（农业昆虫与害虫防治专业论文）植物微生物联合修复毒死蜱污染的土壤.pdf

福建农林人学硕j ：学位论文植物微生物联合修复毒死蜱污染的土壤 摘要 土壤污染是全球面临的热点环境问题之一，而农药污染又是土壤污染最为普 遍的现象，也是国内外土壤污染治理的难题。随着人们对生态环境重视程度的提 高，利用植物微生物联合修复来治理农药污染土壤已经越来越受到普遍的关注。 这种技术将两种修复方法的优点相结合，从而强化根际有机污染物的降解。本论 文以毒死蜱污染土壤为研究材料，利用降解菌d s p a 分别与高丹草、紫花苜蓿、 多花黑麦草进行联合修复，探讨了植物微生物联合修复毒死蜱污染土壤的效果， 以及影响联合修复的因素，为建立有效的农药污染土壤修复体系提供了有益的参 考。本研究所获得的主要内容及结果如下t 1 从农药厂排污口污泥中成功分离筛选到一株对毒死蜱有降解能力的菌株 d s p - a ，该菌株能以毒死蜱为唯一碳源生长，在无机盐培养基中，对毒死蜱( 10 0m g l ) 2d 的降解率达到5 0 1 3 。运用形态、生理生化对降解菌株d s p a 进行鉴定，明 确了该菌株的主要生物学特性。 2 通过盆栽试验研究了毒死蜱污染土壤的植物修复技术，比较了三种植物 对毒死蜱污染土壤的修复能力。研究表明，种植不同品种的植物对土壤中毒死蜱 降解的影响存在差异，其中种植高丹草的处理效果最好，其次是多花黑麦草。 3 以高丹草、紫花苜蓿和多花黑麦草为供试植物，研究了土壤中毒死蜱浓 度对植物种子萌发和种子活力的影响。结果表明，高丹草能耐受高毒死蜱浓度( 大 于1 0 0m g k g ) ，而低浓度的毒死蜱( 小于2 0m g k g ) 可以提高多花黑麦草和紫 花苜蓿的种子活力，但是高浓度的毒死蜱对这两者表现出抑制作用。 4 利用d s p a 菌分别与高丹草、紫花苜蓿、多花黑麦草协同作用，研究联 合修复毒死蜱污染土壤，结果表明，植物微生物联合修复的效果优于单一的植 物修复及单一的微生物修复效果。与d s p a 菌群较合适的植物是高丹草，该组 合对毒死蜱的降解率达到9 6 4 4 ，其次是多花黑麦草。 5 研究了微生物数量、植株密度以及土壤湿度对联合修复效果的影响，结 果表明，d s p a 菌菌液稀释倍数越大，联合修复的效果越差。植株密度对联合 修复的影响，主要表现为对植物根系生长的影响。植株密度越大，对生存环境的 竞争越激烈，植物根系的生长越不好。除了紫花苜蓿外，高丹草和多花黑麦草根 系的生长均受到影响。高丹草种植密度为1 2 株盆时，与d s p a 菌的联合修复 福建农林大学硕j ? 学位论文植物微生物联合修复毒死蜱污染的土壤 效果最好，多花黑麦草则为1 0 株盆。土壤湿度是影响联合修复的重要因素，不 仅影响植物的生长，对微生物的生长也有影响。土壤湿度过大，造成土壤的含氧 量降低，不利于植物根系和好氧细菌的生长，从而影响土壤中农药的降解。土壤 湿度过小，容易造成植株缺水，根系生长和微生物的生长。高丹草与d s p a 菌、 多花黑麦草与d s p a 菌联合修复最适浇水量都为2 0m l d ，紫花苜蓿与d s p a 菌联合修复最适浇水量都为1 5m l d 。 关键词：联合修复，毒死蜱，d s p a 菌，高丹草，紫花苜蓿，多花黑麦草 i l 福建农林人学硕一l ：学位论文 植物微生物联合修复毒死蜱污染的十：壤 a b s t r a c t s o i lc o n t a m i n a t i o nb yp e s t i c i d e si sa ni m p o r t a n tp r o b l e ma l lo v e rt h ew o r l d b i o r e m e d i a t i o nc o m b i n i n gp l a n t sa n dm i c r o o r g a n i s m si si n c r e a s i n g l yr e c o g n i z e da n d a p p l i e d t ot r e a tp e s t i c i d er e s i d u e s t h i sa p p r o a c hi n t e g r a t e st h ea d v a n t a g e so f p h y t o r e m e d i a t i o n a n dm i c r o b i a lr e m e d i a t i o nt oa c c e l e r a t ed e g r a d a t i o no ft h e p e s t i c i d e s p l a n ts p e c i e ss o r g h u mh y b r i d , l o l i u mm u t a f o r u ma n dm e d i c a g os a t i v a , a n dab a c t e r i u m ，d s p a ，w e r eu s e dt o i n v e s t i g a t ep l a n t m i c r o o r g a n i s mc o m b i n e d b i o r e m e d i a t i o no fc o n t a m i n a t e ds o i l t h ec h l o r p y r i f o s - d e g r a d i n gb a c t e r i u m ，d s p a ，w a si s o l a t e df r o mas o i ln e a raw a s t e w a t e ro u t l e to fc h l o r p y r i f o s - p r o d u c i n gf a c t o r i e si nf u a n t h ei s o l a t ec o u l dr e i t l o v e 5 0 13 c h l o r p y r i f o si nt h em i n e r a ll i q u i dm e d i u mw i t h10 0m g lc h l o r p y r i f o sw i t h i n 2 d a y s t h r e ep l a n ts p e c i e sw e r es t u d i e do np h y t o r e m e d i a t i o no fc h l o r p y r i f o s c o n t a m i n a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e i rc a p a c i t i e so fd e g r a d a t i o nw e r ed i f f e r e n t s o r g h u m h y b r i dw a ss u p e r i o rt ot h eo t h e rt w os p e c i e s t h er e l a t i v e l y - g r o w i n gi n d e x ( r g v i ) a n ds e e d sv i t a l i t yo fs o r g h u mh y b r i d , l o l i u m m u l t i f o r u ma n dm e d i c a g os a t i v ai nc h l o r p y r i f o s - c o n t a m i n a t e ds o i lw e r es t u d i e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tc h l o r p y r i f o so fl o wc o n c e n t r a t i o nc o u l dp r o m o t es e e dv i t a l i t yo f l o l i u mm u l t i f o r u ma n dm e d i c a g os a t i v a a n ds o r g h u mh y b r i dc o u l dr e s i s th i 出 c o n t a m i n a t i o no fc h l o r p y r i f o s t h ec o m b i n e db i o r e m e d i a t i o ne f f e c to fd s p aw i t ho n eo ft h r e ep l a n ts p e c i e so n c h l o r p y r i f o si nt h ec o n t a m i n a t e d s o i lw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t p l a n t m i c r o o r g a n i s mc o m b i n e db i o r e r n e d i a t i o nw a sb e t t e rt h a np h y t o r e m e d i a t i o no r m i c r o b i a lr e m e d i a t i o n o u rs t u d yi n d i c a t e dt h a tt h eb e s tp l a n tc o m b i n e dw i t hd s p - a w a ss o r g h u mh y b r i d , f o l l o w e db yl o l i u mm u l t i f o r “m 1 1 1 福建农林人学硕上学位论文植物微生物联合修复毒死蜱污染的土壤 f a c t o r sa f f e c t i n gt h ec o m b i n e dr e m e d i a t i o nw e r es t u d i e d m i c r o b i a lq u a n t i t y , p l a n t d e n s i t ya n ds o i lm o i s t u r ep l a y e di m p o r t a n tr o l e si nt h ec o m b i n e db i o r e m e d i a t i o no f c h l o r p y r i l o s k e yw o r d s ：c o m b i n e db i o r e m e d i a t i o n ；c h l o r p y r i f o s ；d s p - as t r a i n ，s o r g h u mh y b r i d ； m e d i c a g os a t i v a ；l o l i u mm u l t i f o r u m i v 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：懈 日期：九q 印7 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。d 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：娇椎 日期：舻m f7 指导教师亲笔签名：笛彦0 坐 日期：二矽巧罗占彦 福建农林人学硕1 二学位论文 植物微生物联合修复毒死蜱污染的土壤 第一章前言 1 农药污染现状 土壤是人类最基本、最广泛、最重要、不可替代的自然资源，也是农业生产 的基础。在农业生产过程中，农药是保证农作物取得高产的重要农业生产资料之 一，我国农药产量和使用量居世界前列，据统计我国施用农药面积在2 8 亿h m 2 以上，2 0 0 3 年全国农药使用量达1 3 1 2 万t ，全国平均用量为2 3 4k g h m 2 。这些 施用的农药，虽然控制了病虫害，但大部分农药残留于环境中，造成潜在的环境 威胁【1 ，2 1 。土壤是农药在环境中的“贮藏库，与“集散地”，施入农田的农药大部分残 留于土壤环境介质中。据报道，农药使用后有8 a 帖9 0 9 6 的量最终将进入土壤【3 】。虽 然大多数农药在环境中能逐渐分解成无毒的化合物，但有的农药化学物质稳定， 能较长期的残留在作物或土壤中，有的农药能代谢为更毒或致癌的化合物，如杀 虫脒水解产生四卤磷甲苯胺，代森锌代谢为乙撑硫脲，直到农产品收获时还会有 残留的农药及其有毒代谢物1 ，2 1 。目前，全国至少有1 3 0 0 1 6 0 0 万h m 2 耕地受到 农药污梨1 1 。由于污染，土壤的净化功能、缓冲功能和有机体支持功能正在丧失， 作物的产量和品质也因此受到了影响。据估计，土壤污染使我国农业粮食减产已 超过1 3 x 1 0 1 0 k 套4 1 ，农药在杀死靶标生物的同时，也或多或少地杀死非靶标生物。 据报道，埃及农场的稻田等大量使用农药，1 年便导致1 3 0 0 头大型农场动物的 中毒死亡。在美国每年畜产品因农药污染造成的经济损失至少达2 9 6 0 万美元【5 】。 农田污染还造成土壤中动物、微生物数量减少【6 】。此外，农田污染通过土壤植 物根系系统经由食物链危及人类的健康和安全，还通过污染物的迁移引起地表 水和地下水的污染，在多个层面上构成对人类生存环境的威胁，使人类暴露在更 大的环境风险之中【2 1 。因此，对农药污染土壤的治理已成为国内外研究的热点之 一。 随着科学技术的进步，目前农药污染土壤的修复技术主要有物理修复：包括 分离修复、蒸汽浸提、热力学、热解吸附、电动力学和冰冻法等。化学法修复： 主要包括原位化学淋洗、异位化学淋洗、溶剂浸提、原位化学氧化、原位化学还 原与还原脱氯修复和土壤性能改良技术等7 1 。生物修复：主要包括微生物修复、 动物修复、植物修复。 目前，微生物修复是使用最广泛的一种方法，它主要是利用微生物及其产品 福建农林人学硕上学位论文 植物微生物联合修复毒死蜱污染的土壤 进行生物修复，是消除和解毒高浓度农药残留和中毒的种安全、有效、快捷、 廉价的方法【8 1 ，但是由于农药在土壤系统中的多样性与复杂性，微生物修复还需 要靠植物体系来实现。因此选取适当的植物对帮助微生物降解农药将起很大的作 用。采用植物微生物联合修复污染土壤在清楚土壤污染的同时，可以清除污染 土壤周围的大气和水中的污染物，有利于改善生态环境【9 1 。尽管这一技术目前仍 处于起步阶段，在理论体系及技术方面还需要完善，但其应用却日益受到重视。 本研究以在我国广泛使用的毒死蜱农药为例，研究植物一微生物修复有机污 染土壤的机制。 2 有机磷农药毒死蜱简介 有机磷农药是当今农药中主要类别之一，几乎遍及农药所有的领域。目前， 世界上有机磷农药商品已达上百种，特别在杀虫剂方面，有机磷类为三大主柱之 一，并长年来鳌居首位1 0 】。但由于一些有机磷产品具有极高的毒性，不仅对环 境造成危害，对人体健康的危害更大。因此在农药工业“十五”发展规划中，我国 政府要求在此期间彻底削减高毒有机磷杀虫剂，于是毒死蜱成了甲胺磷和对硫磷 等高毒农药的替代品种【1 1 1 。 毒死蜱( c h l o r p y r i l o s ) ，商品名称乐斯本( d u r s b a n ，l o r s b a n ) ，1 9 6 5 年由美 国陶氏化学公司在美国登记。有效成分的化学名称为o ，o 二乙基一o - ( 3 ，5 ，6 三氯 2 吡啶基) 硫逐磷酸酯。化学结构式为： n 按我国农药毒性分级标准，毒死蜱属于中毒性杀虫剂。作为农药杀虫剂，毒死蜱 用于防治水稻、苹果、柑橘、小麦、棉花、玉米、甘蔗、蔬菜等的螟虫、卷叶虫、 粘虫、介壳虫、蚜虫、螨类、菜青虫、小菜蛾、黄曲条跳甲等百余种害虫【1 1 1 ，是 一种广谱高效的有机磷农药。 毒死蜱虽然属于中等毒性杀虫剂，但其在土壤中的持效期较长【1 2 】。r a c k e 等 研究认为毒死蜱降解的主要产物是3 ，5 ，6 一三氯一2 一吡啶醇( t c p ) ，但t c p 的进一步 降解却要缓慢的多，而且1 0 0 0m g k g 的t c p 还能抑制土壤微生物对几种农药的 2 福建农林大学硕士学位论文植物微生物联合修复毒死蜱污染的土壤 降解【1 3 】。毒死蜱潜在危险不容忽视。生物测定实验证明，毒死蜱能够影响线虫 的成熟，而且能够影响微藻类的呼吸和光合作用，通过影响自养和异样水生微生 物的数量来破坏水生微生物的食物链；实验表明毒死蜱为1 0p l 时能明显抑制 异样鞭毛虫的数且【1 4 】。毒死蜱能影响鱼的骨骼发育，降级骨骼的强度，可能引 起动物的基因毒性，导致x 一染色体缺失【l5 1 。低剂量( p g l n g l ) 毒死蜱具有内 分泌干扰作用是最令人担忧的发现，流行病学研究表明暴露于内分泌干扰剂下会 对人类产生严重危害，而且能够影响人的呼吸系统、心血管系统和神经系统等， 并且部分人群的免疫系统可能受毒死蜱的影响【1 6 】。近期实验表明，毒死蜱能够 通过皮肤进入人体，并且在人体内有一定程度的积累现象，可能对人体有一定的 潜在危险【1 7 】。 2 0 0 0 年6 月8 日美国环境保护局官员b r o w n e r 指出，毒死蜱杀虫剂对人的 神经系统和脑发育可能会有潜在影响，对儿童健康有害。许多国家对农产品，特 别是蔬菜上的毒死蜱残留量进行了严格的规定。在对外贸易中农药残留检测项目 中也包括毒死蜱【l8 1 。因此，毒死蜱的残留问题越来越受到重视。 3 污染土壤生物修复研究进展及应用 3 1 微生物修复技术 微生物是农药转化的重要因素之一，利用微生物降解环境中的有毒成分被广 泛地应用，并日益引起人们的重视。迄今为止，研究人员己从土壤、污泥、污水、 天然水体、垃圾场和厩肥中分离到降解不同农药的活性微生物【l9 1 。1 9 8 4 年 m i c h i g a n 州立大学的j a m e st i e d j e 实验室，s h e l t o n 等人首次从污染的河泥中分离 出了具有脱氯功能的厌氧微生物。研究表明，活性微生物主要以转化和矿化两种 方式，通过胞内或胞外酶直接作用于周围环境中的农药【2 0 1 。近年来，随着分子 生物技术研究的深入发展，微生物的降解作用也得到长足的发展 1 9 1 。 许多科研工作工作者通过富集培养、分离筛选等技术已经发现了很多能够降 解农药的微生物【2 1 1 。己报道的农药降解微生物有细菌、放线菌、真菌等，且大 多数来自土壤微生物类群【2 2 1 。王银善分离到一株黄杆菌f l a v o b a c t e r i u ms pp 3 2 ， 可对降解菌对硫磷、杀螟松、水胺硫磷、甲基对硫磷，且性能稳赳2 3 】：杨小蓉 等从经常施用氧乐果的蔬菜地土壤中分离得到一株降解氧乐果的高效菌【2 4 】。 福建农林人学硕上学位论文 植物微生物联合修复毒死蜱污染的土壤 这些农药降解微生物中，细菌由于其生化上的多种适应能力和容易诱发突变 菌株，从而在农药降解中占有主要地位。一般在土壤、污水及高温堆肥体系中， 对农药分解起主要作用的是细菌类，这与农药类型、微生物降解农药的能力和环 境条件等有关。由于自然界中存在这些大量可以降解农药的微生物，所以，微生 物就成为生物修复技术的主体，通过微生物的作用，把环境中有机污染物转化为 c 0 2 和h 2 0 等无毒无害或毒性较小的其他物质【2 5 1 。 在研究微生物降解有机磷农药的途径中发现，它们主要通过裂解p o 键或 p s 键来降解有机磷农药，其中已纯化和鉴定的几种有机磷农药水解酶在底物特 异性、对化学物质的敏感性和分子量大小等方面存在明显差异。有机磷农药的起 始代谢一般为水解反应，即菌株水解有机磷农药，初始产物一般为二甲基硫代磷 酸和对硝基苯酚【2 6 1 。y o n e z a w a 等认为，当微生物对有机化合物的降解作用是由 其细胞内的酶引起时，微生物降解的整个过程可以分为三个步骤：首先是化合物 在微生物细胞膜表面的吸附，这是一个动态平衡：其次是吸附在细胞膜表面的化 合物进入细胞膜内，在生物量一定时，化合物对细胞膜的穿透率决定了化合物穿 透细胞膜的量；最后是化合物进入微生物细胞膜内与降解酶结合发生酶促反应【2 7 1 。 微生物降解农药受多个因素的影响： 1 ) 微生物自身的影响 微生物的种类、代谢活性、适应性等都直接影响到对农药的降解与转化。很 多试验都已经证明，不同的微生物种类或同一种类的不同菌株对同一有机底物或 有毒金属反应不同。另外，微生物具有较强的适应和被驯化的能力，通过适应过 程，新的化合物能诱导微生物产生相应的酶系来降解它，或通过基因突变等建立 新的酶系来降解它。微生物降解本身的功能特性和变化是最重要的因素2 8 1 。 2 ) 环境因子的影响 环境因子如土壤的p h 值、温度、含水量、溶氧量、盐度、有机质含量、粘 度及气候条件等均影响微生物对农药的降解。其中，土壤p h 值对降解影响相对 较大，不仅影响微生物降解酶的活性，同时也影响农药的化学降解 2 8 1 。b 坷e s hk s i n g h 等人研究了p h 值对苯线磷和毒死蜱农药降解的影响，在p h 为4 7 6 7 时，毒 死蜱降解的半衰期由2 5 6d 降至3 5d ，然而，在p h i 7 7 8 4 范围内，半衰期降至 1 6 d 。而苯线磷降解菌在p h i 6 7 6 8 降解最快【2 9 】。 4 福建农林人学硕1 二学位论文植物微生物联合修复毒死蜱污染的十壤 3 ) 农药化学结构的影响 农药化合物的分子量、空间结构、取代基的种类及数量等都影响到微生物对 其的降解。一般高分子化合物比分子量小的化合物难降解，聚合物、复合物更能 抗生物降解，空问结构简单的比结构复杂的容易降解【2 8 1 。p o t t e r 等在小规模堆肥 条件下研究了多环芳烃的降解后指出，2 4 环的芳烃t l 5 6 环的芳烃容易降解 3 0 1 。 王军等认为二甲戊乐灵因苯环上连有两个硝基和一个氨基，其中硝基上的 氮与氧及氨基上的氮都可与土壤颗粒间产生氢键，产生较高的氢键键能，使二甲 戊乐灵与土壤颗粒间结合更加牢固，形成稳定的共轭体系，由于这种低的水溶性 和高的氢键，才使二甲乐灵在土壤中被强烈地吸附，并且解析困难，这种吸附作 用影响了微生物对二甲乐灵的摄取与降解。与生命物质的分子结构越相似，这 类物质越容易被微生物所降解【3 1 1 。 目前从自然中分离的很多广谱降解菌，对同类农药具有降解作用，是由于这 些农药具有相同或相似的结构，刘玉焕等分离出有机磷农药广谱降解菌对乐果、 甲胺磷、氧化乐果、马拉硫磷等有较好的降解效果，是由于有机磷农药具有类似 的结构，只是取代基不同【3 2 1 。农药化学结构中所含的卤素、氮、氢等原子，会降 低有机物的生物降解性，这类基团的数目越多，生物降解性越差。而羟基和羧基 的存在，则有利于生物降解性。农药的化学结构决定了它被微生物降解的速度 2 8 1 。 作为广泛应用的生物修复技术，微生物修复具有以下优点：成本低，对环境 影响小，如使用得当不会带来二次污染；某些微生物可在极端环境条件下生存， 若通过基因技术使其具有高效降解能力，则对治理特殊环境条件下的污染有利【33 1 。 但微生物修复也存在局限性：某些微生物只能降解特定的农药；有些情况下不能 将农药全部去除；微生物，酶制剂可能带来次生污染问题，并对自然生态过程产 生一定影响；各种环境因素的影响较大，加入到自然环境中的微生物可能由于竞 争或难以适应环境而导致作用结果与实验结果有较大出入。因此，为降解菌提供 适宜条件以促进其生长繁殖至关重要【3 4 】。 3 2 植物修复技术 植物修复技术即利用植物来修复和消除由有机毒物和无机废物造成的土壤 环境污染35 1 。植物修复技术，由于它具有投资少、不破坏场地结构、不引起地 下水二次污染等优点，在对重金属和有机污染物的处理上已显示出其明显的有效 5 福建农林人学硕士学位论文 植物微生物联合修复毒死蜱污染的土壤 性，是可靠的、环境相对安全的技术；作为创造现代生物技术的基础，植物修复 尚有广阔的发掘空间，通过精心制作“绿色过滤膜”，可以达到安全、有效地保护 环境，清除污染【3 6 】。 与微生物修复相比，植物修复更适用于现场修复且操作简单，容易大面积应 用，因而近年来有关植物对有机污染土壤的修复研究较多，有的已达到野外实际 应用水平 3 4 1 。 在农药污染的植物修复中，农药的理化性质、环境条件、植物种类等均影响 着修复的效果。植物修复的效果首先取决于植物对污染物的吸收同化能力3 4 1 。 研究表明，许多植物对污染物具有一定的同化能力。不过，不同植物之间同化毒 性物质的能力存在着显著差异，其中同化能力强的植物才具有实际应用的价值。 这种能力除取决于植物自身的遗传特性外，植物的年龄、生物量、根系发育状况 ( 如根系结构、根毛多少、根瘤的有无) 也对同化能力产生重要影响【3 6 1 。 农药的理化性质对植物修复的效果主要取决于辛醇水分配系数k w ，具有中 等l g k o w ，( 约1 4 ) 的农药易被植物根吸收，这些化合物可以在植物木质部流动， 但却不能在韧皮部流动【3 7 】。土壤中这类农药的污染比较适用于植物修复技术。 l g k o w 大于4 的农药能大量被植物根部吸收，可依赖根表面的降解能力，或利用收 获根的修复技术 3 引。收获根，晒干，完全燃烧以破坏这类农药。 此外。植物修复的适用性还依赖环境因子( 如土壤p h 、有机质含量、水分 条件、粘土含量与类型、气温、风速等) ，环境条件的改变会影响农药的生物利 用率。同时，耕作制度也可以影响植物修复效果，如通过挖掘土壤，有利于植物 根系处理那些密度大于水、l g k o w 较低、来源于点源( 如泄露) 且在土壤中呈垂 直浓度分布的农药2 1 。 植物修复农药有三种机制，一是直接吸收并在植物组织中积累非植物毒性的 代谢物；二是释放促进生物化学反应的酶；三是强化根际( 根土壤界面) 的矿 化作用3 9 1 。 1 ) 植物的直接吸收和降解 植物可以直接从土壤中吸收农药等污染物。这些污染物被吸收后会有多种去 向：植物可将其分解并通过木质化作用使其成为植物体的组成部分，也可通过挥 发代谢或矿化作用使其转化成c 0 2 和h 2 0 或转化成为无毒性的中间代谢物储存在 6 祸建农林人学硕士学位论文植物微生物联合修复毒死蜱污染的土壤 植物细胞中，达到去除土壤农药污染物的目的【3 9 1 。农药污染物直接被植物吸收 的速率取决于植物的吸收效率、蒸腾速率以及污染物在土壤中的浓度。而吸收效 率取决于污染物的物理化学特征、污染物的形态以及植物本身特性。蒸腾速率取 决于植物的种类、根系发达程度、叶片面积、营养状况、土壤水分、环境中风速 和相对湿度等，是决定污染物吸收的关键因素 4 0 】。 2 ) 植物释放酶的降解作用 植物根系可以分泌一些物质到土壤中，包括酶和一些有机酸。植物光合产物 4 0 以上通过根释放到土壤，供微生物代谢利用，同时促进根际区微生物生长、 繁殖，进而加速有机农药的降解3 9 1 。n i c h o l s 等研究表明，植物根际微生物明显 比空白土壤中多【4 1 1 ，y o s h i t o m i 等通过模拟根际环境，分离研究根系分泌物对根 际微生物对人为污染物的降解的影响，结果表明，玉米根系分泌物通过促进根际 微生物群落的生长促进芘的矿化作用 4 2 1 。植物根系释放到土壤中的酶可以直接 降解有关的化合物，死亡后的植物还可以将酶释放到土壤继续发挥分解作用。有 机农药在植物体内的脱毒过程基本上是在酶的作用下进行的，大部分属于酶氧化 过程1 3 6 , 4 0 。 3 ) 根际微生物的联合矿化作用 根际是受植物根系影响的根土界面的一个微区，也是植物土壤一微生物与其 环境条件相互作用的场所。由于根系的存在，增加了微生物的活动区域和生物量。 这种微生物在数量和活动上的增长，很可能是根际非生物化合物代谢降解的因素 【4 3 】 o 根际区是农药发生降解是活跃的区域，微生物群落在植物根际区繁殖活动， 根分泌物和分解物给微生物提供营养物质，而微生物活动也促进了根系分泌物的 释放，两者互惠互利，共同加速了根际区农药的降解。直接连接在植物根系和土 壤的微生物，对农药的降解也具有一定的作用。一方面菌根可以强化植物对农药 的耐受性，另一方面农药的某些有机成分又可作为菌根真菌和植株的养分，降低 农药的污染程度4 4 1 。林先贵等研究了施用绿麦隆、二甲四氯和氟乐灵的土壤接 种菌根对呗三叶草生长的影响，发现接种v a 菌根真菌后，植物的菌根侵染率、 生长量和氮、磷的吸收都显著高于不接种的对照植株4 5 1 。m e n e n d c z 等指出，菌 根真菌摩西球囊霉( g l o m u sm o s s e a e ) 侵染的大豆，其生长不受杀虫剂乐果影响， 7 福建农林人学硕士学位论文 植物一微生物联合修复毒死蜱污染的土壤 施用o 5m g l 的乐果反而增加了摩西球囊霉的孢子萌发 4 6 o f e r r o 等人研究发现， 黑麦草根际区五氯苯酚的降解比空白土壤明显增加4 7 1 。以上研究均表明，在有 机农药污染土壤修复过程中，根际区土壤微生物的数量和活性以及相关酶的活性 是最重要的环节。 3 3 微生物和植物的联合修复技术 植物微生物联合修复是土壤修复领域研究的热点。这种技术可以将两种修 复方法的优点相结合，从而强化根际有机污染物的降解。一方面，植物的生长能 够改善环境中温度、p h 、营养状况、氧气量、水分等影响微生物降解过程中的 不利因素。植物为微生物提供了生存场所，并可转移氧气使根区的好氧作用能够 正常进行；根分泌物、脱落物可为微生物提供大量营养，刺激根际各种菌群的生 长繁殖，增强细菌的联合降解作用3 9 4 8 1 。某些情况下，植物根分泌物可作为微 生物天然的共代谢底物促进污染物的降解；根区形成的有机碳可阻止有机化合物 向地下水转移，也可增加微生物对污染物的矿化作用3 9 4 8 1 。s a n d m a n 研究证明 许多植物根际区的农药降解速度快，降解率与根际区微生物数量的增加呈正相 关，而且发现多种微生物联合的群落比单一种的群落对化合物的降解有更广泛的适 应范围【4 9 】。此外，植物根系可以伸展到不同层次的土壤中，故无须混合土壤即可 使降解菌分散在土壤中。另一方面，微生物能够降解农药或改变农药的存在形态， 减轻农药对植物的毒害，提高植物的耐受性、促进植物对农药的吸收转化嗍。马 溪平等利用玉米、芥菜和蓖麻，探讨了植物微生物联合修复污染土壤的效果， 研究表明植物微生物联合修复是生物修复的一种有效形式，其关键是寻找适合 的植物一微生物匹配组合1 5 。 目前，植物微生物联合修复有两种类型。一种是植物专性降解菌的联合修 复：这种联合修复技术是在在利用植物进行污染土壤修复的同时，向土壤中接种 具有较强降解能力的专性降解菌，可促进有机污染物的降解。在种植植物的土壤 中接入外来菌时，针对不同土壤条件和污染状况确定适宜的接种量及施肥量是必 要的。过大或过小的外来菌接种不但不能产生最佳的清洁效果，反而会使土著微 生物的降解能力下降，使污染物去除率降低【3 4 1 。宋玉芳等研究表明引入高效降解 菌或根际协同菌群可以提高植物的修复效率，但要达到预期效果，需要对植物 微生物、微生物微生物之问的相互关系有深入了解，以便进行有效调控 5 1 1 。 福建农林大学硕十学位论文植物微生物联合修复毒死蜱污染的土壤 另一种是植物菌根真菌的联合修复：菌根真菌能与高等植物的营养根系形 成高度平衡的联合共生体菌根。近年来，菌根在降解土壤污染物中的作用已引 起国内外很多学者的关注【5 2 】。菌根生物修复与其他生物修复技术相比具有很多独 特的优点：菌根表面延伸的菌丝体可大大增加根系的吸收面积，大部分菌根真菌 具有很强的酸溶和酶解能力，可为植物吸收传递营养物质，并能合成植物激素， 促进植物生长。菌根真菌的活动还可改善根际微生态环境，增强植物抗病能力， 极大地提高植物在逆境条件下的生存能力【3 4 1 。 4 本论文研究的内容 本试验利用高丹草、紫花苜蓿、多花黑麦草与专性降解菌d s p a 协同作用， 对毒死蜱污染土壤进行修复，研究植物微生物联合修复污染土壤的效果，以及 影响联合修复的因素。探讨植物微生物修复农药污染土壤的机理，寻找较适合 的植物微生物匹配组合。 9 福建农林人学顾，i ：学位论文 植物微生物联合修复毒死蜱污染的十壤 第二章毒死蜱降解菌的分离与筛选 1 材料与方法 1 1 供试土样 土样采自福安农药厂排污口 1 2 实验仪器 高效液相色谱l 2 0 0 0 ( 日本日立) 、恒温摇床t h z c 1 ( 江苏太仓) 、电热恒 温培养箱d h g p 9 0 8 2 ( 上海益恒) 、高压蒸汽灭菌锅l d z x 4 0 b i ( 上海申安) 、 超净工作台s w - c t - i f ( 苏州安泰) 、电热鼓风干燥箱d h g 9 1 4 5 a ( 上海益恒) 、 电子天平a b 2 0 4 e ( 瑞士m e t t l e r - t o l e d o ) 。 1 3 药品试剂 毒死蜱原药( 有效成份含量9 7 7 ) ，上海农药研究所提供、乙腈、硫酸镁、磷 酸氢二钾、硫酸铵、硫酸亚铁、硫酸钙、氯化钠、蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、固体 琼脂等其他化学试剂均为分析纯。 1 4 培养基配方 ( 1 ) 以毒死蜱为唯一碳源的无机盐培养基：m g s 0 4 7 h 2 00 2g ，k 2 h p 0 4o 1g ， ( n h 4 ) 2 s 0 40 1g ，c a s 0 40 0 4g ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 1g ，去离子水ll ，p h7 0 。1 2 1 。c ， 灭菌3 0 m i n 。 ( 2 ) 含少量碳源的培养基：m g s 0 4 7 h 2 0 0 2g ，k 2 h p 0 40 1g ，( n h 4 ) z s 0 40 1g ， c a s 0 40 0 4g ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 1g ，蔗糖3g ，去离子水1l ，p h7 0 。1 2 l ， 灭菌3 0 m i n 。 ( 3 ) 牛肉膏蛋白胨：n a c l5g ，蛋白胨1 0 9 ，牛肉膏3 9 ，去离子水l l ，p h 7 0 。 1 2 1 ，灭菌3 0 m i n 。 固体培养基另添加2 优质琼脂。 1 5 降解菌的驯化培养 称取污泥5g 于9 5m l 无机盐液体培养基中，培养基中毒死蜱的浓度为2 0 0m g l ， 于3 0 。c ，1 2 0r m i n 摇床培养，培养7d 后，以1 0 的接种量接入新鲜培养液中， 以后每周转接一次，每次转接毒死蜱浓度提高2 0 0r n g l ，至培养基中毒死蜱的终 浓度达到1 0 0 0m g l 为止。 1 0 福建农林人学硕士学位论文植物微生物联合修复毒死蜱污染的十壤 1 6 降解菌株的分离与纯化 取驯化后的培养物，梯度稀释后涂布于驯化时使用的选择性培养基( 以毒死 蜱为唯一碳源的无机盐培养基) 平板上，毒死蜱的浓度为2 0 0m g l ，置于3 0 。c 恒温培养箱中培养3d ，挑取菌落形态不同的单菌落划线于选择性培养基上，反 复3 次，以纯化菌株，并转入斜面保存，进行相关性能研究。 1 7 毒死蜱高效液相色谱分析体系的建立 高效液相色谱条件：c1 8 色谱柱；流动相：乙腈水( 比例为9 ：1 ) ；流量：1 0 m l m i n ； 检测波长：2 3 0n l n ；进样体积：5 “l 。 标准曲线的制作：采用外标法，以乙腈为溶剂将毒死蜱标样依次稀释为1 0 、 5 0 、1 0 0 、3 0 0 、5 0 0 、8 0 0 、1 0 0 0m g l7 个浓度梯度，然后进行高效液相色谱 分析，测定峰面积，根据测得的峰面积与浓度的一一对应关系作出标准曲线。 体系添加回收率：设3 个质量浓度( 1 、1 0 、1 0 0r a g l ) 的添加回收率实验。 称取一定量的毒死蜱溶于丙酮，称取一定体积加入到5 0m l 无机盐液体培养基 中，使毒死蜱在5 0m l 无机盐培养基中的终浓度分别为1 、1 0 、1 0 0m g l 。取此 无机盐培养基1 0m l 加入到2 0m l 刻度试管中，加入1 0m l 乙腈，置于涡轮振 荡器上振荡1m i n ，静止2m i n ，用0 4 5 此的尼龙滤膜过滤，进行高效液相色谱 分析。每个浓度重复3 次。 添加回收率( ) = ( 实测量添加量) x 1 0 0 1 8 各菌株对毒死蜱的降解效率的测定 将分离纯化的菌株接种于分离时使用的选择性液体培养基上，培养基中的毒 死蜱浓度为1 0 0m g l ，于3 0 。c ，1 2 0r m i n 摇床培养，培养2d 后，取1 0m l 培 养液于2 0m l 刻度试管中，加入等体积的乙腈，置于涡轮振荡器上振荡1m i n ， 静止2r a i n ，用o 4 5 此的尼龙滤膜过滤，进行高效液相色谱分析。每个浓度重 复3 次，同时设不接菌的空白对照。 降解率( ) = ( 对照组毒死蜱浓度一处理组毒死蜱浓度对照组毒死蜱浓度) 1 0 0 2 结果与分析 2 1 降解菌株的分离与纯化 土样经驯化培养后，得到在选择培养基上形态不同的菌株2 株，记为d s p a 福建农林大学硕上学位论文植物微生物联合修复毒死蜱污染的十壤 和d s p b 。 2 2 毒死蜱色谱分析体系的建立 实验结果如图1 所示，毒死蜱在上述实验条件下的保留时间为6 6 0r a i n 。 时i 司( m i n ) 图1 毒死蜱的高效液相色谱图 f i g 1 h p l cc h r o m a t o g r a mo fc h l o r p y r i f o s 2 3 毒死蜱的标准曲线 应用上述方法，根据峰面积与毒死蜱浓度的对应关系，得出如下标准曲线： y = l1 4 6 8 x 2 3 0 4 5 ，r 2 = o 9 9 ，如图2 所示。 1 4 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 口( 1 0 0 0 0 0 0 懈 星咖咖 6 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 o 2 04 06 0 8 0l o o 毒死蜱浓度( r a g l ) 图2 毒死蜱的标准曲线 f i g 2 s t a n d a r dc u r v eo fc h l o r p y r i f o s 2 4 体系的添加回收率 实验结果( 表1 ) 显示，在添加不同浓度毒死蜱的无机盐培养基体系中，毒 死蜱的添加回收率在1 0 3 3 1 1 2 7 7 6 之间，变异系数在1 3 5 4 1 8 之间，达到 国家标准要求。 1 2 福建农林人学硕f ：学位论文植物微生物联合修复毒死蜱污染的十壤 表l 毒死蜱在无机盐培养基中的添加回收率 t a b l e1r e c o v e r a b l er a t e so fc h l o r p y r i f o si nl i q u i dc u l t u r em e d i u m 2 5 菌株对毒死蜱的降解效率 将分离纯化的2 株菌株全部接种三角瓶培养，测试它们对毒死蜱的降解效 率。实验结果如表2 所示，三个处理中的毒死蜱残留量存在显著差异( d = 2 ， p = 0 0 0 0 ) 。菌株d s p a 对毒死蜱的降解效果高于d s p b ，降解率为5 0 1 3 。 表2 两个菌株对毒死蜱的降解率 t a b l e2 d e g r a d i n gr a t e so fc h l o r p y r i f o sb yi s o l a t e s 不同字母代表差异显著，p 0 0 5 ( l s d 测定) 图3 为毒死蜱残留量的色谱图，从图中可见，接菌处理后，培养基中毒死蜱 的残留量显著降低。其中接种d s p a 菌处理中毒死蜱残留量低于接种d s p b 菌 的处理。 娶 星- ，ii 1 0 12l2，5t 时间( r a i n ) c kd s p ad s p b 图3 菌株d s p - a 与d s p - b 对无机盐培养基中毒死蜱的降解作用 f i g 3d e g r a d a t i o no fc h l o r p y r i f o sb yi s o l a t e sd s p aa n dd s p bi nl i q u i dm e d i u m 3 讨论 毒死蜱在土壤中的半衰期较长，为6 0 1 2 0d 【5 3 1 。微生物在毒死蜱的降解中起 福建农林人学硕，j ：学位论文植物微生物联合修复毒死蜱污染的十壤 重要作用。毒死蜱与其他有机磷农药一样，有p o c 键，但是并不像其它有机 磷农药，毒死蜱自1 9 6 3 年首次使用以来，鲜有田间毒死蜱降解加速的报道。这 可能是因为毒死蜱的代谢产物三氯吡啶醇( t c p ) 具有抑制微生物的作用， 从而抑制了土壤中毒死蜱降解菌的繁殖 5 3 , 5 4 】。 目前关于利用降解菌修复毒死蜱污染土壤的报道还比较少，s i n g h 等发现澳 大利亚连续1 4 年使用毒死蜱的土壤中毒死蜱的降解加快，把澳大利亚的这种土 样接种到英国的5 个不同土样，发现英国土样获得了降解能力【5 5 1