（动物营养与饲料科学专业论文）亮氨酸调节自噬的信号通路研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同7 - - 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生始粉 帆沙年多月伽 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 | 洲文作。渺锄张獬 签名日期：沙lo 年月j 日 签名日期：认( 0 年易月i 乞咱 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 亮氨酸调节自噬的机理研究 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 缩略语表( a b b r e v i a t i o n ) v 第一章文献综述1 1 1 自噬研究进展1 i 1 1 自噬的概念1 1 1 2 自噬相关信号通路。2 1 1 3 自噬的特征及检测方法。3 1 2 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白研究进展6 1 2 1 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的概念6 1 2 2 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白相关信号通路6 1 3 支链氨基酸7 1 4 人胚肾细胞2 9 3 t j 。8 1 5r n a 干扰9 1 6 本研究的目的和意义9 第二章材料与方法11 2 1 试验材料1 1 2 1 1 细胞、菌种、载体与质粒1 l 2 1 2 主要药品及试剂1 2 2 1 3 主要培养基及其配制1 2 2 1 4 缓冲液13 2 2 试验方法1 5 2 2 1 大肠杆菌感受态细胞的制备( 氯化钙法) 15 2 2 2 干扰质粒的构建1 5 2 2 3 质粒的转化_ 15 2 2 4 质粒的小量制备( 改良的碱裂解法) 1 6 2 2 5 质粒的大量制备( 试剂盒) 1 6 2 2 6 限制性内切酶酶切反应1 7 2 2 7 质粒提取产物或酶切产物的电泳检测1 8 2 2 8 人胚肾细胞的培养1 8 2 2 9 质粒转染细胞l9 2 2 10b c a 法测定蛋白质浓度。2 0 2 2 1 1s d s - p a g e w e s t e r nb l o t 2 0 2 2 12 流式细胞术2 2 ， 华中农业人学2 0 1 0 届硕上学位论文 2 2 1 3 透射电镜技术2 2 2 2 1 4 共聚焦显微镜技术( 爬片法) 2 2 2 2 1 5 统计学方法2 3 第三章结果与分析2 4 3 1 质粒小量制备后鉴定2 4 3 1 1 质粒小量制备后电泳鉴定2 4 3 1 2 质粒小量制备后酶切鉴定2 4 3 2 质粒大量制备后鉴定2 4 3 2 1 质粒大量制备后浓度与纯度测定2 4 3 2 2 质粒大量制备后电泳及酶切鉴定2 4 3 3 干扰效率鉴定2 7 3 3 1 转染后荧光显微镜观察细胞荧光2 7 3 3 2 转染后流式细胞术检测荧光细胞率2 8 3 3 3 干扰后w e s t e r nb l o t 检测被干扰蛋白的干扰效率：2 9 3 4 亮氨酸饥饿。3 0 3 4 1 透射电镜观察自噬泡的产生3 0 3 4 2 共聚焦显微镜观察l c 3 g f p 表达质粒的荧光分布3 0 3 4 3 亮氨酸饥饿后w e s t e r nb l o t 检测自噬相关蛋白3 0 3 5 亮氨酸饥饿后重补充3 0 3 5 1w e s t e r nb l o t 检测自噬相关蛋白3 0 3 5 2w e s t e r nb l o t 检测m t o r 下游蛋白3 3 3 6 干扰r o t o r 上游调节蛋白：3 3 36 1 干扰r h e b 3 3 3 6 2 干扰r a p t o r 3 4 3 6 3 干扰g b l 3 4 第四章讨论与结论。4 l 4 1 讨论4 l 4 1 1 亮氨酸饥饿对细胞自噬的影响4 1 4 1 2 亮氨酸对细胞自噬的缓解及其信号机制4 l 4 1 3m t o r 上游调节蛋白参与亮氨酸对细胞自噬的调节4 2 4 2 结论4 5 参考文献4 6 至i 谢5 3 附录在读期间发表的论文5 4 亮氨酸调节自噬的机理研究 摘要 本试验旨在研究亮氨酸对细胞自噬水平的调节，及其调节是否依赖雷帕霉素靶 蛋白( m a m m a l i a nt a r g e to f r a p a m y c i n ，m t o r ) 信号通路，以及亮氨酸的信号传递到 自噬相关蛋白是否必须通过m t o r 上游调节蛋白中的r h e b 、r a p t o r 或g b l ，为开 展营养素感应的信号通路的深入研究提供策略。 本试验主要包括三部分：( 1 ) 培养人胚肾细胞( h e k2 9 3 t ) ，进行时间梯度( o h ， o 5 h ，1 h ，2 h ，4 h ) 亮氨酸饥饿后透射电镜观察是否产生自噬泡及其产生的规律， 并运用w e s t e r nb l o t 方法检测l c 3 i i 和p 6 2 的表达丰度变化规律。将l c 3 g f p 表达 质粒转染至h e k2 9 3 t 细胞中表达，对细胞进行时间梯度( o h ，o 5 h ，l h ，2 h ，4 h ) 亮氨酸饥饿后共聚焦显微镜观察荧光分布规律。( 2 ) 在o 5 h ，1 h ，2 h ，4 h 中选取自 噬最明显的两个时间点( 2 h ，4 h ) ，将细胞进行亮氨酸饥饿，以及有、无雷帕霉素 ( r a p a ) 存在条件下亮氨酸饥饿后重新补充亮氨酸，分别检测l c 3 i i 、p 6 2 和p s 6 k 1 的表达丰度。( 3 ) 运用r n a 干扰( i ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 技术分别干扰m t o r 信号通路中的r h e b 、r a p t o r 或g d l 表达后，在o 5 h ，l h ，2 h ，4 h 中选取自噬最明 显的两个时间点( 2 h ，4 h ) ，将细胞进行亮氨酸饥饿及饥饿后重补充，检测l c 3 i i 、 p 6 2 和p s 6 k 1 的表达丰度。 研究结果如下：( 1 ) 亮氨酸饥饿o h 的细胞未观察到自噬泡，l c 3 g f p 的荧光 弥散分布于整个细胞胞浆。亮氨酸饥饿o 5 h 即产生了自噬泡，l c 3 g f p 的荧光也由 弥散分布于胞浆转变为部分聚集状态。在4 h 内，自噬泡和l c 3 g f p 的荧光聚集程 度随亮氨酸饥饿时间延长而增加，4 h 达到顶峰。0 h 未检测到l c 3 i i 的表达，p 6 2 的表达量是所有时间点中最高的。亮氨酸饥饿0 5 h 后，l c 3 i i 的表达丰度呈极显著 增加( p o 0 1 ) ，p 6 2 的表达丰度呈极显著降低( p o 0 1 ) 。在4 h 内，随亮氨酸饥饿 时间延长，l c 3 一i i 的表达丰度呈逐渐增加趋势，4 h 最多；p 6 2 的表达丰度呈逐渐降 低趋势，4 h 最少。( 2 ) 亮氨酸饥饿2 h 后，相对于o h 对照组，l c 3 i i 的表达丰度均 呈极显著增加( p o 0 1 ) ，p 6 2 和p s 6 k 1 的表达丰度均呈极显著降低( p o 0 1 ) 。无 r a p a 存在时亮氮酸饥饿2 h 时重新补充亮氨酸，相对于饥饿o h 组，l c 3 一i i 和p 6 2 的表达丰度变化均不显著( 胗o 0 5 ) ，p s 6 k 1 的表达丰度呈极显著降低( 氏o 0 1 ) 。 相对于饥饿2 h 组，l c 3 i i 的表达丰度呈极显著降低( 尺0 0 1 ) ，p 6 2 和p s 6 k 1 的表 达丰度均呈极显著增加( 氏o 0 1 ) 。有r a p a 存在时亮氨酸饥饿2 h 后重新补充亮氨 酸，相对于o h 组和无r a p a 存在时补充亮氨酸组，l c 3 i i 的表达丰度呈极显著增 加( p 0 0 1 ) ，p 6 2 和p s 6 k 1 的表达丰度均呈极显著降低( 氏o 0 1 ) 。相对于亮氨酸 饥饿2 h 组，l c 3 i i 的表达丰度呈极显著增加( p 0 0 5 ) 。l e u 饥饿时间为4 h 时，l c 3 i i 、p 6 2 和p s 6 k 1 的丰度变 化趋势与2 h 时一致。( 3 ) 干扰r h e b 或r a p t o r 后，亮氨酸饥饿2 h 与饥饿后重新补 充的结果相同。相对于o h 组，l c 3 i i 的表达丰度均呈极显著增加( 尸 o 0 1 ) ，p 6 2 和p s 6 k 1 的表达丰度均呈极显著降低( p 0 0 1 ) 。l e u 饥饿时间为4 h 时，l c 3 一i i 、 p 6 2 和p s 6 k 1 的丰度变化趋势与2 h 时一致。干扰g 1 3 l 后，相对于0 h 组，亮氨酸饥 饿2 h 时，l c 3 i i 的表达丰度呈极显著增加( 尸 0 0 1 ) ，p 6 2 和p s 6 k 1 的表达丰度均 呈极显著降低( p o 0 1 ) 。干扰g 1 3 l 后重新补充亮氨酸，相对于0 h 组，l c 3 i i 的表 达丰度呈极显著增加( 尸 0 0 1 ) ，p 6 2 和p s 6 k 1 的表达丰度均呈极显著降低( p 0 0 1 ) 。 相对于饥饿2 h 组，l c 3 i i 的表达丰度呈极显著降低( p 0 0 1 ) ，p 6 2 和p s 6 k 1 的表 达丰度均呈极显著增加( 氏o 0 1 ) 。l e u 饥饿时间为4 h 时，l c 3 i i 、p 6 2 和p s 6 k 1 的丰度变化趋势与2 h 时一致。 本试验研究结果表明，亮氨酸饥饿能诱导细胞产生自噬，且自噬在一定时间内 随饥饿时间的延长而加剧。重新补充亮氨酸能缓解自噬，并且这种缓解作用依赖于 m t o r 信号通路。i m e b 和r a p t o r 是m t o r 上游调节蛋白中传递亮氨酸信号的关键 因子，是连接亮氨酸和细胞自噬的串联桥梁。g 1 3 l 不是亮氨酸信号传递至自噬所必 需的。 关键词：自噬；亮氨酸；m t o r ；r h e b ；r a p t o r ；h e k2 9 3 t 细胞 i i 亮氨酸调节自噬的机理研究 a b s t r a ct t h ep u r p o s eo ft h i ss t u d yw a st oe x a m i n ew h e t h e rl e u c i n ed e p r i v a t i o ni n d u c e s a u t o p h a g yo rl e u c i n er e s u p p l e m e n t a t i o nb l o c k sa u t o p h a g yi nh e k 2 9 3 tc e l l s ，a n dt o i d e n t i f yw h e t h e rm a m m a l i a nt a r g e to fr a p a m y c i n ( m t o r ) s i g n a l i n gp a t h w a y i sd e p e n d e n t o rn o t ，a n di fs o ，f u r t h e rt oc l a r i f yw h e t h e rr h e b ，r a p t o ra n dg 1 3 lt h a ta r ea l lr e g u l a t i v e p r o t e i n su p s t r e a mo fm t o r a r en e c e s s a r y t h i sr e s e a r c hi n c l u d e st h r e ep a r t s ( 1 ) d e t e c t e da u t o p h a g i cv a c u o l e sb yt r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p ea n dl c 3 一i i ，p 6 2a b u n d a n c eb yw e s t e r nb l o tw i t ht i m e c o u r s e ( 0 1 1 ， 0 5 h , lh ，2 h ，4 h ) l e u c i n ed e p r i v a t i o ni nh e k 2 9 3 tc e l l s t r a n s f e c t e dh e k2 9 3 tc e l l s w i t ht h el c 3 g f pe x p r e s s i o np l a s m i da n dt h e nd e t e c t e dt h ed i s t r i b u t i o no fg r e e n f l u o r e s c e n c eb yl a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p ew i t ht i m e - c o u r s e ( o h ，0 5 h ，lh , 2 h ，4 h ) l e u c i n ed e p r i v a t i o n ( 2 ) d e t e c t e dl c 3 一i i ，p 6 2a n dp s 6 k 1a b u n d a n c eb yw e s t e r nb l o t a f t e rl e u c i n ed e p r i v a t i o na tt w ot i m ep i o n t sw h i c ha u t o p h a g yi n c r e a s e dt h em o s tm a r k e d l y o ra f t e rl e u c i n er e s u p p l e m e n t a t i o na tt h o s et w ot i m ep i o n t sw i t ho rw i t h o u tr a p a m y c i n ( 3 ) r n ai n t e r f e r e n c eo fr h e b ，r a p t o ra n dg p lr e s p e c t i v e l y , t h e nd e t e c t e da b u n d a n c eo f l c 3 i i ，p 6 2a n dp s 6 k 1b yw e s t e r nb l o ta f t e rl e u c i n ed e p r i v a t i o na t t w ot i m ep i o n t s w h i c ha u t o p h a g yi n c r e a s e dt h em o s tm a r k e d l yo rl e u c i n er e s u p p l e m e n t a t i o na tt h o s et w o t i m ep i o n t s o u rd a t as h o wt h a t ( 1 ) t h e r ew a sn oa u t o p h a g i cv a c u o l e sb e e nw a t c h e da n dg r e e n f l u o r e s c e n c eo fl c 3 g f pd i s t r i b u t e dd i f f u s e l yi nc o n t r o l ( l e u c i n ed e p r i v a t i o nf o ro h ) a f t e rl e u c i n ed e p r i v a t i o nf o r0 5 h ，t h e r ew e r es o m ea u t o p h a g i cv a c u o l e s ，a n dd i f f u s e d i s t r i b u t i o no fg r e e nf l u o r e s c e n c er e s u l t e di nap u n c t a t ep a t t e r np a r t l y w i t ht i m e 。c o u r s e l e u c i n ed e p r i v a t i o nw i t h i n4 h ，a m o u n to fa u t o p h a g i cv a c u o l e si n c r e a s e d ，a n dd i f f u s e d i s t r i b u t i o no fg r e e nf l u o r e s c e n c er e s u l t e di nap u n c t a t ep a t t e mu l t i m a t e l y , r e a c h e dt h e p e a ka t4 h l c 3 - i i w a su n d e t e c t e da n da m o u n to fp 6 2w a st h em o s ta to h ，b u ta m o u n t o fl c 3 i ii n c r e a s e da n dp 6 2d e c r e a s e db o t hv e r ys i g n i f i c a n t l y 衅o 0 1 ) a f t e rl e u c i n e d e p r i v a t i o nf o r0 5 h a m o u n to fl c 3 i ii n c r e a s e da n da m o u n to fp 6 2d e c r e a s e dm o r ea n d m o r ew i t ht i m e c o u r s el e u c i n ed e p r i v a t i o nw i t h i n4 h ( 2 ) a m o u n to fl c 3 i ii n c r e a s e d v e r ys i g n i f i c a n t l y ( p o o1 ) a n da m o u n to fp 6 2 a n dp s 6 k 1b o t hd e c r e a s e dv e r y s i g n i f i c a n t l y 畔o o1 ) a f t e rl e u c i n ed e p r i v a t i o nf o r2 hc o m p a r e dt ol e u c i n ed e p r i v a t i o n f o ro h a m o u n to fl c 3 一i ia n dp 6 2b o t hh a dn os i g n i f i c a n t 0 0 5 ) c h a n g ea n da m o u n t o fp s 6 k1d e c r e a s e dv e r ys i g n i f i c a n t l y ( p o 01 ) a f t e rl e u c i n er e s u p p l e m e n t a t i o nw i t h l e u c i n ed e p r i v a t i o nf o r2 hc o m p a r e dt ol e u c i n ed e p r i v a t i o nf o r0 h a m o u n to fl c 3 一i i i i i 华中农业大学2 0 1 0 届硕十学位论文 d e c r e a s e d v e r ys i g n i f i c a n t l y ( 尸 0 0 1 ) a n dp 6 2a n dp s 6 k 1b o t h i n c r e a s e d v e r y s i g n i f i c a n t l y ( 尸 0 01 ) a f t e rl e u c i n er e s u p p l e m e n t a t i o nw i t hl e u c i n ed e p r i v a t i o nf o r2 h c o m p a r e dt ol e u c i n ed e p r i v a t i o nf o r2 h a m o u n to fl c 3 一i ii n c r e a s e dv e r ys i g n i f i c a n t l y ( 尸 0 0 1 ) a n da m o u n to fp 6 2a n dp s 6 k 1b o t hd e c r e a s e dv e r ys i g n i f i c a n t l y ( 尸 0 0 5 ) c h a n g ea f t e rl e u c i n er e s u p p l e m e n t a t i o nw i t hl e u c i n e d e p r i v a t i o nf o r2 ha n dr a p a m y c i nc o m p a r e dt ol e u c i n ed e p r i v a t i o nf o r2 h w eg e tt h e s a m er e s u l t si fc h a n g e dt h et i m eo fl e u c i n ed e p r i v a t i o nf o r2 ht o4 h ( 3 ) a m o u n to fl c 3 一 i ii n c r e a s e dv e r ys i g n i f i c a n t l y ( 尸 0 0 1 ) a n da m o u n to fp 6 2a n dp s 6 k 1b o t hd e c r e a s e d v e r ys i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 1 ) a f t e rl e u c i n ed e p r i v a t i o no rr e s u p p l e m e n t a t i o n ，w i t h r n a i n t e r f e r e n c eo fr h e bo rr a p t o r , c o m p a r e dt ol e u c i n ed e p r i v a t i o nf o ro h a m o u n to fl c 3 - i ii n c r e a s e dv e r ys i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 1 ) a n da m o u n to fp 6 2a n dp s 6 k 1b o t hd e c r e a s e d v e r ys i g n i f i c a n t l y ( 尸o 01 ) a f t e rl e u c i n ed e p r i v a t i o nf o r2 hw i t hr n a i n t e r f e r e n c eo fg 1 3 l ， c o m p a r e dt ol e u c i n ed e p r i v a t i o nf o ro h c o m p a r e dt ol e u c i n ed e p r i v a t i o nf o ro h ，a m o u n t o fl c 3 一i ii n c r e a s e dv e r ys i g n i f i c a n t l y ( p o 0 1 ) a n da m o u n to fp 6 2a n dp s 6 k 1b o t h d e c r e a s e dv e r ys i g n i f i c a n t l y 衅0 01 ) a f t e rl e u c i n er e s u p p l e m e n t a t i o nw i t hl e u c i n e d e p r i v a t i o nf o r2 h ，a f t e rr n a i n t e r f e r e n c eo fg dl b u tc o m p a r e dt ol e u c i n ed e p r i v a t i o n f o r2 h ，a m o u n to fl c 3 一i id e c r e a s e dv e r ys i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 1 ) a n da m o u n to fp 6 2a n d p s 6 k 1b o t hi n c r e a s e dv e r ys i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 1 ) a f t e rl e u c i n er e s u p p l e m e n t a t i o n 州m l e u c i n ed e p r i v a t i o nf o r2 h ，a f t e rr n ai n t e r f e r e n c eo fg p l w eg e tt h es a m er e s u l t si f c h a n g e dt h et i m eo f l e u c i n ed e p r i v a t i o nf o r2 ht o4 h t o g e t h e r , o u rr e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tl e u c i n ed e p r i v a t i o ni n d u c e sa u t o p h a g ya n dt h i s e f f e c t w i l lb ei n t e n s i f i e dw i t ht h ed e p r i v a t i o np r o l o n g i n gw i t h i nac e r t a i nt i m e l e u c i n e r e s u p p l e m e n t a t i o n b l o c k sa u t o p h a g y , a n dt h i sb l o c ki sm t o rs i g n a l i n g p a t h w a y d e p e n d e n t r h e ba n dr a p t o ra r eb o t hn e c e s s a r yf o rl e u c i n et or e g u l a t ea u t o p h a g yt h a t t h e ya r et w os e r i e s w o u n db r i d g e sf o rl e u c i n et og e tt oa u t o p h a g y g i b li sn o tn e c e s s a r y f o rl e u c i n et ob l o c ka u t o p h a g y k e yw o r d s ：a u t o p h a g y ；l e u c i n e ；m t o r ；r h e b ；r a p t o r ；h e k2 3 9 tc e l l s i v 亮氨酸调节自噬的机理研究 缩略语表( a b b r e v i a t i o n ) 英文缩写英文术语中文术语 a b b r e n g l i s ht e r m c h i n e s et e r m 4 e - b p l e u k a r y o t i ci n i t i a t i o nf a c t o r4 eb i n d i n g 真核细胞启动子4 e 结合蛋白1 p r o t e i n1 a c d a m 【p k a t g a t p b c a a b p ，k b b s a c m a c a m k k p d d h 2 0 d m e m d m s o d n a d s r n a d t t e d t a e i f _ 4 e e i f - 4 g e p f c m g a m g a p g p l g d p g f p g t p h e k2 9 3 t h m b h l 强 i l e k d l b l c 3 l e u l s c m m m m a u t o p h a g i cc e l ld e a t h a m p - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e a u t o p h a g y a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e b r a n c h e d - c h a i na m i n oa c i d b a s ep a i r , k i l o b a s ep a i r b o v i n es e r u ma l b u m i n c h a p e r o n e - m e d i a t e da u t o p h a g y c a l m o d u l i n - d e p e n d e n tk i n a s ek i n a s e - p d o u b l ed i s t i l l e dh 2 0 d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i u m d i m e t h y ls u l f o x i d e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d o u b l e s t r a n d e dr n a d i t h i o t h r e i t o l e m y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d e u k a r y o t i ct r a n s l a t i o ni n i t i a t i o nf a c t o r4 e e u k a r y o t i ci n i t i a t i o nf a c t o r4 g e p p e n d o r fp i p e f l o wc y t o m e t r y g a i n t e r a c t i n gpr o t e i n g t p 勰e - a c t i v a t i n gp r o t e i n g p r o t e i n1 3 - s u b u n i tl i k ep r o t e i n g u a n o s i n ed i p h o s p h a t e g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n g u a n o s i n et r i p h o s p h a t e h u m a ne m b r y o n i ck i d n e y2 9 3 t p - h y d r o x y - p m e t h y l b u t y r a t e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e i s o l e u c i n e k i l o d a l t o n l u r i a b e r t a n im e d i u m m i c r o t u b u l e - a s s o c i a t e d p r o t e i n l l i g h t c h a i n3 l e u c i n e l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e m 0 1 i n m o l 自噬样细胞死亡 a m p 激活蛋白激酶 自噬相关基因 三磷酸腺苷 支链氨基酸 碱基对，干碱基对 牛血清蛋白 分子伴侣介导的自噬 钙依赖激酶激酶p 双蒸水 一种细胞培养基 二甲基亚砜 脱氧核糖核酸 双链r n a 二硫苏糖醇 乙二胺四乙酸 真核翻译起始因子4 e 真核翻译起始因子4 g 1 5 m l 尖底离心管 流式细胞术 g e t 干扰蛋白 g t p 酶激酶蛋白 g 蛋白b 亚基样蛋白 二磷酸鸟苷 绿色荧光蛋白 三磷酸鸟苷 人胚肾细胞2 9 3 t p 羟基p 甲基丁酸 辣根过氧化物酶 异亮氨酸 千道尔顿 l b 培养基 微管结合蛋白1 轻链3 亮氨酸 激光共聚焦扫描显微镜 摩，毫摩 v 华中农业大学2 0 1 0 届硕上学位论文 m a p km i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s分裂素活化蛋白激酶 m l s t 8m a m m a l i a no r t h o l o go fl s t 8 l s t 8 哺乳动物同系物 m t o r m a m m a l i a nt a r g e to f r a p a m y c i n 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 o d o p t i c a ld e n s i t y光密度 p b s p h o s p h a t eb u f f e r ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p m s f r m i n r a p a r a p t o r r e r h c b r n 凡 r o s i u 二p c r p h e n y l m e t h y ls u l f o n y l f l u o r i d e r o t a t i o np e rm i n u t e r a p a m y c i n r e g u l a t o r ya s s o c i a t e dp r o t e i no fm t o r r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e r a sh o m o l o ge n r i c h e di nb r a i n r n ai n t e r f e r e n c e r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r e v e r a s e t r a n s c r i p tp o l y r n e r a s e c h a i n r e a c t i o n s 6r i b o s o m a lp r o t e i ns 6 s 6 k 1 s d s p a g e s e e ，m i n ，h s e m s h r n a s i r n a s t e m t e m t e m e d t s c u i x g ，m g ，g l x l ，m l ，l v a l 7 0 - k d ar i b o s o m a lp r o t e i ns 6k i n a s e s o d i u md o d e c y l s u l p h a t e p o l y a c r y l a m i d e g e le l e c t r o p h o r e s i s s e c o n d , m i n u t e ，h o u r s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e s h o r th a i r p i nr n a s m a l li n t e r f e r e n c ei 斟a s c a n n i n g t r a n s m i s s i o n m i c r o s c o p e t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e t e t r a m e t h y le t h y l e n e d a m i n e t u b e r o u ss c l e r o s i sc o m p l e x u n i t m i c r o g r a m ，m i l l i g r a m ，g r a m m i c r o l i t e r , m i l l i l i t e r , l i t e r ，台j i n e 苯甲基磺酰氟化物 每分钟转速 雷帕霉素 r o t o r 调节性结合蛋白 限制性内切酶 r a s 大脑丰富同系物 r n a 干扰技术 活性氧 反转录聚合酶链反应 核糖体蛋白s 6 核糖体蛋白s 6 激酶1 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电泳 秒钟，分钟，小时 扫描式电子显微镜 短发夹r n a 小干扰r n a 扫描透式显微镜 透射电镜 四甲基乙二胺 结肖性硬化复合物 单位 微克，毫克，克 微升，毫升，升 缬氨酸 v i 亮氨酸调节自噬的机理研究 1 1 自噬研究进展 1 1 1 自噬的概念 第一章文献综述 真核细胞内蛋白质降解途径主要包括溶酶体途径和泛素蛋白水解酶复合体途 径等。自噬是蛋白质水解的主要方式之一，是一种溶酶体依赖的降解途径( k l i o n s k y e ta 1 ，2 0 0 0 ；l e v i n ee ta 1 ，