（免疫学专业论文）人b7h基因原核表达载体的构建和表达.pdf

天津医科大学硕士研究生论文 中文摘要 摘要 目的：本实验诱导健康人外周血单个核细胞( p e r i p h e r a lb l o o d m o n o n u c l e a rc e l l ( s ) ，p b m c ) 分化为树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l ，d c ) ，然 后从d c 中扩增b 7 h 基因，构建人b 7 h 基因原核表达载体，并转化旭c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) 中进行b 7 h 重组蛋白表达。重组b 7 h 蛋白对研究i c o s b t h 途径在体内信号传导中 的作用具有重要的意义，并为下一步制备b 7 h 单克隆抗体奠定实验基础。 方法： 1 用人淋巴细胞分层液从健康人外周血白膜中分离出p b m c ，然后给予i l _ 2 、 i l 一4 和g m - c s f 诱导p b m c 分化为d c 。用t r i z o l 试剂提取d c 的总r n a ，经 逆转录聚合酶链反应( r t p c r ) 法从人d c 中扩增出b 7 h 基因。 2 利用t a 克隆技术，将b 7 h 基因与t 载体p t z 5 7 r t 进行连接，转化入c o l i j m l 0 9 ，构建p t z 5 7 r t b 7 h 。经蓝白斑筛选后，抽提质粒进行p c r 鉴定、双 酶切鉴定和d n a 测序。 3 将测序正确的p t z 5 7 r t b 7 h 用n o ti e c o ri 双酶切，将所得b 7 h 片段与同 样经n o ti e c o ri 双酶切的原核表达载体p g e x 一4 t - 1 连接，转化e c o d h 5 a ， 构建p g 既一4 t 一1 一b 7 h 重组质粒。随机挑选白色菌落，抽提质粒进行p c r 鉴定、 双酶切鉴定和d n a 测序。将重组质粒p g e x - 4 t l - b 7 h 转化表达宿主菌最c 0 1 1 b l 2 1 ( d e 3 ) ，用i p t g 诱导促进b 7 h 融合蛋白表达，对表达产物进行s d s 一聚丙 烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 和免疫印迹( w e s t e r nb l o t ) 鉴定。 结果： 1 将人d c 细胞中b 7 h 基因的p e r 扩增产物进行1 2 琼脂糖凝胶电泳，产物为 单一、清晰条带，大小约为9 0 9 b p 。 2 对p t z 5 7 r t b 7 h 和p g e x 一4 t 一卜b 7 h 分别进行p e r 鉴定、酶切鉴定及d n a 序 天津医科大学硕士研究生论文中文摘要 列分析。p c r 鉴定和酶切鉴定都表明b 7 hc d n a 为9 0 9 b p 的d n a 片段。两 个重组质粒测序结果相同，且与文献报道的b 7 h 基因序列有9 9 6 一致性， 证实p t z 5 7 r t b 7 h 和p g e x - 4 t 一1 一b 7 h 重组质粒构建成功。 3 将重组质粒p g e x 一4 t - 1 一b 7 h 转化入ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) ，表达产物在s d s p a g e 上表现为相对分子质量( r e l a t i v em o l e c u l a ri b a s s ，m r ) 约为5 6 k d 左右的 融合蛋白，与预期的结果相符。在w e s t e r nb l o t 实验中，与抗人b 7 h 单克 隆抗体反应，出现特异性条带，更进一步确定了b 7 h 重组蛋白的表达。 结论： 1 本实验克隆的基因为人b 7 h 基因。 2 重组质粒p g e x 一4 t 一1 一b 7 h 是具有表达功能的原核表达系统。 3 p g e x - 4 t - 1 - b 7 h 转化e c o f ib l 2 1 ( d e 3 ) ，其表达产物是b 7 h 融合蛋白。 关键词：树突状细胞；共刺激信号；b 7 h 基因；t a 克隆：基因重组；原核 表达；融合蛋白 i i 天津医科大学硕士研究生论文 英文摘要 a b s t r a c t o b | e c t i v e t oc o n s t r u c tp r o k a r y o f i ce x p r e s s i o nv e c t o rc a r r y i n gh u m a nb t hg e n e a n de x p r e s si ti n e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) i nt h a tt h er e c o m b i n a n tb 7 hp r o t e i ni sv e r y c r i t i c a lt ot h es t u d yo nt h ef u n c t i o no fi c o s b 7 hp a t h w a ya n dt ot h ep r e p a r a t i o no f a n t i b o d i e st ob 7 hp r o t e i n m e t h o d s 1 d e n d r i t i cc e l l sw e r ep r e p a r e db yi n c u b a t i o no fh u m a np e r i p h e r a lb l o o d m o n o n u c l e a tc e l l s ( p b m c ) i s o l a t e db yf i c o l l h y p a q u ei nt h ep r e s e n c eo f l l - 2 、 i l - 4 、g m - c s et o t a lr n aw a si s o l a t e dw i t ht r i z o lr e a g e n tf r o mt h ed e n d r i t i c c e l l s ，a n dt h ei s o l a t e dt o t a lm r n aw a su s e df o rp r e p a r a t i o no fb 7 he d n a r t p c r 2 t h eb 7 hg e n ew a sc l o n e db yi n s e r t i o no f b 7 he d n ai n t ov e c t o rp t z 5 7 r tu s i n g i u s t a d o n e t mp c rp r o d u c tc l o n i n gk i ta n dt h er e c o m b i n a n tp t z 5 7 r t - b 7 h w a sa m p l i f i e db ye x p a n s i o no fe c o l ij m l 0 9t r a n s f o r m e dw i t ht h er e c o m b i n a n t p t z 5 7 r f r - b 7 h t h ep t z 5 7 r t - b 7 hw a si d e n t i f i e db yp c r , d i g e s t i o nw i t ht h e 锄z y m ee e n ria n de n z y m en o ti a n d s e q u e n c ea n a l y s i s 3 ap r o k a r y o t i ee x p r e s s i o ns y s t e m , p g e x 4 r _ 1 - b 7 h ，w a sc o n s t r u c t e dw i t ht h e c l o n e db 7 hg c n ea n dp g e x - 4 t - 1 ，a n di tw a su s e dt ot r a n s f o r me c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) t h ef u s i o np r o t e i ne x p r e s s e di nt r a n s f o r m e de c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) w a s i d e n t i f i e db ys d s p a g ea n dw e s t e r nb l o t r e s u l t s 1 t h eb 7 he d n ap r o d u c e db yr t - p c rw a sf o u n dt ob e9 0 9 b pi ns i z ea s d e m o n s t r a t e db ya g a r o s ee l e c t r o p h o r e s i s 2 。t h eb 7 he d n aw a su s e dt oc l o n eb 7 hg e n eb yi n s e r t i o no fi ti n t ov e c t o l 葛 i l l 天津医科大学硕士研究生论文英文摘要 p t z 5 7 r t p c ra n de n d o n u c l e a s e sd i g e s t i o ns h o w e dt h a tt h es i z eo f c l o n e db 7 h g e n ew a sf o u n dt ob et h es a n l e 勰t h eb 7 he d n a s e q u e n c i n gd e m o n s t r a t e dt h e c l o n e db 7 hg e n ew a so f9 9 6 i d e n f i t yt ot h eb 7 hs e q u e n c ef r o mt h ed a t a b a s eo f g e n b a n k t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eg e n ec l o n e di nt h ee x p e r i m e n tw a sb 7 h g e n e 3 t h eb 7 hd n ac o n t a i n e di np g e x - 4 t - i - b 7 hw a sa l s oo f9 9 6 i d e n f i t yt ot h e b 7 hs e q u e n c ef r o mt h ed a t a b a s eo fg e n b a n k w h e nt r a n s f o r m e dw i t h p g e x 一4 t 1 一a t h , e x p r e s s e db yt h et r a n s f o r m e de c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) e x p r e s s e da f u s i o np r o t e i no f5 6k da si n d i c a t e db ys d s p a g e w e s t e r nb l o ts h o w e dt h a tt h e e x p r e s s e df u s i o np r o t e i nw a sr e c o g n i z e db yt h em o n o e l o n a la n t i b o d ys p e c i f i ct o b 7 h c o n e l u s i o n 1 t h eg e n ec l o n e di nt h ep r e s e n ts t u d yi sh u m a nb 7 hg e n e 2 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp g e x 4 r - 1 一b 7 hc o n s t r u c t e di nt h ep r e s e n ts t u d yi sa f u n c t i o n a lp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e m 3 t h ef u s i o n p r o t e i ne x p r e s s e d i ne c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t r a n s f o r m e dw i t h p g e x - 4 t 1 - b t hi sb t hp r o t e i n k e y w o r d sd e n d r i t i cc e l l ；e o s t i m u l a t o r ys i g n a l s ；b 7 hg e n e ；t ac l o n e ；g e n e t i cc l o n i n g ； p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e m ；f u s i o np r o t e i n 天津医科大学硕士研究生论文英文缩略词 英文缩略词表 缩略词英文全称 b 7 hb 7h o m o l o g o u sp r o t e i n i c o si n d u c i b l ec o s t i m u l a t o r ys t i m u l a t o r p b m c p e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc d l ( s ) a p c a n t i g e n - p r e s e n t i n gc e l l d cd e n d r i t i cc e l l c o n ac o n c a n a v a l i na i l - 2i n t e r l e u k i n e - 2 i l - 4 i n t e r l e u k i n e 4 g m - c s f g r a n u l o e y t c - m a c r o p h a g ec o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r c d n a c o m p l e m e n t a r yd n a r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e f b sf d a lb o v i n es e r u m p b s p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e e be t h i d i u mb r o m i d e o d o p t i c a ld e n s i t y a m pa m p i c i l l i n s d s s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e 中文译名 b 7 同源蛋白 可诱导协同刺激分 子 外周血单个核细胞 抗原呈递细胞 树突状细胞 刀豆蛋白a 白细胞介素2 白细胞介素4 粒细胞巨噬细胞集 落刺激因子 互补d n a 逆转录聚合酶链式 反应 焦碳酸二乙酯 胎牛血清 磷酸盐缓冲液 溴化乙锭 光密度 氨苄青霉素 十二烷基硫酸钠 天律医科大学硕士研究生论文 英文缩略词 缩略词英文全称 t b st r i sb u f f e rs o l u t i o n e d t a w b p ：a g e d m s o d t r t r i s t e e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d w e s t e mb l o t p o l y a c r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i s d i m a t l l y ls u l f o x i d e d i t h i o t h r e i t o l t r i s - h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e t r i s h e le d t ab u f f e r i p t g i s o p r o p y l - 1 3 - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e e c o l ie s d l e c h i ac o l i x - g a a 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o 3 i n d o l y l 1 3 - d g a l a c t o s i d e m rr e l a t i v em o l e c u l a rm a s s 中文译名 三羟甲基氨基甲烷 缓冲盐溶液 乙二胺四乙酸 免疫印迹 聚丙烯酰胺凝胶 二甲基亚砜 二硫苏糖醇 三羟甲基氨基甲烷 t c i s - h de d t a 缓冲 液 异丙基硫代b d 半乳糖苷 埃希氏大肠杆菌 5 溴乒氯3 吲哚1 3 - d 半乳糖苷 相对分子质量 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研 究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的 地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 建夔凼日期：砷年岁月易日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意 学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密囹。 ( 请在以上方框内打“”) 日期：如7 年f 月够日 天津医科大学硕士研究生论文 前言 前言 已经证实，特异性t 细胞的完全活化需要双重信号的协同作用【l j ：即抗原 识别信号( 第一信号) 和共刺激信号( 第二信号) 。抗原识别信号由抗原提呈 细胞( a p c ) 表面的抗原肽主要组织相容性复合体( m h c ) 与t 细胞表面抗 原受体( t c r ) 结合而形成，具有抗原特异性；共刺激信号由a p c 表面的共 刺激分子与t 细胞表面的相应受体结合而产生，无抗原特异性。t 细胞只有在 双信号的协同作用下，才能堰化、增殖和分化，并分泌细胞因子。如果缺乏共 刺激信号，t 细胞将凋亡或呈现无能状态。在共刺激分子中，研究最深入、最 清楚的是b 7 家族的b 7 1 ( c d 8 0 ) 和b 7 2 ( c d 8 6 ) ，它们的受体是表达于t 细胞表面的c d 2 8 和c t l a - 4 结合。但是，b 7 c d 2 8 途径和b 7 c t l a - 4 途径 的作用相反。前者促进t 细胞的活化，而后者则抑制t 细胞的活化。通过这 二条途径，b 7 分子在调节t 细胞的增殖、活化、分化、凋亡及细胞因子分泌 中发挥重要作用吼除了b 7 1 和b 7 2 分子外，新近又发现了b 7 家族的另一 新成员，即为b 7 h ( b 7h o m o l o g o u sp r o t e i n ) 。已发现多种b t h 异构体，例如 b t r p 1 、g l 5 0 、b 7 h 2 t 3 - 6 1 。b 7 h 的受体称为可诱导的协同刺激分子( i n d u c i b l e c o s t i l n u l a 姗s t i m u l a t o r , i c o s ) 7 1 ，表达于活化t 细胞表面。 1 9 9 9 年s w a l o w 等人首次从经t n f - x t 活化的小鼠胚胎成纤维细胞系和3 t 3 细胞中克隆出一个新基因，由于该基因编码的蛋白在氮基酸水平上与b 7 分子 有2 0 的同源性，故命名为b 7 同源蛋白( b t h ) 【3 1 。同年，l i n g 等人在g c n e b a n k 数据库中找到与小鼠g l 5 0 序列同源的、分离白人脑组织的k i a a 0 6 5 3 c d n a ， 后以该基因编码的蛋白a b 0 1 4 5 5 3 的胞外区基因片段为模板设计引物，从人外 周血淋巴细胞中克隆出人的g l 5 0 基因h g l 5 0 s l 。人b 7 h 分子为i 型跨膜糖蛋 白，含有3 0 2 个氨基酸，n 端信号肽的长度为2 1 个氨基酸，故成熟分子含有 天津医科大学硕士研究生论文 前言 2 8 1 个氨基酸。在结构上分为三个区：胞外区( 2 3 5 个氨基酸) 、疏水跨膜区( 2 1 个氨基酸) 和胞内区( 2 5 个氨基酸) 。胞外区含有一个i g v 样区( 长度为1 0 9 个氨基酸) 和一个i gc 样区( 长度为1 1 3 个氨基酸) 【8 】。h g l s 0 与m g l 5 0 在 氨基酸水平上有4 2 的同源性【5 1 。b 7 h 与b 7 1 和b 7 - 2 氨基酸序列同源性分别 为2 4 和2 1 。它们在结构上的相似性表现在：跨膜区的多肽长度及该区在 分子中的相对位置一致；胞外区都含有4 个保守的半胱氨酸，可参与连接i g v 样区和i gc 样区二硫键的形成；i gv 样区8 0 位上的保守酪氨酸等【6 】。尽管结 构上相似，但b 7 h 不含有与c d 2 8 c t l a 一4 结合所必需的s q d x x x e l y 模序， 因此它只与表达于活化t 细胞表面的i c o s 结合，是独立于c d 2 8 b 7 途径、 具有不同功能的协同刺激途径。 1 9 9 9 年，h u t l u f f 等人用活化的人t 细胞免疫小鼠，制备获得一株单克隆抗 体f 4 4 ( i g g t ) ，该抗体所识别的抗原是一种表达在活化后t 细胞表面的新型膜 分子即i c o s q 。i c o s 为i 型跨膜糖蛋白，单体由1 9 9 个氨基酸组成，结构上 分为胞外i g v 样结构域、跨膜区( 含2 3 个氨基酸) 和胞浆区( 含3 5 个氨基酸) 1 9 】。i c o s 与c d 2 8 c t l a - 4 的氨基酸序列同源性约为3 0 - 4 0 ，都以同源二聚 体的形式表达在细胞膜上，相对分子量为5 5 - 6 0 k d 。i c o s 的基因位点与 c d 2 8 c t l a - 4 相邻，在结构上也有几个与c d 2 8 相同的保守模序，如胞外i g - v 样结构域和胞浆区y m f i v l 模序，该模序可通过p i - 3 k 向下游传递活化信号【7 ，1 0 1 。 但是i c o s 胞外区缺少与b 7 1 或b 7 - 2 结合的m y p p y 模序，所以i c o s 只能与 b t h 特异性结合，而不能与b 7 1 1 3 7 2 结合。 与b 7 1 和b 7 2 相比，b 7 h 具有独特的表达谱，它在淋巴组织和非淋巴组 织均有表达。b 7 h 除了在b 细胞、树突状细胞和单核细胞等免疫细胞上表达外， 心脏、肾脏、脑组织等一些非淋巴组织中也有分布。注射l p s 可上调b 7 h 在 这些非淋巴组织中的表达，推测b 7 h 分子可能参与炎症状态下的局部免疫反 应【3 1 。 目前已知的i c o s b t h 途径的功能包括促进t 细胞增殖、调控t h l 2 分化、 4 天津医科大学硕士研究生论文前言 调节细胞因子生成、抗体分泌、淋巴组织生发中心形成等 1 1 , 1 2 。 在细胞免疫中1 c o s b t h 的作用是促进t 细胞的活化、增殖和分泌细胞因 子。用抗i c o s 的抗体和可溶性b 7 r p 1 作用于t 细胞，可促进t h 细胞的增 生、分化，并可使t 细胞分泌i l - 4 、i l - 5 、i l - 1 0 、i l - 1 3 、t n f - a 等多种细胞 因子【4 】。若缺乏该信号，则t 细胞的增生和细胞因子的生成均降低，尤其是i l - 4 和i l 1 3 。而i l - 4 在b 细胞活化和抗体类别转换过程中有重要作用i l l 】。 i c o s b 7 h 途径对体液免疫应答的促进作用表现在两方面：一是促进淋巴 器官内生发中心的形成和成熟。i c o s 可以上调c d 4 0 l 的表达，同时促进i l 4 、 i l l o 等细胞因子的分泌，使活化t 细胞通过细胞因子和细胞间直接接触 ( c d 4 0 u c d 4 0 ) 辅助b 细胞形成生发中心【1 3 】。有报道，因b 7 h 缺陷导致的体 液免疫反应二次应答受损与生发中心形成不良有关。二是促进抗体类型的转 换。i c o s 4 小鼠i g g l 、i g g 2 a 、i g e 等基础分泌量降低，用抗原再次活化已致 敏的b 7 矿小鼠，并不能上调1 9 g 1 、i g g 2 a 水平耵。由此可见，缺乏b 7 h i c o s 的共刺激作用会影响体内正常的细胞和体液免疫。 还有研究表明，调控i c o s 倡7 h 途径有可能用于肿瘤，移植排斥反应、过 敏性疾病和自身免疫性疾病的治疗。例如，在胶原诱导的关节炎 ( c o l l a g e n i n d u c e da r t h r i t i s ，c i a ) 模型中，用抗b t h 单克隆抗体阻断b 7 h i c o s 途径可显著缓解c i a 小鼠的关节炎症状【1 5 】，阻止红斑狼疮小鼠病情的进展【1 6 1 。 而以转染b 7 h 的小鼠肿瘤细胞s a l n ( b 7 h s a l n ) 接种小鼠，b 7 h 可活化并促 进c d s + t 细胞的增殖，促进其分泌i f n - 7 和i l - 2 ，促进体内c d 8 + t 细胞的初 次与二次免疫应答【1 7 1 ，从而使肿瘤的生长明显受到抑制，可能是因为b 7 h 的 转染增强了肿瘤细胞的免疫原性，从而诱发小鼠更为强烈的机体免疫应答。 耳前国内已有学者利用逆转录病毒载体系统介导g l 5 0 基因转染l 9 2 9 细 胞，建立了g l s 0 的真核转染细胞。并采用b 淋巴细胞杂交瘤技术，制备出两 株鼠抗人g l 5 0 单克隆抗体。然后用转染细胞研究b t h 对t 细胞的作用，结果 发现，g l 5 0 l 9 2 9 转染细胞能促进经抗c d 3 单抗活化的t 细胞增殖和分泌 天津医科大学硕士研究生论文 前言 i l - 1 0 ，还可上调p w m 介导的b 细胞分泌、抗体的生成1 8 五0 】。这些研究都说明 i c o s b 7 1 a 信号途径在机体t 细胞依赖的体液免疫应答反应中发挥重要调节作 用。 虽然已发现多种b 7 h 分子的异构体，但是尚不清楚这些异构体与i c o s 结 合后是否具有相同的作用。事实上，不同的异构体与相同的配体结合有可能产 生不尽相同的作用。最为熟知的例证是b 7 分子的异构体b 7 - 1 和b 7 - 2 分子。 这二种分子在抗原呈递细胞的表达规律不同，与c d 2 8 结合后对活化t 细胞的 作用也不尽相同。 因此，本课题旨在利用基因工程重组技术，构建人b 7 h 基因的原核表达 载体，再将p g e x 4 t 1 一b 7 h 重组质粒转化到宿主菌e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 中，表 达出b 7 h 融合蛋白。b 7 h 融合蛋白不仅对深入研究b t h i c o s 途径的信号传导， 而且对研究不同异构体的作用具有十分重要的意义。 6 天津医科大学硕士研究生论文第一郝分 第一部分人树突状细胞总m r n a 的提取 树突状细胞是表达b 7 h 的主要细胞之一，因此本课题的基本目的是克隆人 树突状细胞b 7 h 基因。树突状细胞最常用的培养方法是以i l 2 、i l 一4 、g m c s f 等细胞因子诱导外周血单个核细胞( p b m c ) 分化成熟为树突状细胞。本课题采 用该方法制各人树突状细胞并提取其总m r n a ，用于b 7 h 基因的克隆。 一、材料和方法 ( 一) 实验材料 1 主要试剂 ( 1 ) 抗凝外周血白膜：购白天津市血液中心 ( 2 ) r p m i1 6 4 0 培养基( 含1 0 0 u m l 青霉素，1 0 0 蚓m l 链霉素) ：北京天润 善达生物科技有限责任公司 ( 3 ) 优级新生牛血清：中美合资兰州民海生物工程有限公司 ( 4 ) 刀豆蛋白a ( c o n c a n a v a l i n a ，c o n a ) ：s i g m a ，u s a ( 5 ) i l - 2 ：北京双鹭药业有限公司 ( 6 ) i l 4 、g m c s f 由本室保存 ( 7 ) 0 2 5 胰酶e d t a ：h y c l o n e ，u s a ( 8 ) 人淋巴细胞分层液：中国医学科学院血液学研究所 ( 9 ) r n a 提取液( t r ir e a g e n t ) ：m o l e c u l a rr e s e a r c hc e n t e r ，i n c ，u s a ( 1 0 ) 无水乙醇( 分析纯) 、异丙醇( 分析纯) ( m w - 6 0 1 0 ) 、三氯甲烷( 分析纯， 氯仿) ( m w 1 1 9 3 8 ) ：天津市致远化学试剂有限公司 ( 1 1 ) 焦碳酸二乙酯( d e p c ) ：北京鼎国生物技术有限责任公司 ( 1 2 ) 去离子水及无核酸酶的去离子水：北京t i a n g e n 科技有限公司 7 天津医科大学硕士研究生论文 第一部分 2 主要仪器和设备 ( 1 ) 显微镜 普通光学显微镜：n 诹o n ，j a p a n ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ) ( 5 ) ( 6 ) ( 7 ) ( 8 ) ( 9 ) ( 1 0 ) ( 1 1 ) ( 1 2 ) ( 1 3 ) ( 1 4 ) ( 1 5 ) 倒置显微镜：o l y m p u sc k 4 0 ，j a p a n 二氧化碳孵箱：t h e r m of o r m as e r i e si iw a t e rj a c k e t e dc 0 2i n c u b a t o r , h e p ac l a s s10 0 ，t h e r m oe l e c t r o nc o r p o r a t i o n , f i n l a n d 超净工作台：t h e r m o ，u s a ；h d l a p p a r a t u s 电子天平；s a r t o r i u s ，g e r m a n y 离心机： 常温高速离心机( 适用于l ，5m l 离心管) ：e p p e n d o r f 5 7 0 2 、5 4 1 5 d ， g e r m a n y 常温高速离心机( 适用于j 5m f 5 0m l 离心管) ：e p p e n d o r f 低温高速离心机( 适用于1 5i i l l 离心管) ：e p p e n d o r f 5 4 1 5 r 、5 8 0 4 r ， g e r m a n y 低温离心机( 适用于1 5m l 5 0 m l 离心管) ：b e c k m a nc o u l t e r a l l e g r a x - 15 rc e n t r i f u g e 纯水机：p a j l ，u i s a 超声粉碎仪：u l t r a s o n i cp r o c e s s o r , s o n i c s & m a t e r i a l si n c u s a 热混旋仪：t h e r m o m i x t e rc o m p a c t , e p p e n d o r f ，g e r m a n y 涡旋混旋仪：v o r t e x 2 ，g e n i e 雪，s c i e n t i f i ci n d u s t r i e s ，i n c u s a p c r 仪：m a s t e r e y c l e rg r a d i e n t ，e p p e n d o r f ，g e r m a n y 电泳仪：p o w e r p a cb a s i c , b i o - r a d , u s a 电泳及电转移装置：m i n i p r o t e a n , b i o r a d ，u s a g e l d o e 凝胶成像分析系统：b i o r a d ，u s a ( b i o - r a d , h e r c u l e s ，c a ) 制冰机：s a n y o ，j a p a n 4 c 及2 0 1 2 电冰箱：海尔，青岛；新飞转换型冷藏冷冻箱( b c b d - 1 0 8 ) 8 天津医科大学硕士研究生论文第一部分 ( 1 6 ) 7 0 - 8 0 超低温电冰箱：s a n y ou l t r a l o w 8 5 ，j a p a n ；t h e r m o f o r m a 8 6 u l tf r e e z e r ( 1 7 ) 新型恒温摇床：z r i e r e n g 。，z h w y - 2 1 0 2 c ，z h w y - 1 0 0 a ，上海智城分析仪 器制造有限公司 ( 18 ) 恒温水浴箱：j o u a n ，f r a n c e ( 1 9 ) s h y - 2 a 水浴恒温振荡器：江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂 ( 2 0 ) h p s 1 6 0 生化培养箱：中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 ( 2 1 ) 全自动立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂 ( 2 2 ) 各种规格微量可调加样器：e p p e n d o r f , g e r m a n y ( 2 3 ) 各种规格无核酸酶吸头及0 2 m i 0 5 m l 1 5 m l e p p e n d o r f 管：a x y g e n ， u s ，a ( 2 4 ) 微波炉：美的，广东 ( 2 5 ) 分光光度计：b i o r a ds m a r ts p 晶mp l u s ，u s a ( 2 6 ) 3 m l 石英比色杯 ( 2 7 ) 6 - 孔板：c o s t a r ，u s a ( 2 8 ) p h 计：s a r t o r i u s ，g e r m a n y ( 2 9 ) 0 2 岫一次性滤器：s a r t o r i u s ，g e r m a n y ( 3 0 ) 1 0 0m i n x 2 0t o n i 及6 0m m x l 5 n l l n 细胞培养平1 1 1 1 ：c o m i n g ，u s a ( 3 1 ) 1 5 m l 及5 0 i n l 离心管：c o m i n g ，u s a ( 3 2 ) 细菌培养用玻璃培养皿( 直径为1 0 c i n ) ：天津玻璃仪器厂 ( 3 3 ) 电子计算机；d e l l ，u s a 3 主要试剂的配制 ( 1 ) r p m i - 1 6 4 0 完全培养液的配制：r p m l 1 6 4 0 培养液中加入热灭活的胎牛 血清，依据实验需要调整血清浓度。 ( 2 ) c o n a 储存液( 1 m g m l ) 的配制：将c o n a 溶于r p m i1 6 4 0 中，终浓度 为l m g m l ，0 2 2 9 i n 滤膜过滤后r 分装为2 m l 管，储存于一2 0 c 。 9 天津医科大学硕士研究生论文第一部分 ( 3 ) i l - 2 工作液的配制：将i l - 2 ( 1 0 ，0 0 0 u 瓶) 溶于r p m l l 6 4 0 中，终浓度为 2 0 0 0 u 恤l 。 ( 4 ) i l 4 工作液的配制：将m - 4 ( 1 0 i _ t g m l ) 溶于r p m l l 6 4 0 中，终浓度为 2 0 n g m l 。 ( 5 ) g m c s f 工作液的配制：将g m c s f 溶于r p m l l 6 4 0 中，终浓度为 8 0 u m l 。 ( 6 ) p b s ( o 1 5 m o l l ，p h 7 2 ) 的配制：n a c l8 0 0 9 、k c l0 2 0 9 、n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 2 9 0 i g 、k h 2 p 0 4o 2 0 9 溶于1 , 0 0 0 m l 蒸馏水中混匀，调p h 值至7 2 。高 压蒸汽灭菌( 1 5 磅，2 0 分钟) 后，储存于4 c 。 ( 7 ) 0 。i d e p c 水：1 0 0 0 m l 蒸馏水内加入l m l d e p c ( 1 0 0 ( 3 1 ，v v ) ，室温过 夜，高压蒸汽灭菌( 1 5 磅，2 0 分钟) 后，储存于4 c 。 ( - - ) 实验方法 1 人外周血单个核细胞q 耐p h 酬b l o o dm o n o n u c l e a rc e l l ，p b m c ) 分离口1 】 p b m c 主要指淋巴细胞和单核细胞。聚蔗糖泛影葡胺密度梯度离心法 ( f i c o l l - h y p a q u ed e n s i t yg r a d i e n te e n t f i f u g a t i o n ) 利用p b m c 与血液中的其他成分 存在密度差异从而简便、有效的分离出p b m c 。聚蔗糖泛影葡胺分层液( 也称 为淋巴细胞分层液) 的主要成分是聚蔗糖和泛影葡胺。聚蔗糖( f i c o l l ) 分子量 为4 0 k d ，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点；常用的f i c o l l 溶液浓度为6 ， 密度为1 0 2 0 。泛影葡胺( h y p a q u e ) 用来增加密度，适量加入密度为1 2 0 0 、浓 度为3 4 的h y p a q u e 于f i e o l l 溶液中，配成浓度为1 0 7 7 4 - 0 0 0 1 的分层液，用于 淋巴细胞的分离。 ( 1 ) 取新鲜的健康人抗凝外周血白膜3 5 m l ，加入等体积的p b s ，使血液等倍 稀释，可降低红细胞的凝聚，提高分离效果。 ( 2 ) 吸取淋巴细胞分离液( 每2 m l 稀释血加i m l 分离液) 置于5 0m l 离心管 中，然后将离心管倾斜4 5 0 角，将稀释血液在距分离液界面上l e n a 处沿 试管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰，勿使血液混入 l o 天津医科大学硕士研究生论文 第一部分 分离液中。 ( 3 ) 将离心管置水平式离心机内，在1 8 。c 2 0 c 下，以1 , 2 0 0 r p n g m i n 离心1 5 分钟。离心后，管内可分为四层：上层为血浆、血液稀释液及绝大部分 血小板；下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分层液；分层液与血浆交 界部位混浊的灰白色层即为单个核细胞层。 ( 4 ) 用吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出灰白色的单个核细胞，盛入 另一支离心管中。既要尽量吸取所有单个核细胞，又要避免吸取过多的 分层液或血浆，以免混入其他细胞成分。 ( 5 ) 将所得到的p b m c 悬液用5 倍体积的无钙镁p b s 洗涤，室温下离心 ( 2 ，0 0 0 r p m m i n ，1 0 分钟) ，弃去p b s ，重复洗涤三次，可去掉大部分混 杂的血小板。 2 树突状细胞的培养 ( 1 ) 将分离的p b m c 用o 0 5 台盼蓝染色计数活细胞数后，混悬于含有 i l - 2 ( 2 0 0 0 u m l ) 和c o n a ( 5 i _ t g m l ) 的完全培养基( 含1 0 f b s 的 r p m l l 6 4 0 ) ，调整细胞密度为2 x 1 0 6 个m l 。接种于6 孔平底培养板，每 孔2 m l 细胞悬液，在3 7 c ，5 c 0 2 孵箱中培养4 8 小时。 ( 2 ) 用含有g m - c s f ( 8 0 u m l ) 、i l - 4 ( 2 0 n g m l ) 和i l - 2 ( 2 0 0 0 u m l ) 的完全培养 基( 含1 0 f b s 的r p m l l 6 4 0 ) 半量换液，继续培养。 ( 3 ) 在培养第七天收集悬浮细胞。细胞计数后，用于总r n a 的提取。 3 人外周血树突状细胞总r n a 的提取 用商品化的t r i z o l 提取人树突状细胞总m r n a 。t r i z o l 是酚和异硫氰酸胍 的均相溶液，利用异硫氰酸胍等物质将各种组织内细胞破碎，并可以抑制核酸 酶的释放，然后通过酚、氯仿抽提，再经过沉淀、洗涤，最后即可得到较高质 量的r n a 纯品【埘。 提取m r n a 所用的e p p e n d o r f 管及吸头均无核糖核酸酶( r n a 酶) 污染， 并经高压蒸汽灭菌( 1 5 磅，2 0 分钟) 后使用。 天津医科大学硕士研究生论文第一部分 人外周血树突状细胞匀浆：收集