（内科学专业论文）血红素氧化酶1在血管内皮细胞延迟预适应中的保护作用.pdf

四川大学临床医学硕十专业学位论文 血红素氧合酶_ 1 在血管内皮细胞延迟 预适应中的保护作用 研究生 毛建斌导师 黄德嘉 摘 要 目的: 通过观察血红素氧合酶- 1 ( h o - 1 ) 在内 皮细胞缺氧/ 复氧延迟预适 应 ( d p c ) 过程中对细胞存活率、 乳酸脱氢酶 ( l d h ) 活性和丙二醛 ( m d a ) 含量的影响， 探讨h o - 1 在d p c 过程中是否具有保护作用，以解决近年来 关于h o - 1 究竟是机体应激反应的标志还是d p c 中的保护蛋白的争议。 方法:体外培养人脐静脉内皮细胞株 ( e c v - 3 0 4 ) ，利用自 制的密闭容器 进行缺氧/ 复氧操作， 分组实验:( 1 )常氧对照组;( 2 ) 单纯缺氧/ 复氧 对照组 ( i r 组) ;( 3 )缺氧/ 复氧预处理对照组 ( d p c 组) ;( 4 ) a 组，单 纯缺氧/ 复氧2 4 小时前加入氯化高铁血红素 ( h e m i n ) l 0 u m o l / 1 ; ( 5 ) b 组，缺氧/ 复氧预处理前加入 h e m i n l o p m o l / 1 ; ( 6 ) c组，缺氧/ 复氧预 处理前加入h e m i n 1 0 v m o l / 1 和原叶琳锌 ( z i n c p r o t o p o r p h y r i n , z n p p 1 0 0 4 m o l / l ; ( 7 ) d 组，缺氧/ 复氧预处理前加入h e m i n 1 0 p m o l / 1 和亚 硝基左旋精氨酸甲 酷 ( n . - n i t r o - l - a r g i n i n e m e t h y l e s t e r , l - n a m e 1 0 m m o l / 1 ; ( 8 ) e 组， 缺氧/ 复氧预处理前加入 h e m i n 1 0 p m o l / l , l - n a m e 1 0 m m o l / l 以及z n p p 1 0 0 p m o l / 1 ; ( 9 ) f 组， 在缺氧/ 复氧预处理前加入h e m i n 1 0 p m o t / 1 ，第二次低氧前半小时加入牛血红蛋白 ( h b ) 5 0 p m o l / 1 。实 验完毕后用台盼蓝排斥法观察细胞生存率，取细胞培养上清液测定 l d h 反映细胞损伤，测定m d a来反映脂质氧化程度，测定胆红素的生成量来 四川人学临床医学硕士专业学位论文 代表h o - 1 的活性，同时用免疫组化染色来观察h o - 1 在内皮细胞浆中的 表达。 结果: 单纯缺氧/ 再复氧对内皮细胞具有明显的损伤，内皮细胞存活率明 显降低，l d h活性明显升高，m d a生成增多。与 i r 组相比d p c 组内皮细 胞存活率明显升高 ( p 0. 0 0 1 ) , l d h 释放减少( p = 0 . 0 0 1 ) , m d a 生成降低 ( 坏0 . 0 0 1 ) , h o - 1 的活性明显增加( p =0 . 0 1 5 ) 。在b 组用h e m i n 诱导后 与 i l? 组相比内皮细胞存活率增加( 坏0 . 0 0 1 ) , l d h释放减少恤 0 . 0 5 ) , m d a 生成降低( p =0 . 0 1 ) 。 在 c 组加入 z n p p 后内皮细胞存活率较 d p c 组、 a 组和b 组均有降低，仍然高于 i r 组 ( 坏0 . 0 5 ) ，同样的l d h 的活性在 c 组有升高，但仍低于 i r组 勺 1=0 . 0 4 7 ) , m d a的生成有所增加，但仍少 于i r 组 ( 厂0 . 0 2 5 ) 。在 d 组，加入l - n a m e 后内皮细胞存活率为7 4 . 9 5 士1 . 4 8 % ， 低于d p c 组、 a 组和b 组，但较 i r 组 ( 6 0 . 8 6 士2 . 0 5 % ) 相比p =0 . 0 0 2 具有统计学意义。l d h的活性在d 组有所升高，但与 工 r 组相比 p 0 . 0 5 ) 。在f 组加入h b 后内皮细胞的存活率、 l d h 的释放和m d a的生成与i r 组相比均有显著差异( p ( 0 . 0 5 ) 。在所有实 验组中 h o - 1的活性改变与细胞存活率呈正相关 ( 相关系数 r =0 . 4 5 ) , 与内皮细胞内l d h 的释放呈负相关 ( r =- 0 . 4 5 ) ， 与m d a 的生成量呈负相 关 ( r = - o . 3 8 ) 。 利用免疫组化染色可见h o - 1 染色为胞浆黄染颗粒， 常 氧对照组几乎没有染色， 在d p c 组、 a 组、 b 组以及f 组内皮细胞胞浆内 均有较多较浓的黄染颗粒， 而在c 组、 d 组染色较弱， e 组则几乎未见胞 浆黄染颗粒。 结论:利用内 皮细胞培养模型能够成功地模拟d p c 保护效应;在。 p c 过 四川大学临床医学硕士专业学位论文 程中 h o - 1参与了其中的调节并具有保护作用;作为一种内源性保护蛋 白， h o - 1 在 d p c 过程中的保护作用可能是部分通过 i n o s / n o 通路来实现 的， 同时11 0 - 1 裂解血红素的代谢产物胆红素的抗氧化应激损伤作用也在 其中起到了重要作用。 关键词:血红素氧合酶 内皮细胞 延迟预适应 四川大学临床医学硕士专业学位论文 h e m e o x y g e n a s e - i p r o t e c t s e n d o t h e l i a l c e l l a g a i n s t i s c h e mi a a n d r e p e r f u s i o n i n j u r y d u r i n g d e l a y e d p r e c o n d i t i o n i n g p o s t g r a d u a t e : di r e c t o r : m a o j i a n - b i n p r o f e s s o r h u a n g d e - j i a ab s t r a c t o b j e c t i v e : i n o r d e r t o c l a r i f y t h e c o n t r o v e r s y w h e t h e r h e m e o x y g e n a s e - 1 ( h o - 1 ) i s a p r o t e c t iv e p r o t e i n d u r i n g t h e . d e l a y e d p r e c o n d i t i o n i n g ( d p c ) o r n o t , w e i n v e s t i g a t e d t h e i n fl u e n c e o f h o - 1 o n c e l l v i a b i l i t y , t h e a c t i v i t i e s o f l a c t a t e d e h y d r o g e n as e ( l d h ) a n d m a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) d u r i n g d p c . me t h o d s : e c v - 3 0 4 h u ma n u m b i l i c a l e n d o t h e l i a l c e l l s i n c u b a t e d i n v i t r o , a n d t h e n t h e s t u d y w a s p e r f o n n e d a c c o r d i n g t o d i f f e r e n t g r o u p s : ( 1 ) n o n n o x i a ; ( 2 ) h y p o x i a / r e o x y g e n a t i o n a l o n e ( g r o u p i r ) ; ( 3 ) p r e c o n d i t i o n i n g w i t h h y p o x i a / r e o x y g e n a t i o n ( g r o u p d p c ) ; ( 4 ) t r e a t e d w it h h e m i n ( 1 0 ax m o l/ 1 ) 2 4 h o u r s b e f o r e l o n g h y p o x i a ( g r o u p a ) ; ( 5 ) t r e a t e d w i t h h e m i n ( 1 0 t i m o l/ 1 ) b e f o r e p r e c o n d i t i o n i n g ( g r o u p b ) ; ( 6 ) t r e a t e d w i t h h e m i n ( 1 0 u m o l / 1) a n d z i n c p r o t o p o r p h y r i n ( z n p p 1 0 0 tr m o l / i ) b e f o r e p r e c o n d i t i o n i n g ( g r o u p c ) ; ( 7 ) t r e a t e d w i t h h e m i n ( 1 0 a m o l / 1 ) a n d n。 - n it r o - l - a r g i n i n e m e t h y l e s t e r ( l - n a m e 1 0 m m o l/ 1 ) b e f o r e p r e c o n d i t i o n i n g ( g r o u p d ) ; ( 8 ) tr e a t e d w i t h h e m i n ( 1 0 u m o l / 1 ) , z n p p ( 1 0 0 a . m o t/ 1 ) a n d l - n a me ( 1 0 m mo l / 1 ) b e f o r e 四川大学临床医学硕士专业学位论文 p r e c o n d i t i o n i n g ( g r o u p e ) ; ( 9 ) t r e a t e d w i t h h e m i n ( 1 0 rl m o l/ 1) b e f o r e p r e c o n d i t i o n i n g a n d t r e a t e d w i t h h b ( 5 0 u m o l / 1) h a l f a n h o u r b e f o r e s e c o n d h y p o x i a / r e o x y g e n a t i o n ( g r o u p f ) . c e l l v i a b i l i t y w a s e v a l u a t e d b y t r y p a n b l u e e x c l u s i o n . l d h a n d md a w e r e d e t e c t e d . b i li m b i n w a s d e t e c t e d t o s u g g e s t t h e a c t i v it y o f h o - 1 . i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y s t a i n w a s u s e d r e s u l t s : t h i s s t u d y s u g g e s t e d u s t h a t h y p o x i a / r e o x y g e n a t i o n c o u ld d e c r e a s e c e l l v i a b i l i t y a n d i n c r e a s e l d h , md a l e v e l s . t h e c e l l v i a b i l i t y i n g r o u p d p c w a s s i g n i f i c a n t ly h i g h e r t h a n t h a t in g r o u p i r , p 0 .0 0 1 . l d h a n d md a l e v e l s i n t h i s g r o u p d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y , p 0 .0 5 . t h e s a m e p h e n o m e n o n w e c o u l d s e e i n g r o u p a . t h i s p r o t e c t i v e f u n c t i o n c o u l d b e k e p t a w a y p a rt l y w h e n w e a d d e d z n p p ( g r o u p c ) o r l - n a me ( g r o u p d ) . wh e n w e p r e c o n d i t i o n e d w i t h z n p p a n d l - n a me ( g r o u p e ) , t h i s p r o t e c t iv e f u n c t i o n d i s a p p e a r . wh i l e a d d e d h b b e f o r e s e c o n d h y p o x i a / r e o x y g e n a t i o n , t h i s p r o t e c t iv e f u n c t i o n c o u l d b e h e l d u p . i n t h i s s t u d y w e a l s o o b s e r v e d t h a t t h e a c t i v i t y o f h o - 1 md a ( r - - 0 . 3 8 ) . w a s r e l a t e d t o c e l l a c t i v i t y ( r- -0.4 5 ) , l d h ( r - - 0 . 4 5 ) a n d c o n c l u s i o n : t h e s e r e s u l t s d e mo n s t r a t e t h a t h o - 1 i s a p r o t e c t i v e p r o t e i n d u r i n g t h e d e l a y e d p r e c o n d i t i o n in g o f e n d o t h e l i a l c e l l . t h e p r o t e c t i v e f u n c t i o n o f h o - 1 i s m o d u l a t e d p a r t l y b y i n o s / n o s y s t e m . t h e a n t i o x i d a n t f u n c t i o n o f b i l i m b i n , p r o d u c t o f h e m e c a t a b o l i s m , c o n t r i b u t t o t h is p r o t e c t i v e 几n c t i o n . k e y wo r d s : h e m e o x y g e n a s e , e n d o t h e l i a l c e l l , d e l a y e d p r e c o n d i t i o n i n g 四川大学临床医学硕士专业学位论文 前 言 心肌拥有的内源性抗损伤作用是在生物进化过程中形成的一种机体 自 我 保护 机 制， 缺 血预 处 理( i s c h e m i c p r e c o n d it i o n in g , i p ) 就 是 这 样 一 种 机制，它是指心肌经过一次或几次短暂缺血后，对随后较长时间的缺血 损伤耐受性增强，表现为灌注后心肌梗死面积缩小川 。随后的研究证实 缺血预处理表现为早期心肌保护( 发生于缺血后数分钟， 持续 2 -3 小时) 和延迟保护 ( 明显出现于缺血后 1 2 2 4 小时， 持续3 -4 天) 两个阶段。 与早期 预适 应不同， 延 迟预适 应( d e l a y e d p r e c o n t i o n i n g , d p c ) 不仅能 缩 小心 肌梗塞的 面积， 而且具有抗心肌顿抑作用2 1 。 由 于d p c的 这一特性， 并巨 持续时间长，因此近年来对它的病理生理机制的研究越来越广泛深 入 。 血管内皮细胞作为血液与组织之间的保护屏漳，经常受到缺血缺氧 的影响，它的功能的完整对维持和保护脏器实质细胞功能的正常运转具 有至关重要的作用，因此内皮细胞缺血预适应的保护作用对于机体组织 抵抗缺血再灌注损伤意义重大。 血红素氧合酶( h e m e o x y g e n a s e , h o ) 是血红素降解的 起始酶和限 速 酶。 在体内脉管系统中共有两种 h o同功酶表达，其中 h o - 1( 分子量 3 2 ,0 0 0 d a ) 具有可诱导性，是一 种应激蛋白，多 种细胞损伤因子均会诱 导其表达， 发挥抗氧化应激作用3 1 。 有证据表明h o - 1 也是一种热休克蛋 白( h e a t s h o c k p r o t e i n , h s p ) ， 又称h s p 3 2 , h o - 1 的生物学及生理特性 与h s p 7 。 有许多相似之处 。 有资料表明d p c对机体组织的保护作用与 内 源性蛋白的合成增强具有因果关系i . h s p是体内的 一种重要的内 源 性保护蛋白， 研究报道热休克预处理在引起h s p 7 0 表达上调的同时亦导 致 h o - 1表达上调，且热休克对大鼠心肌线粒体呼吸功能的保护作用与 四川大学临床医学硕士专业学位论文 这两种应激蛋白 都有关系 。有资料表明 短暂缺血预处理对心肌的保护 作用可能与分布于冠状动脉内 皮细胞的h o - 1 的活性增加有关6 . 7 . 9 , 9 1 目 前比较公认的是h o - 1 在对抗缺血再灌注损伤过程中起到了保护作 用 1 o ， 但是正如h s p 一样， 对于它在i p 延迟保护中的作用则争议颇多， 某些学者甚至还推测它可能仅仅是机体应激反应的标志，而并非是d p c 中的保护蛋白 d u 。因此研究h o - 1 在缺血预处理晚期究竟有无保护作用 对于解决这一争议具有重要的意义， 同时也能够丰富d p c内源性保护蛋 白的研究内容， 有助于我们对d p c作用机制的进一步全面理解。 基于此， 本实验利用内皮细胞培养模型， 通过h o - 1 的作用底物来诱导h o - 1 的表 达， 观察h o - 1 在i p延迟预适应中是否具有保护作用， 并对h o - 1 在d p c 中的作用机制进行了初步的探讨。 材料和方法 一、实验材料 1 、 主要试剂: 氯化高铁血红素( h e m i n ， 美国s i g m a 公司) ， 原叶 琳 锌 ( p r o t o p o r p h y r i n i x z i n c , z n p p - i x ， 美国s i g m a 公司) ， 亚硝基左旋 精 氨酸甲 醋 n ., - n i t r o - l - a r g i n in e m e t h y l e s t e r , l - n a m e ， 美国s i g m a 公司) ， 兔抗人 h o - 1 多克隆抗体 ( 武汉博士德生物工程有限公司) ，md a试剂 盒 ( 南京建成生物工程研究所) ，牛血红蛋白 ( 北京邦定泰克) 2 、主要仪器:c o : 培养箱 ( 美国s h e l l a b 2 3 0 0 型) ，超净工作台， 倒置相差显微镜 日本o l y mp u s b h i 型) ， 7 2 1 分光光度计 ( 上海第三 分析仪器厂) ，超速离心机 ( 美国b e c k m a n l b m型) ，全自 动生化仪 3 、实验细胞:采用 e c v - 3 0 4人脐静脉内皮细胞株 ( 由四川大学华 西医院内科实验室提供) 四川大学临床医学硕士专业学位论文 二、实验方法 1 , e c v - 3 0 4内皮细胞株的培养 细胞的复苏: 将冻存于液氮中的 e c v - 3 0 4细胞株安培取出，迅 速置于3 7 4 0 水浴中，使其在 1 分钟内融化，无菌打开安培，将细胞 悬液吸取到离心管内，加入含 1 0 %小牛血清的d me m培养液至 l o m l , 离心 1 0 0 0 转/ 分)1 0 分钟;去上清，用适量培养液稀释后装入培养瓶， 置于3 7 0c , c 0 2 孵箱培养，次日 更换一次培养液 细胞的传代: 待细胞长成单层， 平铺瓶底后吸取上清夜， 用p b s 洗涤细胞;再用0 .2 5 % 胰蛋白酶/ 0 .0 2 0/ e d t a消化细胞，适时终止消化， 充分吹打，制成单细胞悬液;以一瓶传两瓶或三瓶的方式分装，置于3 7 ，c 0 2 孵箱培养。 2 、缺氧/ 再复氧延迟预处理模型的制备 待细胞数量达实验所需时， 按5 x 1 0 5 / 孔的 细胞数接种于1 2 孔培 养板，用于免疫组化染色的按 1 .0 x 1 0 6 / 孔的细胞数接底置有 2 4 n im x 2 4 m m盖玻片的6 孔培养板中， 加入含 1 0 % d me m培养液， 3 7 0c, 供以 常 氧 气体 ( 9 5 % 空气， 5 % c o 2 ) ， 常规 培养 1 2 小时; 待细胞 贴壁 后 换用 无 血 清的d m e m液 ( g l u 4 5 0 0 m 岁 d l ) ， 培养2 4 小时， 使细胞生 长 同步于g o 期。 实验开始前半小时，换用低糖型 d me m 培养液 ( g l u 1 0 0 0 m g / d l ) ，再将培养板置于自 制密闭容器中改供低氧气体 ( 9 4 % n 2 , 5 0%0 2 ， 和1 %0 2 , p 0 2 = 7 m n 1 h g ) ， 持续1 小时 ( 第一次低氧) 。 改 供常氧， 培养液换用高糖型d m e m液 ( g l u 4 5 0 0 m g / d l ) ( 第 一 次复氧) 2 4 小时后再重复第一次低氧操作， 持续3 小时 第二次低氧) 。 改供常氧气体 1 小时 ( 第二次复氧) 四川大学临床医学y l ll 士专业学位论文 取上清夜进行l d h , md a 、 胆红素活性的测定， 然后进行苔盼 蓝染色，计算细胞存活率;6 孔培养板经上述处理后送病理科进行h o - 1 免疫组化染色，观察h o - 1 的表达。 3 、实验分组 本实验共分9 组，用于生化指标测定的 1 2 孔培养板每组4 孔;用 于免疫组化染色的6 孔培养板每组2 孔。具体分组如下: 常氧对照组:实验开始后 d m e m培养液与实验组同 步培养 量生化指标。 不给予任何干预措施，仅以无血清的 ， 待实验完毕后与实验组同时取标本测 单纯缺氧/ 复氧对照组 ( i r组) :该组不进行第一次低氧操作，直接 经历长达3 小时低氧后改供常氧气体1 小时，然后进行步骤的操作。 缺氧/ 复氧预处理对照组( d p c 组) : 不加入任何试剂， 按照步骤 步骤的顺序进行操作。 a组: 该组同i p组一样不经历第一次低氧操作， 但进行 3 小时低氧 操作前2 4 小时加入h e m i n 1 0 11 m o l / l a b组:该组按照步骤一步骤的顺序进行操作，在第一次低氧前 半小时 加入h e m i n 1 0 1 1 m o l / l o c组:该组按照步骤一步骤的顺序进行操作，在第一次低氧前 半小时加入 h e m i n 1 0 1 1 m6 1 / l 和 z n p p 1 0 0 u mo l / l a d组:该组按照步骤一步骤的顺序进行操作，在第一次低氧前 半小时加入h e m i n 1 0 11 m o l / l 和 l - n a me 1 0 m m o l / 1 a e组:按照步骤一步骤的顺序进行操作，在第一次低氧前半小 时加入 h e mi n 1 0 u m o l l , l - n a me 1 0 m m o l / 1 以及 z n p p 1 0 0 11 m o l / l o f组: 半小时加入 该组按照步骤一步骤的顺序进行操作，在第一次低氧前 h e mi n 1 0 1 1 m o l l ，第二次低氧前半小时加入牛血红蛋白 5 0 四川大学临床医学硕士专业学位论文 u mo l / l o 三、实验指标的测定 1 、内皮细胞生存率测定: 实验完毕后，以 0 .0 5 % 胰蛋白酶/ 0 .0 2 e d t a 消化分离贴壁的内皮细 胞，制成单细胞悬液，以0 .4 % 苔盼蓝 1 : 9 染色，显微镜下计数。死亡的 细胞蓝染，存活的细胞不染色，按照公式计算内皮细胞存活率。 公式: 内皮细胞存活率 =( 细胞总数一蓝染细胞数) / 细胞总数x 1 0 0 % 2 , h o - 1 活性的测定: 按t u r c a n u 的方法p 2 测定胆红素生成量来表示h o - 1 的活性。 具体方 法如下: 实 验完毕 后取上清培 养液。 . 5 m l ， 加 入2 5 0 m g b a c 1 2 2 h 2 0 , 旋 涡混匀器混匀( 1 0 -1 5 秒) ; 然后加入苯0 .7 5 m l ， 用力摇匀( 5 0 - - 6 0 秒) ， 形成乳白 色状乳剂; 离心 ( 1 3 0 0 0 g ) 3 0 分钟， 小心吸取上层苯溶液，以 空白苯溶液为对照， 利用分光光度仪， 在4 5 0 n m处测定吸光度。 利用胆 红素溶解于苯中的消退系数 4 5 0 = 2 7 3 m m o l/ c m， 按照b e e r 定律来计算 胆红素的生成量。 b e e r 定律:按照a=e b c 公式，通过公式变换为 c =a / c b , 其中a为吸光度， b 为液层厚度( 单位。 m ) , c 为被测物质浓度，e 为摩 尔吸光系数。 3 、丙二醛 ( md a )活性的测定: 按照md a测定试剂盒说明书的要求，实验完毕后取上清液0 . 1 m l , 配置成标准管、标准空白管、测定管和测定空白管，然后在5 3 2 n m处， 1 c m光孔径， 蒸馏水调零， 比色测定各管的吸光度值， 按公式计算md a 含量。 m d a含量( n m o l / m l ) = 测定管吸光度一 测定空白 管吸光度) / 标 准管吸光度一标准空白 管吸光度)x1 0 四川大学临床医学硕士专业学位论文 4 、乳酸脱氢酶 ( l d h)活性的测定: 实验完毕后取上清夜 0 . 1 m l ，送四川大学华西医院检验科，用全自 动生化仪测定 l d h活性。 5 、免疫组化染色: 实验完毕后，将底部覆盖有盖玻片的 6孔培养板送四川大学华西医 院病理科进行免疫组化染色，其染色流程如下: 丙酮固定 将适量的 p b s 液反复洗涤 2 次 ( 每次 5 分钟) ; 中放置 5 分钟 0 . 1 % t ri t o n - x - 1 0 0 1 0 . 1 % 柠檬酸三钠加入孔板，置于冰箱 p b s液洗涤 2 次 ( 每次 5 分钟) ; 3 % 过氧化氢处理， 置于室温 1 0 分钟， p b s液洗涤2次 ( 每次5 分钟) ; .3 % 羊血清处理，3 7 0c , 2 0 分钟 ; 用滤纸吸去血清 ( 不洗! ) ，直接滴兔抗人 h o - 1抗体，3 7 0c，6 0 分钟， 4 过夜， 然后p b s 液洗涤2 次 ( 每次5 分钟) ; 滴加 1 :2 0 0 b i o t i n 一 羊抗兔第二抗体， 3 7 0c , 3 0 分钟， p b s 液洗涤 2 次 ( 每次5 分钟) ; 滴加s t r e p t o a v i d i n ( 1 :2 0 0 ) , 3 7 0c ， 3 0 分钟 ， p b s 液洗涤2 次; 显色，自来水充分冲洗， 苏木素复染 ( 约 4 -5 分钟) ， 反复冲洗; 显微镜下观察摄片。 四、统计学处理:一 实验数据以均数士标准差 (x 士s)表示，用s p s s 进行统计分析，多组样本均数比较采用单因素方差分析 1 0 . 0 统计软件 组间比较采用 4 检验，以p 0 . 0 5 为有显著性差异，相关分析采用p e a r s o n 相关分析方 法。 四川大学临床医学硕士专业学位论文 结论 尽管利用e c v - 3 0 4 脐静脉内皮细胞培养模型有一定的局限性， 然而 通过本实验研究仍然可以说明内皮细胞存在1 p 延迟预适应保护效应， 在 这一复杂的调节过程中， h o - 1 / c o通路参与了其中的调节，h o - 1在此 过程中并非只是炎性反应的标志，而是作为一种内源性保护蛋白参与了 内皮细胞的d p c保护作用。 h o - 1 的这种保护作用部分是通过c o与n o 相互作用来实现的，同时其生成产物胆绿素和胆红素的抗氧化应激损伤 也发挥了重要的作用。另外，利用h o - 1 的底物h e m in 可以诱导出内皮 细胞延迟预适应现象，这就丰富了药物预适应研究领域的内容，为临床 开发使用新的药物来诱导d p c作用提供了新的思路。 四川大学临床医学硕士专业学位论文 参考文献 mu r r y c e , j e n n i n g s r b , r e i m e r k a . p r e c o n d i t i o n in g w i t h i s c h e m i a a d e l a y o f l e t h a l c e l l i n j u ry i n i s c h e m i c m y o c a r d i u m . c i r c u l a t i o n . 1 9 8 6 , 7 4 ( 5 ) : 1 1 2 4 - - 1 1 3 6 s u n j z , t a n g x l , k n o w l t o n a a , e t a l . l a t e p r e c o n d i t i o n in g a g a i n s t m y o c a r d i a l s t u n n i n g : a n e n d o g e n o u s p r o t e c t i v e m e c h a n i s m t h a t c o n f e r s r e s i s t a n c e t o p o s t i s c h e m i c d y s f u n c t i o n 2 4 h a f t e r b r i e f i s c h e m i a i n c o n s c i o u s p i g s . j c l in i n v e s t , 1 9 9 5 , 9 5 ( 1 ) : 3 8 8- 4 0 3 ma r k s g s , b r e i n j f , n a k a t s u k . e t a l . d o e s c a r b o n mo n o x i d e h a v e a p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n ? 1 8 8 p h a r m a c o l s c i , 1 9 9 1 , 1 2 ( 5 ) : 1 8 5 一 b o mma n l , s t e i n ma n n c , g e r i c k e g s , e t a l . i n v i v o h e a t s h o c k ， p r o t e c t s r a t m y o c a r d i a l m i t o c h o n d r i a . b i o c h e m b i o p h y s r e s c o m m u n , 1 9 9 8 , 2 4 6 ( 3 ) : 8 3 6 8 4 0 r i z v i a , t a n g x l , q i u y , e t a l . i n c r e a s e d p r o t e in s y n t h e s i s i s n e c e s s a r y f o r t h e d e v e l o p m e n t o f la t e p r e c o n d it i o n i n g a g a i n s t m y o c a r d i a l s t u n n i n g . a m j p h y s i o l , 1 9 9 9 , 2 7 7 ( 3 p t 2 ) : 8 7 4 8 8 4 b e n j a m i n i j , mc mi l l a n d r . s t r e s s ( h e a t s h o c k ) p r o t e i n s mo l e c u l a r c h a p e r o n e s i n c a r d i o v a s c u l a r b i o l o g y a n d d i s e a s e . c i r c r e s , 1 9 9 8 , 8 3 ( 2 ) : 1 1 7 -1 3 2 h a n g a i s h i m, i s h i z a k a n , a i z a w a t , e t a l . i n d u c t i o n o f h e m e o x y g e n a s e - 1 c a n a c t p r o t e c t i v e l y a g a i n s t c a r d i a c i s c h e m i a / r e p e r f u s i o n i n v i v o . b i o c h e m a n d b i o p h y r e s c o m m u n , 2 0 0 0 ,2 7 9 ( 2 ) : 5 8 2 5 8 8 四川大学临床医学硕十专业学位论文 8 . i n d u c t i o n o f h a e m o x y g e n a s e g e n e e x p r e s s i o n d u r i n g t h e r e p e r f u s i o n o f i s c h e m i c r a t my o c a r d i u m. j mo l c e l l c a r d i o l , 1 9 9 6 , 2 8 : 1 2 6 1 一 1 2 7 0 9 . e n h a n c e d e x p r e s s i o n a n d l o c a l i z a t i o n o f h e m e o x y g e n a s e - 1 d u r i n g r e c o v e ry p h a s e o f p o c i n e s t u n n e d m y o c a r d i u m . mo l c e l l b i o c h e m , 1 9 9 9 , 1 9 6 : 1 3 3 一1 3 9 1 0 .何洁，张敏，刘俊倡，等， 血红素氧化酶- 1 在离体心肌缺血预处 理中的作用. 中国病理生理杂志， 2 0 0 1 , 1 7 ( 1 0 ) 9 3 2 9 3 4 1 1 . b o l l i r . t h e l a t e p h a s e o f p r e c o n d i t i o n i n g . c i r c r e s , 2 0 0 0 , 8 7 ( 1 1 ) : 9 7 2. 9 8 3 1 2 . t u r c a n u v , d h o u i b m, p o i n d r o n p . d e t e r m i n a t i o n o f h e m e o x y g e n a s e a c t i v i t y i n m u r i n e m a c r o p h a g e s f o r s t u d y i n g o x i d a t i v e s t r e s s i n h i b i t o r s . a n a l b i o c h e m, 1 9 9 8 , 2 6 3 : 2 5 1 -2 5 3 1 3 . g r a v e n k k , f a r b e r h w. e n d o t h e l i a l c e l l h y p o x i c s t r e s s p r o t e i n s . j l a b c l i n me 氏1 9 9 8 , 1 3 2 ( 6 ) : 4 5 6 x - - 4 6 3 1 4 . s o b e y c g , wo o d m a n o l . my o c a r d i a l i s c h e m i a : w h a t h a p p e n s t o t h e c o r o n a r y a r te r i e s ? t r e n d s p h a r m a c o l s c i , 1 9 9 3 , 1 4 ( 1 2 ) : 4 4 8 4 5 3 巧.周伏文，李元建. 缺血预适应的血管内皮保护作用及机制. 中国 动脉硬化杂志，1 9 9 9 , 7 ( 4 ) : 3 6 6 3 6 9 1 6 . d e f i l y d v , c h i l i a n w m. p r e c o n d i t i o n i n g p r o t e c t s c o r o n a ry a r t e r i o l a r e n d o t h e l i u m f r o m i s c h e m i a - r e p e r f u s i o n i n j u ry . a m j p h y s i o l , 1 9 9 3 , 2 6 5 ( 2 p t 2 ) : h 7 0 0 -h 7 0 6 1 7 . r i c h a r d v , k a e f f e r n , t r o n c , e t a l . i s c h e m i c p r e c o n d i t i o n i n g p r o t e c t s a g a i n s t c o r o n a r y e n d o t h e l i a l d y s f u n c t i o n i n d u c e d b y i s c h e mi a a n d r e p e r f u s i o n . c i r , 1 9 9 4 , 8 9 ( 3 ) : 1 2 5 4 1 2 6 1 四川大学临床医学硕士专业学位论文 1 8 . l o k e k e , wo o d m a n o l . e f f e c t o f i s c h e m i c p r e c o n d i t i o n i n g o n v a s c u l a r d y s f u n c t i o n i n d u c e d b y i s c h e m i a a n d r e p e r f u s i o n i n r a t h i n d q u a rt e r s . c a r d i o v as r e s , 1 9 9 6 , 3 2 ( 1 6 ) : 1 0 8 1 - 1 0 8 7 1 9 . z h o u f 4 ， l i y j , d e n g h v l . me d i a t i o n o f c a l c i t o n i n g e n e - r e l a t e d p e p t i d e i n p r o t e c t i o n o f i s c h e m i c p r e c o n d i t i o n i n g i n r a t h i n d l i m b s . a c t a p h a r m a c o l s i n , 1 9 9 8 , 1 9 : 4 7 7 -4 8 0 2 0 . z h o u x b , z h a i x l , a s h r a f m. p r e c o n d i t i o n i n g o f b o v i n e e n d o t h e l i a l c e l l s : t h e p r o t e c t i v e e f f e c t i s m e d i a t e d b y a n a d e n o s i n e a z r e c e p t o r t h r o u g h a p r o t e i n k i n a s e c s