（免疫学专业论文）a1肾上腺素受体对nk92mi细胞功能影响的研究.pdf

f | f l i i i iii iii i ii ii i ii ii i l y 18 9 2 4 5 2 目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 二、英文缩略语6 三、论文 ， 日u 舌7 材料和方法8 实验结果1 4 讨论1 9 结论2 2 四、本研究创新性的自我评价2 3 五、参考文献2 4 六、附录 综述2 6 在学期间科研成绩3 6 致谢3 7 个人简介3 8 中文论著摘要 仅1 肾上腺素受体对n k 9 2 m i 细胞 功能影响的研究 刖昌 应激( s t r e s s ) 是机体对作用于自身要求的一种非特异性应答，涉及神经内分泌系 统和许多其它器官，最初是由内分泌学家h s e l y e 在2 0 世纪3 0 年代提出，人们 观察应激对机体免疫功能影响时发现，应激会导致机体免疫功能低下，其中自然 杀伤细胞( n k 细胞) 杀伤活性也受到抑制。 研究表明，交感神经系统( s n s ) 对免疫组织具有广泛的支配，交感神经的主要 递质是去甲肾上腺素( n e ) ，n e 的作用是通过肾上腺素受体( a r ) 来实现，根据a r 与其配体结合特性及功能等差异，将a r 主要分为a l 、a 2 和p 三大类。a l - a r 分 为三种亚型，即i l i a 、i i l b - 和5 1 0 - a r ，值得重视的是，a i - a r 三种亚型功能受体 分布的差异，特别是它们在激动剂作用下不同的反应和行为特点，可能是造成其 功能差异的原因之一。 在应激时，n k 细胞是否存在0 【l - a r 各亚型的表达，n e 对n k 细胞的早期凋亡 是否有诱导作用，又有何种变化，本实验研究不同浓度n e 对c c l a r 表达以及n k 细 胞早期凋亡的变化，进而认识神经内分泌系统对免疫系统的影响。 方法 1 、r e a l - t i m ep c r 检测各实验组n k 9 2 m i 细胞伐1 a r 亚型m r n a 的表达水 平，并检测同时加入0 【1 a r 阻断剂哌唑嗪后各实验组( 1 1 - a r 亚型m r n a 的表达水 平变化。 2 、c c k 8 法测定不同浓度n e ( 1 x 1 0 1 2 m ，l x l 0 o m ，l x l 0 一m ，l x l 0 一m ，l x l 0 。6 m ) 对n k 9 2 m i 细胞作用l h 后其杀伤活性的影响。 3 、流式细胞术检测各实验组n k 9 2 m i 细胞早期凋亡率，并检测加入伐l a r 阻断剂哌唑嗪或p 物质后对n k 9 2 m i 细胞早期凋亡的影响。 结果 n k 9 2 m i 细胞存在a 1 a r 三种亚型的表达，a l - a r 阻断剂哌哗嗪能够阻断 n e 对仅1 a r 各亚型表达的诱导作用；用终浓度为l x l 0 。1 2 m ，l x l 0 1 0 m ，l x l 0 一m ， l x l 0 一m ，l x l 0 。6 m 的n e 作用n k 9 2 m i 细胞1 h 后，在效靶细胞比为4 ：l 时，各 浓度n e 对n k 9 2 一m i 细胞的杀伤活性有明显的抑制作用( 氏o 0 5 ) ，加入终浓度为 l x l 0 击ma t - a r 阻断剂哌哗嗪能够阻断低浓度n e 对n k 9 2 m i 细胞杀伤活性的抑 制作用；n e 对n k 9 2 。m i 细胞早期凋亡有诱导作用，哌哗嗪及s p 能够阻断l x l 0 名m 的n e 对n k 9 2 m i 细胞早期凋亡的诱导作用愀o 0 5 ) 。 结论 l 、n k 9 2 m i 细胞表达0 【1 a r 各亚型。 2 、应激浓度n e ( 1 x l f f 8 m ) 对n k 9 2 m i 细胞a t - a r 各亚型的表达有诱导作用， 0 【1 a r 阻断剂哌唑嗪可阻断这种作用。 3 、效靶比为4 ：l 时，各浓度的n e ( 1 x 1 0 - 1 2 m ，l x l 0 旧m ，l x l 0 - 9 m ，l x l 0 一m ， l x l 0 6 m ) 均能降低n k 9 2 m i 细胞杀伤活性。 4 、l x l 0 击m 哌唑嗪对低浓度n e 抑制n k 细胞杀伤活性有阻断作用。 5 、应激浓度n e ( 1 x 1 0 。8 m ) 可诱导n k 9 2 m i 细胞早期凋亡，哌唑嗪和s p 能 够阻断的n e 对n k - 9 2 m i 细胞早期凋亡的诱导作用。 6 、c t l - a r 各亚型参与n e 对n k 细胞功能的影响。 关键词 q l - a r ；n k 9 2 m i ；去甲肾上腺素；哌唑嗪；p 物质：亚型 2 英文论著摘要 s t u d yo n e f f e c to fn k 9 2 一m ic e l lf u n c t i o n w i t ho t l a d r e n o c e p t o r p r e f a c e s t r e s si st h eb o d ya c t i n go ni t so w nr e q u i r e m e n t sf o ra n o n - s p e c i f i cr e s p o n s e ， i n v o l v i n gn e u r o e n d o c r i n es y s t e ma n dm a n yo t h e ro r g a n s ，w h i c hw a so r i g i n a l l y i n t r o d u c e db ye n d o c r i n o l o g i s th s e l y ei nt h e19 3 0 s ，p e o p l ep u ts t r e s so nt h eb o d y s i m m u n ef u n c t i o no b s e r v m i o n ，f o u n dt h a ts t r e s si n f l u e n c ew i l ll e a dt or e d u c e dt h e i m m u n ef u n c t i o n ，i n c l u d i n gn a t u r a lk i l l e rc e l l si sa l s oi n h i b i t e di nc y t o t o x i ca c t i v i t y s t u d i e sh a v es h o w nt h a tt h es y m p a t h e t i cn e r v o u ss y s t e m ( s n s ) o nt h ei m m u n e o r g a n i z a t i o nh a se x t e n s i v ed o m i n a t i o n ，t h es y m p a t h e t i cm a i nn e u r o t r a n s m i t t e ri s n o r e p i n e p h r i n e ( n e ) ，t h er o l eo fn ei sa c h i e v eb ya d r e n e r g i cr e c e p t o r ( a r ) ，i n a c c o r d a n c ew i t ha r l i g a n d b i n d i n gp r o p e r t i e sa n dd i f f e r e n c e so ff u n c t i o n ，a rc o n s i s t s f o r 1 1 ，( 1 2a n dpt h r e ec a t e g o r i e s a l p h a l a ri sd i v i d e di n t ot h r e es u b t y p e s ，n a m e l y a l p h a l a ，a l p h a lb a n da l p h a ld - a r ，s e r i o u s l y , t h r e e a l p h a l a rs u b t y p e s a r e d i f f e r e n c e si nt h ed i s t r i b u t i o nf u n c t i o n ，e s p e c i a l l yt h e i rd i f f e r e n tr e s p o n s ea n db e h a v i o r c h a r a c t e r i s t i c su n d e ra g o n i s t s ，m a yt h eo n eo fr e a s o n sc a u s et h e i rd i f f e r e n c e s f u n c t i o n a l i ns t r e s s ，w h e t h e rt h e r eh a v ea l p h a l a re a c hs u b t y p e se x p r e s s i o ni nn k c e l l s ，n k c e l l sw h e t h e rc a ni n d u c ee a r l ya p o p t o s i sb yn e ，b u ta l s ow h a tk i n do fc h a n g e s ，t h i s e x p e r i m e n tr e s e a r c hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fn eo na l p h al a re x p r e s s i o na n d c h a n g e so nn kc e l l se a r l ya p o p t o s i s ，a n dt of u r t h e ru n d e r s t a n dt h en e u r o e n d o c r i n e s y s t e mi n f l u e n c ei ni m m u n es y s t e m 3 m e t h o d s 1 r e a l - t i m ep c rw a sa p p l i e dt od e t e c tc h e m o k i n ea l p h a l a rm r n a e x p r e s s i o n w i t hd i f f e r e n te x p e r i m e n t a lg r o u p s ，t h e nd e t e c t st h e s ea l p h a l - a rm r n ae x p r e s s i o n a f t e ra l p h a l - a ra n t a g o n i s tp r a z o s i nw a sa d m i n i s t r a t e d 2 c c k - 8a s s a yw a sa p p l i e dt od e t e c tt h ec y t o t o x i c i t ya c t i v i t yi nn k 9 2 一m ic e l l s w h i c hw e r et r e a t e db yd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f n ef o r1h o u r 3 f l o wc y t o m e t r yw a sa p p l i e dt od e t e c tn k 9 2 一m ic e l l se a r l ya p o p t o s i so f d i f f e r e n te x p e r i m e n t a lg r o u p s a n dd e t e c t sn k 9 2 - m ic e l l si n e a r l ya p o p t o s i sa f t e r a l p h a l a ra n t a g o n i s tp r a z o s i no rs u b s t a n c epw a sa d m i n i s t r a t e d r e s u l t s n k 9 2 - m ic e l l se x p r e s s i o ne a c hs u b t y p e so fa l p h a l a ra l ee x i s t ，a l p h a l a r a n t a g o n i s tp r a z o s i nc a nb l o c kt h ei n d u c e da l ls u b t y p e so fa l p h a l a re x p r e s s i o nw i t h n e ；n k 9 2 m ic e l l sa d m i n i s t r a t e dn eu s ef i n a lc o n c e n t r a t i o no flxl0 。1 2 m ，lxl0 1 0 m ， l x l o 。9 m ，l x l 0 一m ，l x l f f 6 ma f t e rl h ；w h e nt h er a t i oo f n k 9 2 m ic e l l st ok 5 6 2c e l l si s 4t o1 ，e a c hc o n c e n t r a t i o no fn ec a ns i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dn k 9 2 - m ic e l l sc y t o t o x i c i t y a c t i v i t y ( 尸o 0 5 ) ，a d m i n i s t r a t e da l p h a l a ra n t a g o n i s tp r a z o s i nu s e 矗n a lc o n c e n t r a t i o n lxl0 。6 mc o u l db l o c kn k 9 2 一m ic e l l s c y t o t o x i c i t ya c t i v i t y i n h i b i t e db yt h el o w c o n c e n t r a t i o nn e ；n eo fn k 9 2 - m ic o u l di n d u c ee a r l ya p o p t o s i s ，p r a z o s i no rs pc a n b l o c kn k 9 2 m ie a r l ya p o p t o s i si n d u c t i o nb ylxl0 。8n e ( p o 0 5 ) c o n e l u s i o n 1 n k 9 2 一m ic e l l se x p r e s se a c hs u b t y p e so fa l p h a l a r 2 m es t r e s sc o n c e n t r a t i o no fn e ( 1xl0 。8 m ) c o u l di n d u c e dn k 9 2 m ic e l l s e x p r e s s i o nv a r i o u ss u b t y p e so fa l p h a l a r ，a l p h a l a ra n t a g o n i s tp r a z o s i nc o u l db l o c k t h i se f f e c t 3 t h er a t i oo fn k 9 2 - m ic e l l st ok s 6 2c e l l si s4t o1 ，a l lc o n c e n t r a t i o no fn e ( 1 x l o 1 2 m ，l x l o 。1 0 m ，l x l 0 - 9 m ，l x l o - s m ，l x l # ，l v bc o u l dr e d u c et h en k 9 2 m ic e l l s c y t o t o x i c i t ya c t i v i t y 4 1xlo 由mp r a z o s i nh a v eb l o c k i n ge f f e c ti nn k 9 2 一m ic e l l si n h i b i t i o nc y t o t o x i c i t y 4 a c t i v i t yb yl o wc o n c e n t r a t i o no f n e 5 t h es t r e s sc o n c e n t r a t i o no fn e ( 1xl0 8 m ) c o u l di n d u c e dn k 9 2 m ic e l l s e a r l v a p o p t o s i s ；p r a z o s i na n ds pc o u l db l o c kt h en k - 9 2 m ic e l l si n d u c e de a r l ya p o p t o s i s b y n e 6 a l p h a l - a rv a r i o u ss u b t y p ei n v o l v e di nn kc e l lf u n c t i o nw i t hn e k e y w o r d s a l p h a l - a d r e n o c e p t o r ；n k 9 2 一m i ；n o r e p i n e p h r i n e ；p r a z o s i n ；n e u r o p e p t i d e s u b s t a n c ep ；s u b t y p e 5 英文缩略语 6 论文 伐l 肾上腺素受体对n k 9 2 m i 细胞 功能影响的研究 刖昌 应激( s t r e s s ) 是机体对作用于自身要求的一种非特异性应答，它是机体保证生 存最重要、最复杂的反应，涉及神经内分泌系统和许多其它器官，最初是由内分 泌学家h s e l y e 在2 0 世纪3 0 年代提出。近年来大量研究证实，应激可影响免疫 功能，并与临床自身免疫性疾病、感染性疾病的发病密切相关。免疫功能变化是 应激反应的主要效应之一，应激对免疫系统的调节以抑制为主【1 1 。 自然杀伤细胞( n k 细胞) 是先天性免疫系统的重要组成部分，是机体抗御感染 和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞【2 ，3 1 ，应激可导致机体n k 细胞杀伤活性 抑制。但整体资料表明人体在应激情况下，n k 细胞的数目和活性会瞬间升高 4 , 5 1 。 研究表明，交感神经系统( s y m p a t h e t i cn e r v o u ss y s t e m ，s n s ) 对免疫组织具有 广泛的支配【6 1 ，交感的主要递质是去甲肾上腺素( n o r e p i n e p h r i n e ，n e ) ，n e 的作用 是通过肾上腺素受体( a d r e n e r g i cr e c e p t o r ，a r ) 来实现 7 1 ，a r 普遍存在于心血管、 呼吸、消化和泌尿等系统的平滑肌和腺体细胞上，是参与介导神经和内分泌系统 调节这些细胞功能的重要结构基础，人们发现神经和内分泌系统能调控免疫细胞 的功能，免疫细胞表面存在肾上腺素受体，目前，根据a r 与其配体结合特性及功 能等差异，将a r 主要分为i f , l 、a 2 和t 3 - x 类【8 】，每类又可分为三种亚型0 1 。 p 物质( s u b s t a n c ep ，s p ) 属于速激肽( n k s ) 家族的一员，s p 是最早发现的神经 肽，由v o n e u l e r 和g a d d u m 于1 9 3 1 年从脑及肠组织中提取出并命名【l l 】，s p 广泛 分布于神经系统和各组织器官中，s p 不仅是一种神经肽，也是一种神经源性炎症 介质、免疫调节因子，是神经系统和免疫内分泌系统共同的信使物质，能以神经 内分泌的方式作用于各种免疫细胞，参与免疫调节，促进免疫功斛1 2 】。 7 a l - a r 同样也是g 蛋白偶联受体家族中的一员，在调节心血管的生理活动和病 理改变过程中起着重要的作用。f f 1 a r 分为三种亚型，即0 【l a 、a i b - 并a c t l d - a r 。虽 然 e f f j 都能激活g q p l c i p 3 和d a g 信号转导通路13 1 ，但三类0 【1 a r 激活p l c 的效力 不同，三者介导的效应也各不相同【1 4 1 。这固然与它们可能拥有各自的尚不为人知 的其它g 蛋白信号通路或非g 蛋白调节途径有关，但同时值得重视的是，a 1 a r 三 种亚型功能受体分布的差异，特别是它们在激动剂作用下不同的反应和行为特点， 可能是造成其功能差异的原因之一。 那么在应激时，人体内大量分泌的n e 是否可以通过a 1 a r 抑n n k 细胞的功 能，n k 细胞o 【1 a r 的表达有何变化，对细胞功能有何影响，n e 是否对n k 细胞的 早期凋亡具有诱导作用，本实验研究n k 细胞q l _ a r 各亚型表达的变化，了解a 1 a r 对n k 细胞功能的影响。 材料和方法 一、主要实验材料 1 、细胞 ( 1 ) n k 9 2 一m i 细胞：n k 一9 2 是从一位患有急进性非霍奇金淋巴瘤的5 0 岁白人男 性外周血单核细胞衍生来的一株i l 2 依赖型n k 细胞株。n k 9 2 m i 是转染得到的源 f l n k - 9 2 的i l - 2 j i e 依赖的n k 细胞株，购自中国科学院细胞库。 ( 2 ) k 5 6 2 细胞：人类自血病细胞，由本实验室保存，以1 0 f b sr p m i 1 6 4 0 培 养。 2 、培养基及血清 ( 1 ) r p m i - 1 6 4 0 培养基：g i b c o b r l 公司 ( 2 ) a m e m 培养基：g i b c o b r l 公司 ( 3 ) 胎牛血清( f b s ) ：h y c l o n e 公司 ( 4 ) 供体马血清：h y c l o n e 公司 二、主要仪器和设备 l 、酶标光度计：s u n r i s er c ( 瑞士t e c a n ) 8 2 、c 0 2 恒温培养箱：h e a rc e l l ( 德国) 3 、普通离心机：0 5 p r 2 2 ( 日本h i t a c h i ) 4 、倒置显微镜：c k 4 0 ( 同本o l y m p u s ) 5 、高速离心机：c f 一1 5 0 ( 同本h i t a c h i ) 6 、d n a 扩增仪：p t c 1 0 0 ( 美国m jr e s r a r c h ) 7 、r e a l - t i m ep c r 仪：f q d 3 3 a ( 杭州博同) 8 、荧光激活细胞分析仪：f a c sc a l i b u r ( 美国b d ) 9 、超净工作台：s w - c t - i f ( 上海博讯) 1 0 、电子天平：b p 2 11 d ( s a r t o r i u s ) 1 l 、微型台式真空泵：z k 8 0 1 ( 上海浦江分析仪器厂) 1 2 、磁力搅拌器：m l - 9 0 2 ( 上海浦江分析仪器厂) 12 、酸度计：d e l ta 3 2 0 ( m e t t l e rt o l e d o ) 13 、紫外可见光分光光度仪：n a n op h o t o m e y e r ( 德国i m p l e n ) 1 4 、荧光显微镜c c d 成像系统：b x 6 1 d p 7 ( 日本o l y m p u s ) 三、主要试剂及配制 1 、主要试剂 ( 1 ) r e a l - t i m ep c r 试剂盒：t a k a r a 公司 ( 2 ) a n n e x i nv - f i t c 细胞凋亡检测试剂盒：凯基生物 ( 3 ) t r i z o l 试剂：i n v i t r o g e n 公司 ( 4 ) 三氯甲烷：沈阳试剂一厂 ( 5 ) 异丙醇：沈阳试剂一厂 ( 6 ) 无水乙醇：北京化工厂 ( 7 ) d e p c ：i n v i t r o g e n 公司 ( 8 ) p 物质：s i g m a 公司 ( 9 ) c c k 一8 - 碧云天公司 ( 1 0 ) 去甲肾上腺素：s i g m a 公司 ( 11 ) p r a z o s i n - s i g m a 公司 9 2 、主要试剂的配制 ( 1 ) r p m i 1 6 4 0 培养液的配制：1 6 4 0 干粉1 袋加入双蒸水5 0 0 m l ，磁力搅拌器搅 拌使其完全溶解，j j i a h e p e s 2 3 8 9 、碳酸氢钠2 9 、双抗l m l ( 青霉素、链霉素) ，定 容至1 , 0 0 0 m l ，用7 5 的n a h c 0 3 调p h 至7 o 7 2 后0 2 2 i t m 滤膜过滤除菌，2 0 0 m 1 分 装，4 。c 保存，3 个月内用完。使用前加入终浓度为1 0 的灭活胎牛血清。 ( 2 ) 0 【m e m 完全培养基：a m e m 干粉2 袋加入双蒸水8 0 0 m l ，磁力搅拌器搅拌 使其完全溶解，加入碳酸氢钠3 9 、叶酸1 7 6 6 m g 、肌醇7 2 0 6 4 m g 、h e p e s 4 7 6 6 9 、 2 - 毓基乙醇1 4 1 t l 、双抗2 m l ，定容至2 0 0 0 r n l ，用7 5 的n a h c 0 3 调p h i - 7 肌7 2 后 0 2 2 9 m 滤膜过滤除菌，2 0 0 m 1 分装。4 。c 保存，3 个月内用完。使用前加入终浓度为 1 2 5 的灭活胎牛血清及1 2 5 的马血清。 ( 3 ) 双抗：青霉素，配制成4 0 力单位m l 贮存液保存于2 0 c ；链霉素，配制成 2 0 0 m g m l 贮存液保存于2 0 。c ，即用即加。每1 l 培养液加入双抗l m l ( 含青霉素和链 霉素各0 5 m 1 ) 。 ( 4 ) 细胞冻存液：n k 9 2 m i 细胞冻存液为5 0 浓度的胎牛血清，取无菌完全 培养基：胎牛血清：二甲基亚砜- - 4 ：5 ：1 ，充分混匀，4 。c 保存备用。 ( 6 ) p b s 缓冲液：氯化钠8 o g 、氯化钾0 2 9 、n a e h p 0 4 h 2 0 1 5 6 9 、磷酸二氢钾 0 2 9 溶于l ，0 0 0 t u l s a 蒸水中，浓盐酸调节溶液p h 值至7 4 ，过滤除菌并高压灭菌，4 。c 保存。 ( 7 ) 台盼蓝生理盐水：取4 份0 2 台盼蓝水溶液与1 份5 生理盐水混合。 ( 8 ) 无r n a s e 水：双蒸水加d e p c 至浓度0 1 ( 体积比) ，混匀，放置过夜，高 压灭菌3 0 r a i n ，备用。 ( 1 1 ) 7 5 乙醇：用无r n a s e 水现用现配。 ( 1 2 ) 去甲肾上腺素溶液：将浓盐酸稀释至0 5 m ，取l i n g 去甲肾上腺素粉末溶 解于l m l0 5 m 盐酸中，过滤后分装，2 0 c 保存，使用时进行稀释。 ( 1 3 ) 哌唑嗪溶液：取0 5 m g 哌唑嗪粉末溶于2 m i x 2 蒸水中，过滤后分装，2 0 。c 保存，使用时进行稀释。 1 0 四、实验方法 ( 一) 细胞培养 n k 9 2 m i 细胞株，以含有1 2 5 灭活胎牛血清和1 2 5 马血清的q m e m 完全 培养基培养于3 7 。c ，5 c 0 2 的培养箱中，细胞呈悬浮聚团生长。k 5 6 2 细胞株以含 有1 0 胎牛血清的r p m i 1 6 4 0 培养液，培养于3 7 。c ，5 c 0 2 的培养箱中，细胞呈悬 浮分散生长。细胞进入对数生长期后，用于实验。 ( 二) n k 9 2 m i 细胞仅l a r 亚型m r n a 的表达 l 、n k 9 2 m i 细胞制备 取对数生长期的n k 9 2 m i 细胞用完全培养基a m e m 调备到5 x 1 0 6 m l ，每孔 l m l 接种于6 孔培养板中，同时将不同浓度的n e 加入相应的培养孔中，终体积 4 m l ，置3 7 * 0 ，5 c 0 2 饱和湿度培养箱中培养l 、2 h 。 2 、n k 9 2 m i 细胞总r n a 的提取 ( 1 ) 收集药物作用组与对照组细胞各5 1 0 6 个子e p p e l l d o 艏中，2 , 0 0 0r p m ，4 * 0 离, l 二, 5 m i n ，p b s 洗涤2 次。 ( 2 ) 弃去上清，每管加入t r i z o l l m l ，反复吹打使细胞裂解至无明显沉淀，室温 静置5 m i n 。 ( 3 ) 加o 2 m l 氯仿，上下震荡15 s ，呈粉红色无分层溶液，室温静置2 m i n 。 ( 4 ) 1 2 ，0 0 0 r p m ，4 。c 离一i 二 1 5 m i n ，将无色上清移至另- - e p p e n d o r f 管，并加入等 体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置1 0 r a i n 。 ( 5 ) 1 2 ，0 0 0 r p m ，4 * 0 离，t , 1 0 r a i n ，弃上清，沿壁缓慢 j i ) k 7 5 冷乙醇l m l 洗涤沉 淀。 ( 6 ) 1 2 ，0 0 0 r p m ，4 * 0 离，i 二, 1 0 m i n ，弃上清，室温晾干5 1 0 m i n 。 ( 7 ) 沉淀用10 5 0 1 x l 无r n a s e 水溶解，5 5 6 0 * 0 水浴5 1 0 r a i n 。 3 、r n a 纯度及浓度检测 取r n a 提取液5 9 l ，采用紫外分光光度仪检测吸光度，波长为2 6 0 n m 及2 8 0 n m ， 测定r n a 浓度与纯度，计算各样本r n a 含量。 4 、引物设计 利用p r i m e r5 0 软件设计引物，引物均由金思特科技( 南京) 有限公司合成，各 引物序列及产物，片段长度如表1 所示。 表1 ，a 1 a a r 、o h b - a r 、0 t l d a r 及1 8 s r r n a 基因引物序列 5 、r e a l t i m ep c r ( 1 ) 将各组r n a 稀释至5 0 0 n p l ，取0 5 m l e p p e n d o r f 管加入如下反应体系( 表2 ) 进行逆转录合成c d n a 。 表2 ，逆转录反应体系 成分体积 5x p r i m es c r i p t t mb u f f e r p r i m es c r i p t t mr te n z y m em i xi o l i g od tp r i m e r ( 5 0 i t m ) r a n d o m6m e r s ( 10 0 1 a m ) t o t a lr n a r n a s ef r e ed h 2 0 4 9 l 1 l a l 1 p l l p l 2 9 l 11 肛l ( 2 ) 反应条件，3 7 。c 反应1 5 m i n ，8 5 。c 反应5 s 。 ( 3 ) 上述反应结束后，轻微离心，取p c r 管加入如下成分进行r e a l t i m ep c r 反应，见表3 。 1 2 表3 ，r e a l t i m ep c r 反应体系 成分体积 s y b rp r e m i xe xt a q 俐( 2 ) p c rf o r w a r dp r i m e r ( 10 l t m ) p c rr e v e r s ep r i m e r ( 10 1 a m ) 模板( e d n a ) d h 2 0 l o i _ t l 0 4 l _ t l 0 4 p l 1 肛l 8 2 t a l ( 4 ) 反应条件：s t a g e l ：9 5 。c 反应3 0 s ： s t a g e 2 ：9 5 * ( 2 反应5 s ，6 0 c 反应3 4 s ，循环4 0 次； s t a g e 3 ：9 5 反应1 5 s ，6 0 反应l m i n ，9 5 反应1 5 s 。 ( 5 ) 反应结束后，以1 8 s r r n a 为内参、以对照组为基准，分析各实验组m r n a 的相对定量r q 值。 ( 三) a l - a r 对n k 9 2 m i 细胞杀伤活性的影响 采用c c k 8 法，不同浓度的n e 孵育n k 9 2 一m i 细胞l h 。离心后弃上清液，每孔 按效靶比为4 ：1 力i i a 靶细胞k s 6 2 悬液1 0 0 i _ t l ，每孔设三个复孔，并设定对照组，3 7 * ( 2 ， 5 c 0 2 的培养箱中孵育4 h ，各孔加入1 0 “l 的c c k 8 溶液，l h 后在酶标仪上以4 5 0 n t o 波长测定吸光度o d 值，实验重复3 次，阻断剂组用l x l o r 6 m 哌唑嗪作用n k 9 2 m i 细胞于3 7 c ，5 c 0 2 的培养箱先孵育3 0 r a i n ，后进行杀伤试验，实验重复3 次。 根据以下公式计算n k 9 2 m i 细胞对k 5 6 2 细胞的杀伤率： 杀伤率c 1 型型型警慧意蒜o d 产幽) l o o 凡6 2 细胞对照组值j ( 四) a 1 - a r 对n k 9 2 m i 细胞早期凋亡率的影响 采用流式细胞术，a n n e x i nv - f i t c p i 双染法。取对数生长期的n k 9 2 m i 细胞 用完全培养基q m e m 调备至l j 4 x 1 0 5 m l ，每孑l l m l 接种于2 4 孔培养板中，将不同浓度 的n e 等体积加入相应的培养孔中，使其终浓度分别为l x l o j 2 m ，l x l 0 一o m ， l x l 0 一m ，l x l 0 培m ，l x l 0 石m ，设阻断剂组，加入哌唑嗪( 1 1 0 石m ) 或不同浓度 s p ( 1 x 1 0 1 2 m ，l x l 0 加m ，l x l 0 。8 m ) ，与应激浓度n e ( i 1 0 。8 m ) 共同处理，同时设空 1 3 白对照组。置3 7 c ，5 c 0 2 饱和湿度培养箱中培养1 、2 h 。将培养板取出收集细胞 ( 2 ，0 0 0 r p m 离心，5 m i n ) ，用冷p b s 洗涤细胞2 次，弃净p b s ，加入5 0 0 p 1 的b i n d i n g b u f f e r 悬浮细胞，加入5 “la n n e x i nv - f i t c 混匀后，加入5 p lp r o p i d i u mi o d i d e ，混匀；避 光、室温反应1 0 m i n ；l h 内上流式细胞仪检测分析。 ( 五) 统计分析 所有数据均经s p s s1 7 0 统计分析软件包处理，采用单因素方差分析和f 检验。 实验结果 一、n k 9 2 m l 细胞a l - a r 亚型m r n a 表达的影响 在1 1 0 2 m ，l x l f f l o m ，l x l o m ，l x l f f 8 m ，l x l 0 击m 的n e 作用于n k 9 2 一m i 细胞1 h 后，r e a l t i m ep c r 显示，n k 9 2 m i 存在0 【l a a r 、0 t l b a r 、a l d - a r - 三种亚型 的表达( 图1 ) 。 l 、o , i a = a r i 捌j ：在l x l 0 。1 2 m _ ； i l x l 0 一m 时n k 9 2 一m i 细胞q l a a r i 驹m r n a 表达显著增加( 图1 ，a ) 。 2 、c 【i b a r 的影响：在l x l 0 。8 m 时n k 9 2 m i 细胞g i b a r 的m r n a 表达显著增加， 而在l x l 0 石m 时则抑制0 【l b a r 的m r n a 的表达( 图l ，b ) 。 3 、a l d a r 的影响：在各浓度的n e ，o 【l d - a r 的m r n a 的表达均有增加，在 l x l 0 也m 和l x l 0 培m 时m r n a 表达有显著意义( 图1 ，c ) 。 4 、用l x l 0 6 m 的哌唑嗪与应激浓度n e ( 1 x 1 0 8 m ) 共嬲n k 9 2 - m i 细胞l h ，哌 唑嗪能够阻断n e 对0 【1 a r 三种亚型的诱导作用( 图l ，d ) 。 1 4 图l ，n e 对舢m i 细胞a i - a r 三种亚型表达的影响 户如0 5v s i e 常对照组么p 0 0 5v s l 0 s mn e 组 二、a i - a r 对n k 9 2 m i 细胞杀伤活性的影响 效靶细胞比为4 ：1 时，各浓度n e 对n k 9 2 m i 细胞处理1 h 对n k 9 2 m i 细胞 的杀伤活性有明显的抑制作用( 尸 0 0 5 ) ( 图2 ) ，终浓度为l x l 0 6 m ( 1 1 a r 阻断剂哌 哗嗪作用n k 9 2 m i 细胞3 0 m i n 后，再加入各浓度n e 作用n k 9 2 m i 细胞l h ，哌 唑嗪可阻断低浓度n e 对n k 9 2 m i 细胞杀伤活性的抑制作用，但对高浓度n e 无 明显效果( 图3 ) 。 图2 ，n e 对n k 9 2 m i 细胞杀伤活性的影响 宰p ( 0 0 5 图3 ，p r a z o s i n 作用3 0 r a i n 后n e 对n k 9 2 m i 细胞杀伤活性的影响奉氏o 0 5 1 6 三、q 1 - a r 对n k 9 2 m i 细胞早期凋亡的影响 根据实验室前期试验结果，表明n e 对n k 9 2 m i 细胞早期凋亡有诱导作用， 随着药物浓度的加大和时间而增加。 n e 与p r a z o s i n 处理的n k 9 2 m i 细胞，经a n n e x i nv - f i t c p i 双染后，荧光显 微镜下可见早期凋亡呈绿色荧光，晚期凋亡细胞呈红绿荧光，而活细胞不染色( 见 图5 ) 。流式细胞仪结果显示，l x l 0 。8 mn e 能够诱导n k 9 2 m i 细胞早期凋亡： l x l 0 由m 哌唑嗪与l x l 0 mn e 共同作用n k - 9 2 m i 细胞1 h ，可阻断n e 对n k 9 2 m i 细胞早期凋亡的诱导作用( 表4 ，图4 ) ；不同浓度的s p ( 1 x l o m m ，l x l 0 1 0 m ，l x l 0 。8 m ) 与l x l 0 mn e 共同作用n k 9 2 m i 细胞l h ，也可阻断n e 的诱导作用( 表5 ，图4 ) ，。 表4 ，n e 、p r a z o s i n 对n k - 9 2 m i 细胞凋亡的影响( ；士s ) 药物浓度( m )l h 凋亡率( ) 对照组 1 0 - 8 n e 10 。6p r a z o s i n 1 0 - 6p r a z o s i n + 1 0 s n e 4 4 3 - 4 - 0 5l 2 0 5 钍5 2 2 * 6 4 8 士3 1 6 6 2 3 士3 0 3 4 拳p o 0 5v s 正常对照组么p 0 0 5v s l 0 8 mn e 组 表5 ，n e 、s p 对n k - 9 2 m i 细胞凋亡的影响( ；士s ) 药物浓度( m ) l h 凋亡率( ) 对照组 1 0 - s n e 1 0 8 s p 1 0 。l o s p 1 0 1 2