（内科学专业论文）cd4cd25调节性t细胞检测在急性白血病的临床意义.pdf

，、， 乞i ： 目录 f llrl liiil l fiiii i iiiil y 18 017 7 9 中文摘要l 英文摘要3 研究论文c d 4 + c d 2 5 + 调节性t 细胞检测在急性白血病的临床意义 前言6刖舌 材料与方法7 结果1 1 附图13 附表l6 讨论18 结论2 2 参考文献2 2 综述c d 4 + c d 2 5 + 调节性t 细胞抑制肿瘤免疫研究进展一2 4 个人简历”3 9 中文摘要 c d 4 + c d 2 5 + 调节性t 细胞检测在急性白血病的临床意义 摘要 目的：1 9 9 5 年s a k a g u c h i 等人首次报道在正常小鼠的外周血c d 4 + t 细胞中约有5 1 0 的细胞持续高表达c d 2 5 分子( i l 2 受体q 链) ，同时 这一亚群细胞是c d 4 5 r b 分子低表达的，称之为c d 4 + c d 2 5 + 调节性t 细 胞( c d 4 + c d 2 5 + r e g u l a t o r ytc e l l ，简称c d 4 + c d 2 5 + t r e g ) 。c d 4 + c d 2 5 + t r e g 能通过“主动”方式抑制免疫系统对自身和外来抗原的应答，在维持自身 免疫耐受中发挥重要作用。许多肿瘤相关抗原是正常的自体成分，而不是 突变基因的异常产物，表明肿瘤免疫在一定程度上是一种自身免疫，因此 c d 4 + c d 2 5 + t r e g 具有抑制肿瘤免疫的作用。白血病是一类起源于造血干 细胞的克隆性恶性肿瘤，近年来白血病的免疫治疗逐渐成为白血病治疗中 的热点，但是肿瘤抗原特异的免疫治疗效果目前并不十分令人满意，可能 与肿瘤细胞能通过某种机制逃避免疫系统的攻击有关。现已证实 c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞可以抑制肿瘤特异性免疫反应，对免疫治疗起负调 控作用，是肿瘤免疫抑制的又一机制。为了探讨恶性血液病发展中 c d 4 + c d 2 5 + t r e g 的负性调节作用。本课题检测急性白血病者初诊者，缓 解患者及复发者外周血c d 4 + c d 2 5 + t r e g 含量。观察比较其和预后还有复 发的关系。以期了解急性白血病患者外周血c d 4 + c d 2 5 + t r e g 亚群的变化， 探讨其在恶性血液病发病中的意义。 方法：选取沧州市中心医院血液科2 0 0 9 年3 月- 2 0 0 9 年1 2 月急性白 血病患者( a m l ) 4 1 例，均为初发化疗前的住院患者，男性2 9 例，女性 1 2 例，患者平均年龄4 8 2 岁。全部急性白血病患者均经临床、骨髓细胞学、 免疫分型检查确诊。同时对这些患者在化疗前行血常规、肝脾b 超、染 色体检查，及出血倾向( 包括皮肤出血点、鼻钮、齿龈出血、球结膜出血， 血尿、血便等) 检查，继之予联合化疗( 应用m a 方案： m t z ：1 0 m g d ，a r a c 2 0 0 3 0 0 m g d ，) ，据骨髓增生程度及原始细胞杀伤指数决 定化疗疗程，骨髓抑制期解除后据血常规、骨髓象评价其化疗疗效。对照 组为本院体检健康者1 6 例，男l o 例，女6 例，平均年龄3 3 5 岁。根据 张之南老师编著的血液病诊断及疗效对于急性白血病缓解和复发标准， 中文摘要 把一次或两次化疗缓解的患者作为化疗敏感组，两次化疗不缓解作为化疗 耐药组。采集a m l 患者化疗前、缓解时、复发时外周血，用流式细胞仪 检测c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞占c d 4 + t 含量。进行急性白血病患者临床特征 包括性别、年龄、外周血白细胞数、骨髓c d 3 针细胞的数量和c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞的数量相关性分析。c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞的百分比以m e a n 士s d 表 示，统计处理采用s p s s1 4 0 ，p 0 0 5 有统计学意义。 结果：急性白血病患者外周血的c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞占c d 4 + t 细 胞的比例高于正常对照( 3 8 8 士1 1 9 9 ) v s ( 1 9 6 士1 6 6 ) ( p o 0 1 ) ，二者有统 计学差异。化疗耐药组患者外周血的c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞占c d 4 + t 细 胞的比例高于化疗敏感组患者( 3 9 0 士1 8 9 ) v s ( 2 0 0 士1 6 5 ) 纵p o 0 1 ) ，表明 c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞的表达可能和急性白血病的预后有一定的关系。 a m l 患者有1 9 例有染色体异常( 见表5 ) 。1 9 例染色体异常患者 c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞表达占c d 4 + t 细胞的( 3 9 2 士1 8 6 ) ，和其他急性白 血病患者的c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞表达占c d 4 + t 细胞的( 3 8 5 士2 0 1 ) ， 两组数据没有显著差别。6 例复发的a m l 患者( 包括4 例m 5 ，2 例m e ) ， 复发后c d 4 + c d 2 5 + 表达水平增高，含量是( 3 9 5 士1 8 6 ) 。持续缓解组患 者数值是( 2 0 2 - 士1 5 5 ) ，两组数据具有统计学差异( p o 0 1 ) 。急性白血病患 者临床特征急性白血病患者临床特征包括性别、年龄、外周血白细胞数、骨 髓c d 3 4 斗细胞的数量和c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞的数量相关性分析结果显示 没有相关性。 结论：急性白血病患者外周血的c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞比例显著高于 正常人对照，提示c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞可能是导致白血病细胞逃避免疫 清除，诱导免疫耐受的机制之一，从而导致急性白血病细胞的恶性增殖。 c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞的数量有可能影响白血病化疗的疗效，可能引起缓 解患者复发的原因之一，可能和有无染色体异常没有关系。急性髓系白血 病中c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞的数量的表达没有年龄性别以及外周血白细胞 数和骨髓中原始细胞数的差别。c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞比例增高是引起急 性白血病的重要原因，而且容易引起急性白血病的复发。 关键词：急性白血病；c d 4 + c d 2 5 + 调节性细胞：预后；免疫表型；染 色体；流式细胞术 2 薹 t h ec l i n i c a ls i g n i f i c a n c eo f 文摘要 c d 4 + c d 2 5 + r e g u l a t o r y t c e l l s d e t e c t i o ni na c u t el e u k e m i a a b s t r a c t o b j e c t ：i n19 9 5s a k a g u 出e ta 1 w e r et h ef i r s tt of o u n dt h a tas u b s e to f c d 4 + l y m p h o c y t e sp e r i p h e r a lb l o o do fn o r m a lm i c eh i g h l ye x p r e s s e dt h ec d 2 5 ( i l - 2 r - a ) a n dl o w l ye x p r e s s e dt h ec d 4 5 r b ，w h i c hc o n s t i t u t e5 - 10 o fp 舐p h e r a lc d 4 + t c e l lr e f f e r e da st oc i m + c d 2 5 + r e g u l a t o r yt c e l l s ( c d 4 + c d 2 5 + t r e g ) a c c u m u l a t i n g e v i d e n c e ss h o wt h a tc a ns u p p r e s st h ei m m u n r e s p o n s et os d fa n dn o n s e l fa n t i g e ni n a c t i v ew a ya n dc o n t r i b u t et ot h em a i t a i n a n c ef o rs e l f - i m m u n et o l e r a n c e m a n yt u m o r a s s o c i a t e da n t i g e n se x p r e s s e do nt h en o r m a lc e l l sa n dn o tt h ep r o d u c to fg e n e m u t a t i o na n di n d i c a t e dt h et u m o ri m m u n i 够i saa u t o i m m u n i t yt os o m ee x t e n t a s s u c h , t r e gc e l l sm a ya l s o b l o c ka u t i t u m o ri m m u n er e s p o n s e s l e u k e m i aw a s h e m a t o l o g i cn e o p l a s mi nw h i c hm a l i g n a n tc e l l s 慌p r e s e n ti nt h eb o r nm a n d w a n d t h eb l o o d n o wt h ei m m u n o t h e r a p yb e c a m et h eh o ts p o tf o rt h el e u k e m i at r e a t m e n t b u tt h ee f f e c to fa n t i g e ns p e c i f i ci m m u n o t h c m p yw a sa n y 衄n gb u ts a t i s f a c t o r y , b e c a u s et h et u m o rc e l l sm a y e s c a p ef r o mt h ei m m u n es u r v e i l l a n c e 心o u g hs o m e k i n d o fm e c h a n i s m c d 4 + c d 2 5 + t r e gc 锄s u p p r e s st u m o rs p e c i f i ci m m u n er e s p o n s ea n d m a k et h et u m o rc e l l s g r o wa n d m e t a b a s i s e a s i l y t h ei n v e s t i g a t i o nf o r t h e i m m u n o e y t ei nl e u k e m i ap a t i e n t sw i l lb e n e f i tt ol e a r nt h em e c h a n i s m o fi n v a s i o na n d m e t a s t a s i so ft u m o ra n de x p l o r et h en e wt r e a t m e n t t oe x p l o r et h ed e v e l o p m e n to f h e m a t o l o g i c a lm a l i g n a n c i e sc d 4 + c d 2 5 + t r e gn e g a t i v ee f f e c t , i nt h i ss t u d y , t h e f o l l o w i n gc o n t e n t sw l x r er e s e a r c h e d ：d e t e c t i n gt h o s en e w l yd i a g n o s e dw i t ha c u t e l e u k e m i a , r e m i s s i o na n dr e l a p s ei np a t i e n t s 、析1p e d p h e r a lc i m + c d 2 5 + t r e g c o n t e n t t oa n a l y z et h ec h a n g eo fc i m + c d 2 5 + t r e gi np e d p h e r a lb l o o dl y m p h o c y t e o fl e u k e m i ap a t i e n t sa n dt oi n v e s t i g a t et h e i rs i g n i f i c a n c ei nt h el e u k e m i ap r o g r e s s m e c h a n i s m m e t h o d s ：41l e u k e m i ap a t i e n t sw l f f l gc o l l e c t e di nt h ec e n t e th o s p i t a lo f c a n g z h o uf r o mm a r c h2 0 0 9t od e c e m b e r2 0 0 9 a 1 lo ft h e mw e r ef i r s ti n v a d e da n d n o tr e c e i v e dt h ec h e m o t h e r a p y a m o n gw h i c hi n c l u d e d2 9m a l ea n d12f a m a l e , t h e 3 英文摘要 m e a na g eo ft h el e u k e m i ap a t i e n t sw a s4 8 2y e a r so l dt h e s el e u k e m i ap a t i e n t sw e r e m a d ead e f i n i t ed i a g n o s i sb yc l i n i c a ls y m p t o m , b o n em a r r o wc e l la n di m m u n i t y t y p i n g k a r y o t y p ea l t e r n a t i o n s ，b l o o dr o u t i o ne x a m i n a t i o n s ，b l e e d i n gt e n d e n c y e x a m i n a t i o n s ( i n c l u d i n gp 既e c h i a e e p i s t a x i s g i n g i v a lb l e e d i n g , h e m a t u r i a m e l e n a ) i n f i l t r a t i o no f e x t r a m e d u l l a r yt i s s u e s ( i n c l u d i n gl y m p h a d e n o v a r i x ， h e p a t o s p l e n o m e g a l y ，c n si n f i l t r a t i o n ，s k i na n da b d o m e ni n f i l t r a t i o n ) w e r es e a r c h e d b e f o r ei n d u c t i o n - c o n s o l i d a t i o nc h e m o t h e r a p y , t h e nm ar e # m e n t ( u t z10 m g 也 a m - c2 0 0 - 3 0 0 m g d ) w a sp e r f o r m e dt ot h e s e a m lp a 位e n t s b o n em a r r o wa s p i r a t e s m e a r sw e r es t u d i e da f t e rt h eb o n em a l t o wc e l l u l a r i t yr e s t o r e d t h ec o r r e s p o n d i n g h e a l t h yc o n t r o l sc a m ef r o mt h eh e a l t he x a m i n a t i o c e n t r e 舢lo f16o n e sh a d10m a l e a n d6f a m a l e t h em e a na g ew a s3 3 5 a c c o r d i n gt o ( a m ld i a g n o s i t i ct r e a t m e n t b yz h i n a nz h ，t h eg r o u p sw e r ed i v i d e d , c h e m o t h e r a p e u t i c a ls e n s i t i v eg r o u pa n d d r u gf a s tg r o u p t e s tw i t ha n dw i t h o u tm i t i g a t i o ns e ta g a i nt h es e c o n dt i m e 、析t 1 1a n d d o e sn o tm i t i g a t et h eg r o u pe x p r e s s i o n , a n dt h ee x p r e s s i o no fr e c - - u r r e n tg r o u p t h e f r e q u e n c yc d 4 + c d 2 5 + t r e gi nt h ep 洒p h e r a lb l o o d ( p b ) w a sd e t e r m i n e db yf l o w c y t o m e t r y t h e d a t aw e r es u m m a r i z e d 弱t h em e a n 蚍d a r de r r o r s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c ew a sa c c 印t e d a tt h ep 0 0 5l e v e l a l lt h es t a t i s t i c a l a n a l y s i sw e r e p e r f o r m e du s i n gt h es p s ss t a t i s t i c a s o f l w a r ep a c k a g e r e s u l t ：t h em e a np r o p o r t i o no fc d 4 + c d 2 5 + t r e go fa l lc d 4 + tc e l l si n a c u t e l e u k e m i p a t i e n t s w a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nt h a to ft h en o r m a l c o n t r o l ( 3 8 8 a ：1 卿v s ( 1 9 6 a ：1 6 6 ) ( p 如0 1 ) ，w h i c hh a ds t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n c e t h em e a np r o p o r t i o no f c d 4 + c d 2 5 + t r e go f a l lc d 4 + tc e l l si nd r u gf a s tg r o u p a n dc h e m o t h e r a p e u t i c a ls e n s i t i v eg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to ft h e n o r m a lc o n t r o l ( 3 9 0 士1 8 9 ) v s ( 2 o q 士1 6 5 ) 如0 1 ) ，w h i c hh a d s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n c e t h e r ew a sr e l a t i o nb o t hc d 4 + c d 2 5 + t r e gc e l le x p r e s s i o na n dt h e p r o g n o s i so fp a t i e n t sw i t ha c u t el e u k e m i a 1 9c a s e sa l v i l p a t i e n t sh a dc h r o m o s o m e a b n o r m a l i t i e s ( i nt a b l e5 ) p a t i e n t sw i t ha b n o r m 2 l lc h r o m o s o m e19c a s e so fc d 4 + c d 2 5 + t r e gc e l l se x p r e s s i o n ( 3 9 2 - - e 1 8 6 ) a n do t h e ra c u t el e u k e m i a p a t i e n t s 谢t hc d 4 + c d 2 5 + t r e gc e l l se x p r e s s i o n ( 3 8 5 ：匕2 0 1 ) ，w h i c hh a d n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s 6c a s e so fp a t i e n t sw i t hl - e l a p s e da m l ( i n c l u d i n g4 a 玛器o fm 5 ，2c a s e so fr e c t m e n tm e ) ，c d 4 + c d 2 5 + t r e gc e l l se x p r e s s i o nh a d 4 英文摘要 s i g n i f i c a n t l ya l t e r , r e c u l t e n c i ea f t e rc d 4 + c d 2 5 + e x p r e s s i o nl e v e l s ，t h en u m b e r w a s ( 3 9 5 + 1 8 6 ) s u s t a i n a b l er e l i e fg r o u pp a t i e n t sv a l u ew a s ( 2 0 2 1 5 5 ) t h e r e w a s s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n c e b o t hs u s t a i n a b l er e l i e f g r o u p a n dr e c u r r e n c e g r o u p ( p 0 0 5 ) c 1 i n i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fp a t i e n t sw i t ha c u t el e u k e m i aa c u t e l e u k e m i ap a t i e n t sw i t hc l i n i c a lf e a t u r e si n c l u d eg e n d e r , a g e ，l e u k o c y t ec o u n t s ，b o n e m a r r o wc d 3 4 + c e l l si nq u a n t i t ya n dc d 4 + c d 2 5 + t r e gc e l l so fc o r r e l a t i o n a n a l y s i sr e v e a l e dt h en u m b e rm a y n o th a dac e r t a i nr e l e v a n c e c o n c l u s i o n ：t h em 笺u lp r o p o r t i o no f c d 4 + c d 2 5 + t r e go f a l lc d 4 + tc e l l si n a c u t el e u k e m i ap a t i e n t sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to ft h e no r m a lc o n t r 0 1 c d 4 + c d 2 5 + t r e gc e l l sm a yb ec a u s i n gl e u k e m i ac e l l se s c a p ei m m u l l ec l e a r , b y o n eo ft h em e c h a n i s m , w h i c hc o u l dl e a dt oap r o l i f e r a t i o no fl e u k 既a i cc e l l s t h e n u m b e ro fc d 4 + c d 2 5 + t r e gc e l l sm a ya f f e c tt h ee f f i c a c yo f c h e m o t h e r a p yi n p a t i e n t sw i t hl e u k e m i a ，m a yc a u s er e l a p s ei np a t i e n t s 也e a s ew s ao n eo ft h e r e a s o n s ，c h r o m o s o m a la b n o r m a l i t i e sh a dn or e l a t i o nw i t ht h ec d 4 + c d 2 5 + t r e gc e l l sp r o p o r t i o n a c u t em y e l o i dl e u k e m i ac d 4 + c d 2 5 + t r e gc e l l s e x p r e s s i o nd i dn o th a v ean u m b e ro fa g e ，s e x , a n dp e n p h e r a lb l o o dc o u n ta n d n u m b e ro ft h eo d 勘mc e l l si nt h eb o n em a r r o wo fd i f f e r e n c e s c d 4 + c d 2 5 + t r e gc e l l si n c r e a s ew a sc a u s e db yaf r a c t i o no fa c u t el e u k e m i ai ni m p o r t a n t r e a s o n s ，a n dc o u l de a s i l y1 e a dt or e c u r r e n c eo fa c u t el e u k e m i a k e y w o r d s ：a c u t el e u k a e m i a ；c d 4 + c d 2 5 + t r e g ；p r o g n o s i s i m m u n o p h e n o t y p e ； c h r o m o s o m e ；f l o wc y t o m e t r y 5 研究论文 c d 4 + c d 2 5 + 调节性t 细胞检测在急性白血病的临床意义 上- t 刍 刖吾 c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞是由s a k a g u c h i 等【l 】于1 9 9 5 年首次报道，在正 常人和小鼠的外周血及脾脏组织的c d 4 + t 细胞中约有5 1 0 的细胞 持续高表达c d 2 5 分子( i l 2 受体a 链) ，同时这一亚群细胞是c d 4 5 r b 分子 低表达的。c d 4 + c d 2 5 + t r e g 是一群独特的专职抑制细胞，主要分泌i l 1 0 和t g f d 等抑制性细胞因子，通过细胞细胞接触的方式发挥抑制免疫反 应的作用 2 】。在抗肿瘤免疫反应中，c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞抑制抗肿瘤t 细胞增殖，会导致病人失去自身的抗肿瘤免疫反应，在肿瘤免疫逃逸机制 中发挥重要作用。已有报道在卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、 肝癌等多种肿瘤患者外周血和肿瘤局部c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞比例增高与 病人肿瘤进展程度和预后呈负相关。白血病是一类起源于造血干细胞的克 隆性恶性肿瘤，白血病的传统治疗通常采用联合化疗、放疗、配合造血干 细胞移植。但这些传统治疗同时也带来很多严重的并发症，还有罹患第二 肿瘤的危险性，并且复发率很高【2 】。近年来白血病的免疫治疗逐渐成为白血 病治疗中的热点。但是肿瘤抗原特异的免疫治疗效果目前并不十分令人满 意，这可能与白血病细胞能通过某种机制逃避免疫系统的攻击有关。研究 白血病体内微环境中免疫细胞的情况，将有助于了解这种疾病的发病和转 移机制，探索新的治疗方法。 本文研究了4 1 例急性髓细胞白血病( a m l ) 各期、1 6 例健康人骨髓细 胞c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞的表达，同时对4 1 例急性髓细胞白血病患者的 染色体核型进行了检测。比较健康人和急性白血病患者c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞占c d 4 + t 细胞的数量表达的统计学差异，并检测了化疗缓解患者和 复发患者的c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞表达占c d 4 + t 细胞的数量，比较了化 疗敏感组和化疗耐药组在c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞表达的统计学差异，分析 了c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞表达在缓解和复发患者中的变化，并进行急性白 血病的临床特征包括患者性别、年龄、外周血白细胞数、骨髓原始细胞数 与c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞表达的相关性分析。以期了解c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞对白血病判断预后和预测复发中的价值。 研究论文 1 材料 1 1 仪器 材料与方法 仪器名称与型号产地 普通光学显微镜 电子天平a e l o o 一2 0 低温冰箱 4 低温冰箱 台式离心机( l a b o f u g e 4 0 0 ) 移液器 恒温水浴箱( h x s h ) c 0 2 培养箱 f i a c s c a l i b u r 流式细胞仪 涡旋器 日本o l y m p u s 公司 德国m e t t l e r 公司 日本s a n y o 公司 青岛海尔公司 德国h e r a e u s 公司 美国吉尔森公司 哈尔滨东联公司 美国n a p c o 公司 美国b d 公司 北京中科生物 1 - 2 试剂 试剂名称产地 抗c d 4 抗体 抗c d 2 5 抗体 鼠抗i g g l 抗体 鼠抗i g g 2 抗体 抗c d 4 5 p e r c p 抗体 b s a 美国b d 公司 美国b d 公司 美国b d 公司 美国b d 公司 美国b d 公司 瑞士r c h o e 公司 研究论文 n a n 3 红细胞裂解液 1 6 4 0 培养液 乙酸 吉姆萨染液 胰蛋白酶 秋水酰胺 k c l 甲醇 p b s 缓冲液 枸橼酸钠 北京赛百盛公司 美国b d 公司 美国g i b c 0 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 华美生物工程公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 北京赛百盛公司 s i g m a 公司 1 3 主要试剂及溶液的制备方法 ( 1 ) p b s 缓冲液( 磷酸盐缓冲液) ：以p b s 干粉( 1 0 0 0 m g 包) 加入 至8 0 0 m l 去离子水中，用玻璃棒搅拌使之充分溶解，调节溶液的p h 值至7 2 ， 定容至1 0 0 0 m l ，备用。 ( 2 ) 红细胞裂解液2 m l ，( 1 份原液+ 9 份过滤后蒸馏水稀释) 于无菌条 件下使用孔径为0 2 2 p r o 的微孔滤膜过滤，备用。 ( 3 ) 流式分析染色缓冲液( 含0 2 b s a 和0 i n a n 3 的p b s ，p h 值为 7 2 ) ：将b s a 干粉o 2 9 及n a n 3 干粉10 0 l n l g 加入至p b s 10 0 m l 中，调定p h 值 为7 2 ，混匀并充分溶解后，于无菌条件下使用孔径为0 2 2 岬的微孔滤膜 过滤并分装。4 。c 冰箱冷藏备用。 ( 4 ) 低渗液配制：k d ( 0 0 7 5 m ) 和1 枸橼酸钠按4 ：1 的比例配制，现 用现配。 ( 5 ) 固定液配制：甲醇和乙酸按3 ：l 的比例配制，现用现配。 ( 6 ) 0 2 5 胰酶配制：0 2 5 9 胰酶干粉加入1 0 0 血的生理盐水中，于无 菌条件下使用孔径为0 2 2 p m 的微孔滤膜过滤并分装。2 0 冰箱冷冻备用。 ( 7 ) 吉姆萨染液配制：缓冲液和吉姆萨染液按9 ：l 的比例配制混匀， 现用现配。 1 4 标本来源 研究论文 本试验的研究对象为4 1 例自2 0 0 9 年3 月至2 0 0 9 年1 2 月在沧州市中心医 院血液科住院的急性髓细胞性白血病患者，其中男2 9 例，女1 2 例，中位年 龄4 8 2 ( 2 0 7 5 ) 岁，依据f a b 分型m 1 2 例，m 21 7 例，m 4 5 例，m 5 1 7 例。1 6 例健康体检者来自于沧州市中心医院体检中心，其中男1 0 例、女6 例中位 年龄3 3 5 ( 2 0 5 3 ) 岁。 2 研究方法 2 1 标本采集与分组 采集4 1 例初诊的急性髓系白血病患者外周血2 m l j l 入e d t a 抗凝管， 充分混匀。患者诱导缓解方案采用m a 方案( 米托葸醌1 0 m g d ，阿糖胞苷 2 0 0 3 0 0 m g d ，) 化疗第四天复查骨穿，据骨髓增生程度及原始细胞杀伤指数 决定化疗应用时间，骨髓增生达活跃i i 级停用化疗) ，同时对这些患者在化 疗前行血常规、肝脾b 超、染色体检查，免疫表型及出血倾向( 包括皮肤出 血点、鼻钮、齿龈出血、球结膜出血，血尿、血便等) 检查。按照张之南 老师编著的血液病诊断及疗效标准，一次化疗或两次化疗缓解患者做 为化疗敏感组，两次化疗不缓解者为化疗耐药组，分别采集患者外周血2 m l 加入e d t a 抗凝管，充分混匀。采集健康体检者的外周血2 m l 力l 入e d t a 抗 凝管，充分混匀。采集复发6 例患者的外周血2 m l 力l 入e d t a 抗凝管，充分 混匀。检测各组的c d 4 + c d 2 5 + t e r g 占c d 4 + t 细胞的百分数，观察其量的 表达的统计学意义。4 l 例急性髓系白血病患者中有1 9 例染色体核型的异 常，比较有染色体核型异常的和无染色体核型异常的患者的 c d 4 + c d 2 5 + t e r g 含量的统计学意义。复发和完全缓解标准按照张之南老 师编著的血液病诊断及疗效标准。 2 2 实验方法 2 2 1c d 4 + c d 2 5 + t r e g 的测定 ( 1 ) 采集急性髓系白血病患者外周血2 m l 力l 入e d t a 抗凝管，充分混 匀，取1 0 0 u l 入流式细胞检测管1 和2 ，第l 管加入各2 0 u l 鼠抗 i g g1 - f i t c i g g 2 - p e c d 4 5 p e r c p , 第2 管加入各2 0 u l c d 4 一f i t c c d 2 5 p e c d 4 5 p e r c p ，涡旋器充分混匀，闭光孵育2 0 4 0 分钟。 ( 2 ) 避光孵育后加入红细胞裂解液2 m l ，( 1 份原液+ 9 份过滤后蒸馏水 稀释) ，闭光孵育l o 分钟至液体透亮。 ( 3 ) 离心1 0 0 0 转5 分钟去上清，加入2 m lp b s 缓冲液洗涤，离心1 0 0 0 研究论文 转5 分钟去上清。 ( 4 ) 加入p b s 缓冲液4 0 0 u l 上流式细胞仪检测。 ( 5 ) 数据获取采用c e l lq u e s t3 2 ，应用鼠抗人i g g l 一f i t c i g g 2 一p e 为 对照设置样本非特异荧光，即阴性对照，使用对照管调整，使阴性群体位 于点图左下角，调整和补偿，顺序放置实验管，收集至少1 0 0 0 0 个细胞， 以c d 4 + t 细胞设门，分析荧光强度，光散射数据存盘，测试后在计算机上 用软件分析数据，记录阳性细胞百分率。减去非特异对照值。 2 2 2 染色体的制备及分析 ( 1 ) 用0 2 肝素浸润之针筒抽取骨髓2 m l ，注入培养瓶( 即1 6 4 0 培养 液) ，在超净室内抽取标本计数有核细胞，按( 1 2 ) 1 0 6 m l 无菌接种于1 6 4 0 培养基2 瓶内，放置于c 0 2 培养箱3 7 。c2 4 小时。中间时间适当的混匀。 ( 2 ) 第二天加入秋水仙胺应用液0 5 m l ( 原液 j i 5 0 u 1 ) ，3 7 ，1 小时。 ( 3 ) 离心1 0 0 0 转分1 0 分钟，弃上清，加入预温至3 7 的低渗液8 m l 左右，轻轻打匀置3 7 4 0 分钟。 ( 4 ) 第一次固定，加入l m l 固定液轻轻打匀，离, t , 1 0 0 0 转分1 0 分钟， 离心后弃上清，合并两瓶。 ( 5 ) 第二次固定，加入固定液约8 m l 打匀，室温放置3 0 分钟。 ( 6 ) 第三次固定，离一t 二, 1 0 0 0 转分1 0 分钟，离心后弃上清，加入固定 液约8 m l 打匀，过夜。 ( 7 ) 滴片，离一t 1 , 1 0 0 0 转分1 0 分钟，弃上清，加适量固定液配成细胞 悬液，制片，所用玻片为在酒精中浸泡过的，用时从4 冰箱里拿出。玻 片放入3 7 恒温温箱三天。 ( 8 ) 染色，1 0 g i e m s a 染色2 0 分钟，水吸干后镜检。分析采用重庆天 海医疗设备公司v e r l 0 染色体组型分析系统，分辨度1 0 2 4 x 7 6 8 像素。 2 2 3 细胞计数方法 血球计数盘一般有二个c h a m b e r s ，每个c h a m b e r 中细刻9 个l m m 2 大正 方形，其中4 个角落之正方形再细亥l j l 6 个小格，深度均为0 1 m m 。当c h a m b e r 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 m m 2 x 0 1 m m = 1 0 x 1 0 m 1 4 。使 用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以1 0 4 ，即 为每血中之细胞数目。 2 3 统计学处理 研究论文 所有数据采用s p s s l 3 0 统计软件进行分析，各组数据以夏士s 表示，检验 水准取p = 0 0 5 ，方差齐性检验水准取a = 0 1 ，各组比较采用t 检验。 结果 1 急性白血病患者t r e g 表达和临床特征的关系 1 6 健康体检者外周血c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞的表达：流式细胞仪检测 时以c d 4 + t 细胞设门，结果发现正常人c d 4 + c d 2 5 + t r e g 细胞占总t 细 胞的( 1 9 6 + 1