（农业昆虫与害虫防治专业论文）细胞代谢网络模型的优化与分析研究.pdf

中山大学磺士学位论文 细胞代谢网络模型的优化与分析研究 专业l 农业昆虫与害虫防治 硕士生。骆合峰 导师：张文军 摘要 细胞的生长与分化涉及众多代谢物的共同作用，而非少数几条代谢途径在 细胞内，相当数量的代谢途径相互交连，构成了复杂的网络，因此，必须从系统 生物学的观点出发。借助数学和计算机技术，对细胞的整个代谢网络进行分析研 究，从而实现对细胞生长与分化的深刻理解伴随基因组学、转录组学、蛋白组 学研究的兴起，代谢组学也开始受到关注对代谢系统进行研究，可以指导代谢 工程应用，例如代谢途径的优化，关键酶的筛选，等等，这比以前仅仅依靠随机 突变、重复筛选株种的效果要更好代谢系统是细胞调控的终端，也是最复杂的 一个生化系统。细胞代谢网络的复杂性，使得有必要采用更加有效的模型来指导 深入的研究 本文在细胞代谢网络的基础上，对代谢平衡分析模型( f b a ) 采用了有约束 优化，以此研究和分析代谢网络首先，建立了酵母细胞的中心碳代谢网络。对 其进行代谢通量分析( m f a ) 。然后利用代谢平衡分析，建立代谢网络数学模型， 并用生长能力与最小代谢调节( m o m a ) 方法对模型进行优化，最后计算结果，并 进行分析在代谢矩阵计算和生化计量方程求解方面，使用了m a t l a b 。 f l u x e x p l o 佗r 等工具，提高了计算速度，降低了模型求解的复杂度。也保证了结 果的可靠性。 结果显示，通过有约束优化方法，可以提高代谢平衡分析模型的效率和准确 度，并能提高我们对细胞代谢调控的理解。通过这些方法，可得到未知途径的代 谢通重。识别节点的刚柔性质，找出代谢网络中的一些替代途径，并由此计算出 代谢物的理论最大得率细胞代谢网络研究方法的应用，可以从分子水平上重现 细胞的宏观生理特征，有助于理解分子与细胞乃至生物体的相互关系。从根本上 提升生物学理论，必将对生命科学的进步产生重要影响 关键词t 代谢网络；代谢通量分析；代谢平衡分析；模型优化 骆合峰细磨代谢同路模型的优化与分析研究 a no p t i m i z a t i o na n a l y s i so nc e l l u l a rm e t a b o l i cn e t w o r km o d e l m a j o r a g r i c u l t u r a le n t o m o l o g ya n di p m n a m e ：l u nh e f e n g s u p e r v i s o r ：z h a n gw e n j u n a b s t r a c t 硼g r o w t ha n dd i f f e r e o t i a t i o no fc e l l si n v o l v e sal a r g en u m b e ro fm e m b o l i c i n t e r a c t i o n s i nac e l l ，ac o n s i d e r a b 王en u m b e ro f m e t a b o l i cp a t h w a y si n t e r a c tw i t he a c h o t h e r , a n dc o n s t i t u t eac o m p l e xn e t w o r k a sar e s u l tw es h o u l df o l l o wt h et h e o r i e so f s y s t e m sb i o l o g y , a n du s em a t h e m a t i c sa n dc o m p u t e rt e c h n o l o g yt oa p p r o a c ht h e m e t a b o l i cm e c h a n i s mi nt h ee n t i r ee e l ln e t w o r k a st h ea d v a n c e m e n to fg e n o m i c s t r a n s c r i p t o m i c s , a n dp r o t e o m i c s ，m e t a b o l o m i c sa l s ob e g i n st or e c e i v es i g n i f i c a n t a t t e n t i o nf r o mr e s e a r c h e r s a nu n d e r s t a n d i n gt om c t a b o l i cs y s t e mw i l lh e l pt og u i d e t h e s t u d i e so fm e t a b o l i ce n g m 蛐a p p l i c a t i o n s ，s u c ha st h eo p t i m i z a t i o no f m e t a b o l i cp a t h w a y s 。t h ek e ye n z y m e ss c r e e n i n g ，a n ds o0 1 1 m e t a b o l i cs y s t e mi st h e t e r m i n a ls v s t e mi nt h er e g u l a t i o no fc e l l a n di ti so l l eo ft h em o s tc o m p l e x b i o c h e m i c a ls y s t e m s m e t a b o l i en e t w o r ki ss oc o m p l i c a t et h a ti th a st ol n a k em o r e e f f e c t i v eu s eo f t h em o d e lt og u i d et h er e s e a r c h b a s e do n 觚o v e r a l lu n d e r s t a n d i n gf o rc e l lm e t a b o l i cn e t w o r k , ac o n s t r a i n t o p t i m i z a t i o no nf l u xb a l a n c ea n a l y s i sm o d e l ( f b a ) h a sb e e nm a d ei no r d e rt os t u d y c e l l u l a rm e t a b o l i cn e t w o r k f i r s t l y , ac e n t r a lc a r b o nm e t a b o l i s mn e t w o r km o d e lo f t h e y e a s te e l iw a sd c v e l o p e da n dm e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ( m f a ) w a sc o n d u c t e do ni t s e c o n d l y , u s i n gt h em e t a b o l i cb a l a n c ea n a l y s i st oe s t a b l i s hm a t h e m a t i c a lm o d e lo f c e l l u l a rm e t a b o l i cn e t w o r k , a n du s i n gt h eg r o w t hc a p a e i t ya n dm i n i m i z a t i o no f m e t a b o l i ca d j u s t m e n t ( m o m a ) m e t h o d st oo p t i m i z et h em o d e l f i n a l l y , c o m p m i n g t h er e s u l t s ，a n dm a k i n ga n a l y s i s i nt h ec o m p u t a t i o no fm a t r i xm e t a b o l i s ma n d b i o c h e m i c a lm e a s u l e n l e n te q u a t i o n , m a n a b a n df l u x e x p l o r e rt o o l sw e r eu s e dt o i m p r o v et h ec o m p u t a t i o ns p e e da n dr e d u c et h ec o m p l e x i t yo ft h em o d e ls o l u t i o n , a n d t h i sh a sa l s og u a r a n t e e dt h er e l i a b i l i t yo ft h er e s u l t s u s i n go p t i m i z a t i o na n a l y s i s0 1 1 t h em o d e lo f c e l l u l a rm e m b o l i cn e t w o r k , w ec 孤i m p r o v et h ee f f i c i e n c ya n da c c u r a c y o ft h em e t a b o l i cb a l a l e em o d e l i tw i l la l s oe n h a l e eo u l u n d e r s t a n d i n go nc e l l m e m b o l i cr e g u l a t i o n , i e tu sg a i ni n s i g h to nt h eu n k n o w nm e m b o l i ef l u x e s 。i d e m i f y n o d e sr i g i dn a t u r e h e l p 懈i d e n t i f ym e m b o l i cn e t w o r ko fa l t e m a t i v ec h a n n e b a n d t h u sc a l c u l a t et h et h e o r e t i c a lm a x i m u my i e l do fm e t a b o l i t e s r e s e a r c h e so nc e l l u l a r m e t a b o l i cn e t w o r kw i l lc o n t r i b u t et oat h o r o u g hu n d e r s t a n d i n go nm o l e c u l a r m e c h a n i s m sa n dc e l lo r g a n i s m sa n de v e nt h e i rm u t u a lr e l a t i o n s w h i c hw i l lr e s d ti na f u n d a m e n t a lc h a n g ei nb i o l o g i c a lt h e o r i e s k e yw o r d s ：c e l l u l a rm e t a b o l i cn e t w o r k , m e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ，f l u xb a l a n c e a n a l y s i s ，m o d e lo p t i m i z a t i o n 中山大学礤士学位论文 引言 在上个世纪九十年代之前，人们对于代谢系统的研究主要建立在生理学的基 础上，集中在一种直观的定性分析过程中伴随着代谢工程的兴起人们开始需 要对代谢网络系统进行量化研究以满足预测代谢网络行为乃至重构代谢网络的 需求本世纪初，人类基因组计划取得成功，生命科学进入到了后基因组时代。 一些科学家为此提出了系统生物学( k i m a o ，2 0 0 2 ；h o o d , 2 0 0 2 ) 在这样个背景 之下，代谢系统的研究开始进入了一个全新的时代 代谢网络模型的研究是伴随着代谢工程这门学科的兴起而发展起来的。代谢 工程是应用分子生物学和反应工程技术不断发展融合的结果，是对细胞( 包括微 生物，植物、动物乃至人体细胞) 内代谢途径网络分析的基础上进行定向地有目 的地改变，以更好地理解和利用细胞代谢进行化学转化、能量转导和超分子组装 ( s t e p h a n o p o u l o s ，1 9 9 8 ) 。在最近十几年里，国内外不断发表了关于代谢途径网 络研究的论文和综述性文章，研究分析手段也不断得到创新。 尽管在代谢网络的研究和应用方面已经取得不少成绩，我们对于代谢网络及 其调控机理仍然还处在一个比较初级的阶段，仅仅停留在对一些代谢网络的解释 和总结上在代谢网络的定量化研究和理论化分析上，与我们的期待还相差很远 我们迫切需要把代谢网络中所有代谢量和反应速度、酶活等参数量化，从而实现 更加精确的分析。实现计算机模拟实验。然而细胞的生化代谢是一个十分复杂的 过程，即使最简单的一个细胞也拥有数目众多的代谢中间产物以及繁杂的调控机 制和网络节点可以这样说。我们目前研究代谢网络系统很大程度上只能依靠随 机突变改变基因、蛋白酶来获得系统输入输出的改变，不能建立在理解网络系统 内部组成和动力学过程基础上对代谢网络进行调节改善，可以说只是一种盲目的 黑箱操作但现在我们可以尝试在分子生物学基础上。结合信息科学、控制论、 系统论方法以及各种数学分析手段，最终把细胞代谢系统乃至整个细胞整个生物 系统化为白箱，不仅知道系统的内部结构功能，而且还明确内部各组份的相互作 用运动规律所有目前尝试建立比较完善的代谢网络模型从而简化细胞代谢网 络。为研究提供更方便的手段，就是整个代谢系统生物系统研究的第一步 骆合峰细胞代谢网络模型的优化与分析研究 传统的分子生物学研究只侧重从实验中获取数据，不重视信息技术的利用， 不重视对实验数据的挖掘，实际上这是对以往实验成果的忽视。系统生物学致力 于整合各种生物信息的实验数据，建立数学模型，并通过实验验证，完善模型， 最终达到准确预测生物系统的行为，充分实现计算机信息技术与实验科学的完美 结合，使得生物学从纯粹的实验科学朝着理论科学方向转变。这是研究网络细胞 代谢网络模型的目标( 图1 ) ，也是本研究的意义所在。 囤乏 l 韧步建立模型 l l 从文献i f l 确认基因在特定 反应途径r p 的震达 、。、。、l ，7 模型确认l ，7、 填补先前代谢网络的空缺 ， ，一 ：”一l 萋建代谢模型 ：- ：蠢、。 1 、- j 柬吲 ， i对代谢模型旄如约柬条件 ： 实验数据 图1 代谢网络模型构建过程。虚线箭头代表的是信息流，实线箭头代表的是工作流程 ( 仿绘) f i g1m e t h o d o l o g yf o rm e t a b o l i cn e t w o r km o d e lf o r m u l a t i o n b r o k e nl i n ea r r o w h e a dm e a n s i n f o r m a t i o ns t r e a m ，r e a ll i n ea r r o w h e a dm e a n sw o r kp r o c e s s 2 中山大学硕士学位论文 1 1 系统生物学 第1 章绪论 二十一世纪是生命科学的时代，也是信息时代如果说= 十世纪的生命科 学是试图通过各种精细手段将生命体分而化之的去深究其各个最基本层次。那么 二十一世纪的生命科学就是利用数字信息技术对生命体的各个层次的已知信息 进行整合处理以期从整体系统的角度来研究生命体，因此也有人于世纪之初就提 出了系统生物学的概念。 上个世纪我们的生命科学兴旺繁荣，从宏观到微观。从解剖生物体到探索细 胞、蛋白质、核糖体直至生命的核心一基因，人类对生命体知道的越来越多也 越来越接近生命的本质。然而这所有的一切还不能让我们满意，因为我们的目光 一直只能局限于了解一个器官的功能，知晓一个细胞的作用，甚至我们还能知道 小到单个基因的功能。可惜这切都是零散的。如同我们在一个富裕的海岛上转 悠经常发现一些零散的极其珍贵的宝物。但是我们始终没法把握宝藏的分布。 系统生物学是研究一个生物系统中所有组成成分的构成以及在特定条件下 相互作用的学科。系统生物学的核心是整体性研究和系统性研究，有别于迄今为 止所有其它生物学分支学科的思维和研究方式，是一种崭新的思想。它表明人类 对生命科学的研究开始了从分析到综合的新革命。在这以前人类的研究是基于如 图1 1 的顺序 伴随着人类基因组计划的完成，基因序列上取得了不少的积累，人类开始在 这个基础上进行生命体的还原化研究了测序完成的基础上去发现基因，了解它 们的形态和结构统计特性，接着通过相似性分析和蛋白质结构域分析进一步明确 基因的功能。各种相关的基因构成了相应的生化代谢途径，每一条代谢途径并非 独立，它们之间又构成复杂的网络，包括了基因调控网络、蛋白作用网络、信号 网络以及代谢网络通过这些复杂的网络。我们就可以系统的来研究细胞、器官 组织乃至生物体了为了研究这些复杂网络，科学家们提出了一些系统的观点来 研究相关网络的学科，比如基因组学( c , e n o m i e s ) 、转录组学( t r a n s c r i p - t o m i c s ) 、蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) ，同样的为了研究代谢，人们也提出了代谢 组学( m e t a b o o m i c s ) 。 宣 骆合峰细胞代谢网络模型的优化与分析研究 牛物体 纰织器宵 钞 l细抛 蠢自矮和祭冈 毒乡 碱舔系列 图1 - 1 生命科学研究中的人类思维次序 f i g1 - 1p e o p l e st h i n k i n gs e q u e n c ei nt h el i f es c i e n c er e s e a r c h 科学家认为要在系统层次上理解生物学系统可以从以下四个关键点( k i t a n o 2 0 0 2 ) ： ( 1 ) 系统的结构。这包括基因的相互作用和生化通路的网络，以及这些相互 作用调节细胞内、细胞间结构的物理性质的机制。 ( 2 ) 系统动力学。通过代谢分析、敏感性分析、动力学分析方法如相位图、 分支分析及特定行为的基本机制的识别来理解系统在不同条件下随时间如何变 化。分支分析跟踪多维空间中系统状态随时间的变化，其中每一维代表所包含的 生化因素的一个特定的集合。 ( 3 ) 系统控制方法。调节控制细胞状态的机制，降低其出错的机会，同时也 为控制疾病提供潜在的治疗目标。 ( 4 ) 系统设计方法。立足于明确的设计原则和比较精确的仿真，而不是通过 盲目的试验重复筛选来提供设计策略，改善生物学系统，使其达到预期的要求。 而其中基因调控逻辑以及生化网络的辨识( d a v i d s o m2 0 0 2 ) 将是主要的挑战。面代 谢网络是生化网络中最重要的最复杂的一部分，也是生化网络的最下游，深受基 4 中山大学硕士学位论文 因、转录，蛋白质网络的调控影响，所以对于它的研究是更加的挑战，也具备十 分的意义。 我们将从系统生物学的观点来认识理解细胞，在图l - - 2 中我们可以看到代 谢网络的研究这一过程中的重要意义 g e n e t i ce n v i r o n m e n t d n a s b q u e n o e a n a l y s i s s a g e2 d em f a d i f f e r e n t i a ld i s p l a y c a p i l k ye k c t l p h o 幅i # m c a d n am i c v t yl c - m s d y l l i a n a l y s i s 圈i - - 2 系统生物学观点下理解基因、环境如何影响细胞生命活动( 仿绘) f i g1 - 2 h o w g e n e sa n de n v i r o r a n e n ta f f e c tt h ec e l l sl i f ea c t i v i t i e si ns y s t e m sb i o l o g y 1 2 代谢组学与代谢途径 代谢组是细胞中所有的代谢物总和，包括底物、中问代谢物以及生成物等 。代谢组学。( m e t a b o n o m i c s ) 是一种整体性的研究策略。通过测定生物体分 泌出来的代谢物的组成变化，来探讨生物体与环境因子和遗传因子的互作关系， 有点类似于通过分析发动机的尾气成分，来研究发动机的运行规律和故障诊断等 的“反向工程学”的技术思路。由于代谢组学不把研究对象破坏例如磨成匀浆来测 定其中的变化。而是着眼于把研究对象作为一个整体来观察和分析，特别是从人 体水平来研究系统的结构与行为，代谢组学是上世纪九十年代中期发展起来的一 门新兴学科，是系统生物学的重要组成部分它是关于生物体系内源代谢物质种 5 骆台峰细胞代谢罔络模型的优化与分析研究 类、数量及其变化规律的科学，研究生物整体、系统或器官的内源性代谢物质及 其与内在或外在因素的互作。常用的方法是检测和量化一个生物整体代谢随时间 变化的规律，建立内在和外在因素影响下，代谢整体的变化轨迹，反映某种病理 ( 生理) 过程中所发生的一系列生物事件。从而达到从整体上把握人体的健康状态 和治疗措施的效果。代谢组学刨始人、英国帝国理工大学教授j e r e m yn i c h o l s o n 认为人体应该作为一个完整的系统来研究( n i e h o l s o n ，1 9 9 9 ) 。应用代谢组学来理解 疾病过程代谢组学的研究可以追溯至上世纪8 0 年代。1 9 8 5 年，n i c h o l s o n ；f f f 究小组 利用核磁共振烈m r ) 技术分析大鼠的尿液，意识到这可能是生命科学研究的巨大 突破( n i e h o l s o ne ta t ，1 9 8 5 ) ，并于1 9 9 9 年，提出了代谢组学的概念。代谢组指的是” 一个细胞、组织或器官中所有代谢组分的集合，尤其指小分子物质”，而代谢组学 则是- r - j ”在新陈代谢的动态进程中，系统研究代谢产物的变化规律揭示机体生 命活动代谢本质”的科学。 1 3 代谢网络的基本性质 在1 9 6 0 年代，匈牙利数学家艾尔德( r e r d 6 s ) 和莱利( a r 6 n y i ) 提出，用 随机作图理论来分析弼络的拓扑复杂性。他们的这一理论后来成为分析网络的经 典数学方法，被称为“e r 理论”，其研究的网络则被称为“e r 模型”。e r 模型 建立在随机过程上，即一定数量的节点( v e r t i c e s 或n o d e s ) 彼此完全随机地连接 在一起，每个节点具有相同数量的连接。因此，这种模型在统计意义上是一种均 一性网络。 最近几年，随着大量数据的产生和计算机的应用，人们发现在现实世界里真 实的网络与e r 模型相差甚远。这些真实的网络既不是概率为零的绝对规则连接 的网络，也不是概率为i 的完全随机连接的网络，而介于这两者之间。科学家把 这种类型的网络称为。小世界网络”( s m a l l w o r l dn e t w o r k ) 。在小世界网络中， 任意一个节点可以和其相邻的最近的两个节点相连接。研究者发现，线虫( c e l e g a n s ) 的神经网络就是一种典型的小世界网络。 许多自然状态下的网络还表现出一种特别的属性：少数节点的连接数远高于 平均的节点连接数。这类网络被称为“无尺度网络”( m a l e f r e en e t w o r k ) ，属于 高度非均一性的网络它具有真实网络中最常见的两个特性：增长( g r o w t h ) 和 8 中山大学碗士学位论文 偏好连接( p r e f e r e n t i a la t t a c h m e n t ) 第一个特点表明无尺度网络可以不断地扩张 第二个特点则意味着两个节点连接能力的差异可以随着网络的扩张而增大；最初 连接较多的节点可以形成更多的连接，即。富者愈富”研究者利用基因组数据 库，对动物、植物、微生物三大类型中的4 3 种生物体的代谢网络进行了分析， 发现这些代谢网络均遵循着无尺度网络的设计原则。 除了具备以上网络的性质之外，细胞代谢网络还具备鲁棒性、冗余性的特点。 鲁棒性是生物学系统的一个基本的特性。理解生物学鲁棒性背后的机制和规律对 系统层次深入理解生物学有十分重要的意义鲁棒系统的表现出来有三类性质： 1 ) 具备一定的适应性，即系统应对环境变化的能力： 2 ) 参数不敏感性，即系统对某些特定动力学参数有着相对不敏感性： 3 ) 渐近退化性，即系统在损伤( 非灾难性失效) 下，其系统功能特性将缓 慢衰减 在工程系统中，鲁棒性有着广泛的应用或者表现为某种形式的系统控制， 比如负反馈，前馈控制等；或者表现为冗余性，系统中会有多个具有相同功能的 部分，从而起到备份效果l 或者表现为结构稳定性，系统中建造一定的内在机制 以提高稳定性；或者表现为模块性，系统下的各个子系统物理上功能上隔离，这 样一个模块的失效不会扩散蓟其他部分而导致系统范围的灾难。 结构性的鲁棒性和冗余性是相互关联的。一个细胞没有冗余度的话，那么某 个基因发生突变，或者某条代谢路径被中断的话，那么细胞的正常功能就将丧失 所以在细胞中，有很多平行的代谢路径，它们是冗余的。当然代谢系统中的这些 冗余途径或者旁支路径比较难以被直接识别，需要一些理论工具或者试错实验来 理解和验证代谢网络的鲁棒性冗余度与网络的柔性有关，冗余度越大，说明替 代途径多，代谢网络的容错能力越强，抗突变能力也越强 1 4 研究内容与研究意义 1 4 1 研究内容 本研究从关注研究细胞代谢网络的模型出发，评述了过去几十年来在研究代 谢网络的手段，代谢网络模型优化以及代谢网络分析方面的进展，介绍了相关研 究模型的理论依据、优缺点以及应用范围，特别是对代谢平衡分析模型进行了重 7 骆合峰细胞代谢网络模型的优化与分析研究 点阐述。然后，采用最小流量约束优化的方法对其进行优化求解，通过其应用在 酵母细胞上的计算结果，分析代谢网络的相应特征。最后进行总结讨论。 1 4 2 研究意义 开展本研究的意义在于： ( 1 ) 代谢网络系统的研究有利于加深我们对代谢系统的理解。尽管以前我们 积累了很多代谢反应途径的信息，然而却很少明确的了解通过不同途径的代谢通 量分布，以及其如何受到细胞代谢调控的影响。特别是当细胞代谢网络作为一个 整体的时候，如何对于单个酶促反应切断时候的反应。研究还有助于我们理解代 谢网络的结构形态如何受到酶蛋白、转录子甚至是基因的影响，有利于我们探索 新陈代谢与遗传基因相互作用的机理。 ( 2 ) 促进代谢工程等应用技术的发展。代谢网络研究的兴起是因为代谢工程 的需要，反过来，代谢网络分析技术特别是代谢通量分析、代谢控制分析以及其 它研究手段的进步，必然推动代谢工程技术的进步。代谢网络分析是代谢途径修 饰、代谢网络重构等代谢工程的前提和理论基础，所以其对代谢工程等应用技术 发展的推动是根本性的。未来生物工程的主角必然少不了代谢网络分析。 ( 3 ) 代谢网络分析手段必将成为蛋白诊断分析、基因诊断分析等医学，生物 学手段之后的一种全新手段。因为代谢网络分析可以对代谢系统的某些行为进行 预测，可以在一定程度上预测代谢系统病变等，所以它可以像当今最流行的蛋白 ( 酶) 诊断一样，用来分析人体以及其它生物体的生理状态，为治疗提供依据。 ( 4 ) 代谢网络分析作为一种重要的基础性理论工具，在制药和工农业生产上 会越来越扮演重要角色。药物的临床检验是一个漫长的过程，而且实际操作过程 中存在着很大的不可控制因素。如果利用代谢网络分析技术提前进行分析，我们 就可以避免走一些弯路。工业发酵以及农业养殖也将因代谢网络分析技术的进步 而受益。 8 中山大学磺士学位论文 第2 章代谢网络模型 2 1 代谢网络通量分析 代谢通量分析是利用己测得的底物和产物质量变化同构造好的代谢网络，在 质量守恒的原则下通过化学计量手段计算出整个代谢网络的流量分布通常认 为，代谢网络流正常运行时，非分支点中间代谢物满足拟稳态平衡，也就是说， 在计量过程中我们可以只考虑代谢反应网络中分支点的代谢物。 考虑经由k 个途径代谢物进行的1 个胞内反应。其质量平衡方程式为： d c j d 训一p c j ( 2 一1 ) 方程( 2 1 ) 考虑了细胞生长而使得细胞膨胀时的代谢纫组分的稀释。其中c 为 第1 个代谢物的浓度，r 为物质i 的消耗速率若不考虑代谢物的稀释，那么方 程( 2 1 ) 可以用向量模式表示为t 。 d c d t = r = g v ( 2 - 2 ) 式中，c 为代谢物浓度向量，g 为化学计量系数矩阵，v 为代谢物质量流向量 由于在拟稳态下，浓度向量c 看作常数，所以t g v = 0 ( 2 3 ) 通过这样一个质量平衡矩阵方程，我们可以得到整个代谢网络的质量流分 布 代谢通量分析( m f a ) 是代谢途径通量量化的一种重要手段，通过利用主 要胞内反应的化学计量模型及应用围绕代谢物的质量平衡关系，就可以计算出胞 内通量。除了能够获得途径通量量化的作用之外，代谢网络还能够提供其它重要 的细胞生理特征方面的信息。比如t 第一，细胞途径中分支点控制( 节点的刚性) 的识别通过比较不同操作 条件下的不同变异株种的相应分支点的通量分配的变化，可以得出 分支点的刚性和柔性强度，也即其抵抗外界干扰条件的能力 第二，替代途径的识别。代谢网络具备一种冗余性，其中的某些途径具备 可以替代性，通过代谢通量的分析，我们可以找到那些途径是具备 弹性的，是可以替代的。而哪些途径又是唯一不可以替代的。这样 对我们研究细胞进行工业化应用具有重要意义 口 骆合峰细胞代谢网络模型的优化与分析研究 第三，可以计算出未测量的胞外通量。有时候，能被测量的胞外通量数目 小于未知胞内通量的数目。所以可以通过利用化学计量模型和已经 测得的通量来计算这些未知的胞外通量。 第四，可以计算细胞内某些产物的最大理论得率。最大理论得率是指从一 个指定得底物产生最多的产物，据此构造一组代谢网络得化学计量 方程式。 k e m p 等( 19 9 9 ) 从基于元素平衡和焓平衡的方程式 v 6 i c 6 h 1 2 0 6 ( g l c ) + v c l n c s hl 。n z 0 3 ( g l n ) + v 0 0 2 c h o p n r ( c e t t ) + v l c 3 n 6 0 , ( l 咖叱c 0 2 + n h 34 - v h 皿d + ( f 厶，出) ( 2 叫 出发来分析动物细胞的生长过程，提出了如表2 1 所示的模型，用以研究细胞生 长过程中对底物的需求变化。其中，v i 为相应物质的化学计算系数。 表2 1 动物细胞培养的元素和焓平衡分析模型 t a b2 - 1s u m m a r yo f m a s sa n de n t h a l p yb a l a n c ea n a l y s i sm o d e li nt h eg r o w t ho f a n i m a lc e l l 对象平衡形式平衡方程 cb a l a n c e 6 v n4 - 5 v , 22 l + 3 v l + v c t o t a l m e t a b o l i s m 1 2 v 1 + 1 0 v , 2 = a + 6 v l + 3 + 2 hb a l a n c e ob a l a n c e6 k l + 3 吃2 + 2 v d = 多+ 3 v l + 2 v c + nb a l a n c e 2 v , 2 = ，+ h a hb a l a n c e a h = a h d t + v l 姐c h a + v c 蛆赃+ v n 删n + v h 圆h o v ，| 6 圆g l 。一v s 6 圆g h v 0 h 啦 c a t a b o l i s mcb a l a n c e ! o 中山大学硕士学位论文 6 ( v j i ) _ + 5 ( v ，2 ) _ = l + 3 v l + ( 屹) “ hb a l a n c e 1 2 ( v , i ) 日+ 1 0 ( 匕2 ) “= o t + 6 v l + 3 v m + 2 ( y h ) “ ob a l a n c e 6 ( 匕1 ) _ + 3 ( 匕2 ) + 2 v o = p + 3 v l + 2 ( v c ) _ + ( v h ) nb a l a n c e 2 ( 匕2 ) 。= ，+ v a hb a l a n c e a h = 日硎+ 匕a 日c | t t , o ，+ ( v c ) 喇日嘞+ v 日隅 + ( ) 。厶抒一d 一( v j l ) 。a 魄一( 匕2 k a 乇- 一a 日& a n a b o l i s m cb a l a n c e 6 ( ) 。+ 5 ( v j 2 ) 。= l + ( 唯) 。 h b a l 1 2 ( v , 1 ) 棚+ 1 0 ( v j 2 ) 删= 口+ 2 ( ) 删 ob a l a n c e 6 ( 弋l k + 3 ( 叱2 k = ，+ 2 ( ) 。+ “) 删 nb a l a n c e 2 ( 2 ) 一= ， a 日b a l a n c e 蛾兰0 上表中分别描述了整体代谢反应，分解反应以及合成反应中c ( 碳) ，h ( 氢) 0 ( 氧) ，n ( 氮) 元素以及整体元素的平衡表达式 v e n k a t e s h ( 1 9 9 7 ) 建立了s t r e p t o c o c c u sl a c t i s 从乳糖到乳酸的代谢网络模型， 通过代谢系数矩阵模型以及细胞内中间代谢产物质量平衡的方法，并且在模型基 础上分析了不同p h 和不同乳酸盐离子浓度下对细胞代谢通量的影响和影响机 制 骆合峰细胞代谢网络模型的优化与分析研究 g l u c o s eh o s tb l o o d 图2 - ls t r e p t o c o c c u sl a c t i s 代谢通量分析中的乳糖到乳酸代谢网络模型( 仿绘) f i g2 - 1f r o m | a c t o s et ol a c t i ca c i dm e t a b o l i cn e t w o r km o d e li ns t r e p t o c o c c u sl a c t i sm e t a b o l i c f l u xa n a l y s i s a t h e lc o m i s h - b o w d e n ( 2 0 0 2 ) 等研究了t r y p a n o s o m ab r u c e i 的糖酵解途径，建 立代谢模型( 图2 1 ) ，并在此基础上建立代谢平衡的系数矩阵模型如下式 12 中山大学硕士学位论文 ( 2 5 ) k 其中系数矩阵中i - 9 表示代谢途径中不同节点的反应通量，a - k 表示代谢网络中 不同的中间代谢产物。矩阵中非零的位置就代表相应的代谢物在相应节点的代谢 通量贡献 f r e s h t e h 等( 2 0 0 0 ) 利用线性规划的方法研究在不同底物条件下连续培养 s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r 代谢通量的变化，并且分析了不同情况下细胞系统的能量 需求。 n i e l s e n 等( 1 9 9 9 ) 名e 研究c l o s t r i d i u ma c t o b u t y l i c u m 发酵过程中通过酶动力学 的选择信息，同时将丁酸盐的代谢与胞内p h 的变化关联，建立了非线性的限制 条件，并且引入一些边界条件和合并冗余反应来处理系数矩阵的奇异性问题。 高红亮等( 2 0 0 0 ) 在分析杂交瘤细胞的代谢通量分布中应用代谢通量平衡模 型，结果显示在连续培养的细胞中，当葡萄糖和谷氨酰胺的流加浓度为1 8 和2 6 m o l l 的时候8 6 2 的葡萄糖通过糖酵解途径生成乳酸，7 5 生成脂类，仅仅只 有0 8 3 进入t c a 循环。 王健和张克旭等( 2 0 0 3 ) 建立谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m ) 的 代谢网络，并且建立其合成l 色氨酸( l t r y ) 的代谢网络模型如表2 2 所示 代谢网络模型假定细胞处于非生长时期，细胞无膨胀，细胞的浓度变化不考虑l 认为细胞代谢过程中没有乙醛酸循环；n a d p h 供需平衡，胞内长生多余的 n a d p h 。通过模型计算出了代谢通量分布并且通过线性规划的方法得到了t r y 的优化代谢通量分布。 1 皇 j o o o o o o o o o l o i o o 0 o o o o l o o o g o o o o o o i o o o o f 0 o o o o l o o o o o e o o o o l o o o o o o dc o o l o o o o o o o o b o i o o o o o 0 o o o o o o o o o o o o 9 o o o o o o，以l o o 8 o o o o o以，一o o o 7 o o o o o o o l 一 6 o o o oo，一o o o 5 o o o一o o o o o 4 o o 一o o o o o o o 3 o一o o o o o o o o o o一o o o l j d d d 一d o d 骆合峰细胞代谢网络模型的优化与分析研究 表2 - 2 应用代谢通量分析建立的l 色氨酸生物合成的代谢网络模型 t a b2 - 2l - t r y p t o p h a nb i o s y n t h e s i sm e t a b o l i cn e t w o r km o d e lc o n s t r u c t e df o rm e t a b o l i cf l u x a n a l y s i s 反应序号化学计量方程式 r lg l c 十a t p = g i c 6 p 十a d p + h r 2g l c 6 p = f r u 6 p r 3 f r u 6 p + a t p = 2 g a p + a d p r 4 g a p + a d p + n a d = 3 p g + n a d h + a t p r 5 3 p c = p e p 4 - h ，o f 6p e p4 - a d p ；a t p + p v r r 7 p y r + c o a + n a d = a c c o a + c 0 2 + n a d h r 8 g i c 6 p + h ，o4 - 2 n a d p = r i b u 5 p 十c o ，+ 2 n a d p h r 9r i b u 5 p = x v l 5 p r i or i b u 5 p = r i b 5 p r l l x y l 5 p 4 - r i b s p = s e d t p + g a p r 1 2 x y l 5 p + e 4 p = f r u 6 p + g a p r 1 3g a p 4 - s e d 7 p = f n f 6 p + e 4 p r 1 4 a e c o a + o a a 十h ，o + n a d p = a k g + c o a + c 0 2 4 - n a d p h r 1 5nh 3 十a k g 十n a d p h = g l u + h 2 0 + n a d p r 1 6 a k g 十h 2 0 + f a d + 2 n a d + a d p = o a a + f a dh 2 十2 n a d h + c 0 2 4 - a t p r 1 7p e p + c o ，+ g d p = o a a 十g t p r 1 82 p e p * e 4 p + n a d p h + a t p = c h o4 - 3 h p 0 4p + n a d p + a d p r 1 9 c h o 十g l n 十p r p p + s e t = t r y + g 1 u 干p y r 十 r + p p i + h 2 0 + c 0 2 a p r 2 03 p g + n a d + + g l u 十h 0 = s e r + n a d h + 矿+ a k g 十p i r 2 1 s e r 十f f l l = g l y + h 2 0 r 2 2 s e t + a c c o a + h 2 s = c o a s h + a c + c y a r 2 3r i b s p + a t p = p r p p + a m p r 2 4 p r p p4 - a t p + g l n + h ，o + 2 n a d = h i a + a k g + p i + 2 n a d h 十2 r r 2 5 p y r + g l u = a l a + a k c r 2 6g l u 十a t p