（内科学专业论文）免疫毒素il3pe38kdel原核表达载体的构建.pdf

重庆医科大学硕士研究生学位论文 免疫毒素i l 3 一p e 3 8 k d e l 原核表达载体的构建 摘要 目的：构建人白细胞介素( i l 3 ) 与假单胞菌外毒素片段 ( p e 3 8 l e l ) 融合基因的原核表达载体，为进一步表达具有杀伤作 用的融合蛋白奠定基础。 方法： 1 ) 提取人外周血总r n a ，经r t - p c r 扩增出i l 一3 基因，并用二 次p c r 方法引入柔性连接肽l i n k e r 片段，p c r 产物插入载体p q e 3 0 中，转化克隆进行酶切鉴定及d n a 测序肯定克隆结果。 2 ) 以p g e x 4 t - 1p e 3 8 k d e l 质粒为模板，p c r 扩增p e 3 8 k d e l 片段，p c r 产物经双酶切后插入到p q e 3 0 一i l 一3 质粒中构建 p q e 3 0 i l 3 一p e 3 8 k d e l ，连接产物转化克隆经酶切鉴定及d a n 测序 鉴定。 结果：本研究成功构建了原核表达质粒p q e 3 0 i l 3 p e 3 8 k d e l 经酶切鉴定与预期结果吻合，核酸序列测定显示插入的i l 3 基因及 p e 3 8 k d e l 基因与g e n e b a n k 报道的序列完全一致。 关键词：重组毒素，人白介素3 ，假单胞菌外毒素( p e 3 8 i e l ) 重庆医科大学硕士研究生学位论文 c o n s t r u c t i o no ff u s i o ne x p r e s s l 0 np l a s m id o b j e c t i v e ： p q e 3 0 - i l 3 - - p e 3 8 k d e l a b s t r a c t t oc o n s t r u c tt h ef u s i o ng e n eo fh u m a ni n t e r l e u k i n 一3a n dt r u n c a t e d p s e u d o m o n a se x o t o x i na ( p e 38 k d e l ) m e t h o d s ： 1 ) h u m a ni n t e r l e u k i n3c d n aw a sc l o n e df r o mp e r i p h e r a lb l o o dc e l l s t h r o u g h r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s c h a i nr e a c t i o n ( r t - p c r ) t h e ( g l y 4 s e r 2 ) 2l i n k e rw a si n s e r t e db yp c r t h ec l o n e dg e n ew a si n s e r t e di n t o p l a s m i dp q e 3 0w h i c hw a sp l a s m i dp q e 3 0 一i l 3 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d s w a si d e n t if i e dw i t hd n a s e q u e n c ea n de n d o n c l e a s e s 2 ) t h et r u n c a t e dp s e u d o m o n a se x o t o x i n a ( p e 38 k d e l ) g e n ew a s a m p l i f i e db yp c rf r o mf u s i o ne x p r e s s i o np l a s m i dp g e x 一4 t - 1 p e 38 k d e l a n dc l o n e di n t o p l a s m i dp q e 3 0 一i l 3 w h i c hw a s p l a s m i d p q e 3 0 - i l 3 一p e 3 8 k d e l ，t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d s p q e 3 0 - i l 3 - - p e 38 k d e l w e r ei d e n t i f i e dw i t hd n a s e q u e n c e a n d e n d o n u c i e a s e s c o n c l u s i o n ： t h ef u s i o n e x p r e s s i o np l a s m i dp q e 3 0 - 1 3 p e 38 k d e lh a sb e e n 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 c o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y k e y w o r d s ：r e c o m b i n et o x i n ，i n t e r l e u k i n3 ，p e 38 k d e l 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 英文缩写 a m p b p d d h 2 0 d n a d n t p e b e d t a l b k b o d p c r r p m t s c d n a e p h l a m i n r n a r n a s e i m p c r s “l p h 英汉缩略语名词对照 英文全称 a m p i c i l l i n b a s ep a i r d o u b l ed i s t i l l a t i o nw a t e r d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y n u c l e o s i d e st r i p h o s p h a t e e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i n i t r i l o t e t r a a c e t i ca c i d l u r i a b e r t a n im e d i u m k i l o b a s e o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e v o l u t i o np e rm i n u t e t r i s ( h y d r o x y m e t h y1 ) a m i n o m e t h a n e c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e p p e n d o r f h o u r l bm e d i a c o n t a i n i n ga m p i c i l l i n m i n u t e r i b o n u c l e i ca c i d r ib o n u c l e a s e 中文全称 氨苄青霉素 碱基对 双蒸水 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 l b 培养基 千碱基对 光密度 聚合酶联反应 每分钟转速 三羟甲氧氨基甲烷 互补d n a 微量离心管 小时 含氨苄青霉素的l b 培养液 分钟 核糖核酸 r n a 酶 r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i n 逆转录聚合酶链反应 r e a c t i o n s e c o n d m i c r o l i t e r p o w e ro fh y d r o g e n 秒 微升 酸碱度 重庆医科大学硕士研究生学位论文 d e p c t a q e c o l i d i e t h ylp u r o c a r b o n t e t h e r m o s a q u a t i c u s ( d n ap o l y m e r a s e ) e s h e r i c h i ac o l i 2 二乙基焦碳酸盐 耐热d n a 聚合酶 大肠杆菌 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 学位论文作者签名：边i 盘日期：硅翌墨： 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期问论文工作的知识产权单位属重庆医科大学本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 重庆医科大学硕士研究生学位论文 免疫毒素i l 一3 一p e 3 8 k d e l 原核表达载体的构建 厶j 一 刖吾 选题的目的和意义 目的：构建免疫毒素i l 3 l p e 3 8 k d e l 原核表达载体。 意义：免疫毒素( i m m u n o t o x i n s ) 是将具有导向能力的分子( 载体) 与具有细胞 毒性的分子( 毒素) 偶联而成的具有细胞杀伤能力的杂和分子，具有较强的导向 特异性，可以明显减少对正常细胞的损害。假单胞菌外毒素( p e ) 是常见的细 菌毒素，通过抑制蛋白质合成使细胞死亡，具有很强的毒力。将p e 进行改造后 即可得到p e 3 8 k d e l 。p e 3 8 k d e l 具有较小的分子量、更好的渗透性，更强的杀 伤毒性。近来研究表明急性髓性白血病w l 的白血病干细胞表达c d l 2 3 ，c d l 2 3 即为白细胞介素3 受体( i l 3 r ) a 链，在正常造血早期细胞中可以表达该受体，但 正常造血干细胞并不表达。i l 一3 受体被认为是a m l 干细胞的相对特异性标志， 细胞实验也证实a m l 细胞能表达i l 一3 受体并对外源性i l 3 有反应，因此i l 3 受 体可作为选择性治疗a m l 的新靶点。本研究旨在构建免疫毒素i l 3 一p e 3 8 k d e l ， 利用其i l 3 与i l 3 受体的选择性结合后内化，介导生物毒素p e 3 8 k d e l 特异性杀 伤白血病干细胞，同时可降低毒素对正常组织细胞的损害，减少毒副作用，可望 成为一种新的治疗急性髓性白血病方法。 国内外研究现状 假单胞菌外毒素( p e ) 为单链蛋白，全长6 1 3 个氨基酸，包括3 个功能区， 从n 端到c 端依次为ia 区、ib 区、i i 区和i i i 区。将p e 的ia 区、部分ib 区 去掉并将p e 的c 端氨基酸r e d l k 变为k d e l 即可得到p e 3 8 k d e l ，可以减小 分子量，极大的提高其跨膜能力和结合活性，增强毒素的杀伤力。近年来，用p e 与单克隆抗体或细胞因子融合成免疫毒素治疗肿瘤的研究逐渐增多。将粒细胞集 落刺激因子( g c s f ) 与p e 4 0 构成免疫毒素g c s f p e 4 0 ，对表达g c s f 受体的 白血病细胞有高度选择性杀伤作用，而对正常造血影响很小。此外，i l 6 p e 4 0 、 抗t a c ( f v ) p e 4 0 近来还被成功应用于移植物肿瘤细胞净化处理。近来研究表明 6 重庆医科大学硕士研究生学位论文 i l 3 受体a 链( c d l 2 3 ) 存在于急性髓性白血病a m l 的白血病干细胞表面，并 可作为a m l 干细胞相对特异标志。1 9 9 6 年，c h u n g h u a n gc h a r t 等首先构建了重组 毒素i l 3 d t 3 9 0 ，并经进一步的细胞和动物实验证明了i l 3 d t 3 9 0 对a m l 的选 择性杀伤作用。但白喉毒素d t 的治疗剂量与中毒剂量非常接近，且人群中因预 防免疫常有d t 抗体而影响其临床应用。p e 与d t 的杀伤细胞机制类似，但对某 些细胞如a 4 3 l 、k b 及m c f 7 细胞株，p e 的毒性更强，且p e 在人体的耐受剂量 较大，治疗剂量空间更大。目前i l 3 与p e 重组毒素靶向治疗a m l 尤其是观察 其对a m l 干细胞作用的研究尚未见报道，有重要研究价值。 研究内容 利用基因工程技术构建融合基因i l 3 p e 3 8 k d e l ，将其克隆至原核表达载体 p q e 3 0 ，得到重组质粒p q e 3 0 一i l 3 p e 3 8 k d e l 。 1 以人总r n a 为模板，根据g e n e b a n k 的i l 3 序列设计引物，进行r t - p c r ， 扩增i l 3 片断，利用p c r 技术在i l 3 片断的3 端引入一段l i n k e r 。 2 以质粒p g e x 4 t - 1 p e 3 8 k d e l 为模板，进行p c r 扩增p e 3 8 k d e l 片断。 3 连接i l 3 l i n k e r 及p e 3 8 k d e l 片断，克隆至真核表达载体p q e 3 0 中并鉴定。 理论与实际意义 免疫毒素i l 3 l p e 3 8 k d e l 的i l 3 载体能够特异识别a m l 白血病干细胞 的i l 3 受体( c d l 2 3 ) ，经该受体快速内化机制将毒素p e 3 8 l e l 带至胞浆发挥 毒作用，选择性杀伤a m l 白血病干细胞。本课题构建的免疫毒素 i l 3 l p e 3 8 k d e l 的原核表达载体为今后重组蛋白质的表达、生物学效应的观 察、动物实验乃至临床应用奠定了基础。 7 本课题研究的技术路线 正常人总r n a r t p c r 土 i l 3 p c r 重庆医科大学硕士研究生学位论文 p q e 3 0 i l 3 - li n k e r 质粒p g e p x c r 4 t 一丁p e 3 8 k 。e l p q e 3 0 - i l 3 p e 3 8 k d e l 8 an d上 r 工ek k n 1l 一 2 jlr l 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 材料 1 1 菌种和质粒 1 1 1 大肠杆菌d h 5 a 来至重庆医科大学检验系实验室。 1 1 2 原核表达载体p q e 3 0 高效非融合原核表达质粒，全长3 4 6 2 b p ，氨苄青霉素抗性，表达的目的蛋白 含有便于纯化和检测的h i s t a g ，来至重庆医科大学肝炎研究室。 1 1 3 质粒p g e x 4 t - l p e 3 8 l 如e l 含p e 3 8 k d e l 序列的p g e x - 4 t - 1 p e 3 8 k d e l 来至四川大学华西医学院微生物 教研室 1 2 工具酶和主要试剂 b a m h i 、k p n l 、h i n d i i i 限制性内切酶、t 4 d n a 连接酶、t a q d n a 连接酶、 t a q d n a 聚合酶逆转录试剂盒购于大连宝生物工程有限公司。胶回收试剂盒、质 粒小量抽提试剂盒购于上海华舜生物有限公司。 1 3 标本 人外周血来自健康志愿者。 1 4 、引物 1 4 1 根据g e n e b a n k 报道的人i l 3 编码序列，由计算机辅助软件 ( p r i m e rp r e m i e r5 0 ) 设计引物。 正向引物p 15 - t c g c q q ! g c t c c c a t g a c c c a g 一3 ( 下划线为b a m hi 酶切位点) 反向引物p 25 - g c g q 鱼螋a a a g a t c g c g a g g c t c 一3 ( 下划线为e c o ri 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 酶切位) 反向引物p 35 - a g g 鱼鱼i a c t a c c a c c t c c t c c a c t t c c a c c t c c a c c a a a g a t g c g g a g g c t c - 3 ( 下划线为k p ni 酶切位点) 1 4 2 根据p e 3 8 k i ) e l 全长序列设计特异引物 正向引物p 4 5 g g q q i g a a t t c g a g g g c g g c a g 3 ( 下划线为k p ni 酶切位点1 反向引物p 5 5 - g c c c 笪三g 匹g c g g c c g c 仉g a g c 一3 ( 下划线为h i m d l i i 酶切位点1 以上引物均由大连宝生物工程有限公司合成，并经聚丙稀凝胶电泳纯化。 1 5 实验室所用到的试剂及其配制 1 5 1l b 培养液 将蛋白胨1 0 9 酵母提取物5 9 ，氯化钠1 0 9 溶解在0 9 5 l 去离子水中。配成i l 的l b 培养液，经1 2 1 高压灭菌2 0 分钟后，冷却至不烫手( 约7 0 ( 2 ) ，加入氨 苄青霉素至工作浓度5 0 i - t g m l ，4 。c 冰箱中保存。 1 5 2l b 琼脂平板 按上述比例加入l b 培养液各种成分，再加入1 5 的琼脂，经1 2 1 高压灭 菌2 0 分钟，在超净台中倒入水平放置的无菌干燥培养皿中，一般9 0 m m 培养皿 中倒入2 0 m l ，待琼脂凝固后成为1 5 的l b 培养基，可直接使用或倒置后放入4 。c 冰箱中保存。如需含相应抗性的l b 琼脂平板，则在高压灭菌后，待琼脂冷却至 不烫手( 约7 0 。c ) 时，加入相应抗生素，轻轻摇动混均后倒入培养皿中，待琼脂 冷却凝固或使用。 1 5 3t b et r i s 硼酸( t b e ) 缓冲液 5 幸储存液l ：5 4 9 t r i s 碱，2 7 5 9 硼酸，2 0 m l0 5 m o l le d t a ( p h 8 0 ) 0 5 m o l l e d t a ( p h 8 0 ) 1 0 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 5 42 5 x g a l ( 5 一溴一4 氯一3 吲哚一p 一半乳糖苷) 溶解2 5 r n gx g a l 于l m l 的二甲基甲酰胺( d m f ) ，用铝箔包裹装液管，储存 于2 0 。 1 5 51 0 m g m l 的溴化乙锭( e b ) 小心称取1 9 溴化乙锭，轻移至广口瓶中，加1 0 0 m l 水，用磁力搅拌器搅拌 至完全溶解，用铝箔包裹盛液管于4 。c 储存。 1 5 6d e p c h 2 0 溶液 在去离子水中，加入d e p c 使其终浓度为0 i ( d e p c h 2 0 ) ，高压灭菌，分 装至处理过的e p 管中，- - 2 0 保存。 1 6 主要实验仪器 g s 1 5 r 低温离心机美国b e c k m a n 公司 低温高速离心机美国b e c k m a nc o u lt e rt a - - m c 公司 凝胶成像系统法国v i l b e rl o u r m a t 公司 a m e r s h a m 电泳设备p h a r m a c i ab i o t e c h 公司 d y y - i i i 型电泳槽北京六一仪器厂 t h z c 恒温震荡器广州深化生物技术有限公司 g n p 9 0 8 0 型隔水式恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司 p k 6 0 0 型电热恒温水槽上海精宏实验设备有限公司 p c r 仪p e r k i n e l m e rd n at h e rm a lc y c l e r p c r 仪 e p p e n d o r fm a s t e r c y c l e rg r a d i e n t 电泳箱青岛h a l e r 公司 s l h 电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司 g r a n t x b 7 0 制冷机浙江格兰特 s w - c t - i f 型洁净工作台苏, k l - i 安泰空气技术有限公司 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 方法 2 1 外周血总r n a 提取 2 1 1 外周血总r n a 提取 1 ) 用e d t a 抗凝管真空采集健康自愿者的外周血约2 m l ，于超净台中加入2 m l d h a n k s 液使之混均。 2 ) 取1 0 m l 玻璃离心管，加入4 m 1 人淋巴细胞分离液，将上述外周血混合液轻轻 滴入玻璃离心管中，使界面清晰。 3 ) 2 0 0 0 r p m 离心2 0 分钟，可见管中液体分为3 层，血清d h a n k s 液血小板；单 个核细胞：粒细胞：红细胞；用巴氏吸管插入单个核细胞层( 中间白色层) ， 小心吸取细胞置于另一离心管中，再加入4 倍体积的d h a n k s 液于离心管中 混合。 4 ) 1 5 0 0 r p m 离心1 5 分钟，弃上清。 5 ) 1 5 0 0 r p m 离心1 5 分钟，弃上清，取剩余液体l 滴于显微镜下计数。 6 ) 用吸管将上述细胞悬液吸至d e p c 处理过的e p 管中，5 0 0 0 r p m 离心1 分钟， 弃上清。 7 ) 加入t r i z o l 液l m l ，用枪头反复抽吸混均，冰上放置1 0 分钟，室温放置5 分 钟。 8 ) 加入2 0 0 9 l 氯仿，剧烈震荡混均3 0 秒，冰上放置3 分钟，4 c ，1 2 0 0 0 9 离心1 0 分钟，离心后分为3 层，下面红色部分为酚一氯仿相，中间层为d n a ，上面 为无色的水相( 蛋白) 。r n a 只存在于水相中，水相占总t r i z o l 的6 0 。 9 ) 将上层水相转移到另一干净e p 管中，加入等体积异丙醇，用枪头混均，冰上 放置2 0 秒，4 c ，1 2 0 0 0 9 离心1 0 分钟，r n a 沉淀于e p 管底部。 1 0 ) 小心移去上清，加入1 m 1 7 5 酒精，d e p c 洗涤2 次，4 c ，7 5 0 0 9 离心5 分钟。 1 1 ) 吸走上清，瞬时离心后再吸走上清，空气中置放5 一1 0 分钟，干燥r n a 沉淀 ( 不可完全干燥，否则会降低r n a 溶解度) 。 1 2 ) 加入3 0 9 ld e p c - 水使r n a 溶解，一2 0 保存。 1 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 1 2r n a 鉴定 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定r n a 1 ) 水平桌面上，在模具上放好梳子。 2 ) 4 0 m l 的o 5 宰t b e 中，加入0 4 9 琼脂糖，加热溶解。 3 ) 冷却至5 5 。c 左右，加入3 9 le b 溶液，摇匀。 4 ) 浇灌温热的琼脂糖溶液至模具，室温下放3 0 分钟，等胶凝固后，拔掉梳子， 将盛胶槽放入0 5 * t b e 缓冲液电泳槽，使缓冲液刚好没过胶面2 m m 。 5 ) 在e p 管中加入2 9 ll 奉l o a d i n gb u f f e rl o i t lr n a ，混匀。 6 ) 用枪头将混合液缓慢加入加样孔中。 7 ) 关上电泳槽，1 0 0 v c m 电压下，电泳1 5 m i n 。 8 ) 取出凝胶，在紫外灯下观察照相。 2 1 3 测定r n a 浓度 取2 p 1r n a 储存液加入另一e p 管中，再加入5 8g ld e p c h 2 0 ，离心混匀。 以d e p c h 2 0 做空白对照，测o d 2 6 0 2 8 0 值，10 d = 4 0 p g d n a 。 2 2r t - p c r 扩增i l 3 基因 2 2 1 以提取的总r n a 为模板，逆转录合成单链c d n a 。 1 ) 根据所测r n a 浓度，使r n a 量为5 p g ，加入总r n ao l i g e ( d t ) p r i m e rl g l ，加 入d e p c h 2 0 定容至1 2 p 1 ，轻轻摇匀，离心3 5 秒。 2 ) 7 0 加热5 分钟，立即将e p 管插入冰水中至少1 分钟。 3 ) 冰上加入下列试剂，5 * r e a c t i o nb u f f e r4 1 t l ，r n a 酶抑制剂( 2 0 u 山) 1 1 t l ，1 0 m m d n t pm i x2 p l ，离心混匀，3 7 加热5 分钟。 4 ) 在冰上加入r n a 逆转录酶( 2 0 0 u p , i ) l g l ，使最终体积为2 0 9 l ，4 2 。c 力1 1 热6 0 分钟。 5 ) 9 4 加热2 分钟以终止反应。 6 ) e p 管插入冰中待用。 1 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 2 2p c r 扩增i l 3 片段 1 ) 5 0g lp c r 体系 p 1 p 2 d n t p 1 0 * p c rb u 肫r e d n a 模板 t a q 酶 无菌d d h 2 0 1 o t a l 2 ) p c r 反应条件 9463；|c 41m5sene蓁薹3072 4 0 s e e 个循环退火个循环 延伸j 2 2 3p c r 产物鉴定 将上述p c r 产物行l 琼脂糖凝胶电泳，方法同2 1 2 。 2 2 4p c r 产物胶回收纯化 使用胶回收纯化试剂盒进行纯化，操作步骤同下： 1 ) 回收凝胶称重，加入1 5m le p 管中，加入2 倍体积的b i n d i n gb u f f e r ， 6 0 水浴溶胶，每2 分钟颠倒混匀一次，使凝胶完全融化。 2 ) 将融化的液体移入吸附柱，1 2 0 0 0r p m 离心3 0 秒，并收集管中液体。 3 ) 1 0 0 0 0 r p m 离心1 分钟，并收集管中液体。 4 ) 加入7 0 0g ls p wb u f f e r ，静置2 3 分钟，室温1 0 0 0 0 r p m ，离心1 分钟，并收 1 4 p “ n d m 5 m 呲 5 卸叽 1 l l 5 5 0 3 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 集管中液体。 5 ) 重复4 ) 操作一次。 6 ) 将吸附柱放入一个干净的1 5 m le p 管中，在吸附柱膜中央加入4 9 l 双蒸水， 室温静置1 分钟。 7 ) 1 0 0 0 0r p m ，离心1 分钟，将e p 管中的p c r 产物( d n a ) 储存于一2 0 c 。 2 3 采用p c r 方法在i l 3 片段3 端引入柔性连接肽( g l y 4 s e r z ) 2 2 3 1p c r 反应体系 p 1 l p 1 p 3 l i b d n t p 4 p 1 1o 幸p c rb u f f e r 5 9 l i l 3 5 l x l t a q 酶 0 5 9 l 无菌d d h 2 03 4 5 9 l t 0 t a l 5 0 l x l 9465圣41耐5sene724 0 s e e 薹蕃 3 。个循环 退火 3 0 个循环 延伸j 2 3 3p c r 产物检测 1 0 9 l 凝胶电泳检测p c r 产物i l 3 - l i n k e r ，方法同2 1 2 。 1 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 3 4p c r 产物纯化回收 胶回收试剂盒纯化回收i l 3 一l i n k e r 片段，方法同2 2 4 。 2 4 重组质粒p q e 3 0 i l 3 。l i n k e r 的构建 2 4 1 提取质粒p q e 3 0 按质粒小量抽提试剂盒提供的步骤进行操作，并做适当调整 1 ) 将7 0 c 冻存的菌种划线接种于l a 平板，3 7 c 培养1 8 2 4 小时。 2 )自l a 平板上挑选单个菌落接种于3m ll a 培养液中，3 7 c ，2 0 0r p m 震荡过 夜。 3 ) 取1 5 m l 培养液，5 0 0 0 9 离心2 分钟，彻底去除上清，在细菌沉淀中加入2 5 0 u lp l 液，振荡至彻底悬浮。 4 ) 加入2 5 0 u lp 2 液，立即温和颠倒离心管5 1 0 次以混匀，室温静置4 分钟。 5 ) 加入3 5 0 u lp 3 液，立即温和颠倒离心管5 一1 0 次以混匀。 6 ) 4 c ，1 2 0 0 0 9 离心5 分钟。将上清液小心移入另一个e p 管中，再离心5 分 钟。 7 ) 将上清液小心移入吸附柱，离心1 5 秒。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入 收集管。 8 ) 在吸附柱中加入5 0 0u lb 1 液，离心1 5 秒。倒掉收集管中液体，将吸附柱 放入收集管。 9 ) 在吸附柱中加入2 5 0u ls w 液，静置1 分钟后，离心1 5 秒。倒掉收集管 中液体，将吸附柱放入收集管。 1 0 ) 在吸附柱中加入5 0 0u lw 1 液，离心1 5 秒。倒掉收集管中液体，将吸附柱 放入收集管。 11 ) 在吸附柱中加入5 0 0u lw 1 液，静置1 分钟后，离心1 5 秒。倒掉收集管中 液体，将吸附柱放入收集管。 1 6 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 2 ) 离心1 分钟。 1 3 ) 将吸附柱放入一个干净的1 5m l 离心管中，在吸附膜中央加入5 0u lt 1 ( 2 m m i r i s ) 液，3 7 c 水浴2 分钟后，离心1 分钟。将1 5m l 离心管( d n a 溶 液) 2 0 c 保存。l 琼脂糖凝胶电泳检测提取效果，并用紫外分光光度法定量。 2 4 2i l 3 片段和质粒p q e 3 0 的酶切及回收 将回收的i l 3 片段和质粒p q e 3 0 分别用b a m hi 、1 , ：p ni 单酶切。 2 4 2 1 酶切体系及条件 酶切体系l i l 3p c r 纯化产物1 5 1 l 1 b a m hi 酶 l n l 1 0 + kb u f f e r 2 9 l 灭菌d d h z o2 9 l t o t a l 2 0 1 t l 酶切条件：3 7 水浴4 小时后置6 5 水浴2 0 分钟终止反应。 酶切体系2 p q e 3 0 质粒1 2 p l b a m hi 酶lgl 1 0 奉kb u f f e r 2 9 l 灭菌d d h 2 05 9 l t o t a l 2 0 1 t l 酶切条件：3 7 。c 水浴4 小时后置6 5 水浴2 0 分钟终止反应。 酶切体系3 i l 3p c r 纯化产物1 5 1 x l k p ni 酶 1 “l 1 0 木lb u f f e r 2 9 l 灭菌d d h 2 0 2 9 l 1 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 i o t a l 2 0 9 l 酶切条件：3 7 c 水浴4 小时后置6 5 c 水浴2 0 分钟终止反应。 酶切体系4 p q e 3 0 质粒1 2 9 l k p ni 酶 lp l l o lb u f f e r 2 p , l 灭菌d d h 2 05 斗l t o t a l 2 0 9 l 酶切条件：3 7 水浴4 小时后置6 5 水浴2 0 分钟终止反应。 2 4 2 2 载体p q e 3 0 大片段和i l 3 酶切片段的胶回收 将上述酶切体系1 和体系2 反应所得全部产物分别做1 琼脂糖胶电泳后胶 回收纯化，然后行酶切体系3 和体系4 的单酶切反应，所得产物再做1 琼脂糖 凝胶电泳后胶回收纯化。 2 4 2 3 构建p q e 3 0 1 1 3 重组质粒 连接酶切i l 3 片段及p q e 3 0 质粒大片段 连接体系： il3片段89l p q e 3 0 质粒大片段2 9 l t 4d n al i g a s e l p l ( 1 0 宰) t 4d n al i g a s eb u f f e r 2 9 l 灭菌d d h 2 07 p , l 总体积 2 0 p , l 反应条件：将上述各成份按比例置于0 5 m l e p 管，低速瞬时离心，于1 6 过 夜。 2 4 3 转化 2 4 3 1 感受态大肠杆菌e e o l id h 5 a 的制备 取大肠杆菌e c o l id h 5 a 菌划线接种l b 平板 1 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 3 7 c 孵育过夜( 1 2 1 4 小时) 土 挑取单菌落，接种于3 m ll b 培养液中 上 3 7 c2 0 0r p m 振荡过夜( 1 2 - 1 4 小时) 取1 0 0 9 l 菌液加入2 m ll b 培养液中3 7 c3 0 0r p m 振摇3 小时 上 取1 5 m l 菌液n , k 预冷e p 管中，冰浴l o 分钟后，4 。c ，4 0 0 0r p m 离心5 分钟， 收集菌体 加入预冷的0 1 m o l lc a c l 21 5 0 9 l ，重悬菌体，4 c ，9 0 0 0 r p m 离心2 分钟，收集 菌体 再加入预冷的o 1 m o l lc a c l 215 0 p l ，重悬细胞 上 进行转化或加入3 0 无菌甘油保存于8 0 c 备用 2 4 3 2 连接产物转入感受态细胞 在2 0 0 9 l 感受态细胞中加入1 0 1 , t l 连接反应产物，混匀后，冰水浴3 0 分钟 1 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 上 4 0 热击9 0 秒，冰水浴2 分钟 加入8 0 0g ll b 培养液，3 7 c2 0 0r p m ，振荡培养11 1 , 时复苏细菌 土 取1 0 0 9 l 菌液均匀涂布于l a 平板 挑取单菌落保种并提取质粒进行鉴定 2 4 4 重组质粒p q e 3 0 i l 3 鉴定 2 4 4 1 酶切鉴定 从转化子中提取重组质粒p q e 3 0 一i l 3 ，用b a m hik p n1 分别进行单酶切和双 酶切鉴定，酶切体系如表1 表l ：重组质粒p q e 3 0 1 1 3 的酶切鉴定( 总体积2 0 p 1 ) t a b l t h er e a c t i o ns y s t e mo fp q e 3 0 - i l 3d i g e s t e dw i t hb a m hik p ni b a m hi 单酶切k p ni 单酶切b a m hik p ni 双酶切 p q e 3 0 一i l 35 9 l5 9 l5 t t l b a m hi l g llld k p nilgll p 1 1 0 枣kb u f f e r 2 9 l 一 2 t t l 1 0 木l b u f f e r一 2 9 l 一 灭菌d d h 2 01 2 i t l 1 2 t l l l g l 2 0 时 、 - = 1 3 上前上 1 ；孚孵 _1 ，3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 反应条件：3 7 。c 酶切反应4 小时后取5 9 l 行l 琼脂凝胶电泳分析。 2 4 4 2 p c r 鉴定 以重组质粒p q e 3 0 i l 3 为模板作p c r 扩增，确定是否可扩增出4 4 9 b p 预期 大小的基因片段，p c r 扩增体系及条件同2 3 1 。 2 4 4 3i l 3 基因序列测定 以i l 3p c r 上下游引物为测序引物，将质粒直接送大连宝生物工程有限公司 测定序列确定该片段的基因序列与目的序列是否一致。 2 5p e 3 8 k d e l 基因片段的p c r 扩增及鉴定 2 5 1p g e x 4 t 1 p e 3 8 k d e l 质粒的提取 将p g e x 4 t - l p e 3 8 l e l 质粒的d h 5 a 菌种接种于3 m ll a 培养液中，3 7 ( 2 ， 2 3 0r p m 摇床内，振荡过夜培养，使用小量质粒抽提试剂盒提取质粒，方法同4 1 。 2 5 2p e 3 8 k d e l 的p c r 扩增 2 5 2 1p c r 反应体系： p 4 p 5 d n t p g c b u f i e ri p g e x - 4 t - ! p e 3 8 k d e l 质粒 l at a q 酶 无菌d d h 2 0 1 o t a l 2 l 叭 m 叭 卸 m s s 卟 l 8 2 5 0 9 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 5 2 2p c r 反应条件 温度 9 4 9 4 6 5 7 2 7 2 时间 2 m i n l m i n 4 5 s e c 1 m i n l o s e c 作用 预变性 茎薹) 3 。个循环 1 0 m i n 后延伸 2 5 2 3p c r 产物鉴定结果分析 1 ) 将上述p e 3 8 k d e lp c r 产物取5 1 t l 行l 琼脂凝胶电泳分析，方法同2 1 2 。 2 ) 胶回收试剂盒回收目的d n a 片段，方法同2 2 4 。 2 6 构建p q e 3 0 一i l 3 p e 3 8 k d e l 重组质粒 2 6 1p e 3 8 k d e lp c r 产物和质粒p q e 3 0 i l 3 的酶切 将回收的p c r 产物和质粒p q e 3 0 一i l 3 分别用k p n l 、h i n d i i i 进行单酶切。 酶切体系l p e 38 k d e lp c r 纯化产物1 5 i t l k p n1 酶l “l 酶切体系2 1 0 * lb u f f e r 灭菌d d h 2 0 t b t a l 酶切体系3 p q e 3 0 i l 3 质粒12 9 l 勋门酶 1g l 1 0 lb u f f e r 2 9 l 灭菌d d h 2 0 5 9 l t o t a l 2 0 p 1 2 2 2 p 1 2 “l 2 0 9 l 重庆医科大学硕士研究生学位论文 酶切体系4 p e 3 8 k d e lp c r 纯化产物15 0 1 1 h i n d l i l 酶 1 0 1 1 1 0 幸mb u 腩r 2 0 1 1 灭菌d d h 2 0 2 0 1 1 t o t a l 2 0 0 1 1 p q e 3 0 一i l 3 质粒12 0 1 1 h i n d l i l 酶 1 0 1 1 lo 幸mb u f f e r 2 0 1 1 灭菌d d h 2 02 0 1 1 t o t a l 2 0 0 , 1 酶切反应条件：3 7 c 水浴4 h 后置6 5 水浴2 0 m i n 终止反应。 2 6 2 质粒p q e 3 0 i l 3 大片段及p e 3 8 k d e l 酶切片段的胶回收 将上述酶切体系1 和体系2 反应所得的全部产物分别做1 琼脂凝胶电泳后 胶回收纯化，然后分别行酶切体系3 和体系4 单酶切，所得产物再行l 琼脂凝 胶电泳后胶回收纯化。 2 6 3 构建p q e 3 0 i l 3 p e 3 8 k d e l 重组质粒 2 6 3 1 连接p q e 3 0 i l 3 大片段及p e 3 8 k d e l 片段，方法同2 4 2 3 。 2 6 3 2 连接产物转化感受态大肠杆菌d h 5 a ，方法同2 4 3 。 2 6 3 3 转化子p q e 3 0 i l 3 p e 3 8 k d e l 的鉴定 1 ) 酶切鉴定： b a m hi k p n ih i n d l i ib a m hih i n d k p nih i n d i i i 单酶切单酶切单酶切i i i 双酶切双酶切 p q e 3 0 i l 3 -5 0 , 1 5 0 , 15 0 , 1 5 0 , 1 5 0 , 1 p e 3 8 k d e i 2 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 b a m hi l g l k p nilgl h i n d l i i _ 1 0 幸kb u 腩r 2 p , l 一 1 0 * lb u f i e r一 2 9 l 1 0 木mb u f f e r一 一 灭菌d d h 2 01 2 9 l1 2 1 1 1 反应条件：3 7 c 酶切反应4 h 后， 1 p l _。lp,l 1 山l g l l p , l 2 p 1 2 p l 一 2 p l 1 2 1 a l 1 1 9 l1 1 9 1 分别取5 i l l 行l 琼脂凝胶电泳分析。 2 ) p c r 鉴定 以重组质粒p q e 3 0 i l 3 p e 3 8 k d e l 为模板作p c r 扩增，扩增p e 3 8 k d e l 片 段确定是否可扩增出1 0 3 8 b p 预期大