（农药学专业论文）一种降解酶及其固定化酶对莠去津降解特性研究.pdf

x9 0 5 9 娟 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：至细 导师签名：彩 日 期：兰型、万 山东农业大学硕士学位论义 中文摘要 本文以莠去津作为主要的研究对象，对莠去津的气相色谱测定方法， 莠去津降解酶的提取，固定化酶的制备以及降解酶和固定化酶的特性进行 了研究，并对降解酶和固定化酶在消除生产废水中莠去津的应用前景进行 了初步的探讨。主要内容如下： 1 介绍了莠去津的理化性质、国内外应用概况，以及由于其广泛应用 所带来的环境污染问题；在对前人工作总结分析的基础上，对莠去津在环 境介质中的残留动态、降解代谢、生态毒理、污染治理措施以及生物修复 技术一酶的固定化进行了全面系统的综述，进而提出了作者要研究的问 题。 2 分别测定了降解菌h b 一5 的无细胞培养液、细胞粗酶提取液等对莠 去津的降解能力，从而对莠去津降解酶进行定位。研究证明，对莠去滓的 降解主要是胞内酶在起作用。从高效降解菌h b 5 中提取到的降解酶，在 不含有莠去津的培养基中连续转接7 次，会逐渐丧失对莠去津的降解代谢 活性，由此判断该降解酶不是组成酶，而是诱导酶。 3 初步研究了从高效降解细菌h b 一5 ( a r t h r o b a c t e r ) 中提取的降解酶 的分离条件及降解酶对莠去津的降解性能。以牛血清白蛋白为标准蛋白测 得粗提酶中可溶性蛋白含量为o 6 5m g m l ；该酶在p h8 0 p h9 5 之间， 酶活力均能保持在最高酶活力的8 9 以上，降解莠去津的最适p h 为8 5 ； 在2 5 4 5 的温度范围内能保持较好的降解活性，最适温度为3 5 ： 进一步研究发现，该酶具有较好的热稳定性和p h 稳定性，暴露在温度3 0 4 0 ，p h6 0 p h9 0 的条件下2 h 仍能保持较高的酶活力：该酶与 底物莠去津结合力强，对莠去津具有较好的降解效果，其米氏常数 ，m 为 o 3 4 5 9 m m o ll ，。为o 7 518 p m o l m g - o m i n 。 4 研究了降解酶对其他三氮苯类除草剂的降解能力。结果表明，降解 酶除了对莠去津具有较高的降解能力外，对三氮苯类除草剂扑草净和西玛 津也具有一定的降解代谢能力，尤其对西玛津表现出类似于莠去津的降解 活性。 5 研究了降解酶的固定化方法。选取包埋剂海藻酸钠浓度为2 o 、 3 o 、3 5 、4 o ，固定剂c a c l 2 浓度为2 o 、3 0 、4 0 、5 o 以及 种降解酶及其固定化酶对莠去津降解特性研究 包埋比( 酶液：海藻酸钠溶液( ) ) 为5 0 、2 0 、1 0 、5 ，设计正 交实验。将h b 一5 莠去津降解酶进行固定化，测定不同配比制成的固定化 酶对莠去津的降解特性。研究表明，固定化酶的最佳固定化条件为海藻酸 钠浓度为3 0 ，酶液与海藻酸钠的包埋比为5 ，氯化钙浓度为4 o ， 固定化时间为4 h 。 6 研究了固定化酶对莠去津的降解特性。固定化酶降解莠去津的最适 温度为3 5 。在此温度下，l h 固定化酶对1 0 0 m g l 。莠去津的降解率达到 7 0 2 2 ，在2 0 6 0 温度下酶活力均能保持在6 2 以上：最适p h 值为 8 0 ，但在p h 6 5 9 5 之间，酶活力也能保持在p h8 0 时酶活力的9 4 以上。 在最适环境条件下测得莠去津降解酶的为1 0 3 6 8 9m m o l l ，v m 。为 0 4 2 5 5 p m o l r a i n ，其和。均大于降解酶的j o 和。该固定化酶具有 较好的热稳定性和p h 稳定性，在5 0 。c 和6 0 时保温2 h ，固定化酶的酶活 力下降幅度不大，其剩余酶活力分别为最大酶活力的9 0 9 1 和8 8 9 3 ； 用p h 6 0 和p h 9 0 的缓冲液处理2 h 后，固定化酶的剩余酶活力仍能维持在 9 2 9 9 和9 1 2 9 。固定化酶对莠去滓的降解率随着反应时间的延长而逐 渐升高，反应6 0 m i n ，固定化酶对莠去津的降解率为6 8 7 3 ，继续延长反 应时间，虽然对莠去津的降解率仍逐渐升高，但是升高的幅度降低。重复 利用后的固定化酶对莠去漳的降解活性有所下降，但下降幅度不大，经过 3 次重复利用后，仍能保持7 8 左右的酶活力。较之2 5 的保存温度，固 定化酶更适宜于保存在4 冰箱中，3 5 d 后固定化酶仍保持6 8 4 4 的酶活 力。 7 研究了从莠去津高效降解菌h b 5 中提取到的降解酶及其固定化 酶对生产废水中莠去津的降解。结果表明，反应1 2 0 r a i n ，降解酶对灭菌 和未灭菌生产废水中莠去津的降解率均能超过5 0 ，而固定化酶对莠去津 的降解率在7 0 左右；不管是降解酶还是固定化酶，对未灭菌生产废水中 莠去津的降解率均高于对灭菌生产废水中莠去津的降解率。 关键词：莠去津残留降解酶固定化酶 山东农业大学硕士学位论文 d e g r a d a t i v ec h a r a c t e r i s t i c so fo n ed e g r a d i n ge n z y m ea n d i t si m m o b i l i z e de n z y m et oa t r a z i n e w a n gx i u g u o ( c o l l e g eo f p l a n tp r o t e c t i o n ，s h a n d o n ga g r i c u l t u r eu n i v e r i s t y , t a i 、a l l ，c h i n a ，2 7 1 0 1 8 ) a b s t r a c t i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t a k i n ga t r a z i n ea sap r i m a r ym o d e lp o l l u t a n t ，i t sg c a n a l y t i c a lm e t h o d ，e x t r a c t i o n o fi t sd e g r a d i n ge n z y m e ，i m m o b i l i z a t i o no f d e g r a d i n ge n z y m ea n dd e g r a d a t i v ec h a r a c t e r i s t i c so fi t sd e g r a d i n ge n z y m ea n d i m m o b i l i z e de n z y m e ，w e r es t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y f u r t h e r m o r e ，a p p l i c a t i o no f a t r a z i n ed e g r a d i n ge n z y m ea n di m m o b i l i z e de n z y m et od e g r a d ea t r a z i n ei n a t r a z i n ew a s t e w a t e rw a ss t u d i e d p r e l i m i n a r i l y t h e r e s u l t sc o u l db e s u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t h es i t u a t i o no fa p p l i c a t i o n ，p o l l u t i o na n dm o b i l i t yi ne n v i r o n m e n t ， e c o l o g i c a lt o x i c o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dp o l l u t a n tm a n a g e m e n to fa t r a z i n e ， w h i c hh a db e e na p p l i e de x t e n s i v e l ya l lo v e rt h ew o r l da n dr e c e n t l yi nc h i n a ， w a si n t r o d u c e da n da c c o r d i n g l yt h ei s s u e st h a tw o u l db ei n v e s t i g a t e dw a s p r e s e m e db yt h ea u t h o r 2 t h ed e g r a d a t i o no fa t r a z i n ei nf r e e c e l l ss u p e m a t a n t so fc u l t u r em e d i u m ， p i e c e so fc e l lw a l la n dc r u d ec e l le x t r a c t sw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h e r ew e r en od e t e c t a b l ed e g r a d a t i o ni nf r e e c e l l ss u p e m a t a n t so fc u l t u r e m e d i u ma n dp i e c e so fc e l lw a l l ；b u tn od e t e c t a b l ea t r a z i n ei nc r u d ec e l l e x t r a c t s ，w h i c hd e m o n s t r a t e dt h a ta t r a z i n ed e g r a d i n ge n z y m el o c a t e di n s i d e t h ec e l lo ft h ei s o l a t e ds t r a i nh b 一5 ，w h i c hh a db e e ni d e n t i f i e da sa r t h r o b a c t e r s p 。t h ea t r a z i n ed e g r a d i n ge n z y m ew o u l dl o s si t s m o s ta c t i v i t yw h e nt h e s t r a i nw a sc o n t i n u o u s l yt r a n s f e r r e df o r7t i m e su n d e rt h ec o n d i t i o no f n o n i n d u c e m e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h i se n z y m ew a sa l s oa ni n d u c i b l e o n e 3 d e g r a d a t i v ec h a r a c t e r i s t i c so fd e g r a d i n ge n z y m e ，w h i c hw a se x t m c t e d 3 一种降解酶及其固定化酶对莠去律降解特性研究 f r o ms t r a i nh b 一5 ，t od e g r a d ea t r a z i n ew a sd e t e r m i n e d t h es o l u b l ep r o t e i no f t h ec r u d ee n z y m ew a so 6 5m g 。m l ，d e t e r m i n e dw i t ha l b u m i n ( b o v i n es e r u m ) a ss t a n d a r d t h ed e g r a d i n ge n z y m es h o w e dc o m p a r a t i v e l yg r e a t e s te n z y m a t i c a c t i v i t ya tp h8 5 h i g ha c t i v i t yr a n g i n gp h8 0 - 9 5 t h ed e g r a d i n ge n z y m e a c t i v i t yh a do p t i m u mt e m p e r a t u r eo f3 5 f o re n z y m a t i cd e g r a d a t i o no f a t r a z i n e ，w h i c hw a ss t i l lo v e r8 9 o ft h em a x i m a la c t i v i t yw i t h i nt e m p e r a t u r e r a n g eo f2 5 * c - 一4 5 a d d i t i o n a le x p e r i m e n t a le v i d e n c er e v e a l e dt h a tt h e e n z y m eh a ds o m ee x t e n ts t a b i l i t yf o rt e m p e r a t u r ea n dp h t h ek mv a l u ea n d t h em a x i m a le n z y m a t i cd e g r a d a t i o nr a t ef o ra t r a z i n ew a so 3 4 5 9m m 0 1 l 1a n d 0 7 5 1 8 p m o l m g m i n r e s p e c t i v e l y 4t h ea b i l i t yo ft h e d e g r a d i n ge n z y m e t o d e g r a d eo t h e r s - t r i a z i n e h e r b i c i d e sw a ss t u d i e d t h er e s u l td e m o n s t r a t e dt h a tt h ed e g r a d i n ge n z y m e c o u l da l s od e g r a d ep r o m e t r y na n ds i m a z i n ei nt h es a m ec u l t u r ec o n d i t i o n s f u r t h e r m o r e ，s i m a z i n es h o w e ds i m i l a rd e g r a d a t i v ec h a r a c t e r i s t i c sa sa t r a z i n e 5 t h ei m m o b i l i z e dm e t h o d so ff r e ee n z y m ew e r es t u d i e d t h ef r e e e n z y m ee x t r a c t e df r o mt h es t r a i nh b 一5w a sf i r s ti m m o b i l i z e da c c o r d i n gt ot h e o r t h o g o n a ld e s i g n ，al 9 ( 4 ) o r t h o g o n a ia r r a y ，w h o s et h r e ef a c t o r sw e r e s o d i u ma l g i n a t e ，c a l c i u mc h l o r i d ea n dp r o p o r t i o no fs o d i u ma l g i n a t ea n dc r u d e e n z y m e t h ed e s i g n st h r e el e v e l sw e r es o d i u ma l g i n a t ec o n t e n to f2 o 3 o 3 5 ，4 0 ，r e s p e c t i v e l y ，c a l c i u mc h l o r i d ec o n t e n to f 2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 o ， r e s p e c t i v e l ya n dp r o p o r t i o no fs o d i u ma l g i n a t ea n dc r u d ee n z y m eo f5 0 ， 2 0 ，1 0 ，5 s u b s e q u e n t l yt h ed e g r a d a t i o no fi m m o b i l i z e de n z y m et o d e g r a d ea t r a z i n ew a sd e t e c t e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ef r e ee n z y m ew a s i m m o b i l i z e df o r4 hu n d e rc o n d i t i o n so fs o d i u ma l g i n a t ec o n t e n to f3 o ， c a l c i u mc h l o r i d ec o n t e n to f4 0 a n dp r o p o r t i o no fs o d i u ma l g i n a t ea n dc r u d e e n z y m eo f5 6 d e g r a d a t i v ec h a r a c t e r i s t i c s o ft h ei m m o b i l i z e d e n z y m e w e r e d e t e r m i n e d t h ei m m o b i l i z e de n z y m es h o w e dm a x i m a la c t i v i t ya tp h8 0f o r e n z y m a t i cd e g r a d a t i o no fa t r a z i n e ，w h i c hw a ss t i l lo v e r9 4 o ft h em a x i m a l a c t i v i t yw i t h i np hr a n g eo f6 5 - 9 5 t h ei m m o b i l i z e de n z y m ef o re n z y m e 4 山东农业大学顺：忙学位论文 a c t i v i t yh a do p t i m u mt e m p e r a t u r eo f3 5 a n da l s oc o m p a r a t i v e l yh i g h a c t i v i t yi nt h er a n g eo ft e m p e r a t u r e2 0 。c 6 0 。c ，s h o w i n go v e r6 2 o ft h e m a x i m a la c t i v i t y t h ei m m o b i l i z e de n z y m es h o w e d a n dv m “v a l u ef o r a t r a z i n eo f1 0 3 6 8 9 m m o l l 1a n d0 4 2 5 5 p m o l m i n r e s p e c t i v e l y , h i g h e rt h a n t h a to ft h ef r e ee n z y m e a d d i t i o n a le x p e r i m e n t a le v i d e n c es u g g e s t e dt h a tt h e i m m o b i l i z e de n z y m es h o w e dg o o ds t a b i l i t ya n de n d u r a n c ef o rt e m p e r a t u r ea n d p hv a l u e ，a f t e r2 hi n c u b a t i o na t5 0 。ca n d6 0 * c ，r e s i d u a la c t i v i t yw a ss t i l lh i 曲， 9 0 91 a n d8 8 9 3 o ft h em a x i m a la c t i v i t y , r e s p e c t i v e l y a f t e r2 ht r e a t m e n t w i t hb u f f e ra tp h6 0a n d9 0 ，r e s i d u a l a c t i v i t ys t i l lr e m a i n e d9 2 9 9 a n d 9 12 9 o ft h em a x i m a la c t i v i t y , r e s p e c t i v e l y i nt h eo p t i m u mc o n d i t i o n ，t h e d e g r a d a t i o no ft h ei m m o b i l i z e de n z y m et od e g r a d ea t r a z i n ew a su pt o6 8 7 3 a f t e r6 0 m i ni n c u b a t i o n w i t ht i m e p r o l o n g e d ，t h ed e g r a d a t i o nw a s s t i l l g r a d u a l l yr i s i n g ，b u tt h ee n z y m a t i cd e g r a d a t i o nr a t er e d u c e d m o r e o v e r , t h e i m m o b i l i z e de n z y m eh a das y s t e mi nw h i c ht h ee n z y m ec o u l db er e c o v e r e d a n du t i l i z e dr e p e a t e d l y a l t h o u g ht h ea c t i v i t yf o re n z y m a t i cd e g r a d a t i o no f a t r a z i n er e d u c e da f t e r3t i m e su t i l i z a t i o n i t sr e m a i n e d7 8 a f t e rc o n s e r v e d f o r3 5 da t4 。c ，t h ee n z y m ea c t i v i t yr e m a i n e d6 8 4 4 ，h i g h e rt h a nt h ea c t i v i t y c o n s e r v e df o r3 5 da t2 0 ct h er e s u l ts h o w e dt h a ti m m o b i l i z e de n z y m ew a s s u p e r i o rt of r e ee n z y m ea n dc o u l db ea p p l i e di nt h et r e a t m e n to fw a s t ew a t e r 7 t h ee v a l u a t i o no ft h ed e g r a d i n ge n z y m ea n di m m o b i l i z e de n z y m et o c l e a n u pt h ew a s t e w a t e ro f a t r a z i n ep r o d u c t i o nw a ss t u d i e d i nw a s t e w a t e ro f a t r a z i n ep r o d u c t i o n ，w h e t h e ri tw a ss t e r i l i z e do rn o t ，a t r a z i n ew a se l i n f i n a t e d o v e r5 0 b yd e g r a d i n ge n z y m e ，a p p r o x i m a t e l y7 0 b yi m m o b i l i z e de n z y m e w i t h i n1 2 0 m i n ：- w h e t h e ru s i n gd e g r a d i n ge n z y m eo ri m m o b i l i z e d ，a t r a z i n e w a se l i m i n a t e dm o r ei nu n s t e r i l i z e dw a s t e r w a t e rt h a ni ns t e r i l i z e dw a t e r k e y w o r d s ：a t r a z i n e ；r e s i d u e s ；d e g r a d i n ge n z y m e ；i m m o b i l i z e de n z y m e 5 种降解酶及其固定化酶对莠去津降解特性研究 英文缩略表 c vc o e f f i c i e n to f v a r i a t i o n变异系数 d d a y 天 f i df l a m ei o n i z a t i o nd e t e c t o r氢焰离子化检测器 e p a e n v i r o n m e n tp r o t e c t i o na g e n c y 美国国家环保局 g g r a m 克 g cg a sc h r o m a t o g r a p h y气相色谱仪 hh o u r 小时 k gk i l o g r a m 千克 h a h d r o x y a t r a z i n e 羟基莠去津 c d e e a t a 。e s e t h y l a t 胁e：拦鲞6 摒涨基 赊o e i s o - 删n e：妻曼姜基6 。乙基胺基 d c a e i a t ,。e s e t h y l - d e i s o p r o p y l 舵i n e 翌。4 胺基岳胺基1 3 争 s as o d i u ma l g i n a t e海藻酸钠 m i nm i n u t e分钟 m gm i l l i g r a m 毫克 o d o p t i c a ld e n s i t y 光密度 r p m r o t a t i o np e rm i n u t e转 rc o r r e l a t i o n相关系数 s s t a n d a r dd e v i a t i o n 标准偏差 6 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 1 1 莠去津的结构和理化性质 莠去津( a t r a z i n e ) ，又名阿特拉津，化学学名2 一氯- - 4 - - 乙基胺一6 一 异丙基胺一1 ，3 ，5 一三嗪，属于三嗪类除草剂，分子式为c 8 h 1 4 c 1 n 5 ，分 子量2 1 5 7 ，结构式为： c l n 公n | | ( c h 3 ) 2 c h n h 吣n n h c 2 h 3 纯品为无色结晶，熔点1 7 3 。c 1 7 5 。c ，蒸气压4 0 1 0 一p a ( 2 0 。c ) ，2 5 时在水中的溶解度为3 3 m g t l ，正戊烷中为3 6 0 m g l ，二乙醚中为2 0 0 0 m g l 。，醋酸乙酯中为2 8 ，0 0 0m g l ，甲醇中为1 8 ，0 0 0m g - l 一，氯仿中为 5 2 ，0 0 0m g l 。在微酸及微碱介质中较稳定，在较高的温度下能被较强的 酸和较强的碱水解。原粉为白色粉末，纯度在9 2 以上( 王险峰，2 0 0 0 ) 。 1 2 莠去津的应用概况 莠去津属选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂，适用于玉米、高粱、 甘蔗、茶园、果园和林地及铁路等防除一年生禾本科杂草和阔时杂草，对 多年生杂草也有一定的抑制作用( 中国化工产品大全，1 9 9 4 ) 。现在生产 上常用的多为莠去滓与酰胺类除草剂乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺的混配 制剂。 该除草剂自1 9 5 9 年投入商业生产以来，在世界各国得到了大面积的 推广和使用。在美国，莠去津被列为最广泛使用的除草剂之一，每年喷洒 3 5 1 0 4 t ( a g e n c yf o rt o x i cs u b s t a n c e sa n dd i s e a s er e g i s t r y ，2 0 0 3 ) 占其除 草剂使用量的6 0 。在日本，莠去津于1 9 6 5 年作为农药登录，现在全日 本每年的生产量为1 7 5 0 t ，产值达3 0 亿日元。我国从2 0 世纪8 0 年代初开 始使用，近年来使用面积不断扩大，1 9 9 6 年莠去津全年的使用量为1 8 0 0 t ， 1 9 9 8 年为2 1 3 0 t ，1 9 9 9 年为2 2 0 5 t ，2 0 0 0 年为2 8 3 5 2 t ( 束放，2 0 0 0 ) ，每 年用量平均以2 0 的速度递增。 一种降解酶及其固定化酶对莠去津降解特性研究 莠去滓虽然是一种低毒除草剂，但由于其残留期长( 4 5 7 周) ，多年 的投入使用，形成了对土壤、水体等自然媒介的污染( g f r e r e re ta 1 ，2 0 0 2 ； g ue t a l ，2 0 0 3 ) 。近年来，人们从环境中不断检测到残留的莠去津，因而 环境中莠去津的污染和防治也日益引起学术界和公众的关注。 1 3 莠去津对环境的污染状况 莠去滓的广泛应用，导致了严重的环境污染。许多莠去津使用历史较 长的国家的地表水和地下水均受到了不同程度的污染。美国环保署报道， 在美国大约2 5 个州的地下水中检测到了莠去滓。1 9 8 7 年，在对爱荷华州 的公共水系的调查中发现，离农药销售点1 0 0 0 英尺范围内的1 8 口井中的 1 6 口井中能够检测到莠去津的存在；在爱荷华州2 8 个销售点的土壤、地 表水和地下水中能够检测到高浓度莠去津，在土壤中莠去津的最大含量为 1 1 0 0p g g ，在地表水中为1 6 g l i ，地下水中为1 5 0 0 g l ，均超过美 国环保署规定的最大安全浓度3 g l 。( f a w c e t t ，1 9 8 9 ) 。在1 9 9 1 1 9 9 2 年美国u s g s 调查发现，w e s tl a k e 湖的1 3 个水样中有1 1 个水样的莠去 津的浓度超出了饮用水的标准。h o f f m a n 等( 2 0 0 0 ) 在对美国8 条城市河 流中农药含量作比较时，发现莠去津、西玛津、甲草胺等除草剂被检出率 很高。在对加拿大魁北克市y a s m s k a 河河口附近的水域及其5 个直流的研 究发现，莠去津的最高浓度一般超过了加拿大为保护水生生物而制定的水 质标准， 。 除此之外，土壤含水量、土壤深度、土壤含碳、氮源的种类和含量也 会影响微生物对土壤中莠去滓的降解。研究表明，在土壤含水量饱和的情 一种降解酶及其固定化酶对莠去津降解特性研究 况下微生物对莠去津和d e a ( 脱乙基莠去津) 的降解速度比在不饱和土 壤中的要快得多( k r u g e re ta 1 ，1 9 9 7 ) ；而莠去津在0 3 0 c m 的表层土中降 解速度较在2 7 0 3 0 0 c m 的土层中降解速度快( j e n k se ta 1 ，1 9 9 8 ) 。高含 量的有机碳和粘土，则能够增加河口沉积物对莠去津的吸收和羟基化作 用；而有限的碳源则有利于莠去津最终降解为d e a 和d i a ，并通过沉积 物到达地下水( s m a l l i n ga n da e l i o n ，2 0 0 6 ) 。金属离子也可以影响莠去 津的降解。c 0 2 + 和p b ”离子的共同存在能够促进莠去津的降解( s u a n d z h u ， 2 0 0 5 ) 。 微生物对莠去津降解的实质是酶促反应，微生物对莠去津的降解代谢 受到影响，实际上就是微生物体内的酶活力受到影响。因此，影响酶对农 药降解的主要因素同微生物一样，主要受到农药本身和环境两方面的影响 ( 王聪颖等，2 0 0 5 ) 。农药的浓度太高，抑制微生物生长从而抑制酶活性， 浓度太低又使其生物可获得性降低，同样不利于降解。酶对农药的降解同 样也受到温度、p h 、有机质和金属离子等因素的影响。每种酶的酶促反 应都有其最适的温度和p h 范围，温度太高容易使酶钝化，低于这个温度 也不能使酶发挥最大作用，因此在一定温度范围内，增温有利于提高生物 降解速率：此外，其效果取决于该反应是酸催化还是碱催化。另有研究表 明，土壤酶活与土壤有机质之间存在着显著相关，提高土壤有机质含量可 有效提高生物降解的速率；而金属离子对土壤酶活性有明显抑制，受抑制 的程度与土壤类型有关，如粘土中该酶受到的抑制相对较弱。土壤酶活性 随a s 、c r 等离子含量的增加而降低，而一些金属如f e 、c o 、c u 、n i 、 m g 等的阳离子常作为一些酶的辅基，在酶的催化反应中有着非常重要的 作用，因而间接对土壤农药污染的酶降解起作用。 1 6 降解酶固定化研究进展 在一般情况下，酶性质不稳定，对酸、碱、热及有机溶剂容易发生酶 蛋白的变性作用，从而降低或失去活性；而且酶往往在溶液中进行反应， 以后会残留在溶液系统中不易回收，造成最终产品生化分离提纯操作上的 麻烦：加之酶反应只能分批进行，难于连续化、自动化操作( 刁颖辉等， 2 0 0 2 ) ，这大大地阻碍了酶工程的发展应用。鉴于此，人们一直都在不断 地研究如何在克服传统酶技术缺点的前提下利用酶的技术，固定化酶就是 山东农业大学硕：忙学位论文 人们在寻求克服这些不足的过程中不断改进发展起来的一项技术。 1 9 5 3 年，g r u b o h o f e r 等人将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶和r n a 酶等 结合固定在聚苯乙烯树脂重氮化载体上，在实验室首次实现了酶的固定化 ( 彭志英，1 9 9 9 ) 。此后，国内外相继开始了固定化酶的研究( d e m i r e la n d h a k k i ，2 0 0 3 ：k r a s t a n o va n dy o s h i d a ，2 0 0 3 ；t a k i m o t oe ta 1 ，2 0 0 4 ) 。酶 的固定化是将原来游离的水溶酶限制或固定于某一局部的空间或固体载 体上，固定化酶经过过滤或离心后，可长期反复使用。固定化方法有物理 吸附法、交联、共价结合及包埋等方法。目前较先进的方法是将酶固定在 生物膜或超滤膜上，制造出来的生物膜反应器的生产能力有明显提高。 经过固定化，酶具有了比原来水溶性酶更多的优点： ( 1 ) 酶经过固定化处理一般稳定性有较大提高，对热、p h 等的稳定 性提高，对抑制剂的敏感性降低，有的酶具有了抗蛋白酶分解的特性； ( 2 ) 反应完成后经过简单的过滤或离心，酶就可以回收，而且酶活 力降低较少，可以降低生产成本； ( 3 ) 固定化体系适合于连续化、自动化生产，催化过程容易控制， 且产品中不会带进酶蛋白或细胞，改善了后处理过程，提高了酶的利用效 率。 目前，酶固定化技术已在食品工业、精细化学品工业、医药，特别是 手性化合物等行业得到广泛应用，在废水处理方面也取得了一定进展 ( c h a n da n dm i s h r a ，2 0 0 3 ) 。用酶技术生产化工产品，条件温和，无三废产 生，随着人类对环保的i ：t 益关注，酶的应用会更受关注。如何充分利用天 然高分子载体，对其改性，或利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固 定酶，必定会成为研究的热点。同时，开发新型、高效固定化酶反应器， 进一步提高转化率和生产能力，也是未来研究的重点。而固定化酶在各行 业的应用研究也必将推动酶固定化技术的进一步发展。 1 7 本文研究内容 关于莠去津污染的生物降解和生物修复研究，国外研究的较早，并且 在高效降解菌的筛选、降解机制以及环境中莠去津的去除技术等方面取得 了一定的进展。研究表明，选择适当的微生物或者降解酶，创造和保持最 佳的环境条件，是能够降解与转化莠去津的( 张兰英等，2 0 0 2 ) 。但是， 种降解酶及其同定化酶对莠去津降解特性研究 由于降解莠去津的微生物及其降解酶在室内与在自然生态中的性质存在 较大差异，温度、湿度、p h 值及营养状况对这些微生物及其降解酶的降 解性能存在较大影响：莠去津降解微生物还会受到土著微生物的竞争，需 要用大量的接种微生物形成优势，以便迅速开始生物降解过程。所以，目 前的生物修复技术在实验室进行的较多，而具体应用到实际生态环境中的 较少。 多年来本实验室一直在从事莠去津生物降解的研究工作，已经筛选到 h b 5 、h b 一3 、h w - 2 3 等多株莠去津的高效降解菌并对降解特性进行了研 究。研究表明，培养温度和p h 条件对降解菌的生长及其对莠去津的降解 有很大的影响，且二者对降解菌的生长和降解能力具有协同影响作用，适 宜降解菌生长及其对莠去津降解的温度在2 0 3 5 之间，p h 在6 o 9 o 之间：在莠去津添加浓度为1 0 0 m g - l 。灭菌和未灭菌处理的农药厂生产 废水中，3 0 。c 培养5 天，接种降解菌处理中的莠去津的降解率可达9 9 以上。为了提高降解菌在生物治理中的应用价值，对莠去津降解菌h b 5 进行了固定化，提高其耐环境冲击能力。实验结果表明，在土壤中，固定 化后的细菌h b 一5 对莠去津具有较高的降解率，但在莠去津生产废水中降 解率不超过8 0 。分析其原因，就是在废水中，由于缺乏必要的营养条 件，细菌h b 5 的存活和活性降低，使其对莠去津的降解能力下降。 为了进一步了解所筛选的菌株的降解机理，需要提取酶、优化其降解 性能并且研究其酶促降解机理；为了克服酶在实际应用中存在的问题，提 高酶在污染土壤和水体生物修复中的应用，固定化的工作也势在必行。 本论文拟进行以下研究：( 1 ) 优化莠去津的提取与分析测定方法，为 正确评价降解酶对莠去津的降解能力提供可靠依据；( 2 ) 莠去津降解酶的 提取及其特性研究；( 3 ) 降解酶的固定化及其特性研究；( 4 ) 降解酶及其 固定化酶对生产废水中莠去津的降解研究，初步判定降解酶及其固定化酶 在未来莠去津污染的生物修复中的应用价值。 山东农业大学硕= i ：学位论文 2 材料与方法 2 1 药品试剂 莠去津 丙酮 三氯甲烷 无水乙醇 盐酸 无水硫酸钠 氧化钠 氢氧化钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 硫酸亚铁 硫酸镁 葡萄糖 蔗糖 可溶性淀粉 磷酸二氢钠 蛋白胨 牛肉浸膏 磷酸氢二钠 琼脂 考马斯亮蓝g 2 5 0 牛血清白蛋白 巴比妥钠 海藻酸钠 氯化钙 纯度9 5 5 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 分析纯 分析纯 生化试剂 分析纯 生化试剂 生化试剂 分析纯 化学纯 分析纯 山东京博农化有限公司 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市广成化学试剂厂 山东省莱阳市化工厂 天津市永大化学试剂开发中心 西安化学试剂厂 博山化学试剂厂 天津市科密欧化学试剂开发中一c 江苏金坛试剂厂 金山县兴塔化工厂 天津市化学试剂三厂 上海化学试剂总厂 成都市彭县利春化学厂 天津市广成化学试剂有限公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 国药集团化学试剂有限公司 天津市科密欧化学试剂丌发中心 闽南琼胶有限公司 上海伯奥生物技术有限公司 上海伯奥生物技术有限公司 中国医药上海化学试剂公司 天津市大茂化学仪器供应站 天津科密欧化学试剂开发中心 种降斛酶及熟固定化酶对莠去津降解特性研究 2 2 仪器设备 g c 1 4 c 气相色谱仪( f i d ) 日本岛滓 n 一2 0 0 0 双通道色谱工作站 浙江大学智达信息工程有限公司 蛳油空气发生器 燃嚣舢轴鼢析 l m _ i i 氢气发生器 溅鬻