用。 2 使用流式细胞仪检测供者移植物中c d 4 + c d 2 5 * t 细胞含量可以预测 造血干细胞移植后g v h d 发生。 3 检测移植后患者外周血中c d 4 + c d 2 s + t 细胞、c d 2 5 * t 细胞有助于 g v h d 的诊断和其治疗后疗效监测。 4 c d 2 5 m a b 治疗和预防g v h d 疗效肯定。 5 ，使用荧光定量p c r 测量移植后发生g v h d 者p b m c s 的f o x p 3 m r n a 水平可以用来监测免疫调节细胞重建、g v h d 的发展以及指导g v h d 的治 疗。 关键词：造血干细胞移植；g v h d ；c d 4 + c d 2 5 + t 细胞；m r n a u l 郑州大学2 0 0 5 届硕十学位论文c d 4 + c d 2 5 + t 细胞与移植物抗宿主病关系研究 a s t u d yo n t h er e l a t i o no fc d 2 s + tc e l l 、 c d z c d 2 5 + tc e l lw i t hg r a f t - v e r s u s - h o s td i s e a s e p o s t g r a d u a t e ：c a n gs h u n d o n g s u p e r v i s o r ：s o n gy o n g p i n g d e p a r t m e n to fh e m a t o l o g y t h ef i r s ta f f i l i a t e dh o s p i t a l ，z h e n gz h o uu n i v e r s i t y z h e n gz h o u 4 5 0 0 5 2 a b s t r a c t b a c k g r o u n da n do b j e c t i v e a l l o g e n e i ch e m a t o p o i e t i cs t e mc e l lt r a n s p l a n t a t i o n ( a l l o - h s c t ) h a sb e e n a ne f f e c t i v e w a y t ot r e a t h e m a t o l o g i c a lm a l i g n a n c y , a p l a s t i ca n e m i a ， a u t o i m m u n ed i s e a s e sa n ds o m es o l i dt u m o r s a l t h o u g hi nt h ep a s td e c a d e sm a n y a d v a n c e sa n di m p r o v e m e n t sh a v ea c h i e v e d ，g r a f t - v e r s u s h o s td i s e a s e ( g v h d ) r e m a i n sam a j o rc o m p l i c a t i o na n dt h em a j o rc a u s eo fd e a t h t h ei n c i d e n c eo f g v h d ，t h o u g h tt ob em e d i a t e db yd o n o rt c e l l sa n dl i ei nt h r e em a i np r o c e s s e s ： 1 t r a n s p l a n tc o n d i t i o ni np r e p a r a t i v er e g i m e na n di n f e c t i o ni n i t i a t eac a s c a d e o f p r o i n f l a m m a t o r yc y t o k i n er e l e a s e w h i c hu p - r e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fh l a i n t a r g e tt i s s u e s 2 d o n o r st c e l l sr e c o g n i z em a j o rh i s t o c o m p a t i b j l i t ya n t i g e n so n r e c i p i e n tt a r g e tc e l l s ，t h i sm a k ed o n o r tc e l l sa c t i v a t ea n de x p a n s e ，t h e ni l - 2 r i v 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文c d 4 * c d 2 ，t 细胞与移植物抗宿主病关系研究 ( c d 2 5 ) r a p i d l ye x p r e s sa n dl e a dt ot h es e c r e t i o no fp r o i n f l a m m a t o r yc y t o k i n e s u c ha si l - 2 3 i l - 2a c t i v a t e sd o n o r stc e l l se n g r a f t e di nr e c i p i e n t ，tc e l l s p r o m o t e ”c y t o k i n es t o r m ”l e a d i n gt o t h em a s s i v e l ys e c r e t i o no fi n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s a n d d e v e l o p g v h d t h ec d ftc e l l sm e d i a t e dt h es e r i o u s a c u t e g v h d h o w e v e rt h er e g u l a t o r ytc e l l ( t r e g ) ，w h i c hi st h o u g h tt oc o n t a i n w i t h i nt h ec d 4 + c d z s + tc e l l ss u b s e ta n ds h o w e dap o t e n t i a lt oa t t e n u a t eg v h d a n da u t o i m m u n i t yi nm u r i n em o d e l f o x p 3 ，w h i c he n c o d e saf o r k _ h e a d w i n g e d h e l i xt r a n s c r i p t i o nf a c t o rd e s i g n a t e ds c u r f i n ，w a si d e n t i f i e da sak e yr e g u l a t o r y g e n er e q u i r e df o rt h ed e v e l o p m e n ta n df u n c t i o n a la c t i v i t yo ft r e gc e l l t of i n da u s e f u lw a yt oe x a m i n et h ef r e q u e n c yo fc d 4 + c d 2 5 + tc e l ls u b s e ta n dt oi d e n t i f y t h er o l ei n t h ei n c i d e n c ea n dd e v e l o p m e n to fg v h dw i l lb el a r g es i g n i f i c a n c e f o rt h ep r e d i c t i o na n dd i a g n o s i so ft h eg v h d m e t h o d sa n dm a t e r i a l t h es u b j e c ti n v o l v e di ni n c l u d e d2 8p a t i e n t sw h or e c e i v e da l l o - h s c ta n d 1 0n o r m a lv o l u n t e e r e dp e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s ( p b m c s ) d o n o r u s i n gf l o wc y t o m e t e r ( f c m ) w i t hl a b e l e dw i t hd o u b l ei m m u n o f l u o r e s c e n c e m o n o c l o n a la n t i b o d i e se x a m i n et h ef r e q u e n c yo fc d 4 + c d 2 5 + tc e l ls u b s e to ft h e p e r i p h e r a lb l o o ds t e mc e l l ( p b s c ) g r a f tf r o md o n o ra n dt h ep b m c s f r o mt h e p a t i e n t su n d e r g o n eh s c t t h er e a l - t i m eq u a n t i t a t i v e p c rr e a c t i o n sw e r e p e r f o r m e du s i n gt a q m a na s s a y ，t o t a lr n a w e r ee x t r a c t e da n dt r a n s c r i b e di n t o c d n a t h ef o x p 3 m r n aw e r ed e t e c t e di na b ip r i m5 7 0 0r e a l t i m e p c r d e t e c t i o ns y s t e m t h ed a t aw e r ea n a l y z e db ys p s s l 2 0s t a t i s t i c a ls o f t _ w a r e ，a v 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文c d 4 + c d 2 5 + t 细胞与移植物抗宿主病关系研究 e q u a l s0 0 5w e r ec o n s i d e r e ds i g n i f i c a n tt e s tl e v e l r e s u l t 1 p a t i e n t sw i t hg v h dh a ds i g n i f i c a n t l yh i g h e rf r e q u e n c yo fc d 2 5 + t 、 c d 4 + c d 2 5 1 c e l li nt h e i rd o n o rg r a f t st h a nt h o s ew i t h o u tg v h d 2 p a t i e n t sw i t hg v h dh a ds i g n i f i c a n t l yh i g h e rf r e q u e n c yo fc d 2 5 + t 、 c d 4 + c d 2 5 + ，rc e l li nt h e i rp b m c st h a nt h o s ew i t h o u tg v h d a n dt h en o r m a l p e r s o n s 3 p a t i e n t sw i t hg v h dt r e a t e db yc d 2 5 m a bn o to n l ym a d ec l i n i c a l a t t e n u a t eb u ta l s oh a ds i g n i f i c a n t l yl o w e rf r e q u e n c yo fc d 2 5 + tc e l l sa n d c d 4 + c d 2 5 + tc e l l s 4 f o x p 3 m r n al e v e l i np b m c sf r o m p a t i e n t s w i t hg v h dw a s s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h ep a t i e n t sw i t h o u tg v h d a n dt h en o r m a lp e r s o n s c o n c l u s i o n 1 c d 4 + c d 2 5 + tc e l l sa r et h ea c t i v a t e dt c e l li nt h eg v h dm o d e la n dp l a y a ni m p o r t a n tr o l ei nt h ei n c i d e n to fg v h d 2 d e t e r m i n i n gt h ef r e q u e n c yo fc d 2 5 + tc e l l sa n dc d 4 + c d 2 5 * tc e l l s i n d o n o rg r a f tb yf c mc a np r e d i c a t et h ei n c i d e n c eg v h d 3 e x a m i n i n gt h ef r e q u e n c yo fc d 2 5 + tc e l l sa n dc d 4 + c d 2 5 + tc e l l si n t h e p b m c so ft h ep a t i e n tw h oe x p e r i e n c e dg v h dc a nh e l pt od i a g n o s eg v h da n d t od i r e c tt h et h e r a p yo fg v h d 4 i ti se f f e c t i v et h a tc d 2 5 m a bt r e a t st h ep a t i e n tw i t hg v h d 5 d e t e c t i n gf o x p 3 m r n a l e v e li np b m c so ft h ep a t i e n tw i t hg v h dc a n 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文c d 4 + c d 2 5 * t 细胞与移植物抗宿主病关系研究 m o n i t o rr e g u l a t o r yt - c e l lr e c o n s t i t u t i o na n dt h ed e v e l o p m e n to fg v h db y r e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ep c r k e yw o r d s ：h s c t ；g v h d ；c d 4 + c d 2 5 + tc e l l ；m r n a 郑重声明 y7 8 2 6 6 2 本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的，学位论文没 有剽窃、抄袭等违反学术道德、学术规范的侵权行为，否则本人愿意 承担由此产生的一切法律责任和法律后果，特此郑重声明。 学位论文作者( 签名) ： 年月日 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文c d 4 4 c d 2 s + t 细胞与移植物抗宿主病关系研究 c d 4 + c d 2 5 + t 细胞与移植物抗宿主病关系研究 研究生仓顺东 导师宋永平 郑州大学第一附属医院血液科 河南郑州4 5 0 0 5 2 引言 异基因造血干细胞移植( a l l o g e n e i ch e m a t o p o i e t i c s t e mc e l l t r a n s p l a n t a t i o n ，a l l o h s c t ) 是近年来治疗恶性血液病、再生障碍性贫血、 自身免疫性疾病、某些遗传性疾病及实体肿瘤的有效手段【。近年来，外 周血及脐带血多能造血干细胞移植以及非清髓移植工作的逐渐开展，加上 支持治疗的进步和提高使得a l l o 。h s c t 使用范围不断扩大，移植后植活得 更快、发病率和致死率有所减轻，使其预后得到了明显改善，但是移植物 抗宿主病( g r a f t v e r s e h o s td i s e a s e ，g v h d ) 仍然是移植主要并发症和死亡 的主要原因1 3 , 4 1 。g v h d 的发生被认为是由供者t 细胞识别受者靶细胞的 主要组织相容性( m h c ) 抗原或次要组织相容性( m i l l ) 抗原介导的 5 , 6 1 。 g v h d 的反应分为3 个过程：由于预处理方案毒性感染或原发病引起细 胞因子释放，如l l - 1 、t n f q 、i l - 6 、自然杀伤细胞刺激因子( n k s f ) 等， 使h l a 抗原在靶组织上表达增加。在受者体内，成熟的供者t 淋巴细胞 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文 c d 4 * c d 2 5 * t 细胞与移植物抗宿主病关系研究 识别组织相容抗原并被激活，然后活化的供者t 淋巴细胞增殖，表达i l - 2 受体( c d 2 5 ) 、分泌i l - 2 。( 国i l - 2 激活供者骨髓中新植活的单个核细胞分泌 更多的炎性细胞因子如i l - 1 、i l - 6 、t n f 、y 一干扰素等，引发细胞因 子瀑布式暴发，直接导致g v h d 的各种病理损害。g v h d 可以通过供受者 血清或h l a 分子相合而减轻。尽管h l a 分子相合，g v h d 在相关供者移 植( m r t ) 移植后病人仍有3 0 5 0 的发病率，且在h l a 不相合或无关 供者移植( m u d ) 供者有更高的发病率1 7 1 。供者移植物特征与g v h d 的 发生风险有关，包括：c d 3 4 + t 细胞、c d 3 + t 细胞、t n 细胞等1 8 , 9 1 ，c d 4 + t 细胞更是介导严重的a g v h d j o , h ，而供者t 细胞的激活与增殖是g v h d 产生的主要过程。在鼠模型已经发现了能够调节g v h d 发展的细胞和细胞 因子1 1 2 1 3 1 。c d 4 + t r e g 细胞，表达c d 2 5 ( i l - 2 a 链) ，( 在鼠模型) 具有能减 轻g v h d 和自身免疫病的潜能，即可控制g v h d 同时有保留g v l 效应 1 4 j 5 , 1 6 1 。c d 4 + t r c g 细胞在维持自身抗原的耐受上起关键的作用，并且可诱 导对异体抗原的无反应性 1 7 , 1 8 , 1 9 】。这些调节细胞阻止异基因和自体抗原反应 性t 细胞的激活和扩增。f o x p 3 是编码s c u r f i n 蛋白的叉头螺旋转录因子， 对c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞生长及功能发挥起重要作用【1 9 , 2 0 1o f o x p 3 的基因转移， 可使c d 4 + t 细胞具有t r e g 细胞表型并能减轻自身侵袭性1 1 9 , 2 0 1 。 c d 4 + c d + t r e g 细胞优先表达f o x p 3 ，并产生调节细胞因子，如i l - 4 、i l 1 0 或t g f b t 2 1 1 。t a y l o r 等在鼠模型中发现回输体外激活和扩增的 c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞能够缓解g v h d 的发展【2 2 1 。其他鼠研究己证实输注供 者来源的c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞能以一种剂量依赖的方式抑制g v h d 的发展 1 2 3 , 2 4 , 2 5 】。由此推测：在人类供者移植物富集、扩增或两种方法共用得到的 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文 c d 4 + c d 2 5 + t 细胞与移植物抗宿主病关系研究 c d 4 + c d 2 5 + t 细胞可以降低g v h d 的发生。鉴于上述c d 4 + c d 2 s + t 细胞的作 用仅在实验动物中发现，我们决定在临床中观察c d 2 5 _ h r 细胞、c d 4 + c d 2 5 + t 细胞在g v h d 的发生、发展中的作用。目前在国内尚未见相关报道。 我们采用双色标记法应用流式细胞仪检测供者移植物中、发生g v h d 者外周血中c d 4 + c d 2 5 + t 细胞的含量，探究h 】l a 相合同胞h s c t 者的 g v h d 和供者移植物中c d 4 + c d 2 5 细胞含量之间的关系，以及h s c t 后 发生g v h d 者外周血中c d 4 * c d 2 5 + t 细胞含量与g v h d 之间的关系；同时 使用r e a l t i m e 定量p c r 检测发生g v h d 者p b m c s 中f o x p 3 m r n a 表达 水平。辨明c d a + t 细胞、c d z s * t 细胞、c d 4 + c d 2 5 + t 细胞在人类a l l o h s c t 中的身份以及他们在g v h d 发生、发展中的作用，为预测h s c t 后受者发 生g v h d 的风险、协助g v h d 的早期诊断以及判断c d 2 5 m a b 治疗g v h d 的效果提供重要依据。 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文c d 4 + c d 2 5 + t 细胞与移植物抗宿主病关系研究 材料与方法 1 试剂与仪器 1 1 主要仪器 1 1 1 流式细胞仪：e p i c sx l 型，b e c k m a nc o u l t e r 公司。 1 1 2 高速离心机：g r 4 1 2 型，法国。 1 1 3 低温冷冻高速离心机：m r l 8 2 2 型，y x q s q 4 1 2 8 0 - b 型，法国。 1 1 4 荧光定量p c r 检测仪：a b i pp r i s m 5 7 0 0 检测仪，美国p e 公司。 1 1 5 t o k a 低温冰箱：u w - 3 6 0 型，俄罗斯。 1 1 6 洁净工作台：北京半导体设备一厂。 1 1 7 g r a n t 恒温水浴箱：g d 1 2 0 型，英国。 1 1 8 高速台式离心机：t g l 1 6 c 型，上海安亭科学仪器厂。 1 1 9 振荡器：k - 5 5 0 g e 型，美国。 1 1 1 0 微量振荡器：x k 9 6 型，江苏姜堰市新康仪器厂。 1 1 1 1 普通光学显微镜：c x 一3 1 型，日本o l y m p l u s 公司。 1 1 1 2 电热鼓风干燥箱：c s l 0 1 2 a b 型，重庆试验设备厂。 1 1 1 3 电热手提式低水控压力蒸汽灭菌器：上海医用核子仪器厂。 1 2 主要试剂 1 2 1 淋巴细胞分离液( 相对比重1 0 7 7 9 l ) ：中国医科院血液学研究所。 1 2 2 p b s 储存夜k c i1 7 5 9 ，k h 2 p 0 41 5 9 ，n a c l5 4 9 ，n a 2 h p 0 4 7 h 2 0 1 6 3 7 5 9 加去离子水至1 0 0 0 m l 。 1 2 3 p b s 应用液：取p b s 储存液1 6 m l 补充三蒸水至4 0 0 m l ，高压灭菌， 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文 c d 4 + c d 2 5 + t 细胞与移植物抗宿主病关系研究 p h = 7 4 。 1 2 4 o p t i c y l ec 溶血素：b e c k mc o u l t 公司。 1 2 5 t r i z o l 试剂：美国i n v e i t r o g e nl i f et e c h n i o l o g i e s 公司。 1 2 6 碱基随机引物序列：美国a p p l i e db i o s y s t e mi n c 公司，宝生物工程( 大 连) 有限公司代理。 1 2 7 s u p e r s c r i p ti i 逆转录酶试剂盒：i n v e i t r o g e n l i f et e c h n i o l o g i e s 公司。 1 2 8 c d 4 f i t c c d 2 5 p e c d 3 p c 5 抗体：美国i q 公司，深圳晶美生物工程 公司代理。 1 2 9 羊抗鼠i g g l f i t c i g g l - p e i g g l 一p c 5 抗体：美国i o 公司，深圳晶美 生物工程公司代理。 2 病例特征 2 1 病例 选取2 8 例在2 0 0 3 年7 月2 0 0 5 年2 月问在河南省肿瘤医院进行的h l a 全相合a l l o h s c t 患者，中位年龄2 2 ( 5 4 6 ) 岁。慢性粒细胞白血病( c m l ) 慢性期1 9 例，急性髓细胞白血病( a m l ) 6 例，急性淋巴细胞白血病( a l l ) 2 例，菲霍奇金淋巴瘤( n h l ) 1 例。其中2 1 例c m l 为同胞全相合，7 例 为非血缘全相合。 表1 病例资料 2 2 预处理方案( 移植当天为“0 ”天，移植前为“，移植后“+ ”) 。 马利兰( b u ) 、环磷酰胺( c y ) 方案：b ul m g k g l d 一，q 6 h ，口服( 8 d 至5 d ) ；c y6 0m g k g t d 1 ( 4 d 至3 d ) 。 郊州大学2 0 0 5 届硕十学位论文c d 4 + c d 2 5 细胞与移植物抗宿主病关系研究 改良b u c y 方案1 ：羟基脲2 o g m 2 ，q 1 2 “，口服( 9 d 至8 d ) ；阿糖胞 苷2 0 9 m 2 ，q d ，( 7 d 至6 d ) ；司莫司汀0 2 9 m 2 ，5 d 口服；b ul m g k g - 1 d ， q 6 h ，口服( - 5 天至一4 天) ；c y l 8 9 m 2 ，q d ，( 一3 天至一2 天) 。 改良b u c y 7 操2 ：阿糖胞苷2 0 9 m 2 ，q d ，( - 8 d 至7 d ) ；司莫司汀0 2 9 m 2 ， 5 d 口服；b ul m g k g - x d 一，q 6 h ，口服( - 6 天至4 天) ；c y l 8 9 m 2 ，q d ，( - 3 天至2 天) 。 2 3 g v h d 的诊断和预防 急性g v h d ( a g v h d ) 、慢性g v h d ( c g v h d ) 的诊断和分级采用西 雅图标准【2 4 1 。 g v h d 的预防：采用经典的环孢素a ( c s a ) + 短程氨甲蝶呤( m t x ) 为主的预防方案：c s a1 5 2 5 m g k g - 1 d ，从1 d 开始持续2 4 小时静滴，根 据g v h d 发生及胃肠道反应情况改口服4 5 m g k g 1 d ，+ 5 0 d 逐渐减量， 每周减5 ，+ 1 8 0 d 停用，定期检测全血c s a 浓度，+ 1 0 0 d 内维持在2 0 0 3 5 0 # g l ；m t x ：+ 1 d ：1 5 m g m 2 ，+ 3 d 、+ 6 d 、+ l l d ：1 0m g m 。 3 c d 2 s 分析 3 1 制备标本 3 1 1 采集标本：取回输前移植物1 5 m h 移植前、0 天、+ 1 、+ 2 、+ 3 、+ 4 、 + 6 、+ 8 周，用无菌抗凝管收集患者外周血1 5 2 0 m l 。 3 1 2 标记样本管和对照管。 3 1 3 样本管加c d 4 f i t c c d 2 5 p e c d 3 - p c 5 抗体双色荧光试剂2 0 u l ，相应 对照管加羊抗鼠i g g l f i t c i g g l p e i g g l 一p c s 抗体2 0 u l 。 3 1 4 每管加待测样本1 0 0 u l ，混匀，室温避光孵育2 0 r a i n 。 3 1 5 加o p t i c y l ec 溶血素5 0 0u l ，混匀室温避光1 0 分钟。 3 1 6 加p b s 试剂5 0 0 u i ，混匀，室温避光放置1 0 分钟。 3 1 7 1 5 0 0 转m i n 离心1 0 r a i n ，去上清。 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文c d 4 + c d z s * t 细胞与移植物抗宿主病关系研究 3 1 8 加入5 0 0 u lp b s 重悬细胞，上机分析。 3 2 用流式细胞仪评价c d 2 5 的表达 染色后用b e c k m a nc o u l t e re p i c sx l 型细胞仪测量并用s y s t e mi i 软件 分析。在前向散射光和侧向散射光的散点图上圈淋巴细胞设门，分析c d 3 + 细胞上c d 4 、c d 2 5 抗原的表达；圈c d 4 细胞门，分别分析c d 4 + 细胞表面 c d 2 5 抗原的表达。 4 实时定量p c r 4 1 m r n a 的提取 4 1 1 淋巴细胞分离： 在离心管内加2 m l 淋巴细胞分离液，将送检样品缓缓加入。离心，1 5 0 0 转分2 0 分钟。小心收集灰白层到1 0 m l 尖底离心管中，加p b s 至1 0 m i 洗涤，1 2 0 0 转分5 分钟冷冻离心后。弃上清，沉淀即为淋巴细胞。 4 1 2 提取r n a ： 采用t r i z o l 试剂将淋巴细胞加t r i z o ll m l 或8 0 0 u l ，氯仿( 试剂1 ) 2 0 0u l ，剧烈震荡3 0 秒，混合均匀，( 用振荡器进行) 。转移至e p 管中， 1 2 0 0 0 转分4 度离心5 分钟。( 用0 1 程序) 小心将上清转移至e p 管中， 加等体积的异丙醇( 试剂2 ) ，轻轻颠倒混合，1 2 0 0 0 转分4 度离心5 分 钟。( 用0 1 程序) 移去上清，沉淀用乙醇洗涤，在沉淀管内加入7 0 0u 1 7 0 的乙醇，颠倒混合后，1 2 0 0 0 转分冷冻离心2 分钟，洗涤2 次，移去上 清，室温下干燥r n a 后以无r n a 酶的水2 0 u l 溶解。- 2 0 4 c 保存备用。 4 2 m r n a 逆转录为e d n a 于冰盒中迅速冷却r n a ( 1 5 u g ) 2 2 u l ，加6 b p 随机引物( 1 0 0u g m 1 ) 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文 c d 4 + c d 2 5 1 细胞与移植物抗宿主病关系研究 置p c r 仪。加入8 u l5 第1 链缓冲液，4 u l0 1 m m o l l 二硫苏糖醇( d h r ) ， 2 u l1 0 m m o l ld n t p ，微离心混匀，4 2 。c 恒温2 m i n 。加入s u p e r s c r i p tt mi i 逆转录酶2 u l 混匀，4 2 。c5 0 m i n ，7 0 。c 1 5 m i n ，取出8 0 。c 保存备用，临用前 1 ：1 0 稀释。 4 。3 扩增引物设计 以甘油醛3 一磷酸脱氢酶( g a p d h ) 作为内参照基因。 g a p d h 上游引物：5 - c c a ( _ t c g ( 玎c a g a c a c c a b 3 、； 下游引物：5 、g g c a a c a a t a t c c c a c 兀私c c a g a g t - 3 、； f x o p ，上游引物：5 - g g c ac t c c t c c a g g a c a g 3 、： 下游引物：5 - g c t g a t c a t g g ( 了g g g c t ( 善3 、； 5 - f a m a n t c a t g c a c c a g c t c t g a a c g g t a m r a 3 、引物设计要 求扩增区跨越内含子外显子的界限以减小基因组d n a 的扩增。 4 4 上机分析 荧光定量p c r 检测仪上机分析，p c r 循环条件：1 5 s 、9 5 ，1 5 s 、 9 4 9 c ，6 0 s 、6 0 ，4 0 5 0 循环，每个样本的扩增量为2 5 u l ，每一标本的相 对表达由每一标本的标准表达与g a p d h 的标准表达相比而得。 5 统计学处理 所有数据应用国际通用统计学分析系统s p s s l 2 0 统计学软件进行统 计分析，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用方差分析，数据分析前 均经方差齐性检验。a = 0 0 5 作为统计学检验有意义的水平。 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文 c d r c d 2 5 细胞与移植物抗宿主病关系研究 结果 1 供者移植物中c d 2 5 + 、c d 4 + c d o t 细胞检测( 见图1 、2 、3 ；表2 ) 图l ： 正常人的c d 4 + c d 鸪+ t 细胞双标流式结果图 9 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文c 仇+ c d 如细胞与移植物抗宿主病关系研究 图2 ：无g v h d 者供者移植物中c d 4 + c d 笛+ t 细胞的表达 图3 ：发生g v e i d 者供者移植物中c 矾+ c + t 细胞的表达 1 0 郑州大学2 0 0 5 届硕十学位论文c d 4 + c d + t 细胞与移植物抗宿主病关系研究 表2 供者移植物中c 1 ) 2 5 + 、c i ) 4 + c d 2 s + t 细胞含量( ) 比较( i s ) 注：c d 4 + c d 2 s + t 细胞在正常人和患者中的比较t = 2 8 4 7 ，p 0 0 5 ； ”c d z s + t 细胞在止常人和患者中的比较t = 3 9 1 4 ，p 0 0 5 。 发生a g v h d 者其供者移植物中c d z s + t 细胞、c d 4 + c d 2 5 1 细胞含量 较未发生a g v h d 者高。 2 患者外周血中c d 2 5 + 、c d 4 + c d 2 5 + t 细胞的检测( 见图4 、5 ；表3 ) 表3 ：外周j f i l 中c d 2 s + t 细胞、c d 4 + c d 2 5 + t 细胞含量( ) 比较( i s ) 注：+ c d 。+ c d j t 细胞在止常人组、a g v h d 组、n o n a g v h dn 2 _ n 的f l 较f = 1 0 0 7 3 ，p 0 0 5 a g v h d 组与正常人组、n o n a g v h d 组相比均有显著性差异。 + c d 2 s + t 细胞在正常人纽、a g v h d 组、n o n a g v h d 绢之问的比较f = 2 0 8 0 0 ，p 0 0 5 止常人组与a g v h d 组、n o n a g v h d 组相比均有显著件著异。 发生a g v h d 者外周血中c d 2 5 + t 细胞、c d 4 + c d 2 5 + t 细胞表达较没有发 生a g v h d 者显著增高。 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文c d 4 + c 吼s h r 细胞与移单塑垣堕圭堕薹墨堑窒 图4 ：发生g v i t d 者外周血中c d 4 。c i h s + t 细胞的表达 图5 ：未发生g 哪者外周血中c 仉+ c d 2 5 + t 细胞的表达 郑州大学2 0 0 5 届硕士学位论文 c d 4 + c d 2 s 细胞与移植物抗宿主病关系研究 3 发生g v h d 者用c d 2 s 单克隆抗体治疗后c d 2 s + t 细胞和c d 4 + c d