（内科学专业论文）狼疮性肾炎易感基因在小鼠模型中的定位及筛选.pdf

删舢 y18 。, , i i l 4 i i i i r4l i t l l l 17lllln 7 i i iiil7i i i l l 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的 研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标 注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责 任。 论文作者签名：递丛日期：之丑：= = 如论文作者签名：甏蛩圣日期：之丑：如 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即： 研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大 学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署 名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦 署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以 公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、 缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名：径： 指导教师签名： 32s 日 期：皂丝2 ：f 肋 目录 一、摘要 1 、中文论著摘要1 2 、英文论著摘要5 二、 英文缩略语1 1 三、论文 论文一新西兰黑鼠狼疮肾炎易感基因的染色体定位研究 l 、前言1 2 2 、材料与方法1 3 3 、结果1 6 4 、讨论2 0 5 、结论2 3 论文二新西兰鼠s l e 候选基因结构区突变位点的筛选 1 、前言2 4 2 、材料与方法2 5 3 、结果3 3 4 、讨论3 6 5 、结论3 9 论文三新西兰黑鼠突变基因与狼疮性肾炎的相关关系研究 l 、前言4 0 2 、材料与方法4 l 3 、结果4 3 4 、讨论4 5 5 、结论4 9 四、本研究创新性的自我评价5 l 五、参考文献5 2 六、附录 1 、综述5 9 l ，j 6 7 7 7 7 绩 历 成 简 研谢人 科致个 ， ， ， 2 o j 4 中文论著摘要 狼疮性肾炎易感基因在小鼠模型中的定位及筛选 目的 系统性红斑狼疮( s y s t e m i cl u p u se r y t h e m a t o s u s ，s l e ) 是一种多基因相关的自 身免疫性疾病，其肾脏损害一狼疮性肾炎( l u p u sn e p h r i t i s ，l n ) 为经典的免疫 复合物性肾病，发病机制复杂，是多个基因与各种环境因素相互作用的累加结果。 就个体而言，任何单个基因均不具有决定性意义，不同的遗传背景及环境暴露因 素决定了个体的不同临床表型。同时就群体而言，单个易感位点的外显率很低或 呈现不完全外显，不同的家系因具有不同的基因组合，而表现出不同的s l e 发病 过程，即有或没有l n 。 从遗传学角度来看，长期的进化和社会文明的发展使人类成为一种高度杂和 性物种，具有很高的遗传变异性。同时由于缺乏对易感基因的自然选择过程，使 各种易感基因遍布于普通人群中。而且因为伦理的原因人类环境暴露因素、遗传 差异无法控制，如果直接进行易感基因定位，要达到理想的灵敏度及特异性，往 往需要采集大量家系或几百对同胞对d n a 标本。在实际研究中要获得如此庞大 的均质病例十分困难。鼠与人类基因具有高度同源性和同线性，小鼠模型中的研 究结果可直接用于人类相同或相关基因的研究。 本研究通过建立( n z b n z w ) f 1 n z w 小鼠模型，以尿蛋白为狼疮性肾 炎表现进行全基因组扫描。首先确定n z b ( n e wz e a l a n db l a c k ，n z b ) 鼠的狼疮 肾炎易感基因在染色体上的位置。然后利用基因组计划已取得的成果，绕过繁琐 的叠连群c d n a 杂交过程，直接对易感区域内已克隆的基因测序，鉴定出n z b 与n z w ( n e wz e a l a n dw h i t e ，n z w ) 之间存在差异的基因。最后利用单链构象 多态性( s i n g l e - s t r a n dc o m f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ，s s c p ) 电泳技术分析这些突 变基因与狼疮小鼠蛋白尿的相关关系，以探讨l n 易感基因在小鼠模型中的意义。 材料与方法 第一部分：选择( n z b x n z w ) f 1x n z w 雌性回交鼠2 2 0 只，从4 月龄开 始每2 周测定1 次尿蛋白，以监测肾脏损伤情况，尿蛋白大于1 1 l m g d l 为阳性标 准。为便于数量性状位点( q t l ) 分析，肾脏受累程度依尿蛋白浓度分6 级：0 级 ；一7 4 m g d l ，3 级1 1 l m g d l ，4 级 7 3 3 3 m g d l , 5 级 1 0 0 0 m g d l ，6 级 7 3 0 0 0 m g d l 。以酚氯仿法提取鼠尾基因组d n a 标本，选 定合适的可覆盖小鼠全部1 9 条染色体的微卫星遗传标记进行d n a 样本的p c r 扩增，根据微卫星d n a 片段的长度多态性确定回交鼠的基因型。将全部小鼠的 狼疮性肾炎表现型数据和基因型数据录入m a p m a k e p q t l 及 m a p m a n a g e r q t l 分析软件包，进行基因组扫描以确定n z b 来源的狼疮肾易 感基因染色体定位。以l o d 值 1 3 3 为表型与遗传标记间具有显著连锁关系。根 据上述连锁分析的结果，将小鼠按不同基因型分组，观察各组间蛋白尿的时间累 积发生率，确定不同易感位点的相互关系。组间比较采用x2 检验，p 7 ) 。( 2 ) 根据易感位点基因 型的不同，分别将入选小鼠分为纯合子( w w ) 及杂合子( b w ) 两组进行比较， 即d 4 m i t 7 1 ( b 侧) 与d 4 m i t 7 1 ( w 脚) 比较，d 1 7 m i t 2 2 ( b 侧) 与d 1 7 m i t 2 2 ( w w ) 比较，发现无论是d 4 m i t 7 1 还是d 1 7 m i t 2 2 位点，b w 的尿蛋白累积阳 性率均大于w 刖型( p 0 0 0 5 ) 。提示( n z b n z w ) f ix n z w 回交鼠的狼疮 肾炎易感基因来源于n z b 。( 3 ) 将全部小鼠按基因型分为4 组，即d 4 b w d 1 7 b w 、 d 4 b w d 1 7 w w 、d 4 w w d 1 7 b w 、d 4 w w d 1 7 w w ，分别进行两两组间尿蛋白累 积阳性率的比较。结果显示d 4 b w d 1 7 b w 小鼠尿蛋白阳性率大于其它三组( p 0 0 0 5 ) ，d 4 w w d 1 7 w w 尿蛋白阳性率小于其它三组( p 0 0 5 ) ，但大于 d 4 w w d 1 7 w w 组( p o 0 5 ) 。提示携有两个b w 位点的小鼠尿蛋白阳性率高 于只有一个位点的小鼠。 第二部分：由于基因的表达受多种因素影响，具有时空特异性，有些转录本 在总r n a 中丰度太低无法有效扩增，6 9 对引物可扩出供测序用样本9 0 例。对这 些基因片段进行直接测序，比对n z b 和n z w 的各自序列，逐一确定单核苷酸差 异。共发现在狼疮易感区存在变异的基因1 1 个，突变点4 1 个。查询g e n e b a n k 数据库，发现1 4 个突变点可导致氨基酸序列的改变，影响了i t l n a 、t i n a g l 、b a i 2 、 t r a f 6 、h i s t 3 h 2 b b 、o b s e n 共6 个基因的最终表达产物。 3 第三部分：( 1 ) 根据s s c p 条带特点确定( n z b n z w ) f ix n z w 回交鼠 b a i 2 及t i n a g l 基因型，将入选小鼠分为纯合子( w w ) 及杂合子( b w ) 两组进 行比较，即b a i 2 b 九与b a i 2 w w 比较，t i n a g l w w - e jt i n a g l w w 比较。结果发现b a i 2 b w 和t i n a g l b 九组的尿蛋白累积阳性率均大于纯和w 脚型，经统计学计算有显著差 异( p o 0 0 1 ) 。( 2 ) d x 鼠按不同基因型自由组合可分为4 组，即b a i 2 b 仍n a g l b 删、 b a i 2 b 仉n a g l 嗍、b a i 2 w 例t i n a g l b 刖、b a i 2 n a g l 嗍。结果发现四组分布极 不均匀，b a i 2 b 僵n a g l 嗍、b a i 2 h 俐门r i n a g l b v 两组个体数量极少，提示两者存在 紧密连锁。而b a i 2 b w t i n a g l w w 小鼠尿蛋白阳性率明显大于b a i 2 w n n a g l w n 组 ( p o 0 0 5 ) 。( 3 ) 将全部小鼠按蛋白尿分为2 组，进行两组间基因分布频率的 比较。结果显示小鼠尿蛋白阳性组b a i 2 b 脚及t i n a g l b 脚基因频率较阴性组明显占 优势( p 0 0 0 5 ) ，而b a i 2 w m 及t i n a g l w w 在尿蛋白阴性组中分布频率增高( p 7 7 4 m g d l ；3 ，1 1l m g d l ；4 ，7 3 3 3 m g d l ； 5 ，10 0 0 m g d l ；6 ， 73 0 0 0 m g d 1 g e n o t y p i n gf o rm i c r o s a t e l l i t em a r k e r s ：d n aw a s e x t r a c t e df r o mt h em o u s et a i lt i s s u e s g e n o t y p i n gf o rm i c r o s a t e l l i t em a r k e r sw a sd o n e u s i n gp c r m i c r o s a t e l l i t ep r i m e r sw e r ep u r c h a s e df r o mr e s e a r c hg e n e t i c s ( h u n t s v i l l e ， 6 a l ) p c rw e r er u ni na9 6 - w e l lp l a t e 、析t i l7 5i i1t o t a lv o l u m ec o n t a i n i n g2 0n go f g e n o m i cd n a at h r e et e m p e r a t u r ep c rp r o t o c o l ( 9 4 ，5 5 ，a n d7 2 0 c ) w a sc o n d u c t e d f o r4 5c y c l e si nag e n e a m p9 6 0 0t h e r m a lc y c l e r p c rp r o d u c t sw e r ed i l u t e d2 - f o l d 、析t l ll o a d i n gb u f f e rc o n s i s t i n go fx y l e n ec y a n o la n db r o m o p h e n o lb l u ed y e si n5 0 g l y c e r i na n dw e r er u no n15 p o l y a c r y l a m i d eg e l s a f t e re l e c t r o p h o r e s i s ，g e l sw e r e s t a i n e dw i 廿le t h i d i u mb r o m i d e s t a t i s t i c s ：l i n k a g e so fp a r t i c u l a rm i c r o s a t e l l i t el o c i w i t hd e v e l o p m e n to fp r o t e i n u r i aw a se s t i m a t e du s i n gac o m p u t e rp a c k a g ep r o g r a mo f m a p m a k e r e x pa n dm a p m a k e r q t lt oi d e n t i f yc h r o m o s o m a ll o c a t i o n so f q t l t h el i k e l i h o o dr a t i os t a t i s t i cl o do f 3 3w a su s e d 嬲t h et h r e s h o l df o r s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n tl i n k a g e p a r t2 ：r t - p c rf o rs y n t h e t i ce d n a ：t o t a lr n aw a si s o l a t e df r o mm o u s es p l e e n ， l i v e r , k i d n e yc e l l su s i n gi s o g e n e f i r s t - s t r a n de d n aw a ss y n t h e t i z e du s i n ga n o l i g o ( d t ) p r i m e r s e r i a lp r i m e r sw e r eu s e dt oa m p l i f yc d n ap r o d u c t sf r o mn z b a n d n z w , w h i c hw e r es e l e c t e db a s e do ne s tn e a r b yt h es u s c e p t i b i l i t yl o c it os c r e e n c a n d i d a t eg e n e s p c rr e a c t i o n sw e r ed o n ei nap e 9 6 0 0t h e r m a lc y c l e r 、析t l l10 0u1 t o t a lv o l u m e ，t h e nb o t hs t r a n dw e r ed i r e c t l ys e q u e n c e du s i n gs p e c i a lp r i m e r s t h e v a r i a t i o no fa m i n oa c i d sw e r ed e t e r r n i n a t e db yt h ed i f f e r e n c eo fn u c l e o t i d ec o n t r a s t i n g s e q u e n c ef r o mn z ba n dn z w p a r t3 ：2 2 0f e m a l em i c ew e r eu s e dt om e a s u r ep r o t e i n u r i a t h eo n s e to fr e n a l d i s e a s ew a sm o n i t o r e db yb i w e e k l yt e s t i n gf o rp r o t e i n u r i aw h i c hi s1ii m e , 10 0m lo r m o r ei nr e p e m e dt e s t st ob ec o n s i d e r e dl n d n aw a se x t r a c t e df r o mt h em o u s et a i l t i s s u e sa n dg e n o t y p i n gf o rt h em u t a t i o no fb a i 2a n dt i n a g lw a sd o n eb yp c ru s i n g p r i m e r s ：f ：c a g g t t t g c a c a c a c t t t g c ，r ：c g c c t c c t c c t c c t c c t c f o rb a i 2a n df ： a t c c a c a g c c a c a g a a g a g g ，r ：a g c c t g g t g c a t c t t t g t c tf o rt i n a 9 1 p c rw e r er u ni na9 6 - 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