（农业昆虫与害虫防治专业论文）海洋真菌1893发酵培养条件及杀虫活性物质的初步研究.pdf

t j l l i 大学硕卜学位论文海洋真曲1 8 9 3 发酵培养条件殷杀虫活性物赝的纠少研究 海洋真菌18 9 3 发酵培养条件及杀虫活性物质的 初步研究 专业：农业昆虫与害虫防治 硕士生：徐树兰 指导老师：陈其津高级工程师 摘要 从香港海域红树林中分离得到了一株代号为1 8 9 3 的海洋真菌，其代谢产物 具有杀虫活性。本文对该真菌的发酵培养条件和培养基配方进行了优化，对其形 态进行了描述。初步分离了该菌的代谢产物，并对其杀虫活性、稳定性及对乙酰 胆碱酯酶( a c h e ) 活性的影响进行了测定。证明其代谢产物对白蚊伊蚊( a e d e s a l b o p i c t u s ) 和桃蚜( m y z u sp e r s i c a e ) 具有一定的毒杀作用。 采用生长速率法，得到了该真菌生长的最适温度为2 5 ( 2 ，最适p h 为7 。显微 观察发现，该真菌产生螺旋状弯曲的孢子，分生孢子不分枝，仅有横分隔，为立 体状卷曲，形成圆筒形的孢子体。初步将其归为立卷旋孢霉属( h e l i c o o n m o r g a n ) 。 利用单因素法和正交设计法，筛选出该真菌最适发酵时间为1 8 天、装液 量为2 0 0 r a l ：最佳发酵培养基的配方为：1 蔗镛、0 4 酵母膏、0 6 粗海盐、 0 1 m g s 矾7 h 。0 、1 0 0 0 m l 蒸馏水。 利用浓缩2 0 倍的发酵液和冷冻| t 燥的粗提物及乙酸乙酯萃取物分别对白 纹伊蚊进行了毒力测定。结果表明，乙酸乙酯萃取物的毒力最高，其l 岛为 0 1 9 2 4 m g m l ；冷冻下燥的粗提物对桃蚜的致死率为3 0 6 5 ；但对斜纹夜蛾 ( s p o d o p t e r al i t u r af a b r i c i u s ) 、甜菜夜蛾( s p o d o p t e r ae x i g u ah u b n e r ) ，粉纹 夜蛾( t r i c h o p l u s i an ih u b n e r ) 、棉铃虫( h e l i c o v e r p aa r m i g e r ah u b n e r ) 、银 纹夜蛾( a r g y r o g r a m m aa g n a t a ( s t a u d i n g e r ) ) 、玉米螟( o s t r i n i an u b i l a l i s ) 没有发现毒杀作用，而对斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和棉铃虫有微弱的拒食作用。 稳定性研究结果表明，代谢产物对热比较稳定，8 0 c 处理l h 后，其杀虫 中l i l 大学硕l ：学位硷史海洋真菌1 8 9 3 发酵培养条件及杀虫活忖_ 物质的 步研究 活性变化小大；但对紫外线非常敏感，紫外照射3 h 后，活性尽失。 分别离体和活体测定了乙酸乙酯萃取物对自纹伊蚊幼虫a c h e 活性的影响， 发现未降低该酶的活性，初步断定该代谢产物小是a c h e 抑制剂。 本文的研究结果为研制高效、低毒、无污染的新型海洋微生物杀虫剂提供 了一定的理论依据和技术支持。 关键词： 海洋真菌，形态观察，发酵条件，杀虫活性物质，乙酰胆碱酯酶 n 中i l i 大学碗f ：学位论义i ： ；f 宾苗1 8 9 3 发酚蚺养条件段杀虫活件物质的蜘步研究 p r i m a r ys t u d y o nf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n d p e s t i c i d a l m e t a b o l i t e so fm a r i n ef u n g u s1 8 9 3 m a j o r ：a g r i c u l t u r a li n s e c ta n dp e s tc o n t r o l n a l e ：x us h u l a n s u p e r v i s o r ：a d v a n c e de n g i n e e rc h e nq i j i n a b s t r a c t t h em e t a b o l l t e so f m a r i n ef u n g u s1 8 9 3 ，b e l a t e df r o mt h em a n g r o v eo f h u n g k o n g ，h a dp e s t i c i d a la c t i v i t y i n t h i sa r t i c l e ，i t sf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n d f e r m e n t a t i o nm e d i u mw e r eo p t i m i z e d ，a n di t s m o r p h o l o g yw a sd e s c r i b e d f u r t h e r m o r e , t h e p e s t i c i d a l t o x i c i t y ,s t a b i l i t y a m e f f i c a c y t o w a r d s a e e t y c h o l i n e s t e r a s eo ft h em e t a b o l i t e sw e r et e s t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti th a d c e r t a i nt o x i c i t ya g a i n s ta e d e sa l b o p i c t u sa n dm y z u s p e r s i c a e u s i n gt h eg r o w t hr a t em e t h o d ，t h eo p t i m u mc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so ft h e m a r i n ef u n g u s1 8 9 3w e r eo b t a i n e d ，a n dt h e yw e r et e m p e r a t u r e2 5 c ，p h 7 b a s e do n i t sc h a r a c t e r i s t i c so fc o l o n y , m y c e l i u ma n dc o n i d i u m , i tw a sp r i m a r i l yi d e n t i f i e da s h e l i c o o nm o r g a n w i t hs i n g l ef a c t o rt e s t i n ga n do r t h o g o n a ld e s i g n , t h eo p t i m u mc u l t i v a t i o n c o n d i t i o n sa n dt h eo p t i m a lc o m p o n e n t so f t h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mw e r eo b t a i n e d 砷e yw e r ea sf o l l o w s c u l t i v i a t i o nt i m e18 d ，v o l u m eo f m e d i u m2 0 0 m l ，s u c r o s e1 ， y e a s te x t r a c to 4 ，s e as a l to 6 ，m g s 0 4 7 h 2 0o i a n dd i s t i l l e dw a t e r1 0 0 0 m l t h er e s u l t so fb i o a s s a yd i s p l a y e dt h a tt h ee t h y la c e t a t ee x t r a c th a dt h eh i g h e s t t o x i c i t yt oa e d e sa l b o p i c t u s i nd i f f e r e n te x t r a c t sw h i c hw e r ei s o l a t e dw i t ht h r e e m e t h o d s i t s5 0 l e t h a lc o n c e n t r a t i o n ( l c s o ) w a s0 1 9 2 4 m g m l t h et o x i c i t yo ft h e c r u d em e t a b o l i t e st om y z u sp e r s i c a ew a s3 0 6 5 ，a n di td e m o s t r a t e da i n t i s h a n t i f e e d i n ge f f i c a c yt os p o d o p t e r al i t u r af a b r i c i u s ，s p o d o p t e r ae x i g u ah u b n e r , a n dh e l i c o v e r p aa r m i g e r ahub n e lb u tn ot o x i c i t yt oo s t r i n i an u b l i l a l i s , i 中i i l 大学硕 ：学位论文海洋真菌1 8 9 3 发酵培养条件殷杀虫活忭物质的韧少研究 a g y r o g e a 豫垃a g n a t 8k s t a u d i n g e r lo rt r i c h o p l u s i an ih u b n e r , t e m p e r a t u r eh a dl e s se f f e c to np e s t i c i d a lb i o a c t i v i t yt h a nu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n t h eb i o a c t i v i t yc o u l db ec o m p l e t ed i s a p p e a r e di f t h e yw e r er a d i a t e df o r3h o u r s , b u t i td i d n th a v ee v i d e n c ec h a n g ew h e nt h et e m p e r a t u r ew a sh i g ht o8 0 t h ee t h y ta c e t a t ee x t r a c tc o u l d ti n h i b i ta c h eo fa e d e aa l b o p i c t u s , s oi t s u g g e s t e dt h a t i n h i b i t i o na c h ew a s n to n eo ft h ep e s t i e i d a lm e c h a n i s m so ft h e m e t a b o l i t e s t h er e s u l t so ft h ea r t i c a lp r o v i d e ds o i l l e t e c h n o l o g i e sa n dt h e o r i e sf o r d e v e l o p i n gn e wm a r i n em i c r o o r g a n i cp e s t i c i d e s k e yw o r d s ：m a r i n ef u n g u s ，m o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n ，p e s t i c l d a lm e t a b o l i t e s ， f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，a c e t y c h o l i n e s t e r a s e 山大学碘十学位论文海 羊龚酋1 8 9 3 发酵培养条件殷系虫滔忭物质的扔步研究 前言 2 0 世纪以来，随着有机合成杀虫剂的出现和推广使用，抗药性便成了害虫防 治中最棘手的问题。自从1 9 0 8 年m e l a n d e r 首先发现美国加利福尼亚州梨园蚧 ( o u a d r a s p i d y o t u s p e r n ，c i o u s ( c o m s t o c k ) ) 对石硫合剂产尘抗药性以来，到 目前为止，至少有6 0 0 种害虫及害螨对杀虫剂产生了抗性( 何书海等，2 0 0 6 ) 。 并且害虫除了对已有的有机合成杀虫剂产生抗性外( 赵善欢，2 0 0 0 ) ，有些害虫 对微生物源杀虫剂阿维菌素类、苏云金杆菌和多杀菌素类药物亦产生了抗性 ( b e m i n g w a ye ta l ，2 0 0 0 ：s h e l t o ne ta l ，2 0 0 2 ：唐振华，2 0 0 3 ) 。同时，由 于化学杀虫剂的大量使用，农药中毒及农产品中农药含量超标等事件层出不穷。 此外，化学杀虫剂的生产过程中，会产生大量的“三废”，在使用过程中，又会 导致水源、空气、土壤的有毒物质超标，造成严重的环境污染问题。因此，寻求 新的高效、低毒、无污染、有选择性的微生物杀虫剂成为当务之急。 海洋占地球表面积的7 0 ，是生物资源的宝库。海洋真菌是海洋微生物的 一个重要组成部分，由于适应了海洋高压、低营养、低温、无光照以及局部高 温、高盐等的极限环境( 林永成，2 0 0 3 ) ，海洋真菌形成了一些特有的代谢途 径和遗传背景，产生了许多结构新颖的活性化合物( g a b r i e l ae ta l , 2 0 0 6 ) 据报道截止2 0 0 2 年，从海洋真菌的代谢产物中共分离得到了2 7 2 种新化合物 ( 刘济宁等，2 0 0 4 ) ，其中8 0 的具有生物活性( f a u l k n e r ，2 0 0 1 ) ，而现代 药理研究表明许多海洋生物的次生代谢产物对害虫有较好的防效( 刘济宁等。 2 0 0 4 ) 。这使得利用活性商、结构独特、作用方式新颖的海洋真菌活性物质， 研制新型杀虫剂，解决同益严重的害虫抗药性、食品安全及环境污染问题变成 了可能。但到目前为止，仅有朱峰等( 2 0 0 7 ) 报道从红树林内生真菌1 9 2 4 4 和 3 8 9 3 。的混合发酵产物中发现了一种对棉铃虫( h e l i c o v e _ r p aa r 耐g e r ah u b n e r ) 和中华鳋( s i n e r g a s i l u ss p ) 具有明显毒杀作用的化合物2 一甲基水杨酸。 由于生物活性物质在海洋真菌代谢产物中含量很微( 吴文君，2 0 0 6 ) ，为了 获得高产量的活性代谢产物，必须寻找代谢产物产生的最佳培养条件。影响微 生物代谢的条件包括了环境因素和营养条件。温度和p h 值是环境因素中两个最 重要因子，不同的微生物有不同的最适生长温度和最适生长p h ( m i c h a e le ta l ， q - 山大学硕十学位论文海洋真苗1 8 9 3 发酵培养条件发杀虫洒件物质的初步研究 1 9 8 4 ) 一般情况下，真菌适宜生长的温度范围是2 5 3 5 ，适宜生长的d h 范 围是z 9 ( 黄秀梨，2 0 0 3 ) ；同时通气量及发酵时间对微生物的代谢影响也很 显著( 吴文君，2 0 0 6 ) 。在微生物的营养中有六大要素物质，它们是：碳源、氮 源、能源、生长因子、无机盐和水( 陈天寿，1 9 9 5 ) ，其中碳源和氮源是微生物 细胞生长中最重要的元素。不同的微生物因为对碳源和氮源的利用不同，会产 生不同的代谢产物。即使同一种微生物，在不同的氮源、碳源组成的培养基中， 在不同的培养时间和培养条件下，其活性物质的产生量也可以相差很大，甚至 有的不能产生( 程光胜，1 9 8 1 ) 。研究发现，海藻真菌p e n i c i l l i u ms p 在两种不 同的培养基：2 葡萄糖，l 蛋白胨，2 麦芽膏，蒸馏水，p h 7 5 ；2 0 0 葡萄糖， l 蛋白胨，o 5 酵母膏，人工海水，p h 7 5 产生结构完全不同的独特细胞毒代 谢产物( a t s u s h ie t 甜，1 9 9 9 ) 因此，筛选合适的发酵条件和营养配比是进行 海洋真菌代谢产物杀虫剂开发的基础。 开展海洋真菌活性物质的研究，最终目的是将其开发成产品投放市场，因 此海洋真菌活性物质的分离、纯化及产品制备等技术，是海洋生物活性物质研 究开发中最重要的( 刘济宁等，2 0 0 4 ) 。传统的活性物质的提取方法是溶剂法， 常用的溶剂提取法有索氏提取法和回流提取法等( 刘湘。2 0 0 5 ) 近年来，有许 多新的、先进的技术应用于海洋生物活性物质的分离、纯化及产品制各过程中， 如超临界流体萃取、双液相萃取、灌注层析、分子蒸馏、膜分离等现代分离技 术，这些新技术的应用加速了从海洋真菌代谢产物中寻求新的杀虫化合物的进 程。 乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 是昆虫神经系统的一种重要酶类，在昆虫神经传导 过程中起着重要的媒介作用，它催化乙酰胆碱分解成胆碱和乙酸，其活性是衡量 试虫神经生理活性的重要指标之一( c r b e t te t 鲥，1 9 8 4 ) a c h e 是多种杀虫 剂的重要的靶标，其作用机理是：通过抑制a c h e 的活性，使催化乙酰胆碱裂解 的反应受阻，导致乙酰胆碱大量蓄积于乙酰胆碱受体( a c h r ) 及效应器周围，使 神经信号传递失败，昆虫的神经传导不断的处于过度兴奋和紊乱状态，破坏了 正常的生理活动，从而引起昆虫的麻痹衰竭而死( 赵善欢，2 0 0 0 ) 。因此，a c h e 抑制剂的研究对新农药的研制和开发具有重要的意义。 海洋真菌1 8 9 3 是采自香港红树林的一种内生真菌，目前已经从其菌体和 2 山大学硕十学位论文海i f 真茁l8 9 3 发酵培养条件搜杀虫洒 牛物质的仞步研究 代谢产物中分离得到了l o 余种化合物，其中5 一对羟基苯乙基一2 ，4 一咪唑烷二酮 和尿囊素是首次从海洋真菌中分离得到( 刘光英等，2 0 0 3 ) 。但目前并没有关于 其代谢产物具有杀虫活性的研究报道。本文在研究过程中发现海洋真菌1 8 9 3 的 代谢产物具有一定的杀虫活性，因此对其发酵条件进行了优化，测定了其代谢 产物的毒力，对杀虫活性物质进行了初步的分离，对稳定性进行了研究，探究 了萃取物对白纹伊蚊a c h e 活性的影响，以期为该代谢产物的开发应用提供一定 的理论依据和技术支持。 山大学钡十学位论文海 辛真苗1 8 9 3 发酵培养条件发杀虫沾什物质的仞步研究 第1 章海洋真菌1 8 9 3 的培养及形态观察 1 1 材料方法 1 1 1 材料 1 1 1 1 供试菌株 海洋真菌1 8 9 3 ，中山大学化学与工程学院林永成教授惠赠。 1 1 1 2 培养基 p d a 培养基：葡萄糖2 0 9 、琼脂粉1 8 9 、马铃薯2 0 0 9 ( 去皮) 、蒸馏水1 0 0 0 m l ， 自然p h ，1 2 1 灭菌3 0 m i n ，备用。 1 1 1 2 主要仪器设备 t e 2 0 0 0 荧光倒置显微镜：尼康公司。 g e n e g e n i u s 全自动凝胶成像分体系统：s y n g e n e 公司。 l r h - 2 5 0 - g s 人工气候箱：广东省医疗仪器厂。 y x 2 8 0 b 手提式不锈钢蒸气消毒器：上海三申医疗器械有限公司。 净化工作台：苏州净化设备有限公司。 p h s p 2 便携式酸度计：上海海恒电仪表有限公司。 1 1 2 方法 1 1 2 1 最适培养条件的测定 1 1 2 1 1 最适培养温度的测定 将在p d a 平板上培养4 天的海洋真菌1 8 9 3 用打孔器( 内径5 m ) 沿菌落边 缘打孔，挑取生长一致的菌饼，接种到直径为9 c m 的p d a 平板中央，每个平板 5 山大学硕十学位论文海洋真菌1 8 9 3 发酵培养条件及杀虫活性物质的 刀步研究 接种一块。接种后分别置于1 6 ( 7 、2 0 c 、2 29 c 、2 5 。c 、2 7 c 、3 0 c 、3 2 c 和 3 5 。c 黑暗培养箱中培养，每个平扳为一个处理，每处理五个重复。以后每隔2 4 h 观察菌的生长情况并测量菌落直径，计算菌丝生长速率，计算公式如下： 菌丝生长速率( 删= 甓瓣 ( 1 - 1 ) 1 1 2 1 2 最适培养p h 的测定 将p d a 培养基用稀h c l 和稀n a o t t 调节p h 至3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、1 0 ， 将在p d a 平板上培养4 天的海洋真菌1 8 9 3 用打孔器( 内径5 m ) 沿菌落边缘打 孔，挑取生长一致的菌饼，接种到不同p h 的p d a 平板中央。每个平板接种一块。 接种后置于2 5 的黑暗培养箱中培养，每个平板为一个处理，每处理五个重复。 以后每隔2 4 h 观察菌生长情况并测量菌落直径，计算菌丝生长速率，计算公式 同( i - i ) 1 1 2 2 形态观察 采用插片法( 程光胜，1 9 8 1 ) ：从斜面上挑取少量的菌丝，接种在直径9 c m 的p d a 平板上，将无菌的盖玻片斜插于培养基中，置于2 5 的培养箱中培养，分 别于接种后不同时间取盖玻片于显微镜下观察并拍照，同时记录菌落的颜色、质 地、表面纹饰、生长速度等特征 1 2 结果 1 2 1 最适生长温度 图1 一l 的试验结果说明，海洋真菌1 8 9 3 在1 6 3 5 c 的温度范围内均能生 长，但菌丝生长速度明显不同。在温度为1 6 。c 时，其生长速率仅为2 0 3m m d ， 随着培养温度的升高，茵丝生长速度逐渐加快，当温度为2 5 c 时，生长速率最 大，达到了8 4 n 帅d ，以后随温度的继续升高，菌丝生长速率开始减小。可以 看出2 5 是海洋真菌1 8 9 3 生长的最适温度。 6 山大学钡十学位论文海汁真苗1 8 9 3 发酵培养条件及杀虫洒件物质的仞步研究 量 、， 蜊 瑚 出 划 1 0r 1 6 2 0 2 2 2 5 2 7 3 0 3 2 3 5 温度 图1 1 海洋真菌1 8 9 3 在不同温度下的生长曲线。实验重复3 次。 f i g 1 - ig r o w t hc u r v eo fm a r i n ef u n g u s1 8 9 3i nd i f f e r e n tt e m p e r a t m e t e s tw a sr e p e a t e dt h r e e t i m e s 1 2 2 最适生长p h 图1 - 2 的试验结果证明，海洋真菌1 8 9 3 在真菌适宜生长的p h 范围内均能 生长，但菌丝生长的速率和菌的生长情况却有很大的区别。在p h 为3 时，菌丝 稀疏，生长速率为5 g 6m m d ，随着培养基p h 的增大，其生长速度逐渐增快， 菌丝也变得越来密集，在p h 为7 时，生长速率达到最大9 0 6 m d ，以后随p h 的增大，其生长速率变小，茵的长势也变差。因此p h = 7 为海洋真菌1 8 9 3 生长 的最适p h 舍 星 、， 世 斓 业 州 p h 3p h 4p h 5 p h 6 p h 7p h 8 p 咐p h l 0 图l 一2 海洋真菌1 8 9 3 在不同p h 下的生长曲线。实验重复3 次 f i g i 一2 g r o w t h c m v e o f m a r i n e f u n g u s1 8 9 3i nd i f f e r e n t p h t e s t w a sr e p e a t e d t h r e e t i m e s 7 中山大学硕十学位论文 海洋真菌l8 9 3 发酵培养条件度杀虫活性物质的切步研究 1 2 3 海洋真菌1 8 9 3 的形态 海洋真菌1 8 9 3 在p d a 平板上，生长初期，菌落呈白色呢绒状，紧贴于培养基， 培养物的底面没有颜色，菌丝细长，有隔。( 图1 - 3 ，图卜4 ，图卜5 ) 。三天后 菌丝开始老化，变为褐色，并产生深褐色的色素，菌丝细胞歼始膨大。每个细胞 有多个细胞核( 图1 - 6 ) 。接种7 天后，菌落覆盖整个培养基的表面。产生螺旋状 弯曲的分生孢子，分生孢子不分枝，仅有横分隔，为立体状卷曲，形成圆筒形的 孢子体( 图卜7 ) 。根据真菌鉴定手册( 魏景超，1 9 7 9 ) ，初步将其定为半知菌 亚门螺旋孢霉科立卷旋孢霉属( t t e l i c o o nm o r g a n ) 。同时观察发现，该菌在营 养缺乏的条件下培养，有厚垣孢子产生( 图1 - 8 ) ，估计其有性态属于担子菌亚 门。 图1 - 3图1 - 4 图1 3 ：培养初期的菌落形态 图l - 4 ：培养初期的菌丝形态。 f i g i 一3 ：t h ec o l o n yo f m a r i n ef u n g u s1 8 9 3a ti n i t i a ls t a g e s f i g , l - 4 ：t h em y c e l i u r ao f m a r i n ef u n g u s1 8 9 3a ti n i t i a ls t a g e s 8 山大学硕十学位论文海洋真菌1 8 9 3 发酵培养条件及杀虫活件物质的扔步研究 图卜5 图1 - 5 ：培养中期的菌丝形态 图t - 6 ：培养后期的菌丝形态。 f i g 1 5 ：t h em y c e l i u mo f m a r i n ef u n g u s1 8 9 3a tm a t a p h a s e f i g 1 - 6 ：t h e m y c e l i u m o f m a r i n e f u n g u s1 8 9 3 a t a n a p h a s e 图卜7 图1 7 ：螺旋状的分生孢子， 图1 - 8 ：逆境f 产生的厚垣孢子。 f i g 卜7 ：t h eh e l i c a lc o n i d i u m f i g i 8 ：t h ec h l a m y d o s p o r e i na d v e r s ee n v i r o n m e n t 9 图1 - 6 图卜8 【i i 山大学礤+ 学位论文海洋真菌1 8 9 3 发酵培养条件及杀虫活性物质的初步研究 1 3 讨论 1 3 1 真菌的培养条件 温度是影响微生物生长的一个重要因子。温度太低，可使原生质膜处于凝 固状态，不能正常地进行营养物质的运输或形成质子梯度，因面生长不能进行 ( 黄秀梨，2 0 0 3 ) 。当温度升高时，细胞内的化学和酶反应以较快地速率进行， 生长速度加快。然而，当超过某一温度时，蛋白质、核酸和细胞的其他成分就 会发生不可逆地变性作用。因此，只有在最适温度时，微生物的生长速度最快， 长势最好，产生的代谢产物量也最大。大多数真菌最适生长的温度在2 5 3 0 之问。实验得出，海洋真菌1 8 9 3 的最适温度为2 5 ，在此温度下的生长速度 最快，达到了9 0 6 m m d 。 介质p h 影响微生物生活环境中营养物质的可给态和有毒物质的毒性，影 响菌体细胞膜的带电荷性质、膜的稳定性及对物资的吸收能力，使菌体表面蛋 白交性或水解，因此每种微生物都有一个可生长的p h 范围( 黄秀梨，2 0 0 3 ) ， 大多数真菌适合在p h 为2 9 的环境内生长本研究发现，海洋真菌1 8 9 3 在 p u 3 t 0 的范围内均能生长，在p i 为7 时的生长速度最快，这为其发酵液的配 翻提供了参考条件。 1 3 2 真菌的分类方法 传统的真菌分类方法主要是依据真菌的形态、细胞生理和生化，尤其是有 性生殖阶段的形态特征进行分类。但这种分类方法有很大的局限性，很多情况 下难以得到所有有用的分类特征，并且培养基中发现的一些特性与真菌自然特 性问有一定差距 近年来随着多门新兴学科和技术的发展，尤其是分子生物学技术的兴起， 真菌分类学获得了很大的推进。d n a 中g + ct 0 0 1 含量的测定是最早用于真菌分 类学研究的分子生物学技术之一，即利用真菌d n a 中核酸序歹i j 的同源往及基因 大小相似性的遗传特征，来测定d n a 中的碱基含量( g + cm 0 1 含量) ，以此作为 真菌分类鉴定的重要遗传指标之一。s t o r c k 等( 1 9 6 4 ) 就利用此方法系统研究 了真菌的d n ag + ct 0 0 1 ，并以此为指标对真菌的分类鉴定作出了实质性评价。 1 0 山大学硕十学位论丈 海 f 真菌1 8 9 3 发酵培养条件成杀虫洒件物质的扔步研究 随后核酸杂交技术也被引进了真菌分类学，c l e t u s 等( 1 9 9 3 ) 首先丌展对黄 曲霉群中各菌种的d n a 关系研究，黄曲霉( d s p e r g j j u s ，1 a v u s ) 和寄尘曲霉 ( d s p e r g j i i u s p a r a s t i c u s ) 显示7 9 的d n a 杂交率，而集峰曲霉( a s p e r g i l l u s n o m i u s ) 和黄曲霉的d n a 杂交率只有3 9 。从而建议把黄曲霉和寄生曲霉划为 黄曲霉的两个变种，而集峰曲霉则划分为一个新种。现在限制性酶切片段长度 多态性分析也被开始用于真菌的分类，6 a r y 等( 1 9 9 1 ) 利用此方法，对1 2 株 不同来源的白色念珠菌r d n a 进行了限制性酶切片段长度多态性分析，得出将 e e o ri 、h i n fi 以及其它限制性内切酶的r f l p 联系起来，作为念珠菌的分类 工具的结论。目前，在真菌分类中应用最为广泛的是r d n a 序列分析法，真菌基 因组中编码核糖体的基因包括4 种，2 5 sr d n a 、5 sr d n a 、1 8 sr d n a 和5 8 sr d n a 。 这4 种核糖体基因及间隔区有不同的进化程度，有的序列比较保守，有的序列 进化较快，因此可以根据它们的序列，将真菌鉴定到属及属以上、种、亚种、 变种、甚至菌株的水平( 蒋盛岩等，2 0 0 2 ) 。需要指出的是任何一种好的分类学 技术指标仍不能单独用于物种分类，必须结合多个可靠的分类指标，如形念性 状、生理性状、生化性状乃至基因水平的指标综合考虑。在此基础上才可能建 立符合客观规律的真菌分类系统。张志华等( 2 0 0 1 ) 综合利用形念观察、生理 特征及核糖体1 8 s r d n a 序列对一株具有细胞毒活性的海洋真菌0 9 4 8 1 l 进行了鉴 定，发现菌株0 9 4 8 11 的形态、生理特征及其核塘体1 8 s r d n a 序列特征具有很好 的一致性，最终鉴定该真菌为泡盛曲霉( a s p e r g i l l u sa 髓彻 根据真菌鉴定手册，h e h c o o nm o r g a n 属主要有以下分类特征：( 1 ) 分生 孢子不串生，单枝或极少分枝，分生孢子不溢束；( 2 ) 腐生或偶尔寄生予其他 真菌上；( 3 ) 分生孢子梗密集成坚实的结构；( 4 ) 分生孢子作立体的卷曲， 形成腰鼓形或圆筒形的孢子体。根据海洋真菌1 8 9 3 的显微照片，均可以发现这 些特征，因此将其仞步归为陔属。其相关的生理生化和分子方面的特征还有待 进一步的研究。 t l 山大学硕十学位论文i l 咔 f 真曲1 9 9 3 发酵培养条件发杀虫酒件物质的仞步研究 第2 章海洋真菌18 9 3 发酵条件及培养基配方的优化 2 1 材料和方法 2 1 1 材料 2 1 1 1 供试幼虫 白纹伊蚊幼虫( a e d e sa i b o p i c t u s ) ：中大校园内采集后，经室内繁殖三代 后所得的健康三龄幼虫。 2 1 1 2 供试菌株 海洋真菌1 8 9 3 菌株，中山大学化学与工程学院林永成教授惠赠。 2 i i 3 培养基 p d a 培养基：葡萄糖2 0 9 、琼脂粉1 8 9 、马铃薯2 0 0 9 ( 去皮) 、蒸馏水1 0 0 0 m l ， 自然p h 。 a ：葡萄糖2 0 9 、马铃薯2 0 0 9 ( 去皮) 、粗海盐2 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l ，自然 p h b ( g d p 培养基) ：葡萄糖1 5 9 、酵母膏2 9 、蛋白胨2 9 、粗海盐2 9 、蒸馏水 1 0 0 0 m l p h - - - - 6 5 7 0 。 c ：可溶性淀粉1 5 9 、酵母膏4 9 、粗海盐2 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h = 7 o 7 5 。 d ：酵母膏2 9 、蔗糖1 5 9 、m g s o ；7 h ：00 5 9 、粗海盐2 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h = 7 o 7 2 。 e ：麦芽糖1 5 9 、蛋白胨2 9 、粗海盐2 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h = 6 5 7 0 。 f ：甘油l ol l l l 、蛋白胨2 9 、c a c 嘎0 5 9 、粗海盐2 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h = 7 o 7 2 。 g ：葡萄糖l o g 、牛肉膏5 9 、蛋白胨l o g 、粗海盐2 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h = 7 0 7 2 。 山大学碰十学位论文海洋真菌18 9 3 发酵培养条件及杀虫活件物质的初步研究 2 1 1 4 主要设备及化学试剂 2 1 1 4 1 主要设备 s i g m a 冷冻台式离心机：s i g m a 仪器公司 j a 2 0 0 3 型电子天平：上海天平仪器厂生产 b s i e 型振荡培养摇床：金坛市富华仪器有限公司 y x 2 8 0 b 手提式不锈钢蒸气消毒器：上海三申医疗器械有限公司 净化工作台：苏州净化设备有限公司 2 l1 4 2 主要化学试剂 葡萄糖、麦芽糖、蔗塘、乳耱、碳酸钙( c a c o 。) 、硫酸镁( m g s o , 7 h ：0 ) 、可 溶性淀粉、蛋白胨、琼脂粉、甘油、酵母膏、牛肉膏均为分析纯。 2 1 2 方法 2 1 2 1 发酵条件的优化 2 1 2 1 1 最适发酵时间的选择 将在p d a 平板上培养4 天的海洋真菌1 8 9 3 用打孔器( 内径5 哪) 沿菌落边 缘打孔，挑取生长一致的菌饼，转接到装有2 5 0 m l g d p 发酵培养液的5 0 0 r a l 三角 瓶中，2 5 1 2 1 6 0 r m i n 振荡培养，分别于接种后第1 0 天、第1 2 天、第1 4 天、 第1 6 天、第1 8 天、第2 0 天、第2 2 天、第2 4 天、第2 6 天、第2 8 天和第3 0 天各取一瓶发酵液，过滤，离心，测其粗提液的p h 值，将粗提液浓缩2 0 倍后， 用灭菌水配成0 3 5 m l m l 的药液，测其对三龄白纹伊蚊幼虫的活性，以无菌培 养液为对照，过滤后所得的菌丝烘干至衡重，称重。实验重复三次。 2 1 2 1 2 最适装液量的选择 将在p d a 平板上培养4 天的海洋真菌1 8 9 3 用打孔器( 内径5 m ) 沿菌落边 缘打孔，挑取生长一致的菌饼，分别接种到装有l o o m l 、1 5 0 m l 、2 0 0 m l 、2 5 0 m l 1 4 山大学硕 学位论文 湃 f 真苗l f l 9 3 发酵培养条件及杀虫活忖物质的扔步研究 和3 0 0 m l g d p 发酵培养液的5 0 0 r a l 三角瓶中，2 8 。c1 6 0 r m i n 振荡培养1 8 天后终 止培养，取发酵液过滤，离心，测其裉提液的p h 值，租提液经冷冻浓缩2 0 倍 后，用灭菌水配成0 3 5 m l m l 药液，测定其对三龄白纹伊蚊幼虫的活性，以无菌 培养液为对照，过滤后所得的菌丝烘干至衡重，称重。实验重复三次。 2 1 2 2 发酵培养基配方的优化 2 1 2 2 1 最适培养基的选择 菌丝生长速率的测定：将a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 七种培养基分别加琼脂， 制成固体培养基。将在p d a 平板上培养4 天的海洋真菌1 8 9 3 用打孔器( 内径 5 w ) 沿菌落边缘打孔，挑取生长一致的菌饼，移至含不同培养基的平板中央， 每个平板接种一块，每种培养基重复5 次。接种后置2 5 培养箱中培养，每天 观察菌落的形态并测量菌落直径，计算生长速率，计算公式同( 卜1 ) 。实验结 果用s p s s l 3 0 进行单因素方差分析。 生物活性的测定：将在p d 平板上培养4 天的海洋真菌1 8 9 3 用打孔器( 内 径5 m ) 沿菌落边缘打孔，挑取生长一致的菌饼，接种a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 七种培养基各两瓶，2 5 1 2 1 6 0 r m i n 振荡培养1 8 天后终止培养，过滤，离心， 所得滤液经冷冻浓缩2 0 倍后，用灭菌水配成不同浓度的药液，测其对伊蚊幼虫 的毒力，过滤后所得菌丝烘干至衡重，称重，实验重复3 次。实验结果用s p s s l 3 0 进行单因素方差分析。 2 1 2 2 2 碳源的选择 将筛选出来的基本培养基中的蔗糖分别换成麦芽糖、淀粉、葡萄糖、乳 糖，比例均为1 5 ，其他成分不变，组成四种不同的培养基，将在p d a 平板 上培养4 天的海洋真菌1 8 9 3 用打孔器( 内径5 哪) 沿菌落边缘打孔，挑取生长 一致的菌饼，分别接种这四种培养基，在2 5 1 2 1 6 0 r m i n 振荡培养，1 8 天后终 止培养，过滤，离心，所得滤液经冷冻浓缩2 0 倍后，用灭菌水配成0 3 5 m l m l 的药液，测其对伊蚊幼虫的毒力，以无菌培养液为对照，过滤后所得菌丝烘干 j 山大学顾十学位论文海洋真菌1 8 9 3 发酵培养条件及杀虫话竹! 物质的初步研究 至衡重，称重，实验重复3 次。实验结果用s p s s l 3 0 进行单因素方差分析。 2 1 2 2 3 氮源的选择 将筛选出来的基本培养基中的酵母膏分别换成蛋白胨、牛肉膏，比例均为 0 2 ，其他成分不变，组成两种不同的培养基，将在p d a 平板上培养4 天的海 洋真菌1 8 9 3 用打孔器( 内径5 m ) 沿菌落边缘打孔，挑取生长一致的菌饼，分 别接种这两种培养基，在2 5 1 6 0 r m i n 振荡培养，1 8 天后终止培养，过滤， 离心，所得滤液经冷冻浓缩2 0 倍后。用灭菌水配成0 3 5 m l m l 的药液，测其对 伊蚊幼虫的毒力，以无菌培养液为对照，过滤后所得菌丝烘干至衡重，称重， 实验重复3 次。实验结果用s p s s l 3 0 进行单因素方差分析。 2 。1 2 2 4 最佳培养基配方的优化 采用正交设计法，选择l 畸( 3 1 ) 正交表，设计了筛选出来的培养基的营养成分 蔗糖、酵母膏、粗海盐、m g s 0 4 7 h 。0 的水平，组成了九种不同配方的培养基， 进行了九次试验。将海洋真菌1 8 9 3 分别接种到这九种培养基中，2 5 1 6 0 r m i n 振荡培养1 8 天后终止培养，过滤，离心，将滤液冷冻浓缩z o 倍后配成不同浓 度的药液，测其对白纹伊蚊幼虫的活性，以无菌培养液为对照，所得菌丝烘干 至衡重，称重实验重复3 次，实验结果用生物统计软件s a s 进行分析。因素 水平见表2 - 1 。 表2 - i 正交实验联幻中的影响因素及水平 t a b l e2 - 1f a c t o r sa n dt e s tl e v e l so f o r t h o g o n a lt e s t 1 6 f 山大学硕十学位论文 海 r 真曲1 9 9 3 发酵培养餐件及杀虫洒件物质的初步研究 2 2 结果 2 2 1 发酵条件的优化结果 2 2 1 1 最适发酵时间的优化结果 0 7 5 雾o 7 警o 6 5 銮n 6 岛0 5 5 篁o ，5 豢o 4 5 0 4 1 01 21 41 61 82 0 2 22 42 62 83 0 培养时间( d ) 图2 - l 发酵时间对代谢产物杀虫活性的影响实验重复3 次。 f i g 2 - 1e f f e c to f c u t i v a f i o nt i m eo l lp e s t i c i d a la c t i v i t yo f t l m c t a b o l i t e t e s tw a sr e p e a t e dt h r e e 2 4 2 3 2 2 2 t 2 1 8 l 1 7 1 6 l j 1 5 o j l l j l j l l o l o 1 2 1 4 1 6 1 82 0 2 2 2 42 62 83 0 培养时p 4 ( d ) 矗8 & 6 & 4 8 2 8 7 8 t 6 7 4 7 2 例2 - 2 发酵时间对菌丝干重和代谢产物p h 的影响。实验重复3 次。 f i g , 2 2e f f e c to fc u t i v a t i o nt i m eo l lm y c e t i a ld r yw e i g h ta n df i n a