（作物遗传育种专业论文）花生MADSbox基因保守序列的克隆与分析.pdf

摘要 摘要 花生是世界最重要的油料和经济作物之一，地上开花，地下结果，其花器官 的诱导与发育与种子产量紧密相关。m a d s - b o x 基因是一类调控植物生长发育的 关键基因，散布在整个植物基因组中，编码多种具有重要生物学功能的转录调节 因子。在植物中，尤其在花分生组织、花器官及各种营养器官的发育过程中起着 重要的作用。本研究以花生品种闽花6 号为研究对象，根据己知的花生m a d s b o x 基因保守序列设计简并引物，以同源序列法分离克隆出花生m a d s b o x 基因序 列，研究了该基因家族的序列特征及进化关系，为花生高产基因工程的开展奠定 基础。 本研究根据本实验室前期得到的并已登录g e n e b a n k 的两条花生m a d s - b o x 全长基因的保守序列，并拓展至豆科植物同源序列，设计了3 条正向和3 条反向 引物，组合成5 对简并引物，分别以花生各组织混合m r n a 逆转录产物为模板 扩增目的片段，得到长度分别为5 2 0 b p 、6 4 4 b p 、4 3 3 b p 、5 5 7 b p 、4 4 8 b p 的目的 片段，与预期的片段长度相符；将这些目的片段克隆到p g e m t 载体上并转化 大肠杆菌，共挑取2 6 个阳性克隆进行测序验证，通过对测序结果进行b l a s t 比对， 结果表明2 6 条测序片段与已知花生m a d s - b o x 基因同源度高达9 7 ，遂将其 d n a 序列翻译为氨基酸序列，并分析了这2 6 条序列保守结构域，分析表明所得 到的序列具有m a d s b o x 基因的两个典型保守结构域，包含部分缺失m a d s 盒 功能域和完整k 盒结构域；通过c l u s t e rx2 0 软件聚类分析表明所得到的2 6 条 序列之间具有序列多态性。 关键词：花生m a d s b o x 基因同源序列克隆 a b s t r a c t a b s t r a c t p e a n u ti so n eo ft h ei m p o r t a n to i la n de c o n o m i cc r o p so ft h ew o r l d ，w h i c h b l o s s o m so v e r g r o u n d l yw h i l ef r u i t su n d e r g r o u n d l y t h es t a t u so ff l o r a lo r g a n s d e v e l o p m e n ti sh i g h l ya s s o c i a t e dw i t ht h ey i e l do fp e a n u ts e e d s m a d s - b o xg e n e s a l eag e n ef a m i l yw h i c hd i s t r i b u t ea l lo v e rt h ep l a n tg e n o m e ，a n da r et h ek e yg e n eo f r e g u l a t i n gp l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n tb ye n c o d i n gs e r i e so ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r s o fs i g n i f i c a n tb i o l o g i c a lf u n c t i o n s m a d s - b o xg e n e sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei np l a n t s ， e s p e c i a l l yi nf l o r a lm e r i s t e m ，f l o r a lo r g a n sa n dv a r i o u sv e g e t a t i v eo r g a n s t a k i n gp e a n u t v a r i e t y , m i n l m a6 ，a sr e s e a r c hm a t e r i a l so ft h i ss t u d y ，w ed e s i g n e dd e g e n e r a t ep r i m e r s a c c o r d i n gt ot h ec o n s e r v e ds e q u e n c eo f m a d s b o xg e n e s ，t h e ni s o l a t e da n dc l o n e d p e a n u t sm a d s - b o xg e n es e g u e n c eb yh o m o l o g yc l o n i n ga p p r o a c h w e a l s o a n a l y s i s e dt h es e q u e n c ec h a r a c t e r i s t i c sa n dt h ee v o l u t i o n a r yr e l a t i o n s h i p ，w h i c hc a n b ef u r t h e ru s e dt oi m p r o v et h ey i e l do fp e a n u tb yp l a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n gi nt h e f u t u r e o nt h eb a s i so ft w of u l l l e n g t hp e a n u tm a d s - b o xg e n e so u rr e s e a c ht e a mh a v e a c q u i r e da n dl o g i n e di n t ot h eg e n e b a n kp r e v i o u s l y , a sw e l la sh o m o l o g o u ss e q u e n c e o fo t h e rl e g u m i n o u sp l a n t s ，w ed e s i g n e d3f o r w a r dp r i m e r sa n d3r e v e r s ep r i m e r s a c c o r d i n gt ot h ec o n s e r v e ds e q u e n c e s o fm a d s - b o x ，a n dm a t c h e d5p a i r sp r i m e rt o a m p l i f yt h ef r a g m e n tb yt h et e m p l a t eo fm i x e de d n af r o md i f f e r e n to r g a n i z a t i o n s w eo b t a i n e d5t a r g e t e df r a g m e n t s ，t h el e n g t hw e r e5 2 0 b p ，6 4 4 b p ，4 3 3 b p ，5 5 7 b pa n d 4 4 8 b pr e s p e c t i v e l y , w h i c hw e r e 8 8t oo u re x p e c t a t i o n ；a n dt h e n ，t h e s ef i a g m e n t sw e r e c l o n ei n t op g e m - tv e c t o r , p i c k e du pt h ec l o n e sa n di d e n t i f i e db yt h ep c ra n d r e s t r i c t e de n z y m ed i g e s t t h ec l o n e sw e r ea n a l y s i sb yd n as e q u e n c i n g a tl a s tw e b l a s tt h es e q u e n c eo ft h e2 6f r a g m e n t s ，a n ds u g g e s t i n gt h a ta l lo ft h ef r a g m e n t sw e r e c o n t a i nt h ec o n s e r v e dk b o xa n dp a r t i a lm a d s b o xo fm a d s - b o x c l u s t e ra n a l y s i s o ft h e2 6s e q u e n c e sb ys o f t w a r ec l u s t e rx2 0s u g g e s t i n gt h a tt h o s es e q u e n c e sw e r e c l u s t e r e di n t od i f f e r e n tc l u s t e r s k e yw o r d s ：p e a n u t ；m a d s - b o x ；h o m o l o g o u ss e q u e n c ec l o n i n g 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 论文使用授权的说明 日期彩矿6 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 学位( 毕业) 论文 指导教师亲笔签名 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 日期：d 弓占砂z ， 日期：。 6 i 前言 第一章前言 1 花生及其遗传育种研究发展简述 花生( a r a c h i sh y p o g a e al ) ，是世界范围内广泛种植的油料和经济作物，也 是全球最重要的四大油料作物之一，又称落花生或长生果，豆科蝶形花亚科花生 属( a r a c h i sl ) ，为双子叶植物，其染色体为异源四倍体，2 n - = 4 x = 4 0 。花生是一 年生草本植物，生活周期约为4 5 个月，原产于南美的巴西、秘鲁，故又称番豆， 于明代时期传入我国福建，现在在全国各地均有种植，集中的产地主要分布于山 东、河南、河北、辽宁、江苏、福建、广东、广西、四川i 等省( 区) 。我国 是世界上最大的花生生产和出口国之一，花生总产量、出口贸易量和花生油消费 量位居世界前列；花生种植面积在我国农作物中排在第七位，而农业产值排在第 五位，年总产已达1 5 0 0 多万吨，占世界花生总产的4 3 ，出口量占世界的4 0 以上【1 1 。花生是我国最具有竞争优势的植物油籽，也是传统的出口创汇产品，自 2 0 世纪8 0 年代以来保持净出口状态【2 】，2 0 0 8 年我国花生出口总额2 3 2 2 1 0 吨， 仅第一季度花生出口金额就达到3 3 亿美元。作为我国为数不多的具有强劲国际 竞争力的大宗农产品，大力发展花生产业具有重要的经济和社会意义。除榨油用 之外，花生还是重要的食品及食品原料，我国目前花生食用比例为2 7 ，而发达 国家花生食用比例达到6 0 以上，随着人民生活水平提高，及食品加工业的发展， 我国花生食用的比例也将增加，并且对花生品质的要求也将有进一步提高【3 j 。 花生具有很高的营养价值，据本草纲目记载：“花生悦脾和胃，润肺化 痰，滋养补气，清咽止痒”。花生及其制品富含丰富的脂肪和蛋白质，及维生 素e 、维生素c 和叶酸等植物活性物质，测定花生脂肪含量为4 4 - 4 5 ，在主 要食用油料作物中，其脂肪含量仅次于芝麻，高于油菜籽、大豆和棉籽；蛋白质 含量为2 4 3 6 ，相当于牛奶的8 1 0 倍、牛肉和猪肉的1 2 倍、稻米的3 4 倍， 在所有农作物中，仅次于大豆，但其蛋白质消化率高于大豆闱；含糖量为2 0 左 右；并含有a 、b 、e 、k 、硫胺素、核黄素、尼克酸等多种物质；花生富含不饱 和脂肪酸，其中油酸3 4 6 8 、亚油酸1 9 4 3 ，可降低血脂，预防心脏病， 还有抗癌的功能；花生油是优质食用植物油，较之棉籽油、菜籽油等其它植物油 前言 具有气味清香、滋味纯正、健康保健等特点，是深受人们喜爱的食用油之一；花 生蛋白是一种完全蛋白，有促进脑细胞发育，增强记忆的功能，且易为人体消化 吸收，含有人体所需的8 种必须氨基酸，除蛋氨酸含量较低外，赖氨酸、色氨酸、 苏氨酸接近联合国粮农组织所规定的标准，而其他4 种氨基酸含量则超过了此 标准，可以作为肉制品、乳制品、糖果和煎炸食品的原料或添加剂，而以花生蛋 白粉为原料或添加剂制成的食品，既提高了食品蛋白质含量，又改善了其功能性， 此外花生蛋白粉还可以通过高压膨化制成蛋白肉；花生经深加工还可制成营养丰 富、色、香、味俱佳的各种食品和保健食品；花生副产品花生壳和花生粕等可以 综合利用，加工增值，提高经济效益；除食用外，花生也是一味中药，中医认为 花生适用营养不良、脾胃失调、咳嗽痰喘等症，而花生的叶子、花生衣、壳、花 生油等，都可以作为药用。 作为广泛种植的优质食用油主要油料品种之一，长期以来，我国的花生科研 工作者运用常规育种方法培育出许多高产、推广性好的优良品种，并示范推广了 配套高产栽培技术【5 】，为我国花生总产量和种植面积的提高做出了巨大贡献。然 而，随着国际贸易的扩大、科学技术的不断发展以及入世后我国花生产业结构的 发展变化，市场的需求对我国的花生提出了更高的标准，为满足快速变化的国际、 国内市场的需求及人民健康的需要，加快花生优质品种及专化品种的选育势在必 行。现今仅靠常规育种已不能满足花生发展的需要，研究表明栽培种花生的遗传 基础狭窄、抗逆性差，从而导致花生产量和质量降低；传统花生育种偏重于高产 性状的选育，对品质性状考虑较少，或花生优质育种的范围过窄，不能满足市场 的需要；大量地利用有限的品种资源作为杂交亲本，产生新变异机会已越来越少， 育种工作难以有突破性的进展【6 】。为了选育出高产、优质、稳产的新型花生品种， 育种工作者们正积极地探索将多种育种途径结合起来，特别是把现代分子生物技 术途径与常规育种方法相结合，以提高育种效率，加速育种进程。 但是花生分子生物学基础研究起步较晚，且花生本身遗传背景比较复杂，生 物技术发展较水稻、油菜等其它作物慢。目前花生生物技术研究发展的热点主要 在于品质与抗性的遗传改良、利用分子标记技术进行遗传作图以及花生重要基因 的筛选上。虽然随着花生分子生物学的发展，越来越多的功能基因正在被研究， 但就目前而言，许多重要的基因特别是重要的转录因子在花生上未见报道，有些 2 前言 是通过同源克隆的方法根据其它植物的序列来克隆花生上的同源序列。孟玉环根 据大麦钙调蛋白c d n a 的保守序列，克隆出花生钙调蛋白的两个异型基因，两 个基因均为4 4 7 b p t 7 1 。袁美等利用了同源克隆方法从花生中克隆出m a d s b o x 基 因片段【8 1 ；彭伟等以同源克隆得到花生蛋白酶抑制剂并构建植物表达载体。随着 花生功能基因组的开展和e s t 大规模测序的进行，研究的重点将趋于研究花生 上重要基因的功能；研究花生上重要的表达调节基因；研究花生要基因的表达模 式等等。 2 m a d s b o x 基因研究进展 1 9 9 0 年，科学家利用转座子突变法从金鱼草中分离并克隆出同源异型基因 d e f ( d e f i c i e n s ) 1 9 。研究发现，该基因编码的蛋白质与两个己知的转录因子， 哺乳动物的s r f ( s e r u mr e s p o n s ef a c t o r ) 和酿酒酵母中的m c m i ( m i n i c h r o m o s o m e m a i n t e n a n c eg e n e ) 的一个保守区域有很高的同源性，这一区域参与二聚化和与 d n a 的结合，在推测的d n a 结合区，单个的氨基酸突变均会导致蛋白质与d n a 的结合能力下降，并导致表型发生改变，说明d e f 基因可能编码一个具有调控 功能的d n a 结合蛋白。同年，通过该方法又从拟南芥中克隆了同源异型基因 a g ( a g a m o u s ) ，它编码的蛋白质与上述转录因子具有高度的序列相似性，即均 在n 端含有一个约5 7 个氨基酸的保守区域。因此，人们根据这四个基因的名字 的第一个字母，将该保守区域命名为m a d s 盒区域( m a d sb o xd o m a i n ) ，并将 具有该区域的基因统称为m a d s b o x 基因【。 m a d s b o x 基因是一类调控植物生长发育的关键基因，散布在整个植物基因 组中，编码多种具有重要生物学功能的转录调节因子。在植物的花分生组织、花 器官及各种营养器官中均有不同形式的时空表达模式，起着各自不同的功能。 2 1m a d s b o x 基因起源与进化 m a d s - b o x 基因属于一个古老的基因家族，存在于整个真核生物界。现存的 植物、动物和真菌中都己发现m a d s - b o x 基因，因此有可能在大约1 0 亿年前的真 核生物的最后一个祖先中己经拥有至少一个真正的m a d s - b o x 基因。研究发现， 一些细菌蛋a 中存在一类u s p a 的蛋白质，它含有一段短的序列与m a d s 盒区 3 前； 域有部分同源i ；并且在其f 游电存在一段与k 盒区域的空i i 】结构极为相似卷 曲的螺旋结构【l ”，由此推断，大约在2 0 - 3 5 亿年前，u s p a 蛋白可能为原核生物与 真核生物m a d s b o x 基因的其同前体。约1 0 亿年前，真核7 e 物m a d s b o x 基因开始分化为3 个主要类群即a r g s 0 或s r f m a d s b o x 基因家族、 m e f 2 m a d s b o x 基因家族以及m i k c m a d s b o x 基因家族。目前，前2 类仅在 真菌和动物中发现，而m i k c m a d s b o x 基因仪限于植物中。通过序列比较分析 推断约在4 亿年前植物m a d s - b o x 基因，f 始分化为蕨类和种子植物2 个族， 而约在i3 亿年前，在双子叶植物和单子叶植物之间发生分化。 2 2m a d s b o x 基因结构特征 植物中的m a d s b o x 基因具有相似的内含了和外显予结构，一般包含6 个 内含子和7 个外显子其中外显子1 编码蛋白因子高度保守的m a d s 盒结构域 l 4 l ；外显子3 5 编码半保守的k 盒结构域，揖后2 0 个外显子编码c 末端。旧。 但金鱼草的d e f h l 2 5 、s q u a 及其它少数基因的结构略有所不同【】”。大部分 m a d s - b o x 基凶的上游有一称为c a r g 盒的( c c a - r i c h g g ) 特异序列m i ，是 m a d s 蛋白与d n a 保守序列结合的位点。研究表明，拟南芥a p 3 基冈的c a r g 盒山功能各异的3 个部分组成：c a r g1 是正调节因子的结合位点c a r g3 是负 调节因了的结合位点，c a r ( 2 的突变使报道基因在花冠中的表达水平大大f 降。 在拟南芥和其它一些生物巾也发现m a d s b o x 基因与其它基因是以连锁群形式 存在的i t s l o m a d s b o x 基因的结构组成及分布特点与它编码的蛋白转录因子的功 能午| j 适应。 三生上j 生上韭上业卫生l 上翌上旦丑卫三o o a m i n oa c i d 圈im a d $ 盘量自园子结构模式田 莉吾 2 3m a d s b o x 转录因子 m a d s b o x 基因编码的蛋白因子是一类转录因子，即反式作用因子，是一群 能与真核基因启动子区域中的顺式作用发生特异性结合，从而保证目的基因以特 定的强度，在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。植物的m a d s b o x 基因编 码的转录因子主要由m a d s 盒、k 盒、i 区、c 末端和n 末端5 个部分组成。其 中的m a d s 盒是由约5 6 5 8 个氨基酸组成的高度保守的结构域，在至今发现的 所有m a d s - b o x 因子中该区域有9 个氨基酸完全一样，是与d n a 特异结合的基 元序列【i9 】。研究表明，m a d s 盒是一个序列特异的d n a 结合基元，依靠其反向 平行的伍螺旋基元所形成的特定的二聚体结构而与d n a 小沟相互作用。m a d s 盒主要与d n a 结合，有时也形成二聚体与辅助因子结合。k 盒由于其结构类似 于卷曲螺旋结构的角蛋白区域而得名，由6 5 7 0 个氨基酸所组成，中度保守，是 蛋白因子之间相互作用的区域，为植物m a d s - b o x 基因特有，在动物和真菌中还 未被发现；一级结构分析表明k 盒结构域含有3 个q 螺旋k 1 ，k 2 和k 3 ，与疏 水残基有保守的整齐间距，能在蛋白二聚体中形成两亲和性螺旋结构，调解蛋白 质之间的相互作用。k 盒同样也是植物m a d s - b o x 基因的特征序列，是发生二 聚体化的结构基元【2 0 1 。i 区位于m a d s - b o x 和k 盒之间，是由约3 5 个氨基酸组 成的微弱保守区域。其作用是帮助二聚体的转录因子与d n a 结合形成复合体， 在决定哪个m a d s b o x 二聚体可以结合d n a 方面具有重要作用。c 末端位于k 盒下游，是由约3 0 个氨基酸组成的富含疏水残基的非保守区域。该区域以反式 激活为特征的非保守区域，可能作为m a d s - b o x 基因的转录激活区域，与 m a d s - b o x 多聚体高级结构有关。利用酵母双杂交已经证明o s m a d s l 6 水稻的 a p 3 同源基因，在c 末端蛋白区域含有一个转录激活区【2 l 】。一些植物蛋白在 m a d s 盒上游含有附加的n 末端残基，是富含碱性氨基酸的亲水结构域，形成 n m i k c 型蛋白【2 2 1 。m a d s 盒、k 盒、i 区、c 末端和n 末端在蛋白因子的二聚 体化及d n a 与二聚体的结合中起着各自不同的作用。 2 4m a d s b o x 转录因子与d n a 的相互作用 m a d s b o x 转录因子是通过二聚体化的形式以其保守结构域与特定的d n a 序列相结合来调控基因的表达，其中二聚体可以是同源二聚体，如拟南芥中的 5 前言 a g 、a p l 和a g l 的蛋白因子形成同源二聚体，也可以形成异源二聚体，如 a p 3 p i 2 3 1 。m a 等1 刁发现与蛋白因子结合的d n a 序列不仅可以是一般的结构基 因，而且也可以是m a d s - b o x 基因家族本身。尽管每个蛋白因子都具有各自不 同的d n a 结合特异性，但大多数m a d s - b o x 蛋白都结合于具有核心序列 c c ( a t ) 6 g g 的相似位点上。d a v i e s 等【2 4 】也发现蛋白质的d n a 结合结构域越相 似，所结合的d n a 的序列组成也越一致。同一个m a d s b o x 因子与不同的序列 有不同的亲合性。例如a g l 2 与末端含t 的序列的结合能力强于中间含g c 的 序列，而a g 则与第7 、8 位为g c 和a t 的序列结合能力较强【2 5 】。蛋白二聚体 与d n a 的结合引起d n a 构型发生改变。实验结果表明【2 6 1 ，a p l a p l 、a p 3 p i 、 a g a g 二聚体保护了与之结合的寡聚核苷酸，并诱导d n a 往小沟方向发生不同 程度的弯曲。 2 5 植物m a d s b o x 基因分布 m a d s - b o x 基因几乎遍布整个植物界。研究表明，模式植物拟南芥和金鱼草 中存在大量的m a d s b o x 基酬2 7 ，2 8 , 2 9 ，3 0 1 ，同样在番茄、油菜、烟草和矮牵牛等 双子叶植物以及玉米、小麦、高粱等单子叶植物中也广泛存在；在植物体不同部 位、不同生长发育阶段均发现m a d s - b o x 基因表达；植物花发育过程中，有5 类m a d s b o x 基因参与调节【3 l 】。从d n a 水平上来看，m a d s - b o x 基因是一个庞 大家族，分散分布在整个基因组中【3 2 1 。 2 6 植物m a d s b o x 基因分类 植物中m a d s b o x 基因属多基因家族，按照其碱基序列、系统发育关系、 表达特性和功能可分为几个亚族。在不同的植物中，同一亚族的大多数基因功能 相似。p u r u g g a n a n 等【3 3 】根据植物进化过程中的系统发育关系，将不同来源的 m a d s b o x 基因分为a g ，a p a g l 9 ，a p 3 ，p i 和o r p h a n5 个群。根据m a d s b o x 基因作用时期，可分为早期作用基因、晚期作用基因和中间作用类型基因。早期 作用基因决定花序分生组织向花分生组织转变；晚期作用基因决定花器官的特 性，拟南芥中的晚期作用基因有a p l ，a p 3 和a g 等；中间作用类型基因如f i m 【3 4 1 ，它们在决定分生组织特性和器官特征之间起调节作用。此外，在拟南芥中 6 前言 还发现一类u f o 基因，在早期、中期和晚期3 个阶段均起作用。 2 7m a d s b o x 基因对植物花发育的调控 开花是高等植物从营养生长转向生殖生长的一个重要的生理过程，开花既受 外界环境因素的影响，又受内在基因的调控，m a d s - b o x 基因参与植物花器官发 育的调控被认为是其最重要最基本的功能。 2 7 1 花发育的a b c 模型及其延伸 1 9 9 1 年c o e n 和m e y e r o w i t z 总结了花器官特异基因在拟南芥的4 轮结构( 由 外到内分别为花萼、花冠、雄蕊、雌蕊) 中的表达，并提出花发育的a b c 模型【9 】。 认为控制花结构的基因( 绝大多数为m a d s 。b o x 基因) 按功能可划分为a b c3 大 类，花的4 轮结构分别由a 、a b 、b c 和c 组基因决定，即a 功能基因单独作用 决定形成萼片，a 和b 决定形成花瓣，b 和c 共同决定雄蕊，心皮则由c 单独 决定。这一模型还提出a 和c 的功能是相互抑制的，b 功能仅限于花发育的第2 轮和第3 轮且不依赖于a 和c 功能3 6 1 。 基于矮牵牛花的研究，a b c 模型延伸了一个决定胎座和胚珠中央分生组织 特征的d 功能基斟3 7 1 ，f b p 7 和f b p l l 是存在于矮牵牛中的d 类基因，它们的 功能主要是调控胎座和胚珠的发育，在f b p 7 和f b p l l 的共抑制植株中胚珠被心 皮状的结构所取代网；另外，f b p l l 的异位表达能够导致萼片及花瓣处出现胚珠 状结构。 2 0 0 3 年又于拟南芥中发现了e 功能基因s e p l 2 3 4 ，分子遗传实验证明， s e p 3 的异位表达能够异位激活a p 3 和a g ，这说明s e p 3 具有激活b 基因及c 基因的功能，并与a 功能基因一起参与了花瓣的调控【3 9 1 。 2 7 2m a d s b o x 基因与花的发育 研究表明，在被子植物中，大多数m a d s - b o x 基因参与花发育的不同阶段， 相互之间可能形成复杂的复合物，并构成复杂的网络来决定花原基和器官的特征 以及调节花发育的整个过程。g u s t a f s o n b r o w n 等 4 0 l 发现发现在a 讲突变体中， 第一轮萼片转变为叶片状结构，第二轮花器官通常不能发育，而第三轮的雌蕊和 7 前言 第四轮的心皮则表现正常。遗传学的研究显示a p l 在决定花的分生组织特性及 在第一轮和第二轮花器官的正常发育中起作用。t z e n g 等【4 l 】用一个a p 3 基因家 族的同源序列从长筒百合中克隆和鉴定了一个m a d s b o x 基因l m a d s l ，其在 花的4 轮花器官中均表达。用3 5 s 启动子转化l m a d s i 基因于拟南芥中，转基 因植株的花具有短的花瓣和雄蕊，没有观察到花器官反转的现象。p i n y o p i c h 4 2 1 等发现在a g 突变体植株中不存在心皮和雄蕊。m i z u k a m i 等【4 3 】将c 功能基因a g 与c a m v3 5 s 启动子相连后转到拟南芥中，发现其表型类似于a 功能丧失的突 变体一萼片变成了心皮，雄蕊的部位却变成了花瓣，这表明组成型表达的a g 抑制了a 功能基因a p l 和a p 2 在第一轮和第二轮器官中的表达，c 功能基因 a g 足以单独决定器官的位置效应。 2 7 3 控制开花时间早晚 开花是高等植物生殖期的开始，许多m a d s - b o x 基因在调控植物从营养生 长转向生殖生长这一过程中起作用，例如：a g l 2 4 、s c 0 1 能促进开花，f l c 、 s v p 能抑制开花。在拟南芥中，调控开花时间一般有3 种途径： 第1 种是自发调控途径，在这种调控途径中起作用的基因是f l c ( f l o w e r i n g l o c u sc ) ，这类基因在从营养生长转向生殖生长这一过程中起负调控作用， m i c h a e l s 等】研究显示，突变体可以导致提前开花，这说明f l c 能抑制开花。 第2 种是长光照途径，即长光照促进开花，在这种调控途径中起作用的基因 是c o ( c o u s t a n s ) ，其直接靶基因是属于m a d s b o x 基因家族的s o c1 ，c o 的 突变会导致植物推迟开花【4 5 1 。 第3 种是非长光照依赖途径，这种途径的调控与植物中的赤霉素相关，己通 过激活l f y 这类基因来完成对开花的调控。在这3 种调控途径中均有m a d s b o x 基因的参与，尤其是s o c1 在以上3 个开花调控途径中均参与并发挥作用，因 此可以说m a d s b o x 基因是调控开花时问的一个重要因素【4 6 】。 2 8 植物m a d s b o x 基因其他生物学功能 m a d s - b o x 基因功能多样，除了决定分生组织和花器官的特性外，也参与营 8 前言 养生长【4 7 - 4 8 】；子房发育【4 9 t5 0 5 1 1 ；胚珠发育m5 3 】；种皮发育【5 4 】；根的形成4 8 】； 胚形态建成【5 5 1 ；共生诱导【5 6 1 ；果实的发育与成熟( 5 7 1 。一些研究也表明m a d s - b o x 基因可以调节植物对外界信号的反应【5 8 5 9 1 。m a d s - b o x 基因在信号转导中所起 的未知的功能正逐渐引起研究者们的兴趣。 在植物生长发育过程中，m a d s b o x 基因可能在不同阶段、不同部位、不同 组织器官影响植物的生长发育。如以a g 基因为探针，己从拟南芥中分离n - 十 几个a g l l a g l 6 基因，它们分别在花发育的不同阶段、根组织以及胚胎等不同 部位表达唧l ，从而对植物生长发育产生不同的影响，完成不同的生物功能。 r i c h a r d 等【6 l 】分离到矮牵牛的p e g 基因，它几乎能在植株的所有部位( 根、雄蕊 和幼苗除外) 或发育时期表达。同样，在其它植物中也分离到许多不同作用类型 的m a d s - b o x 基因。从进化的角度可以认为，在植物发育中m a d s - b o x 基因从 不同的侧面或层次产生各种不同作用，这是m a d s b o x 基因的多效性。 2 9 植物m a d s b o x 基因的克隆 目前国内外关于m a d s - b o x 基因的研究论文有几百篇，植物上除了在模式 植物拟南芥、金鱼草和水稻等上克隆了大量的m a d s b o x 基因，研究者也在其 它植物中进行了相应的探索。l u 【6 2 悃一个拟南芥a ge d n a 探针筛选兰花成熟 花c d n a 文库。一个a g 基因的阳性克隆被分离、测序，该克隆有一个全长为 7 5 0 b p 的开放阅读框，对应于2 5 0 个氨基酸残基，与西红柿和拟南芥中相应的 m a d s - b o x 基因显示具有高度的同源性。j a n g 等 6 3 1 用水稻m a d s b o x 基因 o s m a d s l 作探针筛选烟草花苞c d n a 文库分离了一个烟草m a d s - b o x 基因 n t m a d s 4 ，该基因的异位表达引起早花和矮化表型。杨满业等畔】从苦瓜中分离 出花特异表达基因b a g ，该基因具有典型的植物m a d s b o x 基因的结构， s o u t h e r n 杂交分析显示，在基因组中至少有两个拷贝存在；应用r t - p c r 和 n o r t h e r n 杂交结果证实，该基因在心皮和雄蕊中特异表达。m a r t i n 等1 6 5 1 从兰花 中克隆m a d s - b o x 基因d t h y r a g l 和d t h y r a g 2 ，并分析了它们的表达模式。t e t t y 等嘲l 从可可豆中分离克隆了一个m a d s - b o xc 型转录因子基因t c a g ，研究发现， 该基因在整个发育阶段中，在果壳和果肉均有表达。郭滨等【6 7 】从蝴蝶兰花瓣克 隆出蝴蝶兰花发育相关基因p p l 9 ，半定量p c r 结果表明该基因只在植株的生殖 9 前言 器官中表达，而在营养器官中不表达，推测其可能参与花形态建成过程的调节。刘 涛等【6 8 】从板栗中得到花特异表达基因c m m a d s 3 ，系统进化分析同样将 c m m a d s 3 基因归入m a d s b o x 基因家族的a g l 2 组。r t - p c r 分析显示，该 基因在板栗的花和幼果中表达丰度高，在茎中有微弱的表达，在叶中不表达， 研究结果表明，c m m a d s 3 基因是板栗花器官发育中具有e 功能的功能基因。 虽然目前各种植物m a d s b o x 基因的研究相当多，但是在花生中，m a d s - b o x 基因的研究却极为罕见，目前仅见袁美【8 】从花生上，根据同源克隆得到了一个 m a d s b o x 基因序列的片段，及蔡宁波等利用差异显示及5 r a c e 技术从花生幼 果中获得一个m a d s b o x 基因的全长序列，并将其登录g e n b a n k 。 2 1 0 目前存在的问题 目前，植物生殖发育研究取得了巨大进展，特别是有关高等植物花发育基因 调控的研究，先后在双子叶模式植物拟南芥和金鱼草中克隆了一大批有关的植物 生长发育基因，提出了调控花发育的基因互作模式、花发育过程中六类功能基因 形成的作用网络，以及具有重要意义和广泛代表性的“a b c ”模型。尽管如此， 目前植物m a d s b o x 基因研究还存在一些不足【6 9 1 。归纳为以下几个方面： ( 1 ) 单子叶植物研究明显滞后于双子叶植物。主要原因之一是单子叶植物， 如水稻等中发现的花发育突变体相对较少。目前大多数研究是利用双子叶植物的 同源序列来筛选单子叶植物e d n a 文库，获取其花发育相关基因，然后通过转基 因植物花的表型或者反义r n a 技术来推测其功能。但因缺乏与性状直接联系的证 据，这些基因的具体功能无法确定。 ( 2 ) 研究范围仍需不断拓宽。目前，对m a d s b o x 基因的克隆、功能及表达 等研究主要局限于植物生殖发育过程，而对营养器官的发生与发育、植株形态发 生、抗逆性等过程的研究较少。 ( 3 ) 注重m a d s - b o x 基因功能的特异性和多效性的研究。由于m a d s b o x 基因序列十分保守，因此其功能特异性强，但研究表明，在长期进化过程中，部 分m a d s b o x 基因结构发生变异，其功能可能会发生相应改变，特别是不同科、 属植物间相应的m a d s - b o x 基因的功能会发生重大变化，表现为部分m a d s b o x 基因功能具有多效性和广泛性。 1 0 前言 ( 4 ) 同源克隆基因的局限性。利用m a d s b o x 基因的保守序列克隆植物同 源基因，可以方便快速地克隆相关基因，但这可能限制一些重要的新基因的发现。 ( 5 ) 研究对象需要不断扩大。目前对不同植物类群、不同生态类型的 m a d s b o x 基因研究十分有限，对非种子植物研究尚未进行，对地衣、苔鲜等低 等植物以及藻类等水生植物m a d s - b o x 基因知之甚微。 目前许多科学家已经认识到开展植物m a d s - b o x 基因研究的重要性和紧迫 性。植物发育生物学的研究队伍不断壮大，国际合作进一步加强。随着植物基因 组计划迅速展开，越来越多的植物m a d s - b o x 基因将被发现。同时，利用生物 信息学研究m a d s b o x 基因的结构和功能，将大大加速这一领域的研究进程。 2 1 1 植物m a d s b o x 基因研究的展望 要完全弄清楚m a d s - b o x 基因在植物进化中的作用还有相当长的路要走。 进化发育遗传学的研究手段如基因克隆与测序、系统发生重建、表达分析、突变 体分析等，已架起m a d s b o x 基因系统发育与植物形态进化之间的桥梁【7 0 】。植 物界中m a d s - b o x 基因存在的普遍性和高度保守性在系统进化研究上具有重要 的意义。m a d s b o x 基因调节植物的发育过程与植物体所处的内外因素密切相关， 它涉及到植物体中复杂的信号转导网络。花的诱导是温度、光照、水分和内源 m a d s b o x 基因及其它相关基因共同作用的结果；植物的生长繁殖是根系统、营 养器官、花器官共同发育的结果，最终也涉及到基因的调节。研究m a d s - b o x 基因的分子生物学基础，对于解释植物中各种生理现象具有重要的理论意义。 作为目前植物界中了解最多的调节基因家族，m a d s - b o x 基因表达模式的多 样性和功能的复杂性证明其内在机制的复杂性。拟南芥全基因组有1 0 7 个基因编 码m a d s - b o x 蛋白，其中8 4 的基因功能未知r n 】。在未来的发展中对m a d s - b o x 基因功能的探索及与转录调节相关的启动子的研究将成为倍受关注的领域【7 引。 利用m a d s b o x 基因在不同花器官中特异表达的特点，可将某些基因应用于不同 植物的遗传操作中，以改造植物的园艺性状，如改变观赏花卉的花型、花色、花期 等，对于经济作物还可以缩短世代、减少耕种时间、提高产量 7 3 1 。随着研究的 深入，相信m a d s o b o x 基因会有更深、更广、更好的应用价值。 目前许多科学家已经认识到开展植物m a d s b o x 基因研究的重要性和紧迫 前言 性，研究内容不断深入，研究力度不断加大，国际合作进一步加强。随着植物基 因组计划迅速发展，相信会有越来越多的植物m a d s b o x 基因将被开发、研究 和加以利用。 3 本研究目的与意义 本研究以本实验室所培育的优良花生品种闽花6 号为研究对象，根据已知的 花生m a d s b o x 全长基因序列和其他豆科植物m a d s b o x 基因设计简并引物， 以同源序列法从花生各组织的双链c d n a 中分离克隆出花生m a d s - b o x 基因序 列，研究该基因家族的序列特征及进化关系，为花生m a d s b o x 全长基因的获 得、研究其在花生生长发育过程中的作用，和利用于花生遗传改良奠定基础。 1 2 同源序列法克隆花生m a d s b o x 基阂片段及序列分析 第二章同源序列法克隆花生m a d s b o x 基因片段及序列分析 m a d s - b o x 基因家族广泛存在于真核生物基因组之中，在植物花器官及其他 发育的过程中起着非常重要的作用。本实验利用同源序列克隆法，由已知的两个 花生及其他豆科植物m a d s b o x 基因全长的保守序列设计了五对简并引物，从 花生各组织混合m r n a 逆转录产物中分离m a d s b o x 基因片段序列，长度 4 3 3 6 4 4 b p ，并对其进行序列分析。 1 材料与试剂 1 1 植物材料 以福建农林大学油料作物研究所选育的花生优良品种闽花6 号作为实验植 物材料 1 2 菌种及质粒 转化受体e s c h e r i c h i ac o l id h 5 a , 本实验室保存：克隆载体p m d l 8 t ( a m p ) ， 购自t a k a r a 公司； 1 3e d n a 材料 实验所用的双链c d n a 材料为本实验室保存的花生各组织混合r n a 逆转 录产物 1 4 生化试剂 限制性内切酶购、t 4d n a 连接酶、d n a 聚合酶