（免疫学专业论文）幽门螺杆菌alpa基因在乳酸菌中的表达及免疫原性分析.pdf

中田医学科学院医学生物研究所顺l j j f 究乍毕业论义 目录 摘要1 前。言4刖舌4 一实验材料及方法8 ( 一) 实验材料8 ( 二) 基本实验操作1 0 ( 三) a 捌基因的扩增及其表达载体的构建1 4 ( 四) 重组质粒p n i c e ：s e c a l p a 在乳酸菌中的表达及表达条件的优化1 7 ( 五) 重组蛋白的w e s t e r nb l o t 分析1 8 ( 六) 免疫用灭活幽门螺杆菌的制备1 8 ( 七) 免疫用乳酸菌的制备1 9 ( 八) 表达a l p a 蛋白的重组乳酸菌的免疫原性分析2 0 二结果与分析2 2 ( 一) 幽门螺杆菌基因a 捌的扩增及表达载体的构建2 2 ( 二) 重组蛋白a l p a 的诱导表达2 4 ( 三) 重组蛋白的w e s t e r nb l o t 分析2 7 ( 四) 表达a l p a 蛋白的重组乳酸菌的免疫原性分析2 8 三讨论3 l 四小结3 6 参考文献3 7 综述4 2 附录5 7 致谢6 3 研究生简历6 4 论文独创性声明6 5 性溃疡的主要病因，与胃癌、胃粘膜相关性淋巴样组织( m u c o s a a s s o c i a t e d l y m p h o i dt i s s u e ，m a l t ) 淋巴瘤的发生密切相关，被w h o 确定为i 类致癌因子。 研制疫苗是控制h p y f d 一感染及相关疾病经济有效的途径。 随着对h 砂f d 一致病性的深入研究，人们发现h p ) ，肠疗的致病因子包括诸多 因素，如尿素酶、过氧化氢酶、热休克蛋白、黏附素等，但尤以黏附素最为关键。 黏附素口聊编码5 1 8 个氨基酸，体外黏附实验证明，其位于细菌表面且其融合蛋 白的抗血清能够完全阻止h 矽y 肠一对胃组织的黏附。r 锄o m 等学者通过豚鼠模 型证实口聊、口邶缺陷对h p y ，d 一的黏附定植十分不利，口别的免疫原性在动 物模型中已经有实验室证据。 乳酸菌是人和动物肠胃中正常存在的菌群，被公认为安全级微生物，已广泛 地应用于食品及饮料加工业。并且乳酸菌进入肠道后能发挥佐剂的活性刺激机体 的粘膜免疫反应。乳酸菌和可降解的生物颗粒大小差不多，可以被粘膜m 细胞 摄取，故可作为一种有效的口服疫苗载体。本实验利用分子克隆技术扩增了 只肠一的口聊基因，并构建携带口柳基因的重组原核表达质粒p n i c e ：s e c - a l p a ， 将重组质粒转化乳酸菌n z 9 0 0 0 株，优化表达条件后，以舷4 在乳酸菌中获得表达， 表达量占菌体蛋白总量的9 6 。表达的蛋白能与兔抗h p ) ，f d r f 血清特异性反应， 具有良好的免疫原性。用重组表达a l p a 蛋白的乳酸菌口服免疫小鼠后能刺激小 鼠产生特异性的i g g 和i g a 。 实验结果表明以乳酸菌作为递送载体的口服疫苗可以刺激机体产生局部的 粘膜免疫反应和全身的系统免疫反应。这对于h p ) ，f d 一的治疗和预防都有重要的 意义，将有可能是一种具有很好发展前景的新型疫苗。本实验对乳酸菌作为抗原 递送载体进行了初步尝试，为h 砂，0 一口服疫苗的开发提供一定的实验依据。 关键词幽门螺杆菌；乳酸乳球菌；a 捌基因 中固医学科学院医学生物研究所硕i j _ f i j f 究生毕业论文 摘要 a b s t r a c t 月a 疗c o 蚰c 胞，刃，肠力i sag r a m - n e g a t i v em i c r o a e r o p h i l i cb a c i l l u st h a ti n f e c t st h e s t o m a c h so fm o r et h a nh a l fo ft h eg l o b a lp o p u l a t i o n i th a sb e e nc o n f i n n e dt h a t h 肠一i st h em a i nc a u s eo fc h r o n i cg a s t r i t i sa n dp e p t i c u l c e rd i s e a s e ，a n dh a sac l o s e r e l a t i o nt og a s t 打cm u c o s a a s s o c i a t e dl y m p h o i dt i s s u e ( m a i j ) l y n l p h o m aa n dg a s t r i c a d e l l o c a r c i n o m a t h ew 6 r l dh e a l t ho 略a n i z a t i o nd e f i n e di ta sac l a s si c a r c i n o g e n v a c c i n ew i l lb ea ne 日e c t i v ea n de c o n o m i c 印p r o a c ht op r e v e n ti n f e c t i o nd i s e a s e so f m a s sp o p u l a t i o n w i t hi n c i 印t hs t l l d yo f 助，d p a t h o g e n i c i t y ，i tw a sf o u n d h 肠以p a t h o g e n i c f a c t o r s ，i n c l u d i n gan u m b e ro ff a c t o r s ，s u c ha su r e a s e ，c a t a l a s e ，h e a ts h o c kp r o t e i n s ， a d h e s i n s ，e t c ，b u tp a r t i c u l a 订yt h em o s tc r i t i c a la d h e s i n a d h e s i n s 口盘纠e n c o d i n g518 a m i n oa c i d s ，i nv i t r oa d h e s i o ne x p 甜m e n t ss h o wt h a tt h es u r f a c eo ft h eb a c t 鲥u ma i l d i t s 如s i o np r o t e i na n t i s e m mc a nc o m p l e t e l yp r e v e n tt h ea d h e s i o no f h po nt h eg a s t r i c t i s s u e r a m o ma n do t h e rs c h o l a r s ，c o n f i m l e db y 鲥n e ap i gm o d e l 日肛纠，口岔垴d e f e c t o nm ea d h e s i o no fh p y l o 订c o l o n i z a t i o ni sv e r yu n f a v o r a b l e ，口f 叫o fi m m u n o g e l l i c i t y i n 锄i m a lm o d e l sh a v el a b o r a t o r y “i d e n c e 三口c 幻c c 淞肠c 廊i sag r a m p o s i t i v ef o o d - 伊a d eb a c t e r i u ma n dh a sal o n gh i s t o 巧o fw i d e s p r e a du s ei nt h ef o o di n d u s t 叫f o rt h ep r o d u c t i o no ff e n n e n t e d m i l k p r o d u c t s a n di tc a ns t i m u l a t eam u c o s a li m m u n er e s p o n s ea saa 由u v a n ti nt h ei n t e s - t i n a lt m c t 口c 幻c d 船肠c 斑i sa p p r o x i m a t e l ym es 锄es i z ea sb i o d e g r a d a b l em i c r o p a n i c l e st h a ta r el ( i l o w nt ob et a l ( e 1 1u pb ym c e l l sa n dh a v eb e e i ls h o w nt ob ec a - p a b l eo fa c t i n ga se f f e c t i v eo r a lv a c c i n ev e h i c l e s i nt l l i ss t u d y ，t h e 口f 叫g e l l ew a s a i l l p l i f i e da 1 1 dc l o n ei n t ot h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i v ev e c t o rp n i c e ：s e c t 1 1 er e c o m b i n a l l tv e c t o rw a st r 锄s f o m l a t e di n t ol a c t o c o c c u sl a c t i ss t r a i nn z 9 0 0 0 t h e 向s i o n p r 0 一 t e i nw a se x p r e s s e di nl i a c t i sb yt h ei n d u c t i o no ft h en i s i n t h eq u a n t i t yo fe x p r e s s i o n a c c o u n t e df o r9 6 o ft h et o t a lb a c t 甜a 1p r o t e i n w e s t e mb o l ta 1 1 a l y s i sc o n f i 彻e dt h a t 如s i o np r o t e i nc o u l db er e c o 髓i z e ds p e c i f i c a l l yb yt h es e m mo fa n t i 以，d 以t h e r e c o m b i n a n tl 1 a c t i se x p r e s s i n ga l p ap r o t e i nw a su s e dt 0v a c c i n a t em i c ea n dt h es p e c i f i c a li g aa n di g gw a se l i c i t e d 2 中固医学科学院医学生物研究所硕i j 研究生毕业论文摘要 t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h er e c o m b i n a n tl 1 a c t i sc a ne l i c i tt h el o c a lm u c o s a l a n dt h es y s t e m i ci m m u n er e s p o n s ed e l i v e r e dt l l r o u 曲o r a lr o u t e t h i sm a yb eu s e 向l f o rt h ep r e c a u t i o na n de r a d i c a t i o no ft h ei n f e c t i o no fh 刃如以s ot h i sr e c o m b i n a n t l 1 a c t i sm a yb eag o o dv a c c i n ei nt h e 如t u r e t h e s er e s u l t sw o u l db eh e l p m lf o rt h e d e v e l o p m e n to fo r a lv a c c i n ea g a i n s th ，d 一 1 j e y ? w o r d s ：h e l i c o b c i c t e rp y i o n l n c t o c o c c u sl n c t i s n l p a g e n e 3 中因医学科学院医学生物研究所顺i j 研究生毕业论义丌u 高 1 j _ 刚【看 自1 9 8 2 年澳大利亚学者j r w a 丌e n 和b j m a r s h a n 首次从人胃黏膜组织 中分离出幽门螺杆菌( 胁f f c d 6 口c 尾，缈，d 以h 肠一，h p ) 以来，h p 作为一个新 发现的传染病致病菌从根本上改变了人们对胃肠疾病的认识，使胃肠疾病的病因 学和治疗学发生了一场革命。h p 属弧菌科、螺杆菌属，为革兰式阴性细菌，弯 曲状，轻微螺旋状，长2 5 5pm 、粗0 5um 。菌体一端或两端可有多根鞭毛， 运动活泼。通常在粘液层下面，粘膜上皮表面，在胃小凹内及腺腔内，呈不均匀 的集团状分布【2 ，3 1 。h p 感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃癌、m a l t 淋巴瘤的发生密切相关。1 9 9 4 年国际癌症研究中心( i a r c ) 将h p 列为i 类致 癌因子。h p 的感染率极高，在发达国家占成年人的3 0 5 0 ，发展中国家为 4 0 8 0 ，我国流行病学调查结果为4 0 9 0 ，平均为5 9 。这使得 h p 感染同益引起人们的高度重视【4 _ 8 】。 现有的根除h p 的方法主要是三联和四联抗菌疗法【9 1 ，但药物疗法也面临许 多问题：首先是多种抗生素联合使用副作用较大，复杂的联合用药使病人依从性 下降导致部分药物治疗失败；其次药物不能有效防止h p 再次感染；第三，h p 耐药菌株不断增加；另外对发展中国家而言，药物治疗在经济上也较为昂贵。研 制有效疫苗用于预防或治疗h p 感染成为幽门螺杆菌防治的关键。 免疫接种是预防和控制感染性疾病经济而有效的方法。人类通过疫苗控制疾 病的尝试己经有了近千年的历史，从防患于未然的角度免除了众多传染病对人类 生命群体的威胁，疫苗为人类健康做出了巨大贡献。疫苗通过有效地调动机体免 疫系统的功能，达到预防感染和消除感染的目的。疫苗接种可在人群中大规模运 用，经济而简便，并且对耐药菌株有效，因此研制幽门螺杆菌疫苗具有重要的社 会价值和经济意义。 许多动物实验表明，免疫接种对实验感染h p 具有预防和治疗作用。 c z i 彻 和n e d r u d 【l o 】h p 将全菌抗原加霍乱毒素( c t ) 经口服免疫小鼠引起体液免疫反应， 提出用疫苗抗幽门螺杆菌感染具有可能性，但当时缺乏动物模型验证这一假说。 直到1 9 9 0 年，猫胃螺杆菌似疗施c 纪r 屉凰，h 居凰) 感染的小鼠模型建立才启动 了这方面的工作，c h e n 等首次利用h 尼凰全菌超声粉碎抗原加c t 免疫小鼠， 4 中围医学科学院医学生物研究所坝l j 研究乍毕业论义刖晶 再用h 尼凰活菌攻击结果发现免疫后的小鼠获得了9 5 的保护率【l 。随后 d o i d g e 等【1 2 】又发现了免疫治疗的有效性，随着动物模型的研究进展，这一结论 在实验感染h p 的小鼠模型中进一步得到验证。这些研究为研制安全有效的h p 疫苗，在人群中预防h p 感染，降低h p 相关疾病发病率提供了实验依据。 发展疫苗的关键是获得对人体安全有效的免疫原。h p 培养条件苛刻，生长 周期长，产量低，易污染，菌种保存不易，而且致病因子众多，作用机制复杂， 在疫苗设计中发展减毒活疫苗和全菌体灭活疫苗可能性小，因此，以组分或分子 作为保护性抗原成为疫苗研制的主要方向。 h p 感染是一种很特别的感染，它独特的生活境位于胃粘膜的细胞外。这一特 性导致了这样的假设，最好的预防和治疗h p 感染的方式是打破粘膜免疫耐受，最 终诱导产生粘膜水平的粘膜免疫应答效应。 随着对h p 致病性的深入研究，人们发现h p 的致病因子包括诸多因素，如 尿素酶、过氧化氢酶、热休克蛋白、黏附素等，但尤以黏附素最为关键，黏附素 种类很多，迄今为止唯一明确受体的h p 黏附素是b 口鲥，经体外黏附及其相应 抗体的抑制实验证明的有黏附素口聊，口邶和胁p z 。黏附素是h p 的重要毒力 因子，h p 必须通过黏附素黏附并进一步定植于人胃黏膜才能发挥其致病作用， 如从黏附素出发寻找保护性抗原从而阻断h p 对于胃黏膜的黏附，使之在胃蠕动 时随食物一起被排空，也许是一种有益的尝试【1 3 】。 粘附素a l p a 和a l p b 是s t e 矗mo d e n b r e i t 等鉴定出的两种具有特异性粘附功能的 外膜蛋白，对口蜘，口伽基因分别进行突变会导致h p 黏附能力的明显下斛1 4 】。 口蜘编码5 1 8 个氨基酸，体外黏附实验证明，其位于细菌表面且其融合蛋白的抗血 清能够完全阻止h p 对胃组织的黏附【1 5 】。r 锄o m 等学者通过豚鼠模型证实劬叫， 口伽缺陷对h p 的黏附定植十分不利。白杨【1 6 】等学者在大肠杆菌中克隆表达a l p a 蛋白，并将它免疫兔，得到的兔血清内含有和h p 感染者体内同样的能和该蛋白反 应的抗体。a l p a 的免疫原性在动物模型中已经有实验室证据。此外，a l p a 尚有诸 多特性符合h a q 等【1 7 】在1 9 8 8 年提出的h p 疫苗抗原的标准，是基因工程疫苗的 候选分子。 以上实验表明，h p a l p a 在h p 的粘附、定植，以及引起的炎症反应中都起 到重要作用，是h p 重要致病因子之一。因此，研究h p a l p a 作为h p 免疫原在 5 中网医学科学院医学生物研究所硕l j f i j f 究生毕业论义前击 h p 疫苗设计中的作用具有重要的理论和实际意义。 由于h p 主要定植于胃粘膜，因此粘膜免疫系统是抵抗h p 感染的首要防线。 粘膜免疫方法与传统的肌肉注射方法相比有以下优点：( 1 ) 口服或鼻腔内接种可 避免针剂的疼痛，减少注射局部的炎症反应，易于重复接种；( 2 ) 一个粘膜部位 的免疫可以诱发远隔部位粘膜的免疫反应；( 3 ) 粘膜免疫不仅能有效的诱发粘膜 免疫应答，同时又诱发系统免疫应答。而采用蛋白质或多肽疫苗口服免疫时，会 出现免疫耐受或无应答的现象，要激发有效的粘膜免疫反应必须粘膜免疫佐剂的 参与，粘膜免疫佐剂已经成为研制粘膜免疫疫苗所必须解决的关键问题。 目前已有实验证实h 肠一的一些保护性抗原同粘膜佐剂一起口服免疫小 鼠后能有效保护小鼠抗h p y f d 一感染【1 8 】。霍乱毒素( c t ) 和大肠杆菌不耐热肠 毒素( l t ) 已经成功地用于口服免疫模型，但是由于其毒性而不能用于人类【1 9 洲。 大肠杆菌不耐热肠毒素的突变体l t k 6 3 已经用于疫苗的研究，但是其安全性有 待进一步证实【2 l 】。人类自愿者在口服了表达h 矽y ，d 玎u 枷和曰的减毒伤寒沙 门氏菌后引起了不同程度的肠胃炎综合症【2 2 1 。 乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌，因其在食品工业各个领域中的 长期应用已证明不具有致病性，被公认为安全级( g r a s ，g e n e r a l l yr e c o 驴i z e da s s a f e ) 微生物。乳酸菌作为基因工程受体斟2 3 ，2 4 1 ，其优越性主要表现在：( 1 ) 乳酸 菌本身就能够抑制幽门螺杆菌感染，对胃肠道菌群的稳态起着强大的调节作用： ( 2 ) 对乳酸菌基因组的了解己十分成熟，有利于灵活的基因设计构建重组体；( 3 ) 能够在天然的情况下表达免疫原；( 4 ) 同肠胃外免疫途径相比，通过粘膜免疫，可 以诱发i g a 产生；( 5 ) 具有免疫佐剂作用、固有免疫原性，对胆汁酸的抵抗力很强， 适合口服；( 6 ) 无须培养大量的病原菌，无须纯化抗原成分或亚单位过程相对简 单；无感染风险。已有多种病原微生物抗原在乳酸菌中得到有效表达。n o i 玎o n 【2 5 1 等研究发现，给鼠口服免疫表达破伤风毒素片段c ( t r f c ) 的重组乳酸球菌后，i g g 和l g a 水平显著提高，证实了乳酸乳球菌可有效提高粘膜免疫系统提呈抗原及诱 导特异性免疫反应的能力。国外学者已在乳酸菌中表达幽门螺杆菌c a 9 1 2 和u r e b ， 并诱导了特异性抗体产生1 2 6 加。 本实验将a 枷基因克隆到乳酸菌表达质粒p n l c e ：s e c ，转化乳酸乳球菌 n z 9 0 0 0 并在乳酸菌中实现表达。经活菌灌胃免疫小鼠后，观察其刺激机体产生 6 7 中国医学科学院医学生物研究所硕i j 研究生毕业论文 实验材料及方法 一实验材料及方法 ( 一) 实验材料 1 菌株 ( 1 ) 舱- ，c d 施c f 盯训竹，2 6 6 9 5 ，购自中国预防医学科学院流行病学微生物学 研究所。 ( 2 ) 叵c d j ，d h 5a ，由中国医学科学院医学生物学研究所中试实验室保存。 ( 3 ) 乳酸乳球菌n z 9 0 0 0 由巴西米纳斯吉拉斯联邦大学生物科学研究所分子遗传 实验室赠送。 2 质粒 表达载体：p n i c e ：s e c 由巴西米纳斯吉拉斯联邦大学生物科学研究所分子遗 传实验室赠送。 3 酶 p r i m e s t a rd n ap o l y m e r a s e ，d n al i g a t i o nk i t ，d n a 限铕0 性内切酶，肋di ， 屁d 厂i 购自宝生物工程( 大连) 有限公司。 4 分子量标准 核酸分子量标准d l 2 0 0 0 ，蛋白分子量标准购自宝生物工程( 大连) 有限公 司。 5 试剂盒 细菌d n a 抽提试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，柱式离心胶回收试剂 盒购自鼎国生物制品有限公司；质粒小提试剂盒购自博亚生物制品有限公司。 6 抗体 h r p 标记羊抗兔、羊抗小鼠i g g 购自武汉博士德生物有限公司，h r p 标记的 羊抗小鼠i g a 购自深圳晶美生物工程有限公司。兔抗h p 全菌血清为本室制备。 7 主要化学试剂 琼脂糖凝胶：b i o w e s t 产品； 十二烷基磺酸钠( s d s ) 、溴化乙锭( e b ) ：b i o r a d 公司； 丙烯酰胺、n ，n 一亚甲基双丙烯酰胺、t e m e d 、b 一巯基乙醇、牛血清白( b s a ) ， 氯霉素购自s i g m a 公司产品。 8 培养基及选择添加剂 8 中国医学科学院医学生物研究所坝i ：研究生毕业论义实验材料及方法 ( 1 ) 酵母浸膏、蛋白胨、琼脂粉购自b i o r a d 公司； ( 2 ) 脑心浸液培养基购自b dd e f i c o 公司； ( 3 ) 幽门螺杆菌选择性添加剂购自0 x i d e 公司； ( 4 ) 无菌脱纤维羊血购自昆明医学院动物科。 ( 5 ) m 1 7 培养基购自0 x o i d 公司 9 主要仪器 p c r 扩增仪：p e r k i ne l m e r 公司产品； 高速冷冻离心机：e p p e n d o r f 公司产品； 蛋白电泳仪：p h a 珈a c i a 公司产品； 凝胶扫描仪：岛津c s 一9 3 0 型； 超声波破碎仪、紫外检测仪，以及各型电泳槽水浴、空气浴摇床：江苏太仓 实验仪器厂产品。 1 0 实验动物 i c r 小鼠，雌性，6 周龄，1 8 2 2 9 ，购自中国医学科学院医学生物研究所 灵长类中心一部。 1 1 其它 ( 1 ) 5 h ：，l o c 0 2 ，8 5 n ：( v v ) 混合气体购自昆明梅赛尔公司。 ( 2 ) 真空干燥器购自江苏盐城玻璃制品有限公司。 ( 3 ) 真空密封胶购自上海真空密封设备厂。 9 中围医学科! 学院仄学生物研究所倾i j 研究生毕业论文实验材料及方法 ( 二) 基本实验操作 1 质粒d n a 的小量提取 ( 1 ) 挑取一个新鲜菌落，接种于5 m l 含抗生素的l b 液体培养基中，3 7 振荡 培养1 2 1 6h ； ( 2 ) 用1 5 m 1 的无菌微量离心管收集菌液，6 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃上清； ( 3 ) 用1 0 0u1 预冷的溶液i 重：悬菌体； ( 4 ) 加入2 0 0 ul 新鲜配制的溶液i i ，盖紧管口，颠倒混匀； ( 5 ) 加入1 5 0 i ll 溶液i i i ，盖紧管口，颠倒混匀； ( 6 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，将上清转移至另一离心管中； ( 7 ) 加等体积的酚一氯仿，上下颠倒摇匀，1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ； ( 8 ) 小心地将上层水相转移至另一离心管中，加入l 1 0 体积的3 mn a a c ，2 倍体 积的无水乙醇，一2 0 放置2 0 m i n 以上； ( 9 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，弃上清；用7 0 乙醇沈涤沉淀一次，去尽上清。3 7 挥发1 0 2 0 m i n ，至d n a 沉淀基本透明； ( 1 0 ) t e 或d d h ：0 溶解d n a 。 2 大肠杆菌感受态细胞的制备( 无菌条件下操作) ( 1 ) 将甘油冻存的ec d j 菌株在l b 平皿上划线接种，3 7 过夜培养； ( 2 ) 挑取单菌落接种于5 m ll b 培养基中3 7 培养至o d 。翮= 0 3 ； ( 3 ) 以1 ：2 0 的比例接种于3 7 预热的1 0 0 m ll b 培养基中培养至0 d 。轴= o 4 8 ： ( 4 ) 将培养物置冰浴5 m i n 后，4 3 5 0 0 r p m 离心5 m i n ； ( 5 ) 弃上清，用4 0 m 1 冰预冷的t f b l 重悬细胞，冰浴5 m i n 后，3 5 0 0 r p m 离心5 m i n ； ( 6 ) 弃上清，用4 m l 冰预冷t f b 2 重悬细胞，并置于冰浴1 5 m i n ，以每管2 0 0u1 分装于灭菌的e p p e n d o r f 管中，于一9 0 保存。取一管分为两份，一份做转化载 体，一份做阴性对照，对所制备的感受态细胞进行鉴定。 3 质粒或连接产物转化c d j j 感受态细胞 ( 1 ) 取一只一9 0 冻存的ec d _ f j 感受态细胞迅速置于冰浴中5 1 0 m i n ： ( 2 ) 加入质粒或连接产物约l 一1 0 u1 ，轻轻吹打混匀，冰浴放置3 0 m i n ； ( 3 ) 4 2 水浴9 0 s ，冰浴1 0 m i n ； ( 4 ) 加入2 0 0 u1l b 培养基，颠倒混匀，3 7 水浴5 0 m i n ； 1 0 中困医学科学院医学生物研究所硕f j 研究生毕业论义实验材料及方法 ( 5 ) 将培养基均匀涂布在含相应抗生素的l b 琼脂平板。3 7 倒置培养1 2 h 。 4 乳酸乳球菌感受肽细胞的制备( 无菌条件下操作) ( 1 ) 从g m l 7 平板上挑取n z 9 0 0 0 的单克隆接到g m l 7 液体培养基中，3 0 过夜培 养。 ( 2 ) 准备培养基和试剂 s g m l 7 ：1 0 m lm 1 7 ，1 5 2 6 | il5 0 蔗糖，2 0 0 | ll5 0 葡萄糖，1 0 0pl2 m o l l m g c l 2 ，4 0ulo 5 m 0 1 l c a c l 2 溶液i ：5 0 m l2 m 1 7 ，l m l5 0 葡萄糖，3 4 m l5 0 蔗糖，1 0 m 11 0 甘氨酸，5 m ld d h ：o 溶液i i ：3 4 m 1 5 0 蔗糖，l o m l 甘油，5 6 m 1d d h ：o ( 3 ) 将培养过夜的n z 9 0 0 0 以2 的接种量转接到溶液i 中，3 0 培养。 ( 4 ) 在波长6 0 0 n m 下测菌液的吸光度，当o d 咖= 0 4 o 9 时，离心( 6 0 0 0 r p m ， 1 0 m i n ) 收集菌体。 ( 5 ) 用3 0 m l 溶液i i 洗涤细胞两次，离心( 6 0 0 0 r p m ，1 0 m i n ) 弃上清，用1 m l 溶液i i 悬浮菌体。 ( 6 ) 取4 0 | l1 于1 5 m 1 离心管中，一7 0 冷冻保存备用。 5 质粒电转化乳酸菌n z 9 0 0 0 株感受态细胞 ( 1 ) 取一只一7 0 冻存的n z 9 0 0 0 感受态细胞迅速置于冰浴中5 一l o m i n ； ( 2 ) 加入质粒约1ul ，轻轻吹打混匀，转移到冰预冷的电转杯中； ( 3 ) 将电转杯移至电转仪上固定好，电击( 2 0 0 0 v ，4 0 0q ，2 5 u f ) ； ( 4 ) 电击完后加入s g m l 7 培养液9 6 0ul 混匀，倒入1 5 m 1 离心管3 0 静置培 养2 h ； ( 5 ) 取1 0 0u1 涂含有适量抗生素的g m l 7 平板，3 0 培养2 4 h 。 6 d n a 片段的回收 i 透析袋回收法 ( 1 ) 在紫外检测仪上用干净的刀片切下有目的d n a 片段的凝胶，d d h ：0 冲洗已处 理好的透析袋，将切下的凝胶块装入透析袋中，加入5 0 0pl t e ( p h 8 0 ) ， 两端用夹子央紧，1 0 0 v 电泳； ( 2 ) 紫外下检测，当d n a 已电泳至透析袋膜上，转移电泳方向，1 0 0 v 电泳1 5 s ； ( 3 ) 取出透析袋并吸出袋中溶液至新的e p p e n d o r f 管中，用氯仿抽提一次； 中固医学科学院仄学生物研究所硕i ：研究生毕业论文实验材料及方法 ( 4 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，以去除可能混有的琼脂糖颗粒，小心吸上清于另一管 中，加入l 1 0 体积3 mk a c ( p h 4 8 ) 和2 倍体积冰乙醇，混匀后置一 2 0 l o m i n ，1 2 0 0 0 r p m ，4 离心1 5 m i n ； ( 5 ) 沉淀用7 0 乙醇洗2 次，干燥后用d d h ：o 溶解待用。 透析袋的处理：把透析袋剪成适当长度( 1 0 2 0c i l l ) 的小段，在大体积的2 ( w v ) 碳酸氢钠和1 咖o le d t a ( p h 8 0 ) 中将透析袋煮沸1 0 m i n ，用蒸馏水彻底清 洗透析袋，再放入l 唧o l le d t a ( p h 8 o ) 中煮沸1 0 m i n ，冷却后放置于4 ，必 须确保透析袋始终浸没在溶液内，取用透析袋时必须戴手套。 i i 试剂盒法 d n a 片断的回收：详见试剂盒说明书。 7 w e s t e r nb l o t 免疫印迹 ( 1 ) s d s p a g e 电泳： ( 2 ) 卸下凝胶，去除浓缩胶，用转移缓冲液在室温平衡3 0 m i n ； ( 3 ) 根据凝胶的长宽度，剪与凝胶同等长宽的1 2 张滤纸，硝酸纤维素膜( n c 膜) 1 张，以转移缓冲液浸透平衡，按如下次序：j 下极( + ) 海绵、滤纸、 n c 膜、凝胶片、滤纸、海绵负极( 一) 组装转移央层。层问若有气泡，用 玻棒在表面滚动排除。要求各边缘剪齐，不能相连，以免短路； ( 4 ) 把按顺序排列好的转移夹层放到转移槽，插上( + ) 、( 一) 极，接通电源， 转移3 0 m i n ； ( 5 ) 结束电转，取出转印膜剪角定位； ( 6 ) 丽春红染色5 m i n ，去离子水脱色2 m i n ，用不褪色墨水标记蛋白分子量标准 的位置，在水( 或p b s t ) 中再浸泡1 0 m i n ，使之完全褪色； ( 7 ) 将膜放入洁净培养皿中，加1 0 m l 封闭液，置3 7 摇床封闭2 h ； ( 8 ) 用p b s t 洗净封闭液。用封闭液稀释第一抗体，置3 7 摇床1 h ； ( 9 ) 用2 0 m 1p b s t 洗膜4 次，每次1 0 一1 5 m i n ； ( 1 0 ) 加入1 0 m 1 适当稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，置3 7 摇床2 h ； ( 1 1 ) 用2 0 m lp b s t 洗膜4 5 次，每次1 0 一1 5 m i n ； ( 1 2 ) 加入新鲜配制的d a b 显色液显色4 5 m i n 。 中固 8 e ( 1 ( 2 ( 3 ( 4 ( 5 ( 6 ( 7 ( 8 ( 9 中同医学科学院医学生物研究所颂i j 研究生毕业论义实验材料及方法 ( 三) a 卅基因的扩增及表达载体的构建 1 - 幽门螺杆菌a 俐基因的扩增 ( 1 ) a 例的引物设计与合成 根据g e n b a n k 核酸数据库中屈p y - d ，j2 6 6 9 5 基因组a 删序列，用p r i m e r 5 o 设计引物。上下游引物分别引入艮d 厂i 和肋di 酶切位点。序列如下： a l p a s e n ： 5 一c g ! 鱼鱼t t a g a a t g a a t a c c c a t a a g a c c a a 一3 艮d 厂i a l p a a n t i ： 5 一g c a t g c a t c c a t a a a g a a a a a t a g a a g g c t g t 一3 肋di ( 2 ) a 刎基因的p c r 扩增 p c r 反应在5 0ul 体系中进行。扩增条件为： ( 9 8 1 0 s e c 一6 0 3 0 s e c 一7 2 1 m i n ) 3 0 c y c l e s 一7 2 5 m i n 反应混合物体系如表1 所示。 混合物 体积 h p2 6 6 9 5 基因组 a l p a s e n ( 3 5um ) a l p a a n t i ( 3 5um ) 10 p ri m e s t a rd n ap 0 1y m e r a s eb u f f e r d n t p ( 2 5 m m ) p r i m e s t a rd n ap 0 1 y m e r a s e d d h ：o 总体积 1 0i ll lul lul 2 5u1 4ul 0 5p1 8 5 | ll 5 0ul 表l t a b l e 1 ( 3 ) p c r 结果鉴定及产物回收 p c r 反应混合物体系 r e a c ti o ns y s t e mo fp c r 1 4 中陶医学科学院医学生物研究所坝i j 研究生毕业论文实验材料及方法 以2 的琼脂糖凝胶电泳鉴定p c r 结果。采用试剂盒( 操作按说明书进行) 回收d n a 片断。回收产物溶于d d h ：0 中，一2 0 保存。 2 重组表达质粒p n i c e ：s e c a l p a 的构建及鉴定 ( 1 ) 质粒p n i c e ：s e c 的酶切 质粒p n i c e ：s e c 用屁d ，i 和肋di 同时酶切。在5 0ul 体系中，加样混匀 后置3 7 水浴4 一1 2 h 至酶切完全。酶切产物于2 琼脂糖凝胶电泳后回收，一 2 0 保存。酶切体系如表2 所示。 混合物体积 1 0 x hb u f f e r x h oi e c o ti p n i c e ：s e c t o t a l 5ul 2 5 | 工1 2 5ul 4 0p1 5 0u1 表2 质粒p n i c e ：s e c 的酶切反臆体系 t a b l e 2e n z y m er e a c t i o ns y s t e mo fp n i c e ：s e c ( 2 ) p c r 产物的酶切 将a 捌p c r 回收产物用屁p 丁i 和肋di 同时酶切。在5 0i l1 体系中酶切， 加样混匀后置3 7 水浴4 1 2 h 至酶切完全。酶切产物于2 琼脂糖凝胶电泳后 回收，一2 0 保存。酶切体系如表3 所示。 混合物体积 1 0 hb u f f e r x h oi e c o ti a l p a 回收产物 t o t a l 5u1 2 5 | 工1 2 5pl 4 0u1 5 0u1 表3a l p a | 口l 收产物的酶切反应体系 t a b l e 3e n z y er e a c t i o ns y s t e mo fp c rp r o d u c t i o n ( 3 ) 质粒p n i c e ：s e c 与a 俐基因片断的连接 中网医学科学院医学生物研究所顾i j 研究生毕业论文实验材料及方法 将酶切回收的p n i c e ：s e c 载体片段与酶切回收的a 7 脚基因片段于1 0p1 体 系中进行连接。目的基因与载体的摩尔比为5 ：1 1 0 ：l 。1 6 水浴连接4 8 小 时。连接体系如表4 。 混合物体积 酶切后的p n i c e ：s e c 酶切后的a l p a l i g a t i o nm i x t o t a l o 5l ll 4 5ul 5ul 1 0ul 表4 连接反应体系 t a b l e 4 ：r e a c t i o ns y s t e mo f1i g a t i o n ( 4 ) 连接产物转化ec d - j 感受态细胞 按照基本实验操作，将连接产物转化d h 5q 菌株，涂布含氯霉素( 1 0pg m 1 ) 抗性l b 平板，3 7 温箱倒置培养过夜。 ( 5 ) 重组质粒p n i c e ：s e c a l p a 的筛选及鉴定 从转化平板上挑取单菌落，接种于含氯霉素( 1 0pg m 1 ) 的l b 液体培养基 中，3 7 摇床培养过夜。质粒小量抽提。屁p 7 1i 和肋di 进行酶切鉴定。酶切 方法如p n i c e ：s e c 的酶切，酶切体系如上面的表2 。酶切产物于2 的琼脂糖凝胶 电泳鉴定。将币确连接的克隆转接到新的l b 培养基中并抽提质粒，保存于一 2 0 。 ( 6 ) 菌种保存 将酶切鉴定结果为阳性的重组质粒保存于一2 0 。菌种在l b 琼脂平板上划 线培养；挑取单菌落至5 m 1 含氯霉素( 1 0 ug m 1 ) 的l b 培养基中，3 7 过夜培 养，再以1 ：1 0 0 比例接种至另一新鲜的l b 液体培养基中，3 7 培养至o d 伽= 0 4 0 6 ，与甘油按1 ：l 混合，贮存于一7 0 。 ( 7 ) 重组质粒p n i c e ：s e c a l p a 的序列测定 将酶切正确的质粒p n i c e ：s e c a l p a 送往上海生物工程技术有限公司进行序 列测定。 1 6 中困医学科学院医学生物研究所颀i j 研究生毕业论文 实验材料及办法 ( 四) 重组质粒p n i c e ：s e c a l p a 在乳酸菌中的表达及表达条件的优化 1 诱导表达 ( 1 ) 将测序j 下确的质粒和不含a 捌基因的质粒( p n i c e ：s e c ) 电转化宿主菌 n z 9 0 0 0 ，涂布含氯霉素( 1 0 ug m 1 ) 抗性g m l 7 琼脂平板，3 0 温箱倒置培养 2 4 3 6 h ： ( 2 ) 挑取单菌落接种于1 0 m 1 含有氯霉素的g m l 7 液体培养基中，3 0 培养8 一1 2 h ； ( 3 ) 以2 ：1 0 0 的比例接种于含有氯霉素的新鲜g m l 7 液体培养基中( 剩余的菌 液置4 暂时保存) ；3 0 培养约2 h ，当0 d 啪达o 4 0 6 时，以终浓度l o n g m 1 的n i s i n 诱导培养4 6 h ； ( 4 ) 分别取未诱导和诱导后菌液各5 m l ，1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃上清液，收集 菌体，用t b s 缓冲液洗涤菌体两次，再用1 0 0u1 溶菌酶溶液重悬菌体，3 7 水 浴作用l h 。加入1 0 0ul2 s d s p a g e 上样缓冲液充分混匀，1 5 s d s p a g e 鉴定表达结果。 2 优势表达菌株的筛选和保存 ( 1 ) 取上述实验中表达最好的菌株，用接种环划线于含氯霉素( 1 0ug m 1 ) g m l 7 平板，3 0 温箱倒置培养2 4 3 6 h ； ( 2 ) 挑取若干单菌落接种于l o m l 含有氯霉素的g m l 7 液体培养基中，3 0 过夜 培养； ( 3 ) 以2 ：1 0 0 的比例接种子含有氯霉素的新鲜g m l 7 液体培养基中( 剩余的菌 液置4 暂时保存) ；3 0 培养约2 h ，当o d 咖达0 4 0 6 时，以终浓度l o n g m l 的n i s i n 诱导培养4 6 h ；