（动物营养与饲料科学专业论文）HPLC法同步测定饲料中脂溶性维生素.pdf

摘要 通过实验研究，本论文建立了用高效液相色谱法同步测定饲料中4 种脂溶性维生素5 种形态 化合物的方法。本方法以饲科为基质，以维生素毯、维生素a 乙酸酯、维生素d 3 、维生素e 、 维生素e 乙酸酯为目标对象进行分析。与传统皂化法不同的是。本实验使用了一种商品名为 s a v i n a s e 的酶破坏维生素表面的包被物质而使维生素游离出来，然后用无水乙醇提取这些游离的 维生素在酶解的过程中，使用了o 2 的氨水溶液为维生素硒从其常用的商品剂型呈水溶性的 亚硫酸氢钠甲萘醌中游离出来，解决了饲料中的维生素硒与其他脂溶性维生素同步提取的问题。 经酶解处理过的样品液在固相萃取小柱净化后，上机维生素经配有保护柱的a t l a n t i sd c l 8 色谱 柱分离，以甲醇和水( 9 8 ：2 ，v v ) 为流动相洗脱，并以1 on f l m i n 的流速经紫外可见光检测器 在2 3 0n m 和2 6 5n m 处检测，1 6 分钟内完成分离过程，方法的检测限为2 0 - 4 2 0m g , ，i ( g ，回收率 为8 7 1 3 0 0 , 4 ，变异系数小于1 0 。本方法最大的优点是快速、操作简便，使用了弱毒性的乙醇作 萃取剂并适用于维生素添加剂、多维、预混科等饲料中脂溶性维生素的检测。 关键词：同步测定。脂溶性维生素，饲料，固相萃取，高效液相色谱 a b s t r a c t ah i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p ym e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e df o rt h es i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o no fm e n a d i o n e ，r e t i n y la c e t a t e ，c h o l e c a l c i f e r o l ，a - t o c o p h e r o l ，a n da - t o c o p h e r o la c e t a t ei n a n i m a lf e e d r a t h e rt h a nt h et r a d i t i o n a ls a p o n i f i c a t i o nm e t h o d , t h ep r e s e n ts t u d yu s e dac o m m e r c i a l e n z y m e ，s a v i n a s e ，t od e s t r o yt h ec o a t i n gf i l me o v e d n gv i t a m i np a r t i c l e sa n de x t r a c t e df l e ev i t a m i n s w i t he t h a n 0 1 i nt h ep r o c e s so fe n z y m o l y s i s o 2 a m m o n i as o l u t i o nw a su s e dw h i c hp r o v i d e da l l a l k a l e s c e n c ec o n d i t i o nf o rm e n a d i o n ef r e e i n gf r o mm e n a d i o n es o d i u mb i s u l f i t ew h i c hu s u a l l yw a sa g e n e r a lc o m m e r c i a ls t y l ea d d e di na n i m a lf e e d t h i ss o l v e dt h ep r o b l e mt h a tm e n a d i o n eo f c o m m e r c i a l s t y l ew a sw a t e r - s o l u b l ev i t a m i na n dm a d es i m u l t a n e o u se x t r a c t i o no f v i t a r a i n w i t hv i t a m i n sa a c ，d 3 。 e a n de - a ca c h i e v e d t h ef o l l o w i n gp u r i f i c a t i o np r o c e s sw a st h e r ea i k rt r a n s f e r r e dt oa l lo a s i sh l b c a r t r i d g e ，b yw h i c h t h ef i v ev i t a m i n sw e r es e p a r a t e db yu s i n gaw a t e r sa t l a n t i st m d c l 8c o l u m nw i t ha m a t c h i n gg u a r dc a r t r i d g e t h em o b i l ep h a s ew a st h es o l u t i o no fm e t h a n o l - w a t e r ( 9 8 ：2 ，v v ) d e t e c t i o n w a sp e r f o r m e dw i t hau v - v i sd e t e c t o ra t2 3 0a ma n d2 6 5n ma n dt h er e t e n t i o nt i m ew a sl e s st h a n1 6 m i n t h el i m i to fq u a n t i t a t i o nv a l u e sr a n g e df r o m2 5m g k gt o4 2m g k ga n dr e c o v e r i e sf r o m 8 7 * * - 1 3 0 c o e f f i c i e n t so f v a r i a t i o nw e r el e s st h a n1 0 t h em e t h o dw a ss a t i s f i e dw i t ht h el i n e a r i t y , a c c u r a c y , a n dr e p e a t a b i l i t y t h em o s to u t s t a n d i n ga d v a n t a g eo f t h em e t h o di sr a p i d , e a s yt oh a n d l e ，a n d m o r e o v e rt h el o wt o x i ce t h a n o lw a su s e da st h ee x t r a c t a r l lt h ea p p l i c a t i o no f t h em e t h o di ss u i t a b l ef o r d e t e r m i n a t i o no ft h ef a t - s o l u b l ev i t a m i n si nv i t a m i na d d i t i v e s ，m u l t i - v i t a m i n ss u p p l e m e n t , p r e m i xf e e d ， a n ds o m ef o r m u l af e e d k e yw o r d s ：s i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o n , f a t - s o l u b l ev i t a m i n , f e 咄s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n , h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 缩写 a - a c b h t c v i 功 e e - a c e c d f d h p l c k ， 心b m s b m s b c r d i 乙s d s p e u v 缩写词表( a b b r e v i a t i o n s ) 英文名称 r e t i n y la c e t a t e b u t y l a t e dh y d r o x y t o l u e n e c o e 葡c i e n tv a r i a t i o n c h o l e c a l c i f e i a - t o c o p h e r o l c t - t o c o p h e m la c e t a t e e l e c t r o e h e m i c a ld e t e c t o r f l u o r e s c e n c ed e t e c t o r h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a m m e n a d i o n e m e n a d i o n e p y r i r n i d i n o lb i s u l f i t e m e n a d i o n es o d i u mb i s u l f i t e m e n a d i o n es o d i u mb i s u l f l t ec o m p l e x p h o t o d i o d ea r r a yd e t e c t o r r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n u l t r a v i o l e t - v i s i o nd e t e c t o r 中文名称 维生素a 乙酸酯 二丁基羟基甲苯 变异变异系数 维生素功 维生素e 维生素e 乙酸酯 电化学检测器 荧光检测器 高效液相色谱 维生素k 3 亚硫酸钠嘧啶甲萘醌 亚硫酸氢钠甲萘醌 亚硫酸氢钠甲萘醌复合物 光电二极管阵列检测器 相对标准偏差 固相萃取 紫外可见光检测器 v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：薛毳译 时间： 珈6年，2 月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签氢茸丧珲 一名：匆布定 时间： 沙彩年，2 月名目 时间：如彩年f l 月髟日 中国农业大学硕士学位论文绪论 1 研究目的和意义 第一章绪论 维生素是维持动物正常生理功能，生命活动所必需的一类低分子有机化合物虽然动物对维 生素的需要量很少，但是如果缺乏或过量，都会引起不良症状( l e l u - 等，1 9 9 9 ；w l l d e n s t e d t ，2 0 0 6 ) 大多数动物除了能合成维生素c 和烟酸外，还有些反刍动物和单胃动物能在肠道合成b 族维生素 和维生素k ，但对它们的利用有限，机体所需的维生素必须从饲料中获得( 李德发，2 0 0 1 ) 。近 年来，添加维生素添加剂的饲料越来越受欢迎，然而，维生素在加工贮存过程中容易受破坏，因 此。寻找判定原料或产品中维生素的实际含量的方法迫在眉捷。 近几十年，维生素工业得到迅猛的发展世界饲用维生素的垂每年约9 万吨，主要品种有维 生素a 、维生素e 、维生素k 3 ，维生素b i ，维生素b 2 、维生素b 6 ，维生素b 1 2 维生素c ，维 生素d ，叶酸、烟酸( 烟酰胺) 、d - 泛酸钙、氯化胆碱和生物素。其中以氯化胆碱用量最大。占 7 4 ：其次是烟酸和烟酰胺，占1 8 。上述各种维生素我国现在均能生产，其中以维生素c 的年 生产能力为1 7 万吨，出口约1 4 6 万吨( 吴石金等，2 0 0 4 ) ，其他维生素生产能力不大，如维生 素b 1 2 出口量1 9 9 6 年为1 0 0 0 公斤，到2 0 0 1 年达到4 9 0 0 公斤( 戴伟国，2 0 0 4 ) 。目前，全球范围 内使用最多的是维生素a ，维生素c 和维生素e 。每年市场销售额各为5 亿美元、5 亿美元，1 0 亿美元，维生素作为动物饲料添加剂的市场正以每年2 - 3 的速度增长( 2 0 0 4 ) 因此，需要各种 分析手段来保障并监督维生素添加剂的产品质量。 最早对维生素效力或含量测定是通过生物学、微生物学、化学、物理学的方法测定。生物及 微生物的测定费时繁琐，费用高目前利用化学，物理学的方法测定维生素的研究报道较多， 如毛细管电泳法( s i i 等，1 9 9 5 ：d e l g a d o - z a m a r r e f i o 等，2 0 0 2 ) ，比色法( a m i n ，2 0 0 1 ) ，分光光 度法( t m e m 等。1 9 9 7 ) 、荧光光度法( p a e z - r u i z 等，1 9 9 9 ) 、色谱法( g o m i s 等，2 0 0 0 ；h e u d i 等，2 0 0 4 ) 等有研究认为上述方法分析时闻过长，干扰因素多。适合单一维生素分析( 尚德荣 等，2 0 0 1 ) 近年来，高效液相色谱法已广泛应用于食品和动物饲料的测定( s a l o - v a 苴n 苴n 等， 2 0 0 0 ：m a t a - c - r a n a d o s 等，2 0 0 4 ) ，该方法简单、快捷、准确。目前，对单个维生素测定方法的前 处理，样品提取及色谱条件的研究报道较多( t h o m p s o n ，1 9 8 6 ：h u o 等，1 9 9 6 ：1 w a s o ，2 0 0 0 ： w a n g a 等，2 0 0 4 ) 。也有同时测定饲科中维生素a 、d 、e 、k 检测方法的报道( r a s i n g 等，1 9 9 1 ； w h i t e ，1 9 9 3 ；a r b a t s k i i 等，2 0 0 4 ) ，却很少关于同步检测饲料中脂溶性维生素k 3 ( m e n a d i o n e ， 岛) 、维生素a 乙酸酯( r e t i n y l a c e t a e ，a - a t ) 、维生素d 3 ( c h o l e c a l c i f e r o l ，功) ，维生素e ( a - l o c o p h e r o l ， e ) 、维生素e 乙酸酯( a - l o c o p h e m la g e l a t e ，b ) 的报道 本研究拟通过饲料中脂溶性维生素同步检测技术的研究，建立用酶解替代皂化的高效快速同 步测定饲料中脂溶性维生素b ，a - a c 、d 3 、e 、e - a c 的方法，对该类维生素的定性、定量和确证 的同步分析方法，实现操作步骤简单，减少提取过程中维生素的损失并通过使用毒性更弱的溶剂 傲提取剂，以减少对操作人员身心健康的损伤及减小环境污染 2 国内外研究现状 中国农业大学硕士学位论文绪论 2 1 高效液相色谱法的概述 高效液相色谱法( h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i dr a p h y ，h p l c ) 是一种采用颗粒十分细的固定相， 并采用高压泵输送流动相，由仪器完成对待测分析物的分离分析的液相色谱法。它是利用物质在 两相中吸附或分配系数的微小差异达到分离的目的，当两相作相对移动时，被测物质在两相之间 进行反复多次的分配，这样使原来微小的分配差异产生了很大的效果，达到分离、分析及测定一 些物理化学常数的目的。色谱作为分析方法，其最大的特点在于能将复杂的混合物分离为各个有 关的组成后，逐个地加以检测( 汪茂田等，2 0 0 4 ) 。 该技术是在2 0 世纪6 0 年代中期吸收了普通液相色谱和气相色谱的优点，经过适当改进发展 起来的。到7 0 年代中期，随着微机技术的应用，仪器的自动化水平和分析精度得到了进一步提 高。现在，h p l c 几乎能够分析所有的有机物、高分子及生物试样，在目前已知的有机化合物中， 若事先不进行化学改性，只有2 0 的化合物用气相色谱可以得到较好的分离，而8 0 的有机化合 物则需h p l c 分析。例如h p l c 技术已在生物化学分析、天然药物分析、合成药物分析、中药指 纹图谱分析和环境保护等方面都有广泛的应用( 师治贤等，2 0 0 3 ) 。在食品卫生领域的也有应用， 如：用于食品营养成分( 氦基酸、碳水化合物、维生素、脂肪酸) 的分析，添加剂的分析、食品 中有害成分的分析和食品中无机成分的分析( 黄淑芸和贾友苏，1 9 9 6 ；邢亚东。2 0 0 5 ) 。h p l c 已经成为一项在化学科学中最有优势的仪器分析方法之一。目前，在饲料中的应用，如：用于饲 料中氨基酸的测定，饲料中维生素的测定，饲料中有毒、有害物质的测定( 许世勇和赵健亚，2 0 0 4 ) 2 2 脂溶性维生素研究进展 2 2 1 腊溶性维生素的性质及其商品形式 维生素a 又名视黄醇或抗干眼醇，是高度不饱和脂肪醇。维生素a 在自然界中主要以脂肪 酸的形式存在，常见的是维生素a 乙酸酯和维生素a 棕榈酸酯，二酯均不溶于水，溶于乙醇， 易溶于乙醚、氯仿、丙酮和油脂中。耐热，但易受紫外线及氧化剂破坏。维生素a 的商品形式： 维生素a 醇、维生素a 棕榈酸酯和维生素a 乙酸酯。前者稳定性差，饲料工业较少采用，作为 饲料添加剂的商用产品多为后两者。剂型有油剂、水乳剂和稳定的粉剂。商业上的饲用维生素a 乙酸酯，多是用了抗氧剂并经明胶、淀粉包被处理的产品。常见的维生素a 粉剂规格为5 0 万i u g 。 每一国际单位维生素a 相当于：0 3 鸺维生素a 醇、0 5 4t a g 维生素a 棕榈酸酯、0 3 4 4 鹏维生 素a 乙酸酯。 维生素d 又名钙化醇，是指一组维生素d 活性的甾醇化合物。呈白色到浅黄色结晶粉未， 无臭味，微溶于油脂，但不溶于水，易溶于乙醇、三氯甲烷、丙酮、乙醚。对酸、碱，热稳定。 维生素d 的商品形式：以维生素岛为原料，配有二丁基羟基甲苯( b u t y l a t e d h y d r o x y t o l u e n e 。b h t ) 或乙氧喹啉作稳定剂，用明胶和淀粉作辅料经喷雾制成的微粒。规格有5 0 万i u 幢、4 0 万i u g 、 3 0 万i u 詹，每一国际单位维生素d 3 相当于：0 0 2 5g g 胆钙化醇。 维生素e 又名生育酚，是一组有生物活性的化学结构相近的酚类化合物的总称。目前已知有 8 种。其中四种( c t ，b ，- ，6 ) 较为主要，但以* 生育酚分布最广，效价最高，最代表性。生 2 中国农业大学硕士学位论文绪论 育酚外观为淡黄色粘稠油状液，不溶于水，易溶于乙醇、丙酮，四氯甲烷，乙醚等有机溶剂和植 物油中对酸、热稳定，对碱较不稳定，易被氧化。维生素e 乙酸酯，也呈淡黄色油状物其溶 解性与a 生育酚相同对大气中的氧较稳定，在强碱或强酸存在下，遇湿则水解为游离的小生育 酚维生素e 商品形式：n * 生育酚、d l t 生育酚、d 吨生育酚乙酸酯和d l - c t 生育酚乙酸酯， 其中以维生素e 乙酸酯较稳定，主要有粉荆和油剂。每一个国际单位维生素e 相当于：l m g d l - c t 生育酚乙酸乙酯。 羹主垂e a 4 0 e o p h e r o l 羹生蠢e 乙酸蠹 a - t o e o p t 0 ia e e t a t e 圈i - 1 五种维生素的化学结构 f 堙u r e ! - 1t h ec h e m i c a ls l t u g t u r e so f f r e ev i t a m i n s 维生素k 又叫凝血维生素，维生素k 是一类甲萘醌衍生物的总称按照其来源及溶解性的 不同可分做两大类：一类是脂溶性化合物，是从天然产物中分离提纯出来的，包括维生素k l 和 k 2 ；另一类为水溶性化合物，是人工合成的，主要是亚硫酸氢钠和甲萘醌的加成物、维生素k 3 和乙酰甲萘醌的加成物、维生素瞄。饲料工业中常用的维生素k 3 添加剂为亚硫酸氢钠和甲萘醌 的加成物即亚硫酸氢钠甲萘醌( m e n a d i o n es o d i u mb i s u l f i t e ，m s b ) ，其外观为白色结晶，无臭味， 易溶于水，难溶于乙醇，几乎不溶于乙醚和苯。耐热，但易被光、碱破坏维生素珞商品形式： 未加稳定剂的m s b ( 稳定性较差) 、明胶包被的m s b ( 稳定性较好) ，亚硫酸氢钠甲萘醌复合物 ( m e n a d i o n es o d i u mb i s u l f i t ec o m p l e x ，m s b c ) ( 稳定性较好) 和亚硫酸钠嘧啶甲萘醌( m e n a d i o n e p y r i m i d i n o lb i s u l f i t e ，m p b ) ( 稳定性最好，但有一定的毒性) 2 2 2 脂溶性维生素检潞技术研究现状 2 2 2 1 维生素a 的研究现状 中国农业大学硕士学位论文绪论 姜迅知( 1 9 9 5 ) 采用超声波技术破坏微囊结构，用正已烷提取饲料多维预混剂中维生素a 的 含量，该方法要可作为一个可靠的快速常规分析方法。国标方法中测定饲料中维生素a 是采用高 效液相色谱法( g b ：r 1 7 8 1 7 - 1 9 9 9 ) ( 简称提取法) 分析的，它是用皂化结合乙醚萃取的方法处理 样品的，该方法步骤多，较繁琐，每次要将对照品和饲料试样一起提取，并且对照品极易被氧化， 不易保存。蒋一昕( 2 0 0 3 ) 采用酶解的方法测定饲料中维生素a 含量，结果表明，维生素a 标示 量在0 5 2 6 0 万i u 范围内呈良好的线性关系，该方法较为简便可以批量操作。且有商品化的对 照品出售。 2 2 2 2 维生索现的研究现状 李兰生( 1 9 9 9 a ) 采用皂化的方法测定了预混荆中维生素d 3 的含量，该方法操作繁锁，稳定 性较差。李青( 2 0 0 2 ) 用内标法和外标法两种方法测定维生素d 3 ，结果表明，内标法所用试剂纯 度要求严格，因为内标必须加到每个样品中，所以色谱体系易受干扰，操作过程复杂。外标法容 易使色谱体系快速达到平衡可使操作步骤简化。内标法比外标法测定结果更准确，但外标法比 内标法操作更简便、快速，容易使用。赵榕等( 2 0 0 5 ) 用内标法结合特殊的破壁液解决了“破包 被”问题，获得较高的回收率8 5 1 0 2 ，操作简便。刘绿洲( 2 0 0 5 ) 采用叔丁基甲醚对维生素d 2 直接萃取，使得试验非常简便，3 0m i n 内就能完成一个样品液的制备。 2 2 2 3 维生素e 的研究现状 一般采用硫酸铈法测定维生素e 的含量，该法处理后的溶液除有未反应完的原料外。还有未 处理的硫酸、醋酐、氯化锌等有物质残留。给测定带来干扰( 林承仪，2 0 0 1 ；张乃明和陈艺菁， 2 0 0 2 ) 。李艳飞等( 2 0 0 1 ) 采用荧光光谱法测定饲料中维生素的含量，经皂化和乙醚抽提后。 经荧光光谱仪检测得到维生素e 的含量，该法的回收率高，但操作较繁锁目前，主要采用高效 液相色谱法，直接测定维生素e 含量，分离效果好，方法重现性及回收率高( 张宁2 0 0 2 ) 2 2 2 4 维生素磁的研究现状 李兰生( 1 9 9 9 b ) 用反相分配色谱法测定饲料预混剂中维生素k 3 ，通过皂化和乙醚萃取的方 法，回收率高，但操作繁琐。目前，主要采用有机溶剂与钠的盐溶液按一定的比例萃取维生素 k 3 ，该方法操作简便，所用试剂少，蜂形好( 罗李东和施文娟，2 0 0 0 ：施杏芬等，2 0 0 4 ；刘志祥， 2 0 0 5 ) 。 2 2 2 5 脂溶性维生素同步测定的研究现状 皂化法的发展：皂化法是指在强碱条件下，脂肪会生成易溶于永的物质，而对碱稳定的分析 物被乙醚、石醚等有机溶剂提取出来的方法。通过使用皂化法，马莺和王睛( 1 9 8 9 ) 分析了饲料 中的维生素a ，d 、e ；h e w a v i t h a r a n a 等( 1 9 9 5 ) 分析了奶牛日粮中维生素a ，e 、b 胡萝h 素； a l b a l j - h u r t a d o ( 1 9 9 7 ) 等分析了婴儿奶粉中维生素a 和e ：黄爱珍等( 1 9 9 9 ) 分析了预混料中 维生素a ，e 、d 3 ；海沙尔和塔依尔( 2 0 0 2 ) 分析了混合药片中维生素a 、d 、e 。从这些研究中， 4 中国农业大学硕士学位论文 绪论 发现皂化结合有机溶剂萃取的方法是很普遍的方法，但是操作繁琐，稳定性不好。 直接萃取法的发展；直接萃取法是指选用适当的有机溶荆，并结合超声波水浴的溶解作用， 直接对样品中的脂溶性维生素进行萃取的方法通过使用直接萃取法，李迪和张学科( 1 9 9 2 ) 分 析了饲料添加剂中维生素a 、d ，e ：付丽华等( 1 9 9 5 ) 分析了复合多维添加剂中维生素a 、d 3 、 e ；李雷和陈文利( 2 0 0 3 ) 分析了以玉米粉为辅料混合而成的多种维生素样品中的维生素a a c 、 d 3 、e - a c ；王安群等( 2 0 0 5 ) 分析了饲料中维生素a 、功、e 从这些研究中，发现来用一定浓 度的有机溶液直接提取样品中的维生素的方法，操作简单，但萃取不完全是个普遍存在的问题。 酶解法的发展：酶解法是指利用合适的酶，破坏维生素外的包被物质，使维生素游离出来， 然后用有机溶剂萃取的方法。通过使用酶解法，曹冶( 1 9 9 7 ) 分析了复合维生素中a 、a 棕榈 酸酯、d 3 、e - a c ；t u r n e r 等( 2 0 0 1 ) 分析了奶粉和婴儿食品中维生素a ，d 2 、e - a c 。该方法操作 简便、快速、准确度好，但样品基质的不同，使用的酶就有所不同。 综上所述，很少文献报道关于饲料中4 种脂溶性维生素5 种形态化合物k 3 、a a c 、d 3 、e 、 e - a c 的同步测定。 2 3 萃取与净化技术在维生素分析中的应用 采用液相色谱法测定含脂溶性维生素样品中各种成分的含量的过程中，样品预处理是样品分 析中至关重要的一环，它的好坏，是保证测定结果是否准确的一个重要指标。萃取与净化技术主 要用于样品制各过程中，对样品进行预富集并除去分析物的干扰物质，使得到的样品上机液与所 用的h p l c 方法相兼容。 常用的萃取与净化技术主要有：液液萃取、固相萃取技术、固相微萃取技术、压力液体萃取 和亚i 艋界水萃取、吹扫捕集技术、微波消解和微波辅助萃取技术、超f 临界流体萃取技术、免疫亲 和固相萃取技术等( 江桂斌等，2 0 0 4 ) 。用于维生素分析的净化技术主要有液液萃取( w h i t e ，1 9 9 3 ) 、 固相萃取技术( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) ( l u q u e - o a r c i a 等，2 0 0 1 ) 、超i l 缶界流体萃取技术( s c a l i a 等，1 9 9 4 ：p e r r e t t i 等，2 0 0 4 ) 、免疫亲和固相萃取技术( h e u d i 等，2 0 0 6 ) 经典的液液萃取方法是用氯仿、正己烷、庚烷、石油醚、乙醚等做萃取液提取维生素( y a k u s h i n a 和t a r a n o v a ，1 9 9 5 ；w i e l i f i s k i 和o l s z a n o w s k i ，2 0 0 1 ) 。通过改变p h 、离子对作用、络合作用等 方法使萃取平衡向有利于回收样品的方向移动，提高待测物的回收率。这种方法广泛应用于组分 的分离、提取或净化但此法也存在着许多不足之处：在萃取过程中，乳化现象的形成造成待测 物的损失；共萃取物的干扰、限制了检测方法的选择；整个萃取过程烦琐。消耗大量时间，并造 成结果不稳定( 陈风春和马金才2 0 0 3 ) 。 目前，样品处理方式已经由经典的液液萃取向固相萃取发展与液相萃取相比固相萃取有很 多优点：s p e 处理过程中不会产生乳化现象；高效、高选择性吸附剂( 固定相) 的采用，显著减 少了溶剂的用量，简化样品的处理过程g 同时所需费用也有所减少它是目前样品处理将分离与 浓缩合为一步的最简捷，高效、灵活的技术s p e 技术在维生素检测方法的应用，如：q i a n 和 s h e n g ( 1 9 9 8 ) 用s e p - p a k s p e 小柱净化饲料中的脂溶性维生素；c h a t z i m i c h a l a k i s 等( 2 0 0 4 a ) 用 中国农业大学硕士学位论文 绪论 c y c ! o h e x y lj tb a k e rs p e 小柱净化血清和尿液中的脂溶性维生素；c h a t z i m i c h a l a k i s 等( 2 0 0 4 b ) 用s u p e l c l e a nl c 1 8s p e 小柱净化药片中6 种水溶性维生素。固相萃取法一般包括活化、样品上 柱、淋洗和洗脱四个步骤。活化的目的是使小柱环境与样品溶剂相容，并除去在柱内的杂质；上 样是指样品加入到s p e 柱内并使样品溶剂通过固定相的过程，此时待分析物和少量样品干扰物会 保留在固定相上；淋洗是指用合适的溶液洗掉不需要的样品组分而不会把待分析物洗掉；洗脱是 指用略强于或等于上样溶剂的溶剂，将分析物从相上洗脱出来，但注意采用豹溶剂强度要适当， 如太强，可能使一些更强保留的不需要的物质洗脱出来，太弱则需较多的洗脱液来洗出待分析物， 使固相萃取的浓缩功效削弱( 张玉奎等，2 0 0 0 ) 。 超临界流体萃取是利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而达到萃取分离的目的，它 的优点是超i 艋界流体园其较液体溶剂更低的黏度和更高的扩散系数而更易穿过多孔性基体，提高 了萃取速率，同时由超临界流体提取的分析物可以通过压力的调节进行分离，省去了萃取过程中 样品浓缩过程，节省了时间t 避免了挥发分析物的损失，它的缺点是由于整个提取装置较复杂且 在高压下操作有一定的危险性，加之成本较高，使其不易推广；而免疫亲和固相萃取是将抗体固 定在固相载体材料上，制成免疫亲和吸附剂，将样品溶液通过吸附剂，样品中的且标化合物因与 抗体发生亲和作用而被保留在固相吸附剂上，它的优点是由于免疫亲和作用具有很高的特异性， 所以免疫亲和柱可以很方便地从复杂样品基质中分离其他萃取方法难以萃取的目标化合物，它的 缺点是不能普遍应用于相对分子质量小于1 0 0 0 的化合物，这方面的技术在9 0 年代中期以后才有 所发展( 江桂斌等。2 0 0 4 ) 。 2 4 检测器在维生素分析中的应用 在维生素的检测中，常用的检测器有荧光检测器( f l u o r e s c e n c e d e t e c t o r ，f d ) ( h e w a v i t h a r a n a 等，1 9 9 5 ；h u o 等，1 9 9 6 ) 、紫外可见光检测器( u l t r a v i o l e t - v i s i o nd e t e c t o r ，u v ) ( s a l o - v a , n a n e n 等，2 0 0 0 ) ，光电二极管阵列检测器( p h o t o d i o d ea r r a yd e t e c t o r ，p a d ) ( c h a t z i m i c h a l a k i s 等，2 0 0 4 a ) 和电化学检测器( e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t o r ，e c d ) ( l e r a y 等，1 9 9 8 ；p e r a i e s 等。2 0 0 5 ) 。它们的 特点介绍如下( 陈风春和马金才，2 0 0 3 ；云自厚等，2 0 0 5 ) ： f d 是为自然荧光化合物和同荧光试剂反应形成稳定荧光物的化合物的检测提供了高灵敏度 和高选择性。它的灵敏度比紫外吸收检测器高1 0 0 倍，对痕量组分检测时，是一种高效的检测工 具。但其线性范固较窄，对不能直接产生荧光的物质，要使用柱后衍生技术，操作比较复杂。所 以，在测定维生素时，u v 比f d 测定更快速。 p a d 是用光电二极管阵列同时接受来自流通的全光谱透射光的检测器。它可以同时得到多个 波长的色谱图，对每个色谱峰的指定位置实时记录，可选择整个波长范围的宽谱带检测，因为它 的这些特点，它能为色谱峰准确定性，检验峰纯度并观测最佳吸收波长。但与u v 相比，它的灵 敏度要低一个数量级，从而提高了维生素分析的检测限。 e c d 是根据电化学原理和物质的电化学性质检测的。它的灵敏度很高，选择性高，线性范围 宽。应用范围广，尤其适合于痕量组分的分析但在使用e c d 时要注意流动相必须具有导电性， 并连续不断地除气。流速和温度需要十分稳定，因此操作起来比u v 复杂，影响工作效率。 6 中国农业大学硕士学位论文绪论 u v 是根据光的吸收定律即朗伯比耳定律进行工作的。它是应用最广泛的一种检测器，其灵 敏度较高，噪音低线性范围宽，对流速和温度的波动不灵敏，有莉于梯度洗脱。园其可选择的 波长范围很大，可选用组分的最大吸收波长进行测定，提高检测灵敏度，又可选用样品有强吸收 而干扰物质无吸收的波长处进行分析，从而提高分析的选择性因此，用l c - u v 测定维生素， 可以随意选择吸收波长的范围，提高了工作效率 3 研究内容和方法 3 1 研究内容 本论文拟通过以下方面探讨饲科中脂溶性维生素的检测技术：运用高效液相色谱和固相萃取 技术并结合酶解的方法，建立饲料中脂溶性维生素k 3 、a - a e 、d j 、e 、e a c 的同步检测及确证方 法。 3 2 技术路线 7 中国农业大学硕士学位论文绪论 8 图1 2 论文研究的技术路线 f i i u n l - 2 t d ：h n i q u er o u t e o f t k 。m 竹 中国农业大学硕士学位论文实验研究 第二章实验研究 h p l c 法同步测定饲料中脂溶性维生素的研究 摘要，建立了用 玎，l c 同步测定饲料中的维生素k ，、a - a c 、珥、e 、e - a c 的方法，并进行了方法 确证。饲料样品在0 2 的氨水中用碱性蛋白酶破坏维生素外的包被物质，用乙醇提取游离出的维 生素，用固相萃取小柱和有机滤膜净化后，经c 1 8 柱分离。以甲醇和水( 9 8 ：2 ，v v ) 为流动相洗 脱，并经u v 检测器在2 3 0 n m 和2 6 5n m 处检测。 关键词th p l c ，维生素，固相萃取，饲料 l 前言 脂溶性维生素a ，d 、e ，k 主要存在于脂溶性溶剂中，分子结构只含有碳、氢，氧三种元素， 在饲科中常与脂质共存，在消化道内也随脂肪一同吸收。当维生素吸收不足时。会引起相应的缺 乏症状；当吸收过量时，又会对机体产生毒害作用。因此，各种检测维生素的方法不断涌现， 目前，同时检测饲料中4 种脂溶性维生素5 种形态化合物k ，、a 、d 3 、e 、e a c 的方法还不见 报道。 饲料样品中维生素a 的添加形式，除了维生素a 乙酸酯最常用外。维生素a 棕榈酸酯的使 用也较普遍，根据资料报道，1m l 的乙醇对维生素a 乙酸酯的溶解力为4 6 5 0i u 但对维生素a 棕榈酸酯的溶解力却只为6 4 0i u 。因此，本实验并未对维生素a 棕榈酸酯进行研究。 本实验拟从色谱条件优化，样品前处理、方法性能等几个方面对腊溶性维生素k ，、a a c ， d 3 、e 、e a c 进行研究，建立一种快速，简单，准确的方法同步检测饲料中4 种脂溶性维生素5 种形态化合物，为饲料品质的监督管理提供科学的方法。 2 材料与方法 2 1 仪器设备 l c - 1 0 a 高效液相色谱仪( 日本，岛津( s h i m a d z u ) 包括：脱气泵( d g u 1 2 a ) ，输液泵 ( l c 1 0 a t ) 、系统控制器( c b m 1 0 a ) 、自动进样器( s i l - 1 0 a ) 、柱温箱( c t o - 1 0 a ) 、紫外 可见光检测器( s p d - 1 0 a ) 、数据站( c l a s sl c l 0 ) ；w a t e r s 高效液相色谱仪：a l l i a n c e2 6 9 0 。2 4 8 7 紫外检测器，m a s s l y n x 软件数据系统；反相色谱柱：a t l a n t i sd c l 8 色谱柱( 粒径5 m ，1 5 0 4 6 衄i d ，w a t e r s ，爱尔兰) ：保护柱2 0 4 6m m ，5p m ( 美国w a t e r s 公司) o a s i s oh l b 小桂 ( 1 ) ( 美国w a t e r s 公司) ；分析天平，感量o 1 m g m i l l i - q 超纯水仪( 美国m i l l i p o r e 公司) ： k q 3 2 0 0 d b 数控超声清洗器( 中国昆山市超声仪器有限) ；微型涡旋震荡器( 广州仪科实验室技 术有限公司) ：t d l - 5 - a 离心机( 上海安亭科学仪器厂，中国上海) ；固相萃取装置( 加拿大a g i l e n t 公司) 。 2 2 试剂与溶液 9 中国农业大学硕士学位论文实验研究 维生素e ( ( t o c o p h e r o l ，9 5 ) 、功、k 3 的标准品购自s i g m a 公司，维生素e a c ( d l _ a t o c o p h e r o la c e t a t e ，29 7 ) 标准品购自s u p e l c o 公司，维生素a a c ( 一9 5 a l l - t r a n s a n d 一5 1 3 - c i s - i s o m e r ) 标准品购自f u k a 公司；s a v i n a s e s 酶购自n o v o z y m e s 公司；甲醇，色谱纯( 美国 风h e r 公司) ；超纯水由m i l l i - q 仪器产生；实验中所有水均为超纯水，其他试剂均为分析纯。 标准贮备液：准确称取0 0 1 0 0g 标准品置于1 0i n l 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。 摇匀，其浓度均为1 0m g m l ，贮于4 冰箱中。有效期一个月所有操作均应在避光条件下进 行。 标准工作液：取适量标准贮备液于1 0m l 棕色容量瓶中，用甲醇稀释并定容。配制一系列标 准工作液，维生素k 3 的浓度为0 2 5 峙a i l l ，1 0p g m l 、5 0p g m l 、1 5 0l _ t g m l 、2 5 0i _ l i g m l ：维 生素a - a c 的浓度为2 0l a g m l 、1 0 0p g m l 、2 0 0 蟛m l 、5 0 0 “g m l 、1 0 0 0l a g m l ：维生素d 3 的浓度为1 0l _ l g m l 、5 0j j _ g m l 、2 0 0 “g m l 、5 0 0 “g m l 、1 0 0 0i t g m l ；维生素e 的浓度为3 0 p g m l ，3 0 0p g m l 、9 0 0g g m l 、1 8 0 0p g m l 、3 6 0 0t t g m l ；维生素e - a c 的浓度为5j a g m l 、 4 0i i g m l 、8 0 雌m l l 、2 0 0 “g m l 4 0 0g g m l 并配制维生素e 和维生素e - a c 浓度为4 0 0 烬, m l 维生素a - a c 和维生素功浓度为2 0 0 峙m l ，维生素k 3 浓度为5 0 喝 n l 的混合标准溶液，现用 现配 样品溶解液：0 2 氨水溶液；样品提取溶液：无水乙醇：固相萃取淋洗液：5 甲醇溶液： 圊相萃取洗脱液：无水乙醇。 2 3 操作步骤 2 3 i 色谱条件 色谱柱：a t l a n t i s d c l 8 柱( 1 5 0 x 4 6 t o n i i 击，粒度5 9 r a ) ；保护柱：2 0 x 4 6 h i m i 正，粒度5 i u m 柱2 - 3 5 1 2 ：流动相：甲醇一水( 9 8 ：2 ，v v ) ；流速为1 0m l m i n ) 检测波长2 3 0r i m 和2 6 5n n l ； 进样量：1 0 - 2 0u l 2 样品的前处理 称取添加标样的浓缩料1 0g ( 预混合饲料称取5g 、多维1 2g 和维生素添加剂0 i - 0 2g ，) 及s a v i n a s e 酶1g ( 分别对应为5 0 0 m g ，2 0 0 m g