（农业昆虫与害虫防治专业论文）昆虫病原线虫共生菌中plu4436基因的克隆与表达.pdf

论文题目： 专业： 硕士生： 指导老师： 昆虫病原线虫共生菌中p l u 4 4 3 6 基因的克隆与表达 农业昆虫与害虫防治 石微 邱礼鸿副研究员 摘要 昆虫病原线虫( e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s ，e n ) 现已成为一类新型生物杀 虫剂，己商品化并成功用于防治多种害虫。昆虫病原线虫共生菌在e n 对害虫的 致病力中起关键性作用。共生菌分泌的杀虫毒素具有高效、杀虫谱广的优点，已 受到广泛关注。对这类杀虫毒素进行深入研究，可将其基因转入植物，或者构建 高效表达系统生产杀虫毒素直接用于害虫防治，有助于延缓害虫对转b t 基因抗 虫作物的抗性压力，扩大转基因抗虫作物的抗虫谱。 本研究用p c r 方法从昆虫病原线虫共生菌株中扩增到t p l u 4 4 3 6 基因。将其 连接至t p q e 3 0 载体上，并在大肠杆菌中进行诱导表达，得到了p l u 4 4 3 6 蛋白。利 用n i n t a a g a r o s e 对该蛋白进行纯化，用p l u 4 4 3 6 蛋白对四种鳞翅目昆虫棉铃虫、 斜纹夜蛾、甜菜夜蛾以及粉纹夜蛾的初孵幼虫进行了口服毒力测定，发现p l u 4 4 3 6 蛋白对以上四种试虫均没有毒性。这一结果说明p l u 4 4 3 6 蛋白单独表达可能没有 杀虫活性，需要和其他蛋白联合作用才具有杀虫功效。 关键词：昆虫病原线虫共生菌，p l u 4 4 3 6 基因，克隆表达 t i t l e ：c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fp l u 4 4 3 6g e n ef r o ms y m b i o t i cb a c t e r i ao f e n t o m o p a t h o g e n i cn e m o t o d e s m a j o r ：a g r i c u t u r a li n s e c t sa n dp e s t sc o n t r o l n a l n e ：s h iw e i s u p e r v i s o r ：q i ul i h o n g ，p h d a b s t r a c t e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s ( e n ) h a v eb e e nu s e da sb i o l o g i c a lc o n t r o la g e n t b a c t e r i ao ft h eg e n e r ax e n o r h a b d u sa n dp h o t o r h a b d u sh a v eam u t u a l s y m b i o t i c r e l a t i o n s h i pw i t he n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e so ft h ef a m i l i e ss t e i n e m e m a t i d a ea n d h e t e r o r h a b d i t i d a e ，r e s p e c t i v e l y t h e b a c t e r i a p l a y a n i m p o r t a n t r o l ei nt h e p a t h o g e n i c i t yo ft h ee na n db a c t e r i ac o m p l e xt oi n s e c tp e s t s i tw a sf o u n dt h a ts o m e t o x i n so fe ns y m b i o t i cb a c t e r i ac o u l de f f e c t i v e l yk i l law i d er a n g eo fi n s e c t s g e n e s e n c o d i n gt h e s et o x i n st h e r e f o r eb e c o m ep o t e n t i a la l t e r n a t i v e so ft o x i ng e n e sf r o m b a c i l l u st h u r i n g i e n s i sf o rt h ed e v e l o p m e n to fn o v e lt r a n s g e n i ci n s e c t r e s i s t a n tp l a n t s i nt h ep r e s e n ts t u d y , p l u 4 4 3 6g e n ew a so b t a i n e d b yp c ra m p l i f i c a t i o nf r o m p h o t o r h a b d u sl u m i n e s c e n e st t 0 1 i tw a sl i g a s e dt o p l a s m i dp q e 3 0 ，a n dt h e n e x p r e s s e di nec o l i t h ep l u 4 4 3 6w a sp u r i f i e dw i t hn i n t aa g a r o s e t h eo r a l t o x i c i t yo ft h er e s u l t e dp l u 4 4 3 6t ot h en e o n a t eo fh e l i c o v e r p aa r m i g e r a ，s p o d o p t e r a e x i g u a ，s p o d o p t e r al i t u r aa n dt r i c h o p l u s i an iw a st e s t e d f h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e p l u 4 4 3 6h a v en oo r a lt o x i c i t yt oa l lo ft h ei n s e c t st e s t e d k e y w o r d ：e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s ，s y m b i o t i cb a c t e r i a ， p l u 4 4 3 6g e n t ，c l o n ea n de x p r e s s i o n 1 1 石微 中山大学硕士学位论文 日i j 舌 昆虫病原线虫共生菌复合体由于具有杀虫谱广、主动搜索害虫的能力，已 成为生物防治的方法之一。现已描述的共生菌有两个属：致病杆菌属 ( x e n o r h a b d u s ) 和发光杆菌属( p h o t o r h a b d u s ) 。当线虫主动侵染昆虫后，其肠 道中的共生菌被释放入昆虫血腔，共生菌在血腔中大量繁殖，释放毒素，导致昆 虫迅速死亡( f f r e n c h c o n s t a n t e t a l ，2 0 0 2 ) 。 由于发光杆菌属和致病杆菌属共生菌不能在土壤或水中长时间生存，所以它 们不能直接作为生物杀虫剂使用，但是可以将它们的毒素基因转入其他细菌、微 生物或植物中开发利用。近年来在e n 共生菌有生物活性代谢产物，如抗生素， 杀虫毒素蛋白等的基础和开发研究方面取得的突破性进展也引起了广泛的重视， 成为另一研究热点。自从1 9 9 8 年b o w e n 等在s c i e n c e 上报道了从e n 共生菌中 发现了多个类型的蛋白毒素以来( b o w e ne t a l ，1 9 9 8 b ) ，现己从e n 共生菌中发现 了多个类型的蛋白毒素，不同类型的蛋白毒素的杀虫谱不同，杀虫机理也不同。 2 0 0 3 年完成的共生菌只l u m i n e s c e n st i 0 1 菌株的全基因组测序结果显示，该 菌株中含有8 类至少4 0 个毒素基因，是目前已完成全基因组测序的细菌中拥有 杀虫毒索基因种类和数量最多的菌株( d c c h a u de t a l ，2 0 0 3 ) 。 目前，关于共生菌基因组和后基因组的研究更是将共生菌的研究，尤其是毒 素基因的研究，推向了一个新的高度。这些研究不仅为寻找新的毒素基因应用于 生产提供理论依据，而且使共生菌的抗菌抗肿瘤活性机制及共生菌与线虫之间的 共生关系等基础研究更加深入。 本文对实验室所保藏的共生菌中的p l u 4 4 3 6 基因分布情况进行了调查，并用 p q e 3 0 作为表达载体对p l u 4 4 3 6 基因进行了克隆、表达及蛋白功能分析。结果发 现其对棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾的初孵幼虫都没有口服毒性。 石微中山大学硕士学位论文 第一章昆虫病原线虫共生菌杀虫毒素的 研究进展 1 1 引言 昆虫病原线虫共生菌是存在于昆虫病原线虫( e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s ， e n ) 肠道内的一类细菌，革兰氏染色阴性，属肠杆菌科( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) ( t h o m a sa n dp o i n a r ，1 9 7 9 ) 。现已描述的共生菌有两个属致病杆菌属 ( x e n o r h a b d u s ) 和发光杆菌属( p h o t o r h a b d u s ) ，其中，x e n o r h a b d u s 与斯氏属线 虫( s t e i n e r n e m a ) 共生，p h o t o r h a b d u s 与异小杆属线虫( h e t e r o r h a b d i t i s ) 共生 ( p o i n a r1 9 9 0 ) 。由于线虫一共生菌复合体具有杀虫能力强、杀虫谱广的优点， 已成为引人注目的新型生物杀虫剂( k a y ae ta 1 ，1 9 9 3 ) 。共生菌与线虫的共生关 系可以概括为：共生菌存在于线虫的肠道内，线虫携带共生菌进入寄主昆虫体内， 并将共生菌释放到昆虫的血腔中；线虫保护共生菌不受寄主免疫反应的影响；共 生菌在昆虫血腔内繁殖，产生毒素和抑菌物质，导致昆虫患败血症，并在4 8h 内死亡；共生菌能分解营养物质，提供线虫繁殖发育所需的营养；同时共生菌产 生的抗菌素，能抑制其它杂菌的侵染，为线虫的生长、发育和繁殖提供理想的环 境( b o e m a r ee ta 1 ，1 9 9 6 ) 。图1 - 1 为两类共生菌的共生线虫生活史示意图 ( f f r e n c h - c o n s t a n t e ta 1 ，2 0 0 2 ) ： 链 私 凰矿哟 图l - 1 两类共生菌的共生线虫生活史 f i g 1 - 1l i f ec y c l e so fb a c t e r i u m - n e m a t o d e ss y m b i o s e s 石微 中山大学硕士学位论文 斯氏线虫和异小杆线虫的生活史及携带共生菌的形式明显不同，斯氏线虫在 寄主体内第一代是雌雄异体，其共生菌x e n o r h a b d u s 存在于线虫肠道内的一个特 殊囊状结构内( v e s i c i e s ) ；异小杆线虫在寄主体内第一代是雌雄同体，其共生菌 p h o t o r h a b d u s 则直接存在于线虫肠道内( b i r d e ta 1 ，1 9 8 3 ；p o i n a r , 1 9 9 0 ) 。 目前，关于共生菌杀虫毒素基因的克隆的研究已有了长足的发展，已有一些 毒素基因在异源生物中得到了表达，其中最引人注目的就是已将t c d a 转入模式 生物拟南芥中，成功表达了极高抗虫活性的蛋白( l i ue ta 1 ，2 0 0 3 ) 。未来的研究 将更多的集中于阐明毒素蛋白作用过程或激活过程中胞外蛋白酶所扮演的角色， 毒索蛋白的输出机制，毒素蛋白的联合表达网络和开发高效广谱的毒素基因等 等。 1 2 昆虫病原线虫共生菌 1 2 1 分类地位 昆虫病原线虫共生细菌属杆菌目、肠杆菌科( a k h u r s t1 9 8 3 a ，1 9 8 3 b ；a g u i l l e r a e ta 1 ，1 9 9 3 ) ，它们是一特殊的肠杆菌科细菌，因为这些细菌呈硝酸还原酶阴性。 x e n o r h a b d u s 为过氧化氢酶阴性：p h o t o r h a b d u s 为过氧化氢酶阳性，而且能产生 荧光物质。在人的伤口处曾分离到p h o t o r h a b d u s ，但是经权威医院的临床观察， 发现从伤口处分离到的p h o t o r h a b d u s 在正常条件下对人没有致病性( g e r r a r d ， 2 0 0 3 ) ；而且通过d n a - d n a 杂交实验表明这些菌株明显不同于其它与昆虫病原 线虫共生的p h o t o r h a b d u s 属细菌( a k h u r s t ，1 9 9 6 ) 。 1 9 9 3 年前，所有共生菌均属于一个属娩n d 砌口胁s ( a k h u r s t ， 1 9 8 3 a ，1 9 8 3 b ，1 9 8 8 ) ；后来，b o e m a r e 等根据d n a - d n a 杂交实验结果及细菌生 物学特性的不同，将共生菌分为两个属：和斯氏线虫共生的定为x e n o r h a b d u s 属， 和异小杆线虫共生的定为p h o t o r h a b d u s 属。其中，x e n o r h a b d u s 中已定名的有9 个种：盖n e m a t o p h i l a ，盖p o i n a r i i ，丑b o v i e n i i ，xb e d d i n g i i ，丑j a p o n i c a ，丑 b u d a p e s t e n s i s ，xe h l e r s i i ，xi n n e x i 和丑s z e n t i r m a i i ，还有一些细菌尚未定种。 p h o t o r h a b d u s 属现已描述的有3 个种：pl u m i n e s c e n s 、只t e m p e r a t a 和只 a s y m b i o t i c a ，其中只l u m i n e s c e n s 又包括了3 个亚种，分别是l u m i n e s c e n s 、a k h u r s t i i 3 石微中山大学硕士学位论文 和l a u m o n d i i ，只a s y m b i o t i c a 又含有两个亚种：a s y m b i o t i c a 和a u s t r a l i s ( p e e l e ta 1 ， 1 9 9 9 ) 。 1 2 2 型变 型变( p h a s ev a r i a t i o n ) 是共生菌的一个重要特性。i 型菌与i i 型菌代谢途径 的不同及其对线虫产量和质量的影响，型态变异是近年来国际研究的热点。 昆虫病原线虫共生菌的型变最初被描述为两型现象，根据其在琼脂培养基上 产生两种形态的菌落，及它们吸收染料能力的不同，定为初生型和次生型 ( a k h u r s t ，1 9 8 0 ) 。初生型菌具备的一些生理生化特性，如能吸收染料、分泌蛋 白酶和脂酶、产生胞内晶体蛋白、抑菌物质、色素及荧光素( 荧光素只对 p h o t o r h a b d u s 而言) ，次生型菌皆不具备或仅有少量的上述代谢物产生，但次生 型菌更能有效地利用营养物质。 侵染期线虫只携带初生型菌，次生型菌则出现在初生型菌的体外培养物中， 二者在生理生化方面有明显的区别，初生型菌能为线虫提供更好的生长、发育、 繁殖条件。线虫和初生型菌一起培养时，其产量明显高于与次生型菌一起培养时 的产量( a k h u r s te ta 1 ，1 9 9 0 ) 。当初生型菌和次生型菌共同和线虫培养时，只有 初生型菌能被线虫携带。 共生菌的型变曾被认为是污染的结果，但a k h u r s t & b o e m a r e ( 1 9 9 4 ) 借助 d n a 杂交证明，两种菌型具有1 0 0 的同源性。对于x e n o r h a b d u s 而言，这种型 变是可逆的，即初生型菌可以转变为次生型菌，次生型菌在一定条件下也可转变 为初生型菌( a k h u r s te ta 1 ，1 9 9 2 ) ：而对于p h o t o r h a b d u s 而言，次生型菌不能转 变为初生型菌( h u r l b e r te t a l ，1 9 8 9 ) 。 型变产生的机制仍不清楚，虽然已提出若干学说，但均未被广泛接受。进一 步阐明线虫和共生菌的互惠共生关系，对线虫的商品化生产也有重大的意义。 1 2 3 线虫及共生菌的安全性 利用线虫防治害虫，一般采用的方法是在害虫生境中释放侵染期线虫，因此 必须考虑线虫及其共生菌对非靶标生物的安全性。 p o i n a r ( 1 9 8 2 ) 首次报道了昆虫病原线虫共生菌对温血脊椎动物的影响，他 石微中山大学硕士学位论文 们以活的共生菌皮下注射鸡和小白鼠，实验动物未表现任何病状。o b e n d o r f 等 ( 1 9 8 3 ) 将共生菌xb o v i e n i i 通过口服、皮下注射、呼吸道及皮肤接触，对家兔、 猪、小白鼠进行安全性检测，没有发现此种共生菌的侵染性、致病性和毒性。其 它几种共生菌的菌株通过皮下注射、皮肤接触的方式在小白鼠身上检测，也没有 发现不良反应。 在国内，王进贤等( 1 9 8 3 ；1 9 8 4 ) 通过口服、腹腔注射的方式用格氏线虫( s g l a s e r i ) 对小白鼠、家兔以及与人类相近的高等动物猕猴进行了安全性实验， 被测动物均无异常现象，未发病或死亡，说明格氏线虫对高等生物是无害的。 通过上述实验结果，可以认为线虫共生菌复合体对环境和人畜是安全的。 目前，已广泛应用于防治各种隐蔽性钻蛀害虫和地下害虫( g a u g e r & k a y a ， 1 9 9 0 ) 。 1 3 共生菌基因组和后基因组的研究进展 现代分子生物学一个重要的里程碑就是关于基因组的研究，随着研究手段和 研究材料的日益多样化，基因组学的研究以惊人的速度前进。不仅如此，后基因 组学概念的提出、完善以及广泛应用，使其和基因组学研究相辅相成，推动着我 们的认识和科学的发展。 2 0 0 0 年f f r e n c h c o n s t a n t 等对w 1 4 基因组部分测序首先在共生菌基因组学研 究中迈出了第一步。2 0 0 3 年d u c h a u d 等完成了p h o t o r h a b d u sl u m i n e s c e n e ss u b s p 。 l a u m o n d i i 品系t t 0 1 全序列的测定。这些工作确定了大量的杀虫毒素基因序列、 抗菌的毒素基因、大量牵涉到黏附过程的基因以及共生菌的代谢调控方面的基 因。这些研究不仅可为寻找新的毒素应用于生产提供理论依据，而且能使共生菌 的抗菌抗肿瘤活性，共生菌与线虫之间的共生关系等基础研究更加深入。 1 3 1 只l u m i n e s c e n sw 1 4 基因组部分序列的研究 在对rl u m i n e s c e n sw 1 4 基因组部分序列的研究中，首先建立部分基因组文 库进行测序，再与大肠杆菌ec o l i k l 2 2 基因组比对分析，以及与g e n b a n k 中的 已登录基因进行b l a s t x ( f h e n c h - c o n s t a n te ta 1 ，2 0 0 0 ) 。通过与ec o l ik 1 2 2 的基 因组比对分析可以看出，同属肠杆菌科，它们拥有一定量的保守序列，但是有 石微中山大学硕士学位论文 1 1 3 3 个只l u m i n e s c e n sw 1 4 的克隆与ec o l ik 1 2 2 中序列的相似性极低，可以推 断出有5 3 的rl u m i n e s c e n sw 1 4 基因组序列是完全区别于ec o l ik 1 2 2 基因组 的。 与g e n b a n k 中的已登录基因进行b l a s t x 的结果表明：只l u m i n e s c e n sw 1 4 基 因组中，除已报导的t c 位点，还存在其他一定量的类似于把的序列，并且存在 类似r t x 毒素及溶血素，这些物质也许在攻破昆虫的免疫系统方面起着重要的作 用，并且这类毒素基因的种类众多也表明发光杆菌属细菌产生各种毒力因子以加 强其抗虫活性。只l u m i n e s c e n sw 1 4 基因组中还检测到与其他种类毒素同源的基 因，比如发现了几丁质酶，有可能在降解昆虫外骨骼方面起作用。 1 3 2p h o t o r h a b d u sl u m i n e s c e n st t 0 1 基因组的研究 p h o t o r h a b d u sl u m i n e s c e n st t 0 1 基因组测序的完成，使人们对发光杆菌属中 与共生及毒素相关基因有了一个较为全面的把握：菌株t r 0 1 的染色体为单链环 状，包含5 ，6 8 8 ，9 8 7 个碱基，g c 含量为4 2 8 ，没有发现质粒：共有4 ，8 3 9 个蛋 白编码序列，包括了1 5 7 个假基因，7 套完整的核糖体r n a 操纵子和8 5 个t r n a 基因。在p h o t o r h a b d u s l u m i n e s c e n s t r 0 1 基因组中预测到的毒素基因已超过了其 他已测序的细菌基因组( d e c h a u de t 以，2 0 0 3 ) 。这些大量的毒素基因可能是起增 强毒性的作用，也有可能是冗余使用以保证害虫迅速致死。 菌株t t 0 1 中很多基因都与以前描述过的毒素基因同源，如t c ，m c 并且 包括了t c c 和t c d 位点以及一个不完整的t c a 位点，此外还有5 个新确定的t c 位 点，其中t c c 基因的产物属于一个含重复t y r - a s p 模体的蛋白超家族，这种模体 能与碳水化合物结合，从而可能有利于入侵一系列害虫。 1 3 3p h o t o r h a b d u sl u m i n e s c e n st t 0 1 的蛋白组学研究 为了获得更多关于p h o t o r h a b d u sl u m i n e s c e n s 的型变过程的信息，t u r l i n 等 ( 2 0 0 6 ) 选用菌株t i 0 1 ，将其蛋白组分为三个部分( 胞内蛋白、胞外蛋白、膜 相关蛋白) 进行二维电泳分析。结果表明有一部分蛋白量上调，这可能是由于次 生型菌有更为活跃的胞内代谢过程，或者是储备蛋白为了适应新环境。同时，还 发现了在次生型菌中全局调控因子h n s 的上调，说明h n s 可能是控制共生菌 石微中山大学硕士学位论文 型变的一个关键环节。在分析膜相关蛋白的时候，发现初生型菌和次生型菌有比 较大的差异，因此认为在次生型菌中整个运输系统可能有所改动。p h o t o r h a b d u s l u m i n e s c e n s 的型变是与线虫的共生关系相关的，初生型菌和次生型菌膜表面蛋 白的差异也许可以在一定程度上解释为什么感染期线虫的肠道内不能接纳次生 型菌，为什么次生型菌会出现不同的与细胞膜结构相关表型，比如吸收染料的能 力，菌落形态等。 1 4 共生菌产生的与杀虫活性相关物质 通过系统的研究发现，有多种物质参与共生菌对昆虫的致死作用，包括脂多 糖类物质( l p s ) ( d u n p h y e ta l ，1 9 8 8 ) ，毒素复合体( t o x i n sc o m p l e x ，t c ) ( b o w e n e ta 1 ，1 9 9 8 a ) ，蛋白酶( s c h m i d te ta l ，1 9 8 8 ) ，致软毒素( m c f ) ( d a b o me ta 1 ， 2 0 0 2 ) ，抗生素类( m c l n e r n e ye t a l ，1 9 9 1 ) 等。这些杀虫活性物质在细菌不同生 长阶段产生或存在于细菌细胞的不同位置，共同构成了一个对昆虫的立体防御和 进攻体系。 1 4 1 内毒素 和许多革兰氏阴性细菌一样，昆虫病原线虫共生菌能产生内毒素。其内毒素 是脂多糖类物质( l p s ) ，它是细菌细胞壁的组成成分之一。d u n p h y 和w e b s t e r ( 1 9 8 8 ) 通过鲎变形细胞溶解产物试验( l i m u l u sa m o e b o c y t el y s a t ea s s a y ) 发现， 分别用共生菌的活菌细胞和死菌细胞注射入大蜡螟的血腔，发现l p s 既可以从 活菌细胞也可以从死菌细胞释放出来，但注射到其他非血腔淋巴环境后，l p s 并 不释放出来，说明l p s 需要在寄主昆虫的体液环境刺激下才能释放。对于 x e n o r h a b d u s 而言，纯化的l p s 能致死大蜡螟；而从p h o t o r h a d u s 纯化的l p s 对 大蜡螟没有致死性( c l a r k e ，1 9 9 5 ) 。l p s 作为血细胞毒素，其毒性部分是其类脂 a ，l p s 通过d 氨基葡萄糖苷残基结合外源凝集素包围寄主的血细胞，最终溶解 寄主的血细胞，起到破坏寄主防御反应的作用( d u n p h ye ta 1 ，1 9 8 8 ) 。 7 石微中山大学硕士学位论文 1 4 2 外毒素 共生菌能产生有杀虫活性的外毒素蛋白。这其中研究得较为深入的就是 p h o t o r h a b d u sl u m i n e s c e n sw 1 4 品系中的毒素复合体( t c ) 。与l p s 不同的是，t c 不具有热稳定性。t c 与另一种重要的杀虫蛋白b td 内毒素有明显差异( b o w e n 1 9 9 8 a ；b o w e n1 9 9 8 b ) 。 b l a c k b u r 等( 1 9 9 8 ) 观察注射或饲喂t c 后的胍s e x t a 的幼虫中肠的组织变 化发现，其病理特征与1 c p s 、v i p 3 a ( s u t t e r e ta 1 1 9 6 7 ；k i n s i n g e r1 9 7 9 ；g r i c g oe t a 1 ，1 9 8 0 ) 和c h o l e s t e r oo x i d a s e ( p u r c e l le ta 1 ，1 9 9 3 ) 相似，即首先会在前中肠上皮 组织出现空洞，然后在肠腔中出现细胞碎片，4 8 小时后，空洞出现在整个中肠 并逐渐变大，柱状细胞消失，整个中肠充满着细胞碎片。结果幼虫停止取食，最 后死亡或停止发育。 1 4 3 蛋白酶 现有多篇文献报道了从共生菌的培养液中分离到蛋白酶，这些蛋白酶多为碱 性蛋白水解酶，蛋白酶在共生菌和其宿主的相互作用过程中起着重要的作用。 早期的研究者从共生菌发酵液中纯化到蛋白水解成分，通过与其他昆虫病原 菌产生的蛋白酶分析，推断这些蛋白水解成分可能具有毒性( o n ge ta 1 ， 1 9 9 7 ；s c h m i d te ta 1 1 9 8 8 ；y a m a n a k ae ta l ，1 9 9 2 ) 。或者他们通过血腔注射无细胞培 养液来检测毒力，从而认为蛋白酶活力与毒力有一定联系。 后来b o w e n 等对菌株pl u m i n e s c e n c ew 1 4 中产生的蛋白酶进行了纯化和分 析，认为蛋白酶的作用与t c 是独立的。他们把蛋白酶成分分为三个部分：一个 5 5 k d a 左右的，两个l o k d a 左右的，血腔注射结果表明，上述三种成分对昆虫体 重没有影响( f f r e n c h c o n s t a n te ta 1 ，2 0 0 0 ) 。b o w e n 等人认为不同研究者的结果 之间差异较大是由于所有菌株之间的差异性、共生菌的型变和培养条件的差异造 成的。 为了进一步研究共生菌中的蛋白酶功能，b o w e n 等( 2 0 0 3 ) 对p r t a 蛋白的 生化功能进行了探讨。p r t a 蛋白是一类具有r t x 结构的碱性金属蛋白酶，与酪 蛋白和明胶等底物有高亲和性，并且能被蛋白酶抑制剂抑制。在细菌感染昆虫 石微中山大学硕士学位论文 2 4 小时可检测到p r t a 蛋白活性，推断这种蛋白酶可能在降解昆虫器官的过程中 有重要作用，而不是在攻入昆虫免疫系统中发挥作用的。纯化后的p n a 蛋白对 哺乳动物细胞显示出了毒性，因此它也有可能是在将虫体进行生物转变为细菌和 线虫的食物中发挥作用。 1 4 4 抗生素 共生菌在昆虫体内生长繁殖过程中，除能分泌杀虫毒索蛋白使昆虫迅速死亡 外，还产生抗生素到胞外，阻止其他微生物的入侵，为自身以及其共生线虫提供 一个良好的生长发育环境( a k h u r s t1 9 8 2 ) 。试验证实这类抗生素对植物病原微生 物和医学病原微生物有较强的抗性。具有广阔的应用前景。有意思的是，一些共 生菌分泌的抗生素同时还具有杀虫作用。m c l n e r n e y 等( 1 9 9 1 a ，1 9 9 1 b ) 从 x e n o r h a b d u ss p p 中分离到5 中抗生素，其中x e n o r h a b d i n 2 具有杀虫作用。在 1 5 0 n g c m 2 的浓度下，x e n o r h a b d i n 2 可使1 0 0 夜蛾科昆虫h e l i o t h i s p u n c t i g e r a 的 幼虫死亡，在较低浓度时，存活幼虫的体重也明显降低。 此外，共生菌中分泌其他一些与杀虫活性相关的物质。王立霞( 2 0 0 0 ) 从 兄b o v i e n 越的细胞培养液中分离出一种对棉铃虫、玉米螟有口服和血腔毒性的糖 蛋白；j o y c e 等( 2 0 0 3 ) 的研究证实h e x a 基因所编码的蛋白可能还对pl u m i n e s c e n s k 1 2 2 的杀虫起调节作用，s o u t h e r n 杂交显示h e x a 在共生菌的两个属中普遍存在， 说明h e x a 蛋白对昆虫的致病作用在两个属中可能存在共性。因此，昆虫病原线 虫共生菌对昆虫的致病作用是由多种物质的共同作用结果。 1 5 杀虫毒素基因 目前，已从两种共生菌中克隆到与口服毒性有关的全长毒素基因。这些工作 主要是通过筛选共生菌的质粒文库完成，并通过构建突变株获得关于毒素基因的 更多信息。发光杆菌属的毒素基因和致病杆菌属的毒素基因都有一定程度的同源 性，通过b l a s t 也可以在g e n b a n k 中找到与其他物种中与它们同源的基因。这 些基因的同源性有可能说明了物种间的亲缘关系，也有可能揭示了各种毒素所行 使的功能、作用机理及靶位点。比如t c 产物之间的保守性有可能说明了它们是 9 石微中山大学硕士学位论文 同一种蛋白酶的作用结果( f f r e n c h c o n s t a n te t a l ，1 9 9 9 ) 。 1 5 1 致病基因岛 基因岛是指多个基因组合在一起共同行使一个功能的d n a 区域( h a c k e re t a 1 ，2 0 0 0 ) 。一些微生物的致病基因或共生基因往往以基因岛的形式存在，对致病 基因岛( p a i s ，p a t h o g e n i c i t yi s l a n d s ) 常常还包含一些不稳定区域( h a c k e re ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。 致病基因岛首先是在人的病原性大肠杆菌中被描述的。但是致病基因岛在 无脊椎动物的发病机理中扮演的角色和起源都还不是太清楚( w a t e r f i e l de ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。现在越来越多的研究者开始关注共生菌中的基因岛，它们大多都与致病 性和与昆虫的共生相关( f f r e n c h c o n s t a n te t a l ，2 0 0 2 ) 。共生菌中的致病基因岛主 要包括了t c 基因岛，m c ，基因岛和类d n t 的基因岛。 1 5 2 置n e m a t o p h i l u s 的毒素基因 m o r g a n 等( 2 0 0 1 ) 对xn e m a t o p h i l u sp m l 2 9 6 的粘粒文库进行筛选，发现2 个克隆有杀虫活性，限制性酶切表明，其中一个克隆( c h r l m l ) 就是另一个 ( c h r i m 2 ) 的一部分。对c h r i m l 进行测序分析，发现c h r i m l 含四个完整和 一个不完整的开放阅读框。其中的一些基因被命名为x p t ( x e n o r h a b d u st o x i n p r o t e i n 致病杆菌属毒素蛋白) ，分别为x p t a l 、x p t b l 、x p t c l 、x p t d l 。x p t a l 和x p t a 2 有较大的同源性，并它们之间距离很近，但是它们翻译方向相反可以防止这一区 域d n a 的重组和重排。还有一个基因，预测其编码的蛋白与几丁质酶( c h i t i n a s e ) 有相似性，因此将其命名为c h i 。这些毒素基因，几丁质酶基因，插入序列和t r n a 基因的定位预示：粘粒c h r i m l 所对应的在五n e m a t o p h i l u sp m l 2 9 6 基因组的区 域为一个致病性基因岛。 为了确定这些基因与杀虫活性的关系而对它们进行了转座子突变，实验结果 表明：x p t a l 对毒力的表达起关键作用，x p m 2 、x p t d l 、c h i 对杀虫活性( 菜青虫) 的表达无重要作用，而x p t b l 、x p t c l 有助于完整活性的表达。但是当x p t a l 在大 肠杆菌中单独表达时，其活性却非常低，产物大部分形成包含体，这可能是因为 共生菌细胞内的一些组分有助于其表达或提高其活性。 石微中山大学硕士学位论文 进一步的实验则初步揭示了x p t 基因产物的相互作用。如果x p t b l 和x p t c l 在同种大肠杆菌细胞中表达，其细胞裂解液再与单独表达x p t a l 的细胞裂解液混 合时，则可以恢复对小菜蛾和菜青虫的毒性；如果将表达x p t b l 和x p t c l 大肠杆 菌细胞裂解液与单独表达x p t a 2 的细胞裂解液混合时，则可以恢复对棉铃虫的毒 性。并且它们之间的相互作用可以是体外的，直接通过产物的混合而恢复毒性 ( s e r g e a n te t a l ，2 0 0 3 ) 。 1 5 3 只l u m i n e s c e n sw 1 4 的杀虫毒素基因 在发光杆菌属的生长过程中，产生了若干种可能的毒力因子，并且可在其发 酵液中分离纯化到。主要包括：脂肪酶、蛋白酶、抗生素、脂多糖和毒素复合体 ( t c s ) ( d a b o m e t a l ，2 0 0 1 ) 。 1 5 3 1 缸基因 b o w e n 等对pl u m i n e s e n sw 1 4 的发酵液进行处理：利用d e a e 、凝胶过滤、 h p l c 分离纯化得到四种毒素复合体：t e a 、t c b 、t c c 、t c d ，各复合体又由不同 的亚组分构成( b o w e ne ta 1 ，1 9 9 8 a ) 。纯化得到的t e a 对烟草天蛾有口服及注射 毒性，基因敲除t c a a l 和t c d a l 都能降低正常毒力，这些结果都表明t e a 、t c d 对w 1 4 的毒力贡献最大。 用毒素复合体的单克隆抗体和多克隆抗体筛选只l u m i n e s e n s 的文库，克隆到 了四个编码毒素复合体的位点：t c a 、t c b 、t c c 、t c d 、t c a 和t c c 都是同一类型的操 纵子：含三个同一方向翻译的开放阅读框和一个末端反向翻译的开放阅读框。t c b 和t c d 都是只有单个长开放阅读框的操纵子( f f r e n c h c o n s t a n te t a l ，1 9 9 9 ) 。这些 位点都与g e n b a n k 中的序列的同源性相当低，并且没有相同的分泌信号 ( w a t e r f i e l de ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 但是当把所构建的含t c a 和t c d 的质粒转入大肠杆菌后，毒素都不能被有效 表达，不能重建其对烟草天蛾的毒力。后来w a t e r f i e l d 等的实验表明：当t c c c 和 t c d a b 在大肠杆菌中共表达时，能够恢复其正常毒力，并且要达到最大毒力需要 丝裂霉素c 的加入和把基因自身启动子的使用。在电镜下可观察到，t c d _ 4 b 编码 的复合体有类似于头和尾的亚结构。在其他的杀虫微生物( 致病杆菌属，嗜虫沙 1 1 石微中山大学硕士学位论文 雷氏菌，鼠疫耶尔森氏菌) 中，也发现了象这样的t c d a b 和t c c c 基因的物理连 锁现象。这样的结构也许是由于共享相同小生境( 昆虫) 的细菌之间的基因迁移 的结果( d e c h a u de t a l ，2 0 0 3 ) 。 j ! ! ：b l i j 植i 删j 挂m谚岸弛罐 州封 晋4马，bw1 啊啪s “唱m” 一：奇口j 愚熙爨蟹焉辈淹击 匿圈ij 妊幽缸。t ：。赫瓯霹k 以b l j | | l lli uu 二p - - p l + 一竺唔焉黑哩飘i 圃号 i 面虹j 抽目“脚粕l + 雠新m hll 嘲翮卜i 一一l r 1 百刁i 谲， 图1 - 2rl u m i n e s c e n sw 1 4 中的t c 杀虫毒素基因 f i g 1 - 2g e n o m i co r g a n i z a t i o no f t cl o c if r o mr l u m i n e s c e n sw 1 4 t c 基因岛中包括多个拷贝的t c 基因，这些基因被插入到一个a s p v t r n a 之 中。在这个基因岛中，有3 个拷贝的t c d a 类似基因( t c d a l 、t c d a 2 和t c d a 3 ) 、2 个拷贝的t c d b 类似基因( t c d b l 和t c d b 2 ) 以及5 个拷贝的t c c c 类似基因，这种 基因排序与一种肠道重复共有基因序列( e n t e r i cr e p e t i v e i n t e r g e n i cc o n s e n s u s ， e r i c ) 类似( v e r s a l o v i ce la 1 ，1 9 9 1 ) 。这个基因岛与n r g a 基因相连，n r g a 所编 码的4 - p p a n t 转移酶是肠杆菌素合成所必需的酶，该基因缺失后只l u m i n e s e n s 不 能支持其共生线虫的生长( w a t e r f i e l de ta 1 ，2 0 0 2 ) 。这种连接方式说明这个区域是 一个水平基因重组的热点。 睁 石微 中山大学硕士学位论文 - 】u 一札 1 ；i 图1 - 3 只l u m i n e s c e n s w l 4 基因组中的t c 基因岛 f i g 1 - 3 p u t a t i v ep a lf r o m 只l u m i n e s c e n sw 1 4 s t r a i nc a r r y i n gm u l t i p l er e p e a t e d c o p i e so f t cl i k eg e n e s 1 5 3 2 缸与x p t 或其产物的同源性 m o r g a n 等( 2 0 0 1 ) 在对含x p t 的粘粒进行序列分析的时候，也将其与t c 进行了 比对。结果显示：x p t a l 编码的蛋白与t c b a ：t c d a 、t c a b 、t c c b 、t c c a 都有一 定程度的同源性；x p t a 2 编码的蛋白与t c b a 、t c d a 、t c a b 、t c c b 、t c c a 有同源 性；x p t b l 与t c c c 有4 8 的同源性；x p t c l 与t c a c 有4 9 的同源性；此粘粒中 的x p t d l 为一个不完整的基因，但与t c c b 、t c b a 、t c a b 都有3 1 3 9 的同源性。 1 5 3 3 与其他物种基因的同源性 只l u m i n e s e n sw 1 4 的t c 位点与g e n b a n k 中的序列的同源性都很有限，并且 也没有一致的分泌信号。但是t c a c ，t c d b ，t c c a 的氨基末端都与s p v a 或s p v b ( s a l m o n e l l a 质粒产生的毒力因子) 有一定的同源性( w a t e r f i e l d e t a l ，2 0 0 1 ) 。 2 0 0 0 年，h u r s t 等( 2 0 0 0 )