（作物遗传育种专业论文）马铃薯抗晚疫病基因R10的高分辨率遗传图谱构建.pdf

中丈摘爨 中文摘要 马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u ml ) 是世界上第四大粮食作物，种植面积仅次丁水稻、小麦利 玉米，同时也是菜、饲、加上兼j j 及j 二业原料作物，在农业生产和人比生活中均占有重要地 位。而晚疫病是马铃薯生产的一种毁灭性病害，在全球范围内绝大多数栽培马铃薯的地区广 泛传播。其危害性、防治难度及对社会影响已超过了水稻稻瘟病和小麦锈病被视为国际第一 大作物病害。克隆抗病基因，实现田间抗病基冈的多态性是目前马铃薯抗晚疫病的一种可行 方法。由于马铃薯抗晚疫病基因r i o 抗谱j “，应刖价值人，所以常用于马铃磐抗病杂交育种。 本实验以只含马铃薯抗晚疫病基囚r i o 的四倍体马铃薯鉴别寄主3 6 8 l a d ( m a r l o ) 秉i 不含 已知抗病基冈的四倍体马铃薯栽培种k a t a h d i n ( k a t ) 及其杂交f 1 代为研究材料。对其进行了 晚疫病接种鉴定，新：分别提取了基冈组d n a 。利用比较基因纪学原理，采用b s a 和c a p s 、 a f l p 标记相结合的技术开发出与r i o 基因迮锁的标记，构建了马铃薯抗晚疫病主效基冈r i o 的高分辨率遗传图谱。实验取得了如下结果： 1 、通过对1 9 5 株f l 代单株进行抗病性鉴定，结果表明有9 2 株表现抗病，1 0 0 株表现感 病，病情指数为2 、3 和4 的植株分别只有1 株，病情指数1 _ j ；i i5 的植株数比例基本符合孟 德尔的l ：1 分离比( z = o 2 6 ：0 - 2 _ 0 5 ) ，分离群体出现明显的抗感两极分化，表明r i o 是一个 主效基冈，而抗感病植株数目符合1 ：1 比例，说明r i o 又是一个单拷贝基冈( r l o r i o r l o r l o ) 。 2 、通过对m l b 位点分析。发现该位点已知的各单倍型基冈乇有保守结构域，属丁同一 r 3 a 基冈家族。将r 3 a 和源丁m l b 位点的r 3 a 同源序列的信息进行比对，根据它f i j 高度保 守的区域i 5 2 计引物，获得与r i o 基冈连锁的r 3 a 基冈的抗病基冈同源序列，最终获得两个与 r i o 基冈连锁的r g a 标记，距离r i o 基因0 3 6 c m 。 3 、构建了马铃薯抗晚疫病主效基因r i o 的高分辨率遗传图谱。其中包含与r i o 基闪连 锁的6 个p c r 标记和9 个a f l p 标记，并将r i o 定位在1 0 0 1 t 和6 5 6 t 两个遗传距离为0 2 6 c m 的分子标记之间，为r i o 基因的兜隆打f 了基础。 关键词马铃薯；晚疫病；抗痫基冈；遗传幽谱； v 东北农业人学硕i 。学位论文 c o n s t r u c t i o no ft h eh i g h r e s o l u t i o ng e n e t i cm a po fr lo g e n ec o n f e r r i n gr e s i s t a n c et ol a t eb l i g h ti np o t a t o a b s t r a c t p o t a t o ( s o l a n u mt u b e r o s u ml ) i st h ef o u r t hm o s ti m p o r t a n tc r o pi nt h ew o r l da n dt h ea c r e a g e i so n l yi n f e r i o rt op a d d yr i c e ，w h e a ta n dc o r n s i m u l t a n e o u s l y ，i ti sa l s ot h ev e g e t a b l e ，f o r a g e ， p r o c e s s e sa n di n d u s t r i a lc r o p i th o l d st h ei m p o r t a n ts t a t u si nt h ea g r i c u l t u r a lp r o d u c t i o na n dt h e l i v e so ft h ep e o p l e l a t eb l i g h t ，c a u s e db yp h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s ，i so n eo ft h em o s td e v a s t a t i n g d i s e a s e si nc u l t i v a t e dp o t a t o i t sh a z a r d o u sa n dt h ep r e v e n t i o nd i f f i c u l t i e sh a v es u r p a s s e dr i c eb l a s t a n dw h e a tr u s tt h a tw a sr e g a r da st h ei n t e r n a t i o n a lf i r s tb i gc r o p sd i s e a s e s c l o n i n go ft h e r e s i s t a n c eg e n e ，r e s i s t a n c eg e n ep o l y m o r p h i s mi nt h ef i e l di sc o n s i d e r e dt h em o s tp r o m i s i n g s t r a t e g yf o rb l i g h tc o n t r o li nt h ef u t u r e t h er i og e n ec o n f e r r i n gr e s i s t a n c et op o t a t ol a t eb l i g h th a s b r o a dr e s i s t a n c es p e c t r u ma n dw a su s e dw i d e l yi nb r e e d i n gp r o g r a m s i nt h i ss t u d y ，t h el a t e b l i g h td i f f e r e n t i a l3 6 8 1 a d ( m a r l 0 ) w h i c hc o n t a i nr i oa n dt h e s u s c e p t i b l ec u l t i v a rk a t a h d i na n dt h e i rf 1w e r eu s e dt oc o n t r u c tg e n e t i cm a p p i n g t h ep l a n tc l o n e s w e r ei n o c u l a t i o nw i t ht h ep i n f e s t a n si s o l a t e8 914 8 9 ，a n dt h e i rd n aw e r ee x t r a c t e d c o m p a r a t i v e g e n o m i c sf a c i l i t a t e dt h em a p p i n go ft h er i og e n e ，a n db s ai nc o m b i n a t i o nw i t ht h ec a p sa n d a f l pt e c h n i q u ei sap o w e r f u lt o o lf o rm a r k e r sd e v e l o p m e n ta n de n r i c h m e n t t h eh i g h r e s o l u t i o n g e n e t i cm a po ft h er 10l o c u sw a sc o n s t r u c t e d t h ee x p e r i m e n ta c h i e v e dt h ef o l l o w i n gr e s u l t s ： 1 as i n g l ed o m i n a n tg e n ei si d e n t i f i e di nt h er i od i f f e r e n t i a lw i t hpi n f e s t a n si s o l a t e8 914 8 9 as e g r e g a t i n gp o p u l a t i o no f19 5g e n o t y p e sw a si n o c u l a t e da n da n a l y s i e d t h er e s u l t ss h o wt h a t9 2 c l o n e sw e r er e s i s t a n t ，10 0c l o n e sw e r es u s c e p t i b l e ，a n dt h em i d d l ei n d e xo fd i s e a s ew a so n l yo n e c l o n e t h en u m b e r so fp l a n t sw h i c hd i s e a s ei n d e x1a n d5a c c o r dw i t hr a t i oo f1 ：1 ( 贮= 0 2 6 ；p 之 0 5 ) 2 b a s e do ns e q u e n c ea n a l y s i sf o rr e s i s t a n tg e n e sk n o w ni nm l b ，i t si n d i c a t e dt h a tt h e s e h a p l o t y p e sh a v ec o n s e r v e dd o m a i n sa n db e l o n gt or 3 ag e n ef a m i l y s ot h ec o n s e r v e dp r i m e r sw e r e d e s i g n e db a s e do nt h ec o n s e r v e ds e q u e n c e so fr 3 ag e n ea n di t sh o r o l o g e sd e r i v e df r o mm l bw e r e u s e dt oi d e n t i f yr e s i s t a n c eg e n ea n a l o g s ( r g a ) c l o s e l yl i n k e dt ot h er10g e n e t h er g a - c a p s m a r k e rr g a 一6 0 0a n dr g a 1 0 0 0l i n k e do 3 6c mt ot h er 1 0g e n e w e r ed e v e l o p e da n dm a d eb a s e f o rt h ec l o n i n go f r l0g e n e 3 c o n s t r u c t i o nf o rt h eh i g h - r e s o l u t i o ng e n e t i cm a po fr i o 6p c rm a r k e r sa n d9a f l p v l 英文摘要 m a r k e r sl i n k e dt or 1 0a r ed e v e l o p e du s i n gac o m b i n e ds t r a t e g yo fc o m p a r a t i v eg e n o m i c sa n d b u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s ，r i og e n er e s i d e sb e t w e e nt h et w op c rm a r k e r s1 0 0 1 ta n d6 5 6 tt h a t d e f i n eag e n e t i ci n t e r v a lo f0 2 6c m t h eg e n e t i cm a pg i v e sab a s ef o rm o l e c u l a ri s o l a t i o nt h er io g e n ev i ap o s i t i o n a lc l o n i n ga n dc o m p a r a t i v eg e n o m i c s k e y w o r d sp o t a t o ；l a t eb l i g h t ；r e s i s t a n tg e n e ；g e n e t i cm a p p o s t g r a d u a t e ：w a n gj i a j i a m a j o r ：c r o pg e n e t i ca n db r e e d i n g s u p e r v i s o r ：p r o f w a n gf e n g y i p r o f h u a n gs a n w e n v i i 研究生学位论文独创声i p j 和版权使用授权 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。掘我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 逵! 如遗查墓丝盂塞挂别直明鲍! 奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：圣仞物日期山g 年6 月知同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁箍，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：毛仞和 同期：如以年石月力同 导师签名： 同期更稍年莎户劬| 前 言 1 前言 1 1 马铃薯的重要性及晚疫病的危害性 马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u ml ) 为茄科茄属舣子叶草本植物，起源丁南美洲安第斯山脉一 带，是世界上第人粮食作物，种植面积仅次于水稻、玉米和小麦，同时也是菜、饲、加i ：兼 用及l 业原料作物。由丁其耐早、耐瘠、高产、稳产、适应性j 、生育j 1 1 短、营养成分全面 等特点，在农业生产和人民生活中均 有重要地位。现在全球种植马铃薯的国家有1 4 8 个， 总产鼍达3 亿吨。过去2 0 年间，发展中国家的马铃薯产量儿乎翻了一侨。国际马铃薯中心 ( i n t e r n a t i o n a lp o t a t oc e n t e r , c t p ) 的研究表明，在世界范围内对马铃薯的需求剑2 0 2 0 年将有望 增长2 0 ，超过水稻、小麦、玉米的增k ，届时发展中国家对马铃薯的需求将是2 0 0 0 年的两 倍0 m 冬玉，2 0 0 0 ) 。我国己成为国际上马铃薯生产第一人国，据联合国粮食及农业组织( f a o ， 2 0 0 6 ) 报道，2 0 0 5 年我国马铃薯栽培面积为4 ，4 0 1 ，5 0 0 公顷，总产量达7 3 ，0 3 6 。5 0 0 n 屯，均居世 界首位。马铃薯富含淀粉，并含多种氨基酸，营养全面丰富。在我国不仅是高寒地区人【心的 重要粮食作物，而且也是其它地区的大宗蔬菜作物。此外，马铃薯j 泛的加，i ：川途，往我国 和世界：i ：农业生产中均占有重要地何。 马铃薯的生产受到多种病虫害的制约，其中影响最人，最受国际社会关注的病害是由致 病疫霉( p h y t o p h t h o r a i n f e s t a n s ) c 3 i 起的晚疫病( r i s t a i n oe ta i ，2 0 0 1 ) 。马铃薯晚疫病是马铃薯生 产的一种毁灭性病害，在全球范围内绝大多数栽培马铃薯的地区广泛传播( 宋伯符，1 9 9 7 ) 。1 8 3 0 年在德国首先发现了马铃薯晚疫病，但当时并朱引起人们重视。1 8 4 5 年，比利时首次报道了 晚疫病的发生，随后该病在欧洲迅速传播开米，在荷兰、丹麦、芬兰、法国、意人利、英国 等国家均有发生，特别是在爱尔兰1 8 4 7 年晚疫病的流行性传播造成全部马铃薯儿乎绝收，引 起广人居比的饥荒( a u s t i nb o u r k epm ，1 9 6 4 ) 。进入2 0 世纪8 0 年代，晚疫病住1 u ：界各地的频频 发生，引起国际社会的极人关注( f r ye ta 1 ，1 9 9 3 ) 。甲住1 9 9 2 年，国际马铃薯中, l 二, ( i n t e r n a t i o n a l p o t a t oc e n t e r , c i p ) 根据各国权威科学家的建议将晚疫病列为c i p 优先研究目标。联合国粮农组 织1 9 9 6 年的年度报告认为，晚疫病的危害性、防治难度及对社会影响已超过了水稻稻瘟病和 小麦锈病被视为国际第一大作物病害。据估计，中国每年区l 晚疫病损火近l o 亿美元，全世界 范嗣内由晚疫病造成的损火和为防治晚疫病所需要的花费人约每年在5 0 亿美元左右( 宋伯符， 1 9 9 7 ) 。冈此，抗晚疫病育种已成为全球马铃薯抗病育种的焦点。 东北农业人学农学硕i 学位论史 1 2 马铃薯抗晚疫病的研究进展 1 2 1 马铃薯对只i n f e s t a n s 的抗性研究 植物发病是寄主病原物相互作用的结果，发病表型的变异取决丁寄士、病原物和环境条 件二者之间的关系。马铃薯的野生种或栽培种对pi n f e s t a n s 的抗性主要有二种方式：毛直抗 性、水平抗性和非寄土抗性。 1 2 1 1 垂直抗性( v e r t i c a lr e s i s t e n c e ) 币直抗性是受单基冈或少数基冈控制的，一般表现为高度抗性，而在选种过程中抗、感 界限明显，便丁对后代进行选择，容易进入育种科序。冈此，柏：本1 士f ：纪初从墨两哥马铃薯野 生种s d e m i s s u m 中把罨直抗性弓| 入马铃薯栽培种s t u b e r o s u m 以米，受剑育种学家利植物 病理学家的普遍重视。但由丁其抗病性只针对一个或少数儿个病原物生理小种，所以随着小 种的变化，抗病性丧失的现象时有发生。根据有关资料，许多高度抗病的w - 种只能维持3 5 年( 李先平等，2 0 0 1 ) 。冈此，虽然币直抗性在选育抗晚疫病的马铃薯新 i ! 1 种中起了较人作川， 但由j i 晚疫病菌的生理小种多变，新的生理小种随着环境条什利新- u 1 种的出现而卅i 断增加， 甚至抗晚疫病新晶种刚投入生产，有的 种随即受到了晚疫病新的小种的侵染而丧火其抗病 力。冈此，单纯依靠垂直抗性已经不能完全解决品种对晚疫病的抗性，必须寻求新的抗病类 刑。 1 2 1 2 水平抗。r e ( h o r i z o n t a lr e s i s t e n c e ) 水平抗性也叫非小种专化抗性( r a c e n o n s p e c i f i cr e s i s t a n c e ) 或部分抗性( p a r t i a lr e s i s t a n c e ) ， 是由微效多基因控制的数避性状，虽然其抗病稚度不及砥亢抗性，但由- 丁它对病原菌不同小 种都表现抗性，且表现出多种保护机制，如对晚疫病菌孢f 侵入寄主细胞的抗性、对i 辑丝体 侵入寄主历的抗性、抑制孢子囊的发育和形成不f f 抑制孢子在单何感染面积上的形成能力等抗 性( 孙慧生，1 9 8 7 ) 。超微结构观察发现，在病原凶侵入非专化抗性品种表皮细胞的最初阶段， 未观察剑抗病反应，寄主细胞内朱山现次生产物的淀积。而一口7 南卤侵入寄主细胞后，! j ! l j 在 很短时间内启动抗性反应，其特征足在寄主细胞质中出现稠密的颗粒积累，发生过敏反廊。 菌丝有时可以逃出发生过敏反应的表皮细胞侵入i - 表皮，但是次级过敏反应义会发生，卤丝 扩展不断受剑阻抑。有时，一部分菌丝逃山过敏病斑，并在寄土叶肉细胞定殖，但植株会进 一步表现出抗产孢璎的抗性，使定 f f 凶丝的产孢率人人卜降。冈此，水平抗性所表现山的优 点引起了育种学家的高度重视，并使他们改变过之的育种策略转而从事对水平抗性的研究 1 2 1 3 非寄主抗。1 q ：( n o n h o s tr e s i s t a n c e ) 许多病原凶具有高度的专一性，只能侵染有限的寄主。例如，人多数植物都对侵染马铃 薯币界茄的p i n f e s t a n s 有抗性。这种现象，也就是病原只能在特定的植物物种上引起病害而 2 前苦 不能在其它种上引起病害的能力，就称为非寄主抗性或种特异性抗性( s p e c i e s s p e c i f i c r e s i s t a n c e ) ( k a m o u n ，s ，2 0 0 1o 完全抗性植株，如1 卜寄土的龙葵( s o l a n u mn i g r u m ) 、欧芹( p a r s l e y ) 、 烟草( t o b a c c o ) 和拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 对p i n f e s t a n s 具有典型的原位过敏反应 ( h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ，h r ) ，也就是在所有的侵染点产生程序性细胞夕匕亡( c o l o nlt e ta l ， 1 9 9 2 ；n a t o nbe ta 1 ，1 9 9 6 ；k a m o u ns , e ta 1 1 9 9 8 ，1 9 9 9 ；v i e e s h o u w e r svg aa ，e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。过敏 反应发生在菌丝侵入点周嗣的单个或一组细胞( k a m o u ns ，e ta 1 1 9 9 8 ，1 9 9 9 ；vgaa ，e ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。这种观点源于所有的对p i n f e s t a n s 遗传抗性包括非寄主抗性都! j 过敏反应相关联 ( k a m o u n 。s e ta 1 1 9 9 9 ) 。在已知的寄主病原系统中，特异性抗性基本都符合f i o r 的基冈对基 因学说，这种学说在1 f 寄主且作中的应h j 程度还不可知。对丁疫病国( p h y t o p h t h o r a ) 来说，非 寄主抗性也许可以简单解释成r 基因能识别多个或必要的a v r 基因( k a m o u n ，s e ta i 1 9 9 9 ) 。也 有人猜测，非寄土抗性也许是由一套与病原群体共进化的一套古老的广谱抗性的尺基冈位点 或识别a v r 等位基冈的高频率的尺基因的等位基因介导的( k a m o u ns ，2 0 0 1 ) 。 1 2 2 马铃薯抗晚疫病基因的研究 植物病害给农业生产造成巨大损火，是农业生产的主要限制原闪之一。由丁化学约剂造 成的病原物抗性问题和环保问题，使其应川越米越受到限制，开发和利川寄士本身的抗性是 解决病害问题的根本途径。 1 2 2 1 马铃薯抗晚疫病基因的研究进展 根据f l o r ( 1 9 7 1 ) 提出的基冈对基冈假说，植物对某种病原菌的特异抗性取决丁它是否具 有相应抗性基因( d i s e a s er e s i s t a n c eg e n e ，r 基因) ，而同时瘸源物的专一致病性取决于是否具有 无毒基冈( a v i r u l e n c eg e n e ，a v r 基冈) 。只有当具有相廊抗病基冈的寄主植物与具有无毒基冈的 病原物相遇时，才会激发植物的抗病反应，二者表现为不亲和，而在其它情况。卜寄土感病， 表现为亲和。随着研究向分子水平的深入，基冈对基冈假说得剑了补充：病原无毒基冈直接 或间接产生激发子( e l i c i t o r ) ，与植物抗病基因编码的受体( r e c e p t o r ) 相互识别并产生信号，通过 传导途径传播，诱发植物的防御机制，使植物产生防御反应，这被称为激发子受体模删。 白1 9 9 2 年应川转座子标签法分离出第一个抗病基冈h m l ( j o h a la n db r i g g s ，1 9 9 2 ) ，1 9 9 3 年应用作图克隆法( m a p b a s e dg e n ec l o n i n g ) 分离出第二个抗病基冈p t o ( m a r t i ne ta l ，1 9 9 3 ) 以 来，已有4 8 个尺基因从1 2 种不同植物中克隆出米( d i l b i r l i g i & g i l l ，2 0 0 3 ) 。甲在1 0 0 年前， 人们就在一个墨i 撕哥野生种sd e m 站s u m 中发现对晚疫病的抗性单基冈( r 基冈) ，f ：把这些基 因引入剑栽培种中，这些材料构成了2 01 i j ：纪3 0 年代剑5 0 年代的晚疫病抗性育种的基础 ( b l a c kw e ta 1 1 9 5 3 ；m a l c o h n s o njfe ta 1 ，1 9 6 6 ) 。然而向马铃薯栽培种中引入对晚疫病小 种专一抗性的尺基冈只能提供暂时抗性，这种尺基冈介导的抗性不久就会被新的病原小种所 克h l 曼( f r ywee ta 1 ，1 9 9 7 ) 。目前在马铃薯中已鉴定的控制马铃薯晚疫病菌生理小种专化性抗 性的主效尺基因有：来源于马铃薯野生种s d e m i s s u m 的r 基冈尺厶r 1 1 ( b l a c kw ，e ta i ，1 9 5 3 ； m a l c o l m s o njf e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。米源丁马铃薯野生种s b u l b o c a s t a n u m 的尺基冈r b r p i b i b i ， 3 东北农业人学农学颀f 学化论文 i i i i1 1 i i i r p i b l b 2 、r p i b l b 3 等( s o n gje ta 1 2 0 0 3 ；v a nd e rv o s s e ne ，e ta 1 2 0 0 3 ，2 0 0 5 ；t a e h op a r ke ta 1 2 0 0 5 ) 。运用r f l p 、a f l p 等技术已经成功地将尺j 基冈定位在染色体v 上( o b e r h a g e m a n np e t a 1 1 9 9 9 ) ；将粥，r 6 、r 7 、基因定位在染色体x l 上，并让明这三个基冈高度连锁( e l k h a r b o t l y ae t a l 。1 9 9 4 ，1 9 9 6 ) ；将艘基冈定位在染色体l v 上( l - xe t a l 。1 9 9 8 ) ；r 4 是与r 1 ，尺2 羽lr 3 独立遗传的，但它的染色体位置还没有确定( m o i l e rko e ta i 1 9 5 2 ) 。r 5 和r 8 r 11 现已被确 认为是尺3 的等位基因，初步认为它们都侮于染色体x i 上。e p i b i b i 、r p i - b l b 2 ，r p i - b l b 3 基 因分别被定位在染色体v i i i 、v i 、i v 上，虽然这三个基冈对晚疫病菌有着宽j “抗性，但仍然 需要j 1 j 更多的晚疫病菌株来检验其抗性。而米源7 - s b e r t h a u t i i 和s p i n n a t i s e c t u m 的尺基冈目 前研究较少( 见表l - 1 ) 。 现己被克隆的马铃薯抗晚疫病冗基闪有包括来源于s d e m i s s w n 的r 1 ( b l a c kw ，e ta 1 ，1 9 5 3 ) 和r 3 a ( h u a n gse ta 1 2 0 0 5 ) ，米源于s b u l b o c a s t a n u m 的r b r p i - b l b l ( s o n gje ta 1 2 0 0 3 ；v a nd e r v o s s e ne e ta 1 2 0 0 3 ) 、r p f b l b 2 ( v a nd e rv o s s e nee ta 1 2 0 0 5 ) 。它们全部编码c c n b s l r r 蛋 白。 1 2 2 2 马铃薯抗病基因的结构特点 现已克隆的r 基闪虽然米臼不同物种、介导对不同类病原体的抗性，t 这些尺基1 人i 编码 的蛋向产物却具有相对保守的结构基序。其编码产物都含有卜列一种或多种保守结构：核苗 酸结合位点( n u c l e o t i d eb i n d i n gs i t e ，n b s ) 、亮氨酸富集重复序列区( l e u c i n e r i c hr e p ed o m a i n ， l r r ) 丝氨酸苏氨酸激酶( s a r i n e t h r e o n i n a ek i n a s a e ，s t k ) 、跨膜结构域( t r a n s m e m b r a n ed o m a i n ， t m ) 汞l 果蝇t o l l 蛋向以及人类自细胞介素一1 受体类似结构域( t o l l h u m a ni n t e r l e u k i n 1r e c e p t o r g e n ec y t o p l a s m i cd o m a i n ，t i r ) ( c o l l i n sn c e ta l 。1 9 9 8 ) 。 1 核苷酸结合位点0 、i b s ) n b s 存在丁真核生物的许多篮白中，它由p 1 0 0 p ， k i n a s e 2 a ， k i n a s e 一3 a 及两个未知功 能的保守区组成。p 1 0 0 p 即磷酸结合环，又称k i n a s e l a ，作川是结合a t p 或g t a 的磷酸， 其共有序列为g m ( g p ) g x g k t t ( a t ) ( x 为任意氮基酸，a 为疏水氨摹酸) 。k i n a s e 2 a 区共 有特点是4 个疏水氨基酸残基后紧跟一个不变的讲 负l u 筒的大冬氮酸，但徊：丰l l f 物中，这区 域的两边还具有高度保守的氨基酸，共有序列为k ( k r ) x a a a a d d v ( w d ) 。k i n a s e 3 a i x 与d n a 的喋呤或核糖结合有关，通常含有一个粘氨酸残基，其保守区为s r a a a t ( t s ) r 。 j r 基闪中n b s 结构域的高度保守性说明= 磷酸核茁酸的结合对尺荩冈发挥功能是必要 的。蛋自质的磷酸化和玄磷酸化可引起构象变化，在这些构象变化的蛋向质中许多i 叮能是荩 冈转录中的凋节冈子，可通过核膜孔与基顺式作州元件结合，从而调控基冈的转录表达。 实验已证明通过定点突变改变r p s 2 蛋白中n b s 的犬键氨基酸可使其火玄诱发过敏性反戍 ( h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ，h r ) 的功能( b o y e se ta l ，1 9 9 8 ) 。 2 亮氨酸富集重复序列区( l r r ) l r r 是指连续重复的富含亮氨酸的一段氨基酸序列，每个重复序列约由2 0 2 9 个( 一股为 2 4 个) 氨基酸残基组成，在一定的间隔区域内规律性地含有亮氨酸或其他疏水氨基酸残基。 4 前苦 表1 - 1 已知晚疫病足基因及其特性 t a b 1 - 1r e s i s t a n tg e n eo fl a t eb l i g h ta n dt h e i rc h a r a c t e r 抗病基凶 来源染色体抗性类型参考文献 墨g 曼璺曼墨仑皇里i 皇! 竺垫旦! 塑q ! q 里曼垦竺! ! 璺! 垒翌竺皇! y 巳曼垦星! ! ! 曼旦里星! r 1s d e m i s s u m5 r a c e - s p e c i f i c i t yb a l l v o r ae ta 1 ，2 0 0 2 r 2s d e m i s s u m r 3 a r 3 bs d e m i s s u m r 4 r 5 r 6 r 7 r 8 尺9 r j o r ll 4 l l r a c e - s p e c i f i c i t y l ie ta 1 ，19 9 8 r a c e - s p e c i f i c i t yh u a n g e ta 1 ，2 0 0 4 s d e m i s s u mu n k n o w n r a c e - s p e c i f i c i t y m f i l l e ra n db l a c k ，1 9 5 2 s d e m l s s z t m s d e m i s s u m s i d e m i s s u m d e m i s s u m s d e m t s s u m s d e m i s s u m d e m i s s u m r a c e - s p e c i f i c i t yh u a n g ，p h dd i s s e r t a t i o n r a c e - s p e c i f i c i t yh u a n g ，p h dd i s s e r t a t i o n r a c e - s p e c i f i c i t yh u a n g ，p h dd i s s e r t a t i o n r a c e - s p e c i f i c i t yh u a n g ，p h dd i s s e r t a t i o n r a c e - s p e c i f i c i t yh u a n g ，p h dd i s s e r t a t i o n r a c e - s p e c i f i c i t yh u a n g ，p h dd i s s e r t a t i o n r a c e s p e c i f i c i t yh u a n g ，p h dd i s s e r t a t i o n r b r p i b l b l s b u l b o c a s t a n u m 8 w i d e s p e c t u m 邱l f b l b 2 印f b l b 3 r p i b e r l r p i l r p i m c d l s b u l b o c a s t a n u m6 s b u l b o c a s t a n u m4 sb e r t h a u l t i f w i d e s p e c t u m u n c l e a r s o n ge ta 1 ，2 0 0 3 ； v a nd e rv o s s e ne ta 1 ，2 0 0 3 v a nd e rv o s s e ne ta 1 ，2 0 0 5 p a r ke ta 1 ，2 0 0 5 r a c e - s p e c i f i c i t ye w i n ge ta 1 ，2 0 0 0 s p i n n a t i s e c t u m 7u n c l e a r k u a le ta 1 ，2 0 01 r p i m o c l s m o c h i q u e n s e r p i n e o l 印f o k a l s n e o r o s s i i 5 9 a n 9 u n c l e a rs m i l d ee ta 1 ，2 0 0 5 u n c l e a rs a nd i e g o 2 0 0 4 u n c l e a r s a nd i e g o ，2 0 0 4 u n c l e a rs a nd i e g o ，2 0 0 4 r p i - o k a 2 s o k a d e4u n c l e a r s a nd i e g o ，2 0 0 4 人部分已克隆的r 基冈编码产物都含有l r r 。根据r 基冈编码蛋白所含的l r r 的细胞 定位，将其分为2 类。一类是定位丁细胞质的l r r ，识别膜内配体，如n ，m 、l 6 ，r p s 2 和 5 东北农业火学农学硕i 。学化论文 r p m l 等，主要见于含有n b s 的尺基冈产物中，其l r r 区一般位丁蚩白质的c 端；另一类 是定位丁二胞外的l r r ，识别膜外配体，如x a 2 1 、印、c f e 和h s l 岬_ 等，其l r r 的重复数 较高，一般具有完蔡的重复结构。胞外l r r 第1 4 位上的残基为甘氨酸，这是所有跨膜l r r 的特征。胞外l r r 区一般位于n 端信号肽之后，r i 据了蛋白质的绝火部分。 r 基冈的l r r 区正好提供了结合其它蛋白的受体结构域，其中保守的亮氨酸形成疏水的 与无毒基因编码蛋白配体结合的结构，而一i 卜保守的氨基酸残基决定了与配体结合的特异性 ( b o s t j a na n dj o h a n n ，1 9 9 4 ) ，即与受体一配体相互识别的专一性有关。b e n t 等f 1 9 9 6 ) 也提出某 些r 基冈产物中的l r r 是病原体无毒基因产物的结合区域，与丰f i 物抗病反应的识别有关。 除此之外，l r r 可能还有促进月基冈产物与植物抗性反应信号传导中的其他蛋白质之间互作 的作州，从而参与识别后的信号传导。人们发现l r r 中单一氨基酸的变化可导致抗病反府的 消火或减弱，而且单独在水稻中表达肠2 1 蛋白的l r r ，水稻亦可表现出对水稻白1 1 i 丰占病菌 部分抗性，这些证据都表明l r r 舀j 植物抗病过程中具有重要作川。 3 白细胞介素一1 受体类似结构( t i r ) 哺乳动物向细胞介素1 受体蛋白( i l 1 r 蛋向) 和果蝇发育受体蛋向t o l l 的胞质域都会在 病原物信号的作j j 下，引起有关转录冈子的激活和从胞质剑细胞核的移位进而激活防甲基 阏的转录乖jj 表达( b r i g h t b i l l ，1 9 9 9 ) 。n 。l 6 、艘p ，、艘p 5 基冈编码的n h 2 末端区域与儿一j r 基冈和而基冈的胞质信号【孓域同源( l a w r e n c e ，1 9 9 5 ) 。r 基因的类似结构可能与激活防甲基 冈的转隶i 碍子有关，所以植物抗病基冈也可能存在与哺乳动物和比虫臼然免疫系统相似的抗 病途径，通过其编码蛋白行使受体功能、触发信号传递途径，最终激活植物防甲反应。 由丁抗病基冈产物的这些保守结构域在植物对病原物的识别、诱导抗病反应及信号传导 等过程中起到非常重要的作用。因此认为在郧些尚术被克隆的抗病基冈决定的产物中可能也 存在这样的保守结构，这样为克隆抗病基冈捉供了一种全新的思维方式。利川抗痫基冈产物 具有保守结构域的特性，通过人丁合成与己失i 抗病基冈产物的保守序列类似的简井引物，以 植物总d n a 、e d n a 为模板进行p c r - i 。增，就可以得剑该植物的抗病丛冈同源序列( r e s i s t a n t g e n ea n a l o g s ，r g a s ) ，就为分离植物的抗病基和作为分子标记跟踪抗病基冈提供了新的思 路。 1 3 遗传图谱的构建 遗传幽潜( g e n e t i cm a p ) ，也称连锁图谱( 1 i n k a g em a p ) ，是指以遗传标i 己( 已知性状的基冈或 特定d n a 序夕| j ) 问重组频率为基础的l 条染色体或墓冈f ! | 伉点的相对1 1 i 7 = 置线性排列图( 魏惠军 等，1 9 9 9 ；a l l e naf ，1 9 9 4 ) 。分子遗传图谱( m o l e c u l a rg e n e t i cm a p ) ，是以d n a 为标记的遗传 图谱。建立高等生物详尽的遗传图谱一直是遗传学家们研究的目标。分子遗传作图不仅在理 论上，而且在育种实践上有十分重要的意义利价值。通过与目的基闪紧密迮锁的分子标记所 构建的分子遗传图谱，为育种者指明了育种目标及剑达目标的最佳路径( a l l e naf ，1 9 9 4 ) 。植 物分子遗传幽谱不仅为育种者提供了一份基本资料，使育种i ：作目的性更慢，有效性更高， 6 前言 同时为育种工作者提供了数量无限、简便易行的分子标记，这样在育种实践中，可利川分子 标记提早选择( 即使在性状未表现之前也可进行) ，因而可人大提高育种效率，加速育种进程， 缩短育种周期，节省财力和物力( t a n k s l e ysd e ta 1 1 9 8 3 ；r a g o tm e ta 1 1 9 9 3 ；b a i dwve t a 1 1 9 9 6 ) 。 目前主要作物的分子遗传图谱构建 作已基本完成。在蔬菜作物中，番茄、马铃薯、辣 椒、莴苣、