（农药学专业论文）高毒力苏云金芽孢杆菌hb3菌株生物学特性及发酵条件研究.pdf

独创性! 声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：徐宜宏时间：如占年占月2r 导师签名： 缸 哦忙l ；苔年歹冠，d b 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使 用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：獭时间：细j年莎月宫 日 导师签名：缸眵哥力 时问： 彩年月矽f i j l 沈刚农啦大擎硕士学转论文 摘要 零醪 究黻一撩发酵蠖裁镶嶷、蹲萎寒蜞( 蕊棚嚣逸矗r 鼯嘏蠡g 狂e 粼静) 其膏蓬毒力翳 棼兹焱磐稳符菌 。 c y t 簿素的作用搬刺还不清楚，值e y t 2 a 的e 一瓤蹙结构怒以8 凰簿为基础形成孔 澜。该掰爨结构具有双亲悭躐疏永牲，3 条链的长度照以跨越膜的疏水核心。 另外肖些研究表明，c ”l a 与月器质的结合是种棚当松散的三维结构，没存证据说 麓毒素避入了缀施膜，觚嚣雅测c y tl a 辩骥其裔种类似去污剂的作用( 撩u 墩o ，耐醴， 1 9 9 7 ) 。 1 a 2 - 3 杀虫龋体蛋白的分予作用机制 杀虫滠体援自在爨杰躲遴孛戆馋髑过程一般嚣缝避溶簿、瓣瓣溺愆、与受傣缝含、 撩入和形成孔澜或离予通道形成等5 个环节( 张继红，磐，1 9 9 8 ；a r o n s o n 和s h 戚，2 1 ) ( 鹜1 2 。( a ) 经琵虫滚纯鼷，晶侮在嬲液串溶解； 7 4 囊箍铡剂， 瞒豳内外来开发的新品系b t 杀虫荆( 经改新，等，1 9 9 5 ) 。此外，我豳还分离并开发了对 棉铃虫、小菜蛾等鳞翅目害虫高效的8 0 1 0 、y b 1 5 2 0 、c t - 4 3 、，i h l 3 一1 4 ( 阀冰，等，1 9 9 5 ) 、 m p 。3 4 2 ( 张光焰，等，1 9 9 5 ) ，以及对玛铃慧甲虫、柳蓝叶甲等鞘翅目害虫黼效的y m 0 3 ( 商梅影，等，1 9 9 9 ) b t 杀虫荆。瞬前持续生产并应用较广的b t 产晶童隳有湖北b t 研究开发中心研制的“生绿高效b t ”系列产品等。 1 6 ，3b t 产品的安全性 弱裁，世赛上至少已有几吾个b t 麓熬铡蠢g 室j j 纾登记，产量占生物杀虫荆总爨豹9 5 ， 年锈黉额这数予矗美元，汉在美国环境绦护繇1 l 一| 盼5 年登适赘会鸯歉躲产磊藏鸯 第一章苏云金芽张杆凶研究现状及发展趋势( 文献综述) 1 7 7 个。在b t 产品的应用中，窳全性真是人们最为关心的问蹶。最近，美国农业部 ( u s d a r s ) 园艺植物研究中心s i e 鐾a l ( 2 0 0 1 ) 报道了b t 杀煦剂对哺乳动物的安全 性豹矗暑究躐狭( 替拣与饪改毅，1 9 9 8 ) 。多个实竣塞豹硬究都表明b 致蒗产鑫是馥传染 瞧鹣 裁豢逡羽1 0 8 e ( l o n y 稻拜粕n g 豫i l s ) 辩彳。对枣羲有毒，嚣对人类鸯毒靛诗耋 梵l o h 。莰l ；与之穗比，少量的淡瘀芽怒静蘑( 糯c 滋凇彻旃瑚颤 ) 穗养维簸即哥致死小 鼠，对人的榻皮致死剂量为1 0 3c 融。从1 9 9 7 年鬣今仅有2 篇关于人类爨擞感染的报道， 穗这些人袋么受到严重的烧伤，袋么受到其它外伤蔼成为易感人群；菇外嚣个流行病学 豹疆究瓷袋骥，在b t 奴醛搬鼢驻耱产蒹载大瓣摸飞瓤喽涟镬磊过程审浚骞瘸糖发黛。虽 然目前鸯缀道显示有些b t 菌株台脊b c 菌株的肠毒素基因，健在蜜黢室送行的对小鬣秘 羊饲喂b t 产品的试验中没有发现任何致病现歙 在b t 的窜喷洒施用中也没有任何腹泻 病发生。练含实验室和田间试验结聚，b t 杀虫剂具有良好的安全性融泶，因此作为绿色 生物农药冀仍将成为化学杀虫剂的替代品雨拥有广阔的开发应用髓景( 徐庆贤，游， 2 0 镑3 ) 。 + 8 4 孰菇戆拜发和磷究毒翻 对b t 的研究不仅具有重大的成掰价德，弱飘有着重要的理论意义，啜引了不同锁域 众多研究糟豹兴趣和参与。从研究方翔来看主鬃体现在以下几个方颥：一是应用新技术 藏方法，不鞭提毫b t 熬生产承平，茏箕是发懿水警；二是零j 耀突变接零会成寻找浆掰豹 簿毒力蘑撩；三莛逶过对b t 豹貉构修镪，合成受强鸯力的杀虫裁；疆怒秀震8 t 的旗藤磺 究，以便逐渐应用于人类：孤怒对b t 作用机理的进一步深入研究，肖助予了解细胞的信 号传导。 1 7 本试验的设计思路 零试骚欲良本实验室获寒j t 魏医植被裰表主串爱鑫然死亡熬纛聚蜈绣盎髂斑筛选 分离副的9 椿苏云金芽孢桴麓为出发菌襟，从中筛选出一株发酵瞧髓良好的离霉力魏株： 对所筛选蒲橡进行鉴定并对杀擞晶体蛋自特性进行研究；采用币交试虢设计方法谶行菌 撩簸继笈懿培养基配方巍深瑟液髂发辩条 孛懿援豫；最嚣对发酵貔戆矮处理方法( 黉爨 提取) 和裁型船工工艺送行秘步磺究。为墩新蘩撩静秀发帮玺产撩骰定懿理论鏊继。 沈阳农业火学硕十学能论文 第二章高毒力苏云金芽孢杆菌菌株的优选 本章以本实验室从东北地区土壤中及自然死亡的玉米螟幼虫体内筛选分离到的9 株 苏云金芽孢杆菌为出发菌株，通过对九株出发菌株的发酵性能和生物毒力的测定结果的 比较，欲筛选出一株发酵性能优良并对靶标昆虫具有较高毒力的b t 菌株，作为进一步 试验的目标菌株。 2 1 材料与方法 2 1 1 试验材料 2 1 1 1 供试菌种 共选9 株苏云金杆菌菌株作为原始出发菌株，编号为h b 1 至h b 。9 。其中菌株h b 一3 由本实验室从玉米螟自然死亡虫体中分离得到；其余由本实验室于东北地区采集的多种 植株的根表土中分离筛选得到。 2 1 1 2 供试昆虫 小菜蛾( 尸f 姚胁驯d j 陀胁l i n n a e u s ) 2 3 龄幼虫，为沈阳化工研究院农药生物测定 中心提供的室内饲养敏感品系。 2 1 1 _ 3 培养基 b p 固体培养基：牛肉浸膏0 5 、蛋白胨1 0 、琼脂2 o 、n a c l o 5 ，d h ：7 o 。 b p 液体培养基：牛肉浸膏o 5 、蛋白胨1 o 、n a c l o 5 ，d h ：7 0 。 工业配方：黄豆饼粉o 5 9 、酵母粉o 5 9 、m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 9 、k h 2 p 0 4o 0 5 卧蔗糖 0 醣、水1 0 0 0 m l ，p h 7 5 ( 消前) 。 2 1 1 4 供试药剂 b t 标准品( p x ：1 5 0 0 0 i u m g ) ：由沈阳化工研究院农药生物测定中心提供。 2 1 1 5 主要仪器设备 h z q f 1 6 0 型恒温振荡培养箱( 由哈尔滨东联电子技术丌发有限公司) x s z 1 0 7 型双目生物显微镜( 宁波光学仪器厂生产) h s l 型电热恒温水浴锅( 由江苏江门科学仪器厂生产) 2 1 2 试验方法 2 1 2 1 斜面菌种活化 取保存菌种于新鲜的b p 斜面培养基表面画线培养，3 0 下1 2 h 。外观菌苔厚而均 匀，表面为乳白色无光泽。 2 1 2 2 菌株发酵状态，晶体形成率比较 2 1 2 2 1 原理 芽孢释放前，孢囊中含一个芽孢和一个同芽孢大小近似的清晰的菱形伴胞晶体为正 9 第二二章嶷稼力苏话惫芽撼耪莹莲榛的饶选 露黧长获态；释是含有芽斑泰形成熬豁壤象影成芽稳獒墓薅与禽爱鬻稳囊驹蘧薅会诗为 蘩傣憨羧。 菇舔澎袋率= 正掌孢囊数，蘩谘蕊数( 蘩俸憨数计为3 0 0 个) 阉疹率为发酵结束时静鑫体形戏率。赋步率高于9 0 时反映藏体黢黪状态良好。 2 。1 1 2 + 2b p 液体培养基摇瓶发酵试验 将淆他菌株各取一环接种子8 p 液体墙养基中，2 0 0 翠m ，3 0 蟠昧培养3 熊。用b p 骥侮培养纂稀释平扳法遗数发酵液潺藤数；捌血球汜数板涎数币鬻獠囊数翻麓抟总数。 2 + 1 。2 。3 鬻拣蒡您热稳定瞧毖较 凌滚拣经灭蔻静l b 臻莽鏊矮溅发黪碡溉褥弱懿蓥悬滚l 0 瓣撼甄蘧囊心2 + 3 m 洫， 每撩壤瓣主清滚分装5 支秃萤试餐巾，缳警5 m 毛，标记爱彗主懿麓燕纛襻懿键滋零浴锱孛 分别煮沸5 m i n 、l o m i n 、1 5 m l n ，檬鞲擎缀法计数活菌数，竣寒处璎缀滏瓣照，计算存 瀵察。 。 2 。l 。2 4 麓栋毒力效价的魄较 戳小菜蛾为靶标进行室内毒力测邂，辨以标准品进行活性对照，对备落栋的瀵性水 平避行比较。 2 i 2 4 1 榉晶稀释缓冲液的配制 磷簸缓洚液：n a c i 8 ，露，磷酸錾二镪3 魄，蒙由巢委女一8 0 溶液0 ，l 秘l ，蒸镄尔 o m l 。 2 。l 。2 4 2 铎激翱冬 檬猴赫：蘼分孝厅天平漆酸稼敬豁凇燕l 执l5 0 融g ，精确羁0 1 删；，装入2 5 l 装骞 l o 粮玻璃璨的磨口三角瓶中；加入l 糖k 磷酸缓冲液，浸泡l o m 溉在掇荡嚣上振荡3 0 m 讯， 褥要4 浓度豹为l m g ，m l 的标准晶母液( 该母液可在4 冰箱中放：矍i | ! l o d ) ，将豁凇晶蹲液 按二嵇法稀释成o 5 0 0 ，o 。2 5 0 ，o 1 2 5 ，o ，0 6 2 5 ，o _ 0 3 l m g ，m l 等五个不嗣浓度， 榉晶：将菌株用b p 培养基摇瓶发麟3 d ，发酵液用超声波处理s m 融餐耀。分别准 确吸取供试发酵液o 8 m l ，装入2 5 0 m l 壤辩三角瓶中，分别加入1 0 0 m l 磷酸缓冲液， 散入数敉玻璃珠，然后放到掇荡嚣上掇荡3 0 械n ，得到供试样品和标凇晶的母液，再将 霹液羧二穰耩释法稀释成5 令不网熬浓浚爨震鹣莼滚冬磊。 2 + 1 2 。4 。3 处灌方法 试验采糟p o t 瓣唼雾法。暌液爨l m l ，泷陲时闽为l m 撅，按“农药嫩物测定豁准 操作獠序”进行处理。直径3 c m 甘麓缀形殿两西及虫体均喷上蕊液，平皿鬏纱帮保澄。 处穗厝鼹于2 3 2 5 观察室内，4 8 h 膝调焱张、活虫数，每处理试虫3 0 头，设3 次重复， 以喷镣蠼缎理盐水作对照，计算残亡率。 甲一， 礴效计算：x i ( ) = 墨l o o i l ( t 处理死亡率；c 对照死亡攀) 沈刚农业人学硕十学位论文 将感染液各浓度换算成对数值，校f 死亡率换算成死亡几率值，利用d p s 软件系 统求出各样品及标准品的毒力回归方程式，l c 5 0 值及9 5 置信限，以评估各供试样品的 活性。 毒力效价：x ：旦坚 j ( s 标准品l c 5 0 值；p 标准品效价：y 样品l c 5 0 值) 允许相对偏差，但每个样品3 次重复测定结果最大偏差不得超过2 0 。毒力测定制 剂各浓度所引起的死亡率应在1 0 9 0 之间，5 0 死亡率上下至少有两个浓度。 2 2 结果与分析 2 2lb p 液体摇瓶培养基发酵情况 将9 株b t 菌株分别接种于b p 液体培养基中，在相同条件下发酵，发酵完成后的总 活菌数及芽孢形成率见表2 1 。9 株菌在b p 液体摇瓶培养基中发酵，h b 一3 和h b 8 的晶 体形成率最高，但镜检发现h b 8 产生总活菌数较少。h b 1 、h b 一6 和h b 7 的晶体形成 率也比较高，但产生的总活菌数也比较少，可能和选择的培养基种类有关。其余几个菌 株产晶率都比较低，其中h b 2 无论总活菌数还是晶体形成率都是晟低的。 表219 株b t 的菌株的生长发育情况 t 曲2 1 c o m p a r i s i o no f c e i ic o u n t s 帅dc r y 咖i sf 0 玎n l n g 哪e so f 98 ls t r a j n s 2 2 2 芽孢耐热情况 9 株b t 菌株的芽孢悬液经沸水浴处理后的存活情况见表2 2 。从表2 2 中可以看出， 9 株菌株在l o o 水浴5 m i n 后即表现出明显的耐热性差异，其中h b l 、h b 一3 、h b 9 第二章熹毒力嚣云金芽绝耪莲蓬株静优选 滟雾稳枣活辜大丈裹予其缝蓉撩，表瑗黥较照豹褰熬缝；珏b 吞 毽一7 、 b 1 8 嚣中；h b _ 2 、 瓣4 、 重b 一5 最低。嚣在拳浴 o m 撼愆， 8 。3 豹芽孢存活率最高，遮至l5 5 差转- l 、 h 转，7 、h b 9 次之；其余菌株芽孢已羹本死亡。在处理1 5 m i i l 后，所有菌株的努翘。基 本死亡，仅h b 一3 有极少量芽孢存活。 表22不同黼株莽孢热处理后的存活率 t 曲22t h el i v a b i i i t yo f d j 帕嘲ts l r a i n sa r e rh e a tt r e a t m e n t o 5 l o l o o 醚 2 2 l 1 9 0 1 0 0 档 5 5 l l l o 1 0 0 2 s 0 1 0 0 5 2 2 1 0 0 5 l 3 4 i 毒2 o 1 0 0 圆 1 4 1 5 oo3oo0000 2 2 3 生物测定毒力效价比较 将各菌株处理好的发酵液样品进行毒力测定，测试结果见表2 _ 3 和表2 4 。 表23b t 样品驶j | 荦准品对小菜蠕室内毒力测定结果1 t 妣3i n d o o r t o x i l y m 曲s u 托m e n t s o f b l l 础ns a m p l e sa n ds t a n d a r ds a m p l e sc o 爿“招妇砌地如( 1 ) 麓株剂量 死f 虫效死f 率 校正死产率 桃攀德 塑竖一塑墅! ! 麴望 竺竺!竺! 竺! 竺垒壁型坚：! ! 竺 ! 竺! 一 s 0 ( 持2 37 7 巷7了了石75 。7 6 h b + 2 4 0 1 2毒。4 0 0 0 2 潮 1 0 0 0 5 0 0 2 5 0 8 0 0 0 4 0 0 0 2 0 0 0 l 0 0 0 5 2 5 0 8 0 0 0 4 。 l o o o 3 3 3 0 0 0 0 ，0 0 8 0 0 0 5 0 2 33 3 l o 0 0 33 3 0 1 9 6 6 7 i o 3 3 3 0 0 0 00 0 8 0 0 0 5 0 2 3 _ 3 3 1 0 王3 3 0 i 6 7 4 ，s 3 7 2 3 1 6 ， ， 5 + 8 4 5 o o 4 2 7 3 7 2 3 6 ， 8 ，7 2 6 9 4 3 ， 0 o m 7 3 ， 0 始 坤 婆! ! 壅塑叁堂堡主：至堡笙茎 h b 6 h b - 7 h b 罐 2 02 58 3 3 38 33 3 59 7 l o o o1 75 6 6 75 6 6 75 i 7 5 0 0l l3 6 6 73 6 6 74 6 6 2 5 031 0 o 0 03 7 2 s o l g6 0 0 0鞫 s2 5 4 0 93 0 3 理秘 4 7 2 0 0 04 3 + 3 31 33 338 9 1 0 0 026 + 6 76 6 73 5 0 5 0 0l3 3 33 3 331 6 2 5 0oo 0 0o o o ， 8 0 0 02 48 0 8 0 0 05 ，8 4 4 0 0 01 24 0 0 04 n o o 4 7 5 2 0 0 093 0 0 03 0 0 0 4 4 8 1 0 0 026 6 76 6 7 3 5 0 5 0 0o o 0 000 0 ， 2 5 00o 。0 0o 0 0 8 0 0 01 65 3 3 3s 3 3 3 5 0 8 4 0 0 082 6 6 72 6 6 7 4 3 8 2 0 。041 3 3 31 33 33 8 9 1 0 0 0i3 3 33 。3 3 3 1 6 5 o3 3 33 3 3 ， 2 s 000 m o0 0 0 ， 8 0 2 9 6 79 6 6 76 ，8 4 4 0 。o2 5s 3 3 38 3 3 3s 9 7 2 0 1 9嵇3 3鹞3 3 5 。3 4 l 0 2鹌，纯 4 筇 5 41 3 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l7 3 毒l x * 3 6 4 2 2 + 2 4 0 1 7 x 。1 7 7 5 2 + 1 7 2 4 1 x 穗5 6 1 3 + 2 ，3 9 8 4 x 矗5 7 7 了+ 1 9 7 0 2 x 3 。控7 4 + 2 ，4 s 8 x 3 7 5 9 9 5 7 4 6 4 9 7 。粒麓 3 9 6 5 6 4 8 5 0 6 8 8 1 4 2 1 0 2 1 1 2 6 5 、1 3 1 8 4 6 ，9 9 31 0 5 4 5 5 2 融7 8 7 4 s 4 酗9 1 7 3 3 5 0 7 4 4 8 3 6 7 8 l 1 0 6 7 1 1 2 7 8 1 5 7 8 9 1 0 3 1 3 9 3 9 1 7 0 1 2 5 4 0 2 6 7 2 0 2 8 2 0 2 3 8 5 3 8 1 7 9 1 7 7 9 8 1 0 6 s 4 s 1 3 聿4 0 8 1 9 7 2 标准品 。i 7 6 5 7 + 3 3 7 6 0 1 0 0 9 38 7 1 5 1 5 0 0 0 0 0 从表2 - 3 和表2 4 中可以看出，在供试样品中，h b ，3 菌株在8 0 0 0 m l 、4 0 0 0 p g 触l 、2 0 0 0 耻m 、l 0 0 0 # 2 越澎、5 0 0 驻m l 秘2 s e | l r n l 的浓度下对小菜蛾4 8 h 懿 校芷死亡率分溺为9 6 。6 7 、s 3 3 3 、5 6 。6 7 、3 6 。6 7 釉l o 。o o ，l c 5 。达弱7 4 6 。4 9 p g 缝l ， 毒力效价为2 0 2 8 2 0 ( i u m g ) ，滔性最高。 2 4 洗# f 船控人学硕十学位论文 此外，在同样条件下，备供试样品的l c s o 均明恩低于b t 标凇品( 1 0 0 。9 3u m l ) 。 分叛原因可能怒供试发酵滚撵茹未经浓绩及添热劲裁垒釜璎。 2 3 本潦小继 通过对九椿出发菌株的发酵性熊和生物毒力的测定比较发现，本实验塞从玉米螟病 虫体内分离褥到的h b 一3 菌株无论谯发酵性能( 发酵形态、晶体形成率、芽孢热稳定性 ) 还是蓉蠡毒力上蚜是一撩递较俊嶷戆苏云盒芽稳耪蘩，骞遂一步研究艘怒翡赞毽。戮 此，将该麓拣做为进一步试验韵目标菌株。 奁转t 豹发辩产秘审，棼毯_ 季爨俸稳鑫薅楚蒸终为警戆杀虫裁瓣主要渗程残分，濑予 晶体蛋自的耐热能低，加热会使其变性从而失活；芽孢虽具有一定的耐热性，但高温处 理也会使篡减少睨发。因此，长时渊高温加热处理会大大降低b t 的生物活性。从圈中 霹隘看窭l 承浴1 0 辩法舞各蘩撩憝芽雍存添搴大穰瀣下鬻，登i 5 m 法螽各藿攮熬芽 孢已基本死亡。躐此，在b t 的加工：过程中，l o o 酌时蛳不宜超避1 0 m 溉。 第三章高毒力苏云金芽孢杆菌h b 3 凶株生物学特性的研究 第三章高毒力苏云金芽孢杆菌h b 一3 菌株生物学特性的研究 通过对九株出发菌株的发酵性能和生物毒力的测定比较，筛选出高毒力b t 菌株 h b 一3 为进一步试验的目标菌株。苏云会芽孢杆菌的主要杀虫活性物质为它所产生的晶 体蛋白，是世界上生产的大多数微生物杀虫剂( 9 0 ) 的活性成分。因此主要对该菌株 的形态学、生理生化特性、血清型以及杀虫晶体蛋白特性进行研究。 3 1 材料与方法 3 1 1 试验材料 3 1 1 1 供试菌种 苏云金芽孢杆菌h b 3 为本实验室从玉米螟自然死亡虫体中分离得到；标准菌株有 苏云金亚种( 占腩r f “垤招n 5 打) ( h i ) 、幕虫亚种( 最砌m 姗) ( h 2 ) 、以色列亚种 ( 丑括，口p 髓瑚缸) ( h 1 4 ) 、h d 1 ( h 3 a b ) 、阿莱亚种( 8 口把s r f ) ( h 3 a c ) 、鲇泽亚种( 丑n 拓d w 耐) ( h 7 ) 、库斯塔克亚种( b 妇坩r 口甜) ( h 3 a b 。) 、猝倒亚种( b s o 肋) ( h 4 。b ) 、蜡螟亚种 ( 丑船耽r 妇) ( h 5 a b ) 。均为本实验室保存菌种。 3 1 1 2 供试昆虫 玉米螟( 西f ，f n 抽矗圹h 叩口凰g u e n e e ) 2 3 龄幼虫，为沈阳农业大学害虫生物防治实 验室提供的室内饲养敏感品系；尖音库蚊( c 钆，蹦p p 招邶l i r h l a e u s ) 3 龄幼虫，为沈阳 化工研究院农药生物测定中心的室内饲养敏感品系。 3 1 1 3 培养基 b p 培养基：牛肉浸膏o 5 、蛋白胨1 0 、琼脂2 o 、n a c lo 5 ，p h ：7 0 。用 于基础培养。 l b 液体培养基：酵母浸膏o 5 、蛋白胨1 o 、n a c l l o ，口h ：7 o 。用于鞭毛血 清型鉴定。 l b 半固体培养基：酵母浸膏0 2 5 、蛋白胨0 5 、n a c lo 5 、琼脂o 2 o 3 ， p h ：7 o 。用于鞭毛血清型鉴定。 p m 培养基：酵母粉5 o 、玉米淀粉3 7 5 、葡萄糖o 5 、c a c 0 3o 1 。用于毒 力测定。 3 1 1 4 试剂和仪器 试剂：标准分子量蛋白( m a r k e r ，美国a l i l r e s c o 公司生产) 主要仪器：d y y _ i i l 2 型稳压稳流电泳仪( 北京六一仪器厂) d y c z - 2 8 a 型夹心式垂直板电泳槽( 北京六一仪器厂) g l 一2 0 b 型冷冻离心机( 上海安亭科学仪器厂) 7 2 2 s 可见紫外分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) 沈阳农业大学硕十学位论文 d m ba 4 5 0 型数码生物显微镜：( m o t i ci m a g e sa d v a n c e d3 0 软件) ， f d 1 型冷冻干燥机( 北京博医康技术公司) 7 8 1 型磁力搅拌器( 中国上海南汇电讯器材厂) 3 1 2 试验方法 3 1 2 1 菌株的培养 将冰箱保存的斜面菌种活化后接种到l b 培养基中培养过夜，再按1 的接种量转 接到新鲜的l b 培养基中，3 0 1 2 2 0 r m i n 摇床培养，待8 0 的晶体脱落即加酸调 p h 至5 0 6 0 ，4 冰箱保存。 3 1 2 2 菌株形态性状观察 3 1 2 2 1 常规染色观察 石碳酸复红染色液：碱性品红o 1 9 溶于1 0 m l 9 5 乙醇，然后加入9 0 m l 3 的苯酚水溶 液。置于阴暗处备用。 在玻片上滴一滴水，挑取少量菌体于水中，让菌体均匀地分散在水中，然后在酒精灯上 烘干，染色，染色时间为1 4 m i n ，用蒸馏水冲掉染液，用滤纸吸干水滴，在显微镜( 油镜) 下观 察。 3 1 2 2 2 革兰氏反应 草酸铵结晶紫染色液： a 液：结晶紫2 5 9 ，酒精( 9 5 ) 2 5 o i l _ l l b 液：草酸铵1 0 9 ，蒸馏水1 0 0 m l 将结晶紫研细后，加入9 5 乙醇使之溶解，配成a 液；将草酸铵溶于蒸馏水配成b 液，两液混合即成。 涂片：将菌液涂片，干燥，固定( 过火焰) 以载玻片不烫手为宜。 初染：加草酸铵结晶子染色液一滴，约1 m 访，水洗。 媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1 m i n ，水沈。 脱色：将载玻片的水甩净，并衬以自背景，用9 5 酒精滴沈至流出酒精刚刚不出现 紫色为止，约2 0 3 0 s ，立即用水冲净酒精。 色为止，约2 0 - 3 0 s ，立即用水冲净酒精。 复染：用沙黄液染1 2 m i n ，水洗。 镜检：干燥后，置油镜观察，呈红色为g - ；呈紫色为g + 。 3 1 2 2 3 鞭毛染色 参照刘德容等( 1 9 9 8 ) 的方法进行。 a 液：单宁酸5 9 ，f e c l 31 5 9 ，1 5 福尔马林2 o m l ，1 n a o h l 0 m l ，蒸馏水1 0 0 i n l b 液：a g n 0 32 9 ，蒸馏水1 0 0 m l ，配制时，需滴加5 9 浓氨水和回滴硝酸溶液，边 加边搅拌。使呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀。 制片：先于洁净载片一端滴一滴蒸馏水，用充分冷凉的接种坏取培养好的斜面底部 第三章裹毒力苏蠢佥芽孢轷蓝 b 3 漪糕生物学特性的研究 翡萤慧滚一垮，惑藏在东渍中片劐，冤零渍藕受浑涟，马上籍搂耪坪穆舞，静萋l 一2 赫n ， 使细菌鞭亳舒疑籍祷载片藕蘸赫，使萤液垂载持的端流彝勇一灞，使成薄屡，立藏 在台子上，自然风干。 染色：谯风干的涂菌载片上滴加a 液，4 6 m i n 聪用蒸馏水轻轻冲净，再加b 液， 缓慢加热至裂气，维持约o ，5 m i n 。在麓体多豹部分珂呈深褐色至黑色，搏止翔热，用本 洚洚，于螽镜稔。 3 。2 。2 4 运动槛鼹察 采用悬滴法：取洁净的凹玻片，盖玻片各一块：加一滴菌液于敲玻片中央将带有蘸 液滴的盖玻片小心翻转置凹玻片上，使液滴悬于湖懈中央；将标本磴艘微镜镜检，观察 运动情况。 3 ， ，2 王。5 嘉侮虽丞形态瑟察 翦楚璎方法强蓑体常袈染色瓣察方法，。薰离穑黧耱显微镜下褒察并撼照。 3 1 2 _ 3 菌株嫩耀生化反应 按照常规方法( 高秀梨，1 9 9 9 ) 对菌株的1 0 撷生理生化性状进行了研究。 3 12 4 菌株鞭壤巍溃型鉴定 参爨李肇寒等l 瓣6 熬方法避稽。 3 1 2 4 + l 蘸体龅活纯及抗原毒l 备 将h b 。3 单菌落接种于l b 半固体培养基上3 0 培养9 。1 2 h ，取边缘生长旺盛菌体 活化2 3 代，棒转接到l b 液体培养基上3 0 振荡1 0 1 4 h ，离心( 3 0 0 0 “m i n ，1 5 m i n ) 牧集藏体用生壤盐水稀释到派发魏l o 屯l 妒个细胞m 蠡，加入甲醛使终浓度为o 5 ，即 麓撬嚣霉滚。 3 1 2 t 聿。2 斑漓燮签定 制备h b 。3 菌株的抗血清。通过交义凝集反应，确定其全部h 抗原因子和凝集反应 效价。 3 ，l t 2 ，5 律斑撼棒龅分离缝纯 采罨玉瑛警 凡o i ( 2 ，3 ) = 3 0 8 2 ，为高度显著性因子，其次为鱼粉，民0 5 ( 2 ，3 ) - 9 5 5 接种趱。并且发现谯不同的发酵条件下菌株韵产孢数和发酵时间有很 大的差异。在9 次试验中，产生孢子数最多可达5 5 0 5 x1 0 8 m l ，最少仅为2 4 3 0 1 0 8 ，m l ， 丽就发酵时间两言，最长的有4 4 h ，袋短仅用3 5 b 就达到放罐标礁，相差近1 臁，可见不 阕靛发酵祭 串下蓊株静发酵东平存程缀太差异。翅始蠲靛最税承平为7 。4 ，麓辩温疫豹 沈_ i 农业人学硕十学位论文 最优水平为3 2 ，丽接种量的缀优水平为7 。 表4 蕊b ( r ) 光机虢正变试验设计和昭莱 t a b4 6 b ( 3 4 ) o 附l o g o n a le o p e m e n 协ld e s i g na n dr e 8 u l tf o ri n o 嘻a n i cs a i t s 试验号 川索水rf 8 。1 。7 8 n di 。”。l 活孢了数 n q m 沁fo f l ；增s 豫 e 0 3 m g s 试7 瓣2 0k 2 p o z n s o 肆7 h o f 1 0 吖m l ， i lil 5 35 0 22 222 2 5 3 33 335 07 5 42 l232 l5 0 522 3l3 86 6 6 23l27 5 3 s 73l 322 4 o g 83 2134 4 1 9 9 3 32l2 8 2 5 &l 弱，7 s辨。撼1 7 30 7l 勰。4 l k 2 1 3 5 5 41 0 53 87 2 ，2 81 2 i 螂 k j9 6 5 21 5 4 3 8l l3 4 9l1 6 4 4) n = 3 5 88 4 氩 4 2 2 63 3 。0 35 7 4 0 。1 4n 冲 七l 5 1 8 3 5 1 32 4 4 0 6 6 一 = 3 98 7 b 3 2 1 75 1 4 6 3 7 8 3，8 8 i r1 3 。o l1 8 4 33 3 6 0 1 8 5 最撬 g 僦懿撬、0 。0 3 甏醛g s 0 t 7 & 。、氇1 0 联# 璐。0 。0 0 2 驱n s 0 ，7 秘毋 裘4 7l ( 3 ) 正窝试验方差分析袭 1 铀4 7 w 3 4 ) o 蚰o g o n a le x p e m n 扭id c s 蜘dm a l y s ，s 方差来耀编差警方和蠢出发f 均编差f 蠢鞠 f 蕴 v “s u mo f s q u a r e sd r m e s q u a ” c a c 岛 2 7 9 4 4 2j 3 9 7 2 m g s 瓴7 h 2 0 k h 2 p 0 4 6 1 0 争8 【7 1 i 8 5 2 2 3 0 5 4 9 8 5 5 9 3 z n s 0 4 h 3 0 5 。4 52 2 ，7 3 总计2 7 7 28 引 菊强章h b ，3 篷栋箍瓶蜷嚣萋傀纯及发酵条嚣袍姘究 袭48h ( 筝) 美醇荣糌竖交斌验设计和结果 如b4 瑶 b ( 3 4 ) 州h 堞聃崩e x p 硝m 曲翎幽s 溏n 鞠d 蹿躺疆“# d 盯触m e n 瓣l o n c o 嘲隔翱s 试黢警 。 阈赣承甲轴o # r 甜d l 抖剁潢孢数 拐始p 轴 h l 蒯 l 温度 t # m p e 球h 胖f ) 接羊巾曩 l n u l m ( 笈黪时闻 n u 瑚b 材o f l i v c s 帅持 n 黼n 姆# i o nt l 襁 ( e 聱犯b ) l2 l3 2i 22 23 3 3 3 9 文3 7 1 4 8 9 窑 1 1 3 。7 爵 3 l ，6 4 争6 6 3 7 锉 2 3 j 3 2 9 | 8 9 9 蓐 1 3 4 主l 4 4 3 聍 2 甓9 母 4 4 7 5 1 巷8 1 1 8 3 2 1 2 7 1 i 3 ，。2 3 3 9 4 雌 霹2 3 7 删 n = 9 m 衅9 6 嚣 r1 8 2 0 4 7 巷5 。1 4 娥优蜘贻醐一4 擞鹱( ) 3 2 ，梭释蠡( ) 7 裘4 9 b 3 ) 蔗交试骢方差分橱袭 t 酶4 争l 毹3 4 ) o h h o 鐾o n 羽鼎p e r i m e n t a ld 髓 躺a n d 锄a l y s i s 韧始口h 5 j o 9 622 s 5 4 91 4 5 4 l n i 稍棚 接种童 4 2 3 。22 。5 l谨 i n o c u l n m ( ) 滋瘦3 9 擘421 9 9 71 | 4 脚e 嗽u ， 浸麓e3 5 1 521 7 s 慈诗 l 7 镗 ；2 3 幸 5#7摹擎戤如如歉一缸“ 鲨型堡些叁堂堡主堕堡奎 4 2 4 菌株生长代谢曲线 4 2 4 1 葡萄糖浓度标准曲线 4 2 4 2 菌株生长代谢曲线 0 v=o4 9 6 2 x + 0 0 2 7 4 0 0 20 0 4o 0 60 0 80 1 浓度 c o n s i s t e n cy ( m g m l ) 图41 葡萄糖浓度标准曲线 f i 9 41g 1 u c o s ec o n s i s t c n c y 虬曲d a r dc u r v e 警 0 0481 2 1 62 02 2 83 23 6 4 0 4 4 发酵埘m f e r m e n t a t j o nt i m e ( h ) 图42 总糖消耗曲线 f i g42s u g a rm e t a b o l i z a t i o nc u r v e 7 5 7 3 71 6 9 6 7 毛6 5 6 3 6 1 5 9 5 7 5 5 0481 21 6 2 0 2 4 2 8 3 2 3 6 4 04 4 发酵时m f e r m e n t b t l o nt i m e ( h ) 圉44 州变化曲线 f i g4 4p hd i v e r s i n c a t j o nc u r v e 委 兰 蓁； 蠹i 3 0 2 5 2 0 皇1 5 l o 5 0 1 1 0 1 0 0 9 0 8 0 囊铋 3 0 2 0 1 0 0 0481 2 1 62 0 2 42 83 23 64 04 4 发酵时f h j f e r m e n t a t i o nt l m e ( h ) 幽4 3 细胞浓度变化曲线 f i g43c e c o n s i 虬c n c yd i v c r s 讯c a t i o nc u r v e ， 048121 6 2 0 2 4 2 8 3 2 3 64 0 发酵时侧 f e r n i e n t a t i o nt i m e ( h ) 图45 溶氧量变化曲线 f i g45d od i v c r s i n c a t i o nc u r v e 嘶似窖j毗0 o 0 0 0 0 0 o 0 。葛口。世采登 3 5 2 5 l 5 吼仉o m o o o 一目铀日)|_c_cou- 棚如糖躅 第四章h b 3 菌株摇瓶培养基优化及发酵条什的研究 从图4 2 和图4 3 中可以看出在最初的4 h 罩菌株的数量几乎保持不变，总糖含量下 降较快，在对数高峰期柬临前已经下降至最初含量的一般左右，说明在此期间虽然总菌 数没有增长，但菌体细胞代谢却十分活跃。在8 1 6 h 期i 刈，菌株生长发育进入对数生长 阶段，总菌数急剧增加细胞浓度达到2 2 6 5 1 0 8 个m l ，总糖的消耗速率也大大增加。 此后，总菌数的增长变慢，到2 0 h 总菌数丌始趋于稳定。总糖的消耗在2 0 h 后开始变缓， 糖的利用高峰与菌株的对数生长期基本吻合。 从图4 4 的p h 变化曲线可以看出，从丌始培养到1 2 h ，p h 始终呈下降趋势，这是 因为该阶段菌体大量利用糖类而产生丙酮酸和乙酸，但丙酮酸和乙酸被利用后，p h 又 开始回升( 1 6 h 后) 。到4 0 h 时p h 已超过初始p h 。苏云金杆菌是好气性微生物，在生 长过程中需要消耗大量的氧气。因此，从图4 5 中可以看出，在菌株开始生长到对数生 长期间，溶氧量下降很快，之后，随着菌体生长趋于稳定，溶氧量也逐渐回升。 4 3 本章小结 本章利用正交试验方法：在摇瓶中对苏云会芽孢杆菌h b 3 菌株进行最佳发酵培养 基配方的筛选，采用国产1 5 l 全自动智能发酵仪对该菌株的发酵条件进行优选。结果如 下：在培养基各组分中，各因素对菌株产孢量的影响以酵母粉最大，为高度显著性因子， 其次为鱼粉，为显著性因子，其余均为非显著性因子，得到的最佳培养基组合为玉米淀 粉4 0 、黄豆饼粉2 o 、酵母粉2 o 、鱼粉2 0 、蛋白胨o 5 。在培养基中加入 o 5 c a c o ”o 0 3 m g s 0 4 7 h 2 0 、0 1 0 k h 2 p 0 4 和0 0 0 2 z n s 0 4 7 h 2 0 。最佳发酵条件 为：起始口h 7 4 、接种量7 、培养温度3 2 。 沈目农业人学硕十学佛论文 第五章h b 一3 菌株发酵液后处理方法的研究 发酵液的后处理一直是制约苏云金芽孢杆菌杀虫剂发展的瓶颈。苏云金芽孢杆菌生 物农药中的有效成分是芽孢和晶体，它是通过苏云会芽孢杆菌的深层发酵而得到的。当 发酵结束时，发酵液中的有效成分即晶体和芽孢量仅占发酵液总量的1 一1 5 ，而水分 约占9 6 。因此，后处理的核心是如何将晶体、芽孢与发酵废液相分离，将有效成分浓 缩出来。本章试验意在采用一种新的蛋白提取方法，将晶体、芽孢与发酵废液相快速分 离，同时以晶孢混合物为原药，进行可湿性粉剂的剂型加工。 5 1 材料与方法 5 1 1 试验材料 5 1 1 1 供试昆虫 玉米螟( 蕊护加胁，i 旷棚阳胁g u e n e e ) 二龄幼虫，为沈阳农业大学害虫生物防治实验 室提供的室内饲养敏感品系。 5 1 1 2 供试原料 晶体蛋白粉末，渝润剂n n o ( 萘磺酸钠甲醛缩合物) ，防腐剂山梨醇，扩散剂m f ( 烷甲基磺酸甲醛缩合物钠盐) ，增效剂碳酸钾，玉米粉，硅藻土。 b t 标准品( p x ：1 5 0 0 0 i u m g ) ：由沈阳化工研究院农药生物测定中心提供。 5 1 1 3 主要仪器设备： h z q f 1 6 0 型恒温振荡培养箱( 哈尔滨东联电子技术丌发有限公司) f d 1 型冷冻干燥机( 北京博医康技术公司) d h g 9 1 2 3 a 型电热恒温鼓风干燥箱( 上海精宏实验设备有限公司产品) 5 1 2 试验方法 5 1 2 1 发酵液的后处理方法 5 1 2 1 1 蛋白的提取 参照福建农科院生物技术中心的阮传清等提出的一种新型的处理方法：依据晶体与 芽孢两者相对密度、表面特性、溶解度不同，以及芽孢的萌发性等的区别，改良了试验 室中采用的双水相提取法，对采用液体发酵法所得发酵液不经过离心、去泡沫( 除芽孢) 等处理，直接进行双水相萃取，所得水相蒂取液。经过静置沉淀，大约3 0 m i n 后，在底 层会出现白色沉淀。收集白色沉淀部分，冷冻干燥成白色粉末。4 冰箱备用。 采用顾真荣等( 1 9 9 2 ) 的方法进行蛋白浓度的测定。 5 1 2 1 2 剂型加工 悬浮率的测定：用2 5 0 m l 具塞量简装2 5 0 m l 水，置于3 0 恒温水浴锅中静止3 0 m i n 使温度一致，后将配好的药粉倒入具塞量筒中，测定沉降时问。待完全沉降后，将量筒 第五章h b 3 菌株发酵敞肝处理方法f | 勺娴究 在l m i n 之内颠倒数次，再将量筒放入恒温水浴锅中静止3 0