（动物营养与饲料科学专业论文）浓缩型乳酸菌发酵剂制备工艺的研究.pdf

摘要 以优化选育的保加利亚乳杆菌( l _ b ) 和嗜热链球菌( s 0 为原菌种，对其最佳生 长培养条件、增菌方法、菌体富集方法、冻干保护、复水进行了系统的研究，构 建起浓缩型乳酸菌发酵剂制备技术路线和工艺参数，为浓缩型乳酸菌发酵剂工业 化生产提供依据。 1 lb 菌和s t 菌的生长条件的比较研究表明：4 2 培养发酵液的o d 值较其 它培养温度的效果好；接种量为2 时的s t 菌和l b 菌的o d 值增量分别为o 7 5 、 o 8 4 ，比生长速率分别为0 3 2 2 6 、o 3 0 0 5 ，结果较好；摇瓶培养时培养液中溶氧量 增大，对乳酸菌的生长有不利的影响。 2 采用单因素试验的方法，研究流加碱增菌效果。研究结果表明，以常用碱 作为中和剂，以流加形式调控p n 值在5 8 6 3 范围，均对保加利亚乳杆菌有较 明显的增菌效果，其中以5 0 氨水效果最好；流加碱调控p h 值对嗜热链球菌亦 有明显的增菌效果，其中以1 5 n a 2 c o ，为最好。 3 采用l ( 3 3 ) 正交试验设计对缓冲盐及其p h 值和添加量进行优化筛选， 研究结果表明：在添加缓冲盐对l b 菌的增菌研究中各因素对结果的影响为：p h 值 缓冲盐 添加量通过本实验所得最佳优化组合为：用柠檬酸一柠檬酸钠缓冲 液( c 6 h s 0 7 h 2 0 卜_ _ n a 3 c c , i - 1 5 0 7 h 2 0 ) 作为缓冲体系，起始p h 值为6 2 ，添加量 为5 ；在添加缓冲盐对s t 菌的增菌研究中各因素对结果的影响为：缓冲盐 p h 值 添加量。通过本实验所获得的最佳优化组合为：用磷酸氢二钠一柠檬酸缓 冲液( n a 2 h p 0 4 c d - i s o v h 2 0 ) 作为缓冲体系，起始p h 值为6 2 ，添加量为1 5 。 4 在菌体富集研究中，研究了离心力、离心时间等对乳酸菌离心损失率 和存活率的影响。结果表明，4 0 0 0 r m i n 离心2 0 m i n 是悬浮液制备的最佳离心条件； 同时对中空膜纤维组件的应用进行了初步探讨，结果显示中空膜纤维组件在浓缩 发酵液的应用问题上还有待进一步研究。 5 比较研究了悬浮液样品在- 2 0 、3 0 ( 2 和7 0 的几个不同温度下预冻处 理方案，试验结果表明：2 0 的预冻温度下，乳酸菌的冷冻伤害后的存活率最 高。 6 在乳酸菌冻干保护研究中，对几种不同的保护剂及其混合物的保护效果 进行了比较研究，研究结果显示在众多保护剂中以1 0 n f m + 5 甘油的保护效 果最好，其冻干存活率在l b 菌可达4 6 8 ，而在s t 菌中是可达7 5 。 7 通过含水量的控制研究适宜冻干时间参数，结果显示在本实验室条件下3 4 小时为适宜冻干时间参数。 8 ，运用三因素二次旋转正交组合设计建立了乳酸菌悬浮液制备条件的回归 模型为： y 1 = 3 3 4 4 + 1 6 6 x l 一3 2 9 ) ( 2 + 9 1 5 x 3 0 5 l x l z 28 1 x 2 z - 07 8 x 3 + 1 3 3 x l x 2 + o 9 8 x l x 3 - 35 5 x 2 x 3 在此模型下得到悬浮液制备最佳条件参数为：保护剂p h 值6 5 ，保护剂与 菌泥的平衡时间4 0 m i n , 保护剂与菌泥的混合比例1 ：1 6 。 9 在乳酸菌冻干样复水活力的研究中，比较研究了复水剂、复水时间对滴 定酸度、活力及乳酸菌的凝乳状态的影响，得出最佳的复水剂为1 0 n f m 和胡 萝h 汁脱脂乳培养基，最佳的复水时间为6 0 m i n ，将浓缩型乳酸菌发酵剂在适宜 条件下活化后再投入使用，可提高发酵剂的活性。 关键词：乳酸菌发酵剂制备工艺 a b s t r a c t t op r o v i d et h ed a t a sf o ri n d u s t r i a l i z a t i o no fc o n c e n t r a t e dl a e r i ca c i db a c t e r i aa n d e s t a b l i s ht h et e c h n i c a lp r o c e s sa n dt e c h n i c sp a r a m e t e ro ft h el a c t i ca c i d b a c t e r i a c o n c e n t r m e ds t a r t e r , t h el ba n ds to p t i m i z e dw e r ec h c o s e na so r i g i n a lc u l t u r et o s t u d yt h e i rg r o w t hc o n d i t i o n , m e t h o do fe n h a n c e m e n ta n d e n r i c h m e n tb a c t e r i a , f r e e z e - d r y i n gp r o t e c t i o na n dr e h y d r a t i o n 1t h eg r o w t hc o n d i t i o n so fl ba n ds , tw e r ec o m p a r e da n ds t u d i e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h eo dv a l u eo fl a c t i ca c i db a c t e r i ac o n c e n t r a t e ds t a r t e rw e r eb e s tw i t h c u l t i v a t e dt e m p e r a t u r e4 2 c t h eo dv a l u ei n c r e m e n to fs ta n dl bw e r eo 7 5a n d o 8 4 a n dt h eg r o w t hr a t ew e r eo 3 2 2 6a n d0 3 0 0 5w h e ni n o c u l a t i o nd o s a g ew a s2 t h es t i rp r o c e d u r ew a sd i s a d v a n t a g e o u st ot h eg r o w t ho fl a c t i ca c i db a c t e r i ab e c a u s e t h ec o n t e n to f d e l i q u e s c e n to x y g e nw o u l db ei n c r e a s e d 2 ，t h ee f f e c to ff l o w i n ga d d e da l k a l io nb a c t e r i ae n h a n c e m e n tw a ss t u d i e db ys i n g l e f a c t o rt e s t t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ，f o rt h el b ，t h e5 0 0 , 6a m m o n i aw a st h eb e s t n e u t r a l i z a t i o nr e a g e n tt oc o n t r o l lt h ep hv a l u ed u r i n g58 6 3 t h es a m et ot h es t a n dt h e1 5 s o d i u mc a r b o n a t e n e u t r a l i z a t i o nr e a g e n tw a st h eb e s t 3 f o rs e l e c t i n gb u f f e rs a l t ，p hv a l u ea n dd o s a g eo p t i m u m ，t h eo r t h o g o n a l e x p e r i m e n tl ( 3 3 ) w a su s e d t h er e s u l t se x h i b i t e dt h a t ，f o rt h el b ，t h ep h v a l u eh a dt h eg r e a t e s te f f e c to nb a c t e r i ae n h a n c e m e n ta n db u f f e rs a l t sw a st h es e c o n d a n dt h e nw a st h es a l td o s a g e t h eo p t i m i z e dg r o u pw a sc 6 h 9 0 7 h 2 0 - - n a 3 c 6 h 5 0 7 h 2 0b u f f e r , t h eo r i g i n a lp hv a l u ea n dt h es a l td o s a g ew e r e6 2a n d5 a st os t ， t h eo p t i m i z e dg r o u pw a sn a 2 h p o 越6 h s 0 7 h 2 0b u f f e r , t h eo r i g i n a lp h v a l u ea n dd o s a g ew e r e6 2a n d15 4 t h ee f f e c t so fc e n t r i f u g a t i o np o w e ra n dc e n t r i f u g a t i o nt i m eo nl o s i n gr a t ea n d l i v a b i l i t vo fl a c t i ca c i db a c t e r i aw e r es t u d i e di nb a c t e r i ae n r i c h m e n ts t u d y t h er e s u l t m a n i f e s t e dt h a tt h em o s to p t i m u mc o n d i t i o np a r a m e t e rf o rp r e p a r i n gt h el a c t i ca c i d b a c t e r i as u s p e n s i o nw e r e2 0 m i n , 4 0 0 0 r m i n i na d d i t i o nt h ea p p l i c a t i o no fh o l l o w f i b r o u s 丘l mo nc o n c e n t r a t i o no f l a c t i ca c i db a c t e r i at h a l l u sw a ss t i hi n d e f i m t e d 5 p u tt h es u s p e n s i o ns a m p l e si nd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ( - 2 0 c 、- 3 0 。ca n d - 7 0 c ) t o f r e e z e d r i e di na d v a n c e da n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h el a c t i ca c i dh a dt h eh i g h e s t s u r 、，i v a lr a t ew h e nt h eb a c t e r i as u s p e n s i o nw a sf r e e z e - d r i e da t - 2 0 i na d v a n c e 6 t h ee f f e c to fd i f f e r e n tp r o t e c t i o na g e n t sa n dt h e i ra d m i x t u r e so nt h es u r v i v i n gr a t e w e r ec o m p a r e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e1 0 n f m + 5 g l y c e r i nw a st h eb e s t p r o t e c t i o na g e n t s t h e nt h es u r v i v i n gr a t eo f l ba n ds tc a n r e a c h e d4 6 8 a n d7 5 7 t h ep a r a m e t e ro ff r e e z e d r y i n gt i m ew a ss t u d i e db yc o n t r o l l i n gt h em o i s t u r e c o n t e n ta n d3 4 h w a st h ea p p r o p r i a t ef r e e z e - d r y i n gt i m e 8 t h em a t h e m a t i c sm o d e lf o rs u s p e n s i o n sp r e p a r a t i o nc o n d i t i o nw a so b t a i n e db y t h r e ef a c t o r sq u a d r a t i cr o t a r yc o m b i n a t i o nd e s i g n y 1 - - 3 3 4 4 + 1 6 6 x 1 - 3 2 9 x 2 + 9 1 5 x 3 0 5 1 x 1 2 - 2 8 1 x 2 2 _ 0 7 8 x 3 2 + 1 3 3 x l x 2 + o 9 8 x 1 ) ( 3 35 5 x 2 x 3 t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o np a r a m e t e rf o rb a c t e r i as u s p e n s i o np r e p a r a t i o nw e r e a c q u i r e da c c o r d i n gt h em o d l e ：p hv a l u eo f p r o t e c t i o na g e n t sw a s6 5 ，t h ee q u a t i o n t i m eo f p r o t e c t i o na g e n t sm i x e dw i t hb a c t e r i u mm u dw a s4 0 r a i na n dt h ep r o p o r t i o no f p r o t e c t i o na g e n t sm i x e dw i t hb a c t e r i u mm u dw a s1 ：1 6 9t h ee f f e c to f r e h y d r a t i o na g e n t sa n dt i m eo nt i t r a t i o na c i d i t y , a c t i v i t ya n dc u r ds t a t e l a c t i ca c i db a c t e r i af r e e z e - d r i e ds a m p l ew e r es t u d i e d t h eo p t i m u mr e h y d r a t i o n r e a g e n tw a si o n f mm i x e dw i t h c a r r o tj u i c en f ms u b s t r a t e ；t h e o p t i m u m r e h y d r a t i o nt i m ew a s6 0 m i n t h ea c t i v i t yo fl a c t i ca c i db a c t e r i ac o n c e n t r a t e ds t a r t e r c a nb ee n h a n c e db yr e u s i n gt h ec o n c e n t r a t e dl a c t i ca c i db a c t e r i ac o n c e n t r a t e ds t a r t e r w i t ha p p r o p r i a t ea c t i v e dc o n d i t i o n k e yw o r d s ：l a c t i ca c i db a c t e r i a , c o n c e n t r a t e ds t a r t e r , t e c h n o l o g y 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名时间：苦年月方日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 第一导师签名 i 对l m ：扣口年钿凶i = _ 1 时间：刃彩年月孔垌 溆 文献综述 乳品生产中发酵剂一般是指生产酸奶及发酵乳饮料接种使用的保加利亚杆 菌( l b ) 、嗜热链球菌( s 0 、干酪乳杆菌、乳酸链球菌等一种或几种细菌的培养 物。其发展大致经历了天然型发酵剂、传统人工型发酵剂、浓缩型发酵n z - 个阶 段。目前，我国发酵剂的制备技术大都停留在传统人工型发酵剂的水平。传统发 酵剂一般是将少量自己保存的菌种经活化、扩增制成普通液体发酵剂。这种发酵 剂由于含菌量低( 1 0 7 1 0 8 m l 1 ) ，所以用量大，而且制作过程繁杂，质量不易控 制，容易污染杂菌和噬菌体。由于这些弊端的存在，人们迫切需要一种能直接用 于生产的高浓度发酵剂【2 ”。 浓缩型乳酸菌发酵剂是特指为制作发酵- * t , a i 0 品和乳酸菌制剂而调制的一种 高密度( 1 0 1 0 1 2 1 2 c f u m 1 ) 乳酸菌纯培养物，具有可以直接作为生产发酵剂使用： 接种量较传统人工型发酵剂降低1 0 0 1 0 0 0 倍；减少菌种车间的投资；防止菌种 的退化和污染；可使发酵乳制品工业的劳动生产率和产品质量大大提高等优点。 西方发达国家早在2 0 世纪初开始研究浓缩型乳酸菌发酵剂，6 0 年代后开始 商品化，目前已形成了一定的产业化规模。我国对浓缩型乳酸菌发酵剂的研究起 步较晚，1 9 9 1 年才有高松柏1 5 】等人采用缓冲盐法增殖浓缩菌体、再经离心分离和 真空冷冻干燥制备浓缩型冻干发酵剂的研究报道。随后，在内蒙、黑龙江等地相 继建立了发酵剂研究中心，研制并开发出酸奶粉和商品发酵剂。 1 乳酸菌发酵剂的功能 乳酸菌发酵剂除具有分解乳糖产生乳酸形成凝胶状食品的基本功能外还陆续 被发现多种新的功能特性。 1 1 乳糖的利用 牛乳中乳糖的含量为4 0 s o g a 。乳球菌利用乳糖的葡萄糖部分快于半乳糖部 分。乳球菌发酵的主要产物是l ( + ) 哥l 酸。 乳酸菌通过细胞膜转运乳糖、葡萄糖和半乳糖的途径，其通过细胞膜的转运 体系有两种不同的机理：通透酶体系和烯醇丙酮酸磷酸磷酸转移酶体系 ( p e p p t s 体系1 。在嗜热菌和明串珠菌中发现通透酶体系；在乳球菌中存在的是 p e p p t s 体系。在p e p p t s 体系中乳糖通过一个复杂的系统转运到细胞内，经 磷酸化后转变为磷酸化乳糖，磷酸化乳糖在磷酸b 半乳糖苷酶( p 8 g a 0 的作用 下水解为葡萄糖和半乳糖6 - 磷酸。乳糖也可以通过通透酶体系进行转运，需要 细胞的a t p 供能。关于嗜热菌的乳糖转运体系研究结果较少。在唾液链球菌嗜 热亚种的乳糖转运的研究中甚至出现相反的试验结果。在嗜热菌中也认为存在通 透酶体系和烯醇丙酮酸磷酸一磷酸转移酶体系或者仅存在通透酶体系【_ ”】。与磷酸 一b 一半乳糖苷酶相比，乳杆菌中存在更多的b 一半乳糖苷酣”，这表明通透酶是 其重要的转运体系。 转运后的糖类可能是磷酸化的乳糖、葡萄糖和半乳糖或游离的糖类。这些糖 类分子可以通过三种不同的途径代谢。磷酸乳糖在1 3 一半乳糖苷酶的作用下水解 为葡萄糖和6 一磷酸。葡萄糖部分通过糖酵解途径( e m p 途径) 催化代谢，而半乳糖 - 6 一磷酸沿着d 一塔格糖_ 6 一磷酸途径进行代谢。半乳糖通过洛氏途径( l e l o i r 途径) 代谢。碳水化合物的代谢通过阻遏和逆向抑制进行控制。阻遏是控制酶合成的机 理，逆向抑制则控制酶的活力。 1 2 蛋白质分解 与芽孢杆菌和假单胞杆菌相比，乳酸菌只有相对和缓的蛋白质分解力。乳酸 菌可以利用凝乳酶和菌体细胞壁蛋白酶降解蛋白质产生的多肽。蛋白酶和肽酶的 联合作用提供给菌体细胞生长所需的多肽和游离氨基酸。肽类和氨基酸通过特异 的转运体系穿过细胞膜，转运到内部的肽类可以通过细胞肽酶进一步的降解。 1 3 风味物质 乳球菌产生的风味化合物可以分为两类：发酵乳制品中的风味化合物和成熟 干酪中存在的化合物。发酵乳中乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳油亚种产生 的有机酸主要是乳酸和乙酸。乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种和明串珠菌可发酵 牛乳中的柠檬酸产生乙醛、丁二酮、3 羟基丁酮、2 , 3 丁二醇。在德氏乳杆菌保 加利亚亚种、干酪乳杆菌、唾液链球菌嗜热亚种发酵剂菌株以及瑞士干酪、莫扎 雷拉干酪、契达干酪中发现二羧酸、乙二醛、甲基乙二醛、丁二酮、二羟丙酮等 化合物。一般认为菌体产生的风味化合物是为了避免菌体中丙酮酸的积累【l ”。 1 4 胞外多糖( 产粘) 的产生 许多乳酸菌可以产生胞外多糖。胞外多糖可以以荚膜多糖或粘液多糖存在。 几个世纪以来在芬兰使用产粘菌株生产浓厚的、粘性发酵产品“维利”( v i l l i ) 。、 自1 9 8 0 年以来，嗜热性的、产粘性的乳酸菌已经被广泛地用于酸乳生产中。改 善酸乳的流变学特性，减少或阻止乳清的析出。在酸乳生产中这些粘性菌株的使 用可以替代稳定剂。 1 5 抑制物质的产生 乳酸菌活动过程中将糖发酵产生有机酸，赋予产品良好的保藏效果。产品p h 值的降低和产生的有机酸( 乳酸和醋酸) 对其他微生物具有良好的抑制作用。很 少的细菌能在如此低的p n 值下增殖。 乳酸菌还产生一些含量较低的其他抑制物质。这些化合物包括过氧化氢、细 菌素类。 乳酸菌细菌素是近十几年来广泛研究的课题。乳酸菌细菌素一般具有狭窄的 2 抗菌谱：分子的一部分是肽类，因此对蛋白酶比较敏感，一般是热稳定的。 1 6 益生功能 发酵剂菌株不仅应赋予产品适宜的感官特性，而且需要考虑其保健或营养功 效。发酵剂菌株选择的重要因素是具有某种保健功能，而且应具有在肠道中定植、 增殖特性【l ”。具有耐胆汁酸的能力，同时要考虑益生菌的宿主特异性，还要考 虑微生物的来源。 益生菌发酵剂有以下几个方面的重要作用：防止肠道的感染【13 j ；控制血清胆 固醇的含量；对免疫系统的影响14 】；促进乳糖不耐症患者对乳糖的利用；抗 致癌作用【l “。上述研究领域的研究还在继续进行，其健康作用机理和科学依据 不断被完善和创立。 2 乳酸菌发酵剂的制造工艺与技术 浓缩型乳酸菌发酵剂的制备系采用优质乳酸菌种，经液体增殖培养、浓缩分 离。配以生物活性因子，再经冷冻或干燥方式制成。乳酸菌浓缩发酵剂制备的关 键是要实现对其进行高活性、高密度的培养。高密度培养技术( h i g hc e l ld e n s i t y c u l t u r e ，h c d c ) ，即高密度发酵技术，一般指在液体培养中的细胞密度超过常规 培养1 0 倍以上的培养技术，达到提高菌体密度的目的。 2 1 菌体的增殖培养技术 2 1 1 增殖培养基的选择获得乳酸菌大量生长的培养基是制备浓缩型发酵剂的 前提。增菌培养基大致可分为配制培养基、乳基质培养基、乳清基质培养基。后 两者因其增殖慢，或不易分离菌体而不宜采用嘲，或常常配合以其他生长因子方 可使用。使用乳清基质培养基时，乳清蛋白易发生热变性，易产生沉淀。实验室 使用的乳酸菌培养基一般成分复杂、价格昂贵。适合工业化生产浓缩型发酵剂的 乳酸菌培养基必须具备原料易得、价格低廉、菌体产量高、容易浓缩分离细胞等 特点。目前，国外主要使用以乳清为原料的培养基，而国内主要使用以脱脂乳为 原料的培养基。脱脂乳培养基虽然经济易得、价格低廉，但是粘度大，菌体不易 浓缩分离。因此积极寻求来源广泛、经济易得的廉价原料，优化筛选适合乳酸菌 大量生长的增殖培养基，这是实现工业化生产浓缩型发酵剂的重要研究课题之 一o 2 1 2 国外增菌培养基的研究现状早在8 0 年代初，全苏乳品工业研究所就采用 冷冻干燥法，研制成含嗜温嗜热的乳酸链球菌和嗜酸乳杆菌的干燥菌种，所用培 养基由乳清、水和缓冲盐组成。 目前国外乳酸菌发酵剂的工业生产培养基主要有4 种： ( 1 ) 脱脂乳或r s m p 中加生长促进剂同时进行p h 值控制，这种培养基很难收 集到菌体，添加柠檬酸盐后有所提高。 ( 2 ) 水解乳加生长促进剂、o h 值控制，这种培养基的菌体易于收集问题，但 是费用昂贵，而且培养基制备过程繁杂i | 7 i 。 ( 3 ) 乳清基质加生长促进剂、p h 值控制，这种培养基在热处理时易引起蛋白 质沉淀，需要澄清过滤，费用不是很高。 ( 4 ) 乳糖加生长促进剂、p h 值控制，这种培养基简单而且便宜，灭菌也比较 容易，是一种工业生产乳酸菌的较好方法。 2 1 3 国内现状 房兴利掣8 1 用改良的m r s 培养基和葡萄糖酵母膏培养基分别培养保加利亚 杆菌和嗜热链球菌，4 0 培养4 8 小时，收集的菌体分散在o 1 m o v m l 、p h 值为 4 2 的缓冲溶液中，能制成菌数为1 0 1 0 m l d 的菌悬液。刘宇峰等用含有胰蛋白 胨、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、葡萄糖、n a c l 、l 半胱氨酸的复合培 养基和天然脱脂乳培养基分别培养保加利亚杆菌和嗜热链球菌。结果表明，脱脂 乳优于复合培养基。史缓英等对传统乳酸菌l b 和s t 进行了高浓度混合培养的 研究，确定了培养基配比为脱脂奶粉质量分数为1 0 ，乳清粉质量分数为1 ，酵 母膏质量分数为1 ，磷酸氢二氨质量分数为0 2 5 。培养过程控制p h 为58 63 ， 菌数达到2 5 8 x1 0 1 0 m l 。黄良昌等【9 】从多种培养基中优选出改良的m r s 培养基 作为保加利亚杆菌的增菌培养基，同时将初始p h 调到58 ，在4 0 条件下培养， 添加生长促进剂后茵落数达到1 0 1 0 m l 。1 以上。 2 2 浓缩培养的方法 制备浓缩型乳酸菌发酵剂，需要获得高浓度的细胞培养物，因此，必须对乳 酸菌进行浓缩培养。浓缩培养的基本原理是：在乳酸菌培养过程中，通过追加营 养物质、缓解代谢产物一乳酸对细胞生长的抑制作用，延长乳酸菌的对数生长期， 获得高浓度的细胞培养物。目前，国内外浓缩培养乳酸菌的方法有以下几种。 ( 1 ) 化学中和法。在乳酸菌培养过程中自动向培养液中添加n a o h 或 n h 3 h 2 0 等碱类物质，不断中和乳酸菌产生的乳酸，促进乳酸菌的大量繁殖。 ( 2 ) 缓冲盐法。向乳酸菌的培养液中加入缓冲盐，调节培养液的酸度在一 定的范围内不升高，促进乳酸菌生长繁殖。 ( 3 ) 膜渗析法。向乳酸菌的培养液中不断添加营养物质，代谢产物通过膜 而除去，促进乳酸菌生长繁殖。用此种方法达到的菌体浓度比上述两种方法都要 高( 大于1 0 1 1 m l d ) 【1 0 】。在国内有人利用中空纤维膜对乳杆菌进行了渗析培养， 这种培养方法尽管达到了较高的菌体浓度，但多次过滤耗能大。对超滤膜材料的 要求比较严格，另外在培养过程中易感染噬菌体，此法应用并不广泛。目前应用 较为广泛的是平板式膜过滤设备【2 0 1 。吕晓龙【2 1 】等用内压式中空纤维膜组件进行 发酵液菌体培养液的浓缩回收，结果发现酵母细胞可以1 0 0 被截留，并且被浓 4 缩的酵母细胞无破裂变形。 上述浓缩培养乳酸菌的方法中，膜渗析法是目前国内外最先进的方法，但该 法对膜材料和操作技术要求较高，而化学中和法和缓冲盐法的研究及应用相对普 遍。在缓冲盐法浓缩培养研究领域中，美国和意大利处于领先水平，但其缓冲盐 配方属于专利保密。t i n e k e h 等人曾用质量分数为2 0 2 9 的超滤浓缩奶和脱脂 乳作为培养液，利用高浓度的蛋白和磷酸盐达到缓冲效果【4 】；高松柏等人。1 曾在 质量分数为5 脱脂乳水解液培养基中和质量分数为1 2 脱脂乳培养基中分别加 入缓冲盐a 和缓冲盐b ，4 0 培养8 h 和6 h ，乳酸菌活菌数分别达到2 2 x1 0 。m l 。 和6 5x1 0 9 m l - 1 ，是不加缓冲盐培养基的3 倍和6 倍；吕兵等人“”在含有质量分 数为0 3 酵母膏、质量分数为0 1 吐温8 0 的1 2 ( 质量分数) 脱脂乳培养基中， 加入质量分数为0 5 k 。h p 0 。作为缓冲盐，4 2 培养4 h ，乳酸菌活菌数达到2 9 5 x1 0 l ，是起始培养基的2 倍以上，在此基础上，添加质量分数为3 0 n 巩c 0 。 作为中和剂，控制基质p h 值为6 3 ，4 2 培养6 h ，乳酸菌活菌数达到5 8 9 1 0 9 m l 一，较起始培养基的活菌数提高4 5 倍。利用缓冲盐法和化学中和法进行乳 酸菌的浓缩培养，增殖效果显而易见。 2 3 菌体细胞的分离技术 菌体分离技术是制备浓缩型乳酸菌发酵剂( 特别是浓缩型冻干发酵剂) 重要 的中间工艺环节。分离方法有超滤和离心。研究表明，超滤效果忧于离心，而超 速离心效果优于普通离心【4 l 。但，离心比超滤操作简便、设备清洗和消毒方便、 不易污染，其应用较超滤普遍【1 1 2 。j 。 23 1 在离心分离过程中【1 ”，一方面，离心力机械作用以及温度和基质p h 等因素 的影响，会造成部分菌体死亡；另一方面，部分菌体必然残留在上清液中而损失。 如果离心工艺掌握不当，菌体死亡率和损失率随之增高，使活菌收得率大大降低， 直接导致发酵剂的活菌含量下降。因而，对离心力、离心时间、温度、基质p h 等因素对乳酸菌的离心损失率和存活率的影响有待深入细致的研究，以寻求获得 最高活菌收得率的最佳离心条件。 2 3 2 在超滤分离过程中，浓差极化和膜污染是影响膜渗透通量下降的主要原因， 国内外许多专家对此进行了分析，取得了许多深刻的理性认识。在减少和消除浓 差极化和膜污染时可采用的主要措施有：改善膜表面的流动状态，如提高总通量、 进行脉冲供液、改善设备的结构形式等，这些方法可以减轻膜的浓差极化；开发 新的膜材料，根据不同的处理液选用不同的膜材料，在选择膜材料时，应尽量选 择对处理物料有“排斥”作用的微滤膜。膜面的污染总是要发生的【l ”，目前多 采用膜的清洗来消除和减轻膜的污染，膜的清洗方法主要可分为化学清洗和物理 清洗两大类，有时也可改变运行条件来实现。物理清洗法有变流速冲洗法( 脉冲、 逆向及反向流动) 、海绵球清洗法、超声波法、热水及空气和水混合冲洗法等， 化学清洗所用的药剂可分为氧化剂( n a o c i 、1 2 、h 2 0 2 、0 3 ) 、还原剂( h c h o ) 、 螯合剂( e d t a 、六偏磷酸钠) 、酸( 矾0 3 、h 3 p 0 4 、h c i 、h 2 s 0 4 、草酸、柠檬 酸) 、碱( n a o h 、n h 4 0 h ) 、有机溶剂( 乙醇) 、表面活性剂及酵母清洗剂等。 尽管预处理时采取了一定的措施，但是长时间运行不可避免地导致膜组件的污 染，因此必须对膜组件进行定期的清洗。一般下列情形发生时进行清洗：在正常 压力下产品水流量下降1 0 一1 5 ；产品水质下降1 0 1 5 ，盐透过率增加 1 0 - 一1 5 ；为维持正常产品水流量，使用压力增加；r o 各段间压差比运行初期 增加l o 1 5 。 2 4 生物保藏技术 乳酸菌发酵剂的保藏技术是目前研究较多的课题之一。一般分为冷冻保藏法 和干燥保藏法。 24 1 冷冻保藏法 乳酸菌种经液体增殖培养、浓缩分离、与冷冻保护介质混溶、再经冷冻，制 成浓缩型冻藏发酵剂。影响浓缩型冻藏发酵剂活力和贮藏稳定性的因素主要有： 冷冻保护介质、冻结速度和冷冻温度。 冷冻保护介质的主要作用是防止乳酸菌在冷冻过程中胞内冰晶的形成而造 成细胞损伤和死亡。乔发东等人 3 1 研究发现，由甘油、脱脂乳、蔗糖、酵母膏、 蛋白胨、v c 和谷氨酸钠组成的冷冻保护介质，可使浓缩型发酵剂在冻藏期间保 持较高的活菌数。 对大多数微生物的冷冻试验表明，快速冻结对细胞的损害较大，而慢速冻结 可提高细胞存活率。一般认为，细胞悬液在2 0 - - - 4 0 、l h 左右达到冻结的为慢 速冻结方式：在3 0 r a i n 内甚至更短时间内完全冻结的为快速冻结方式【2 ”。研究 表明，慢速冻结，水分有足够时间由细胞内渗出，防止冰晶在胞内形成而损害细 胞；快速冻结水分没有足够时间由细胞内渗出，使胞内冰晶形成而损伤细胞【2 4 1 。 冷冻温度有2 0 、4 0 - - 8 0 。c 和1 9 6 。c ，分别称为冷冻、低温冷冻和超低温液 氮冷冻【2 ”，其中超低温液氮冷冻效果最好。吕加平等人( 1 9 9 7 ) 对浓缩型发酵 剂进行了2 0 和4 0 的冻藏试验，结果表明，冻藏3 个月后，2 0 和4 0 的 活菌数无明显差异【”，但对- 4 0 以下的低温未进行相应的研究。 浓缩型冻藏发酵剂在应用中，维持冷冻费用较高，运输不方便，需要配备专 用冷藏车，对发酵中心的依赖性过强。 2 4 2 干燥保藏法 乳酸菌种经液体增殖培养，浓缩分离，与保护介质混溶，再经一定方式进行 干燥，制成浓缩型干燥发酵剂。干燥工艺有：真空低温干燥法、喷雾干燥法和真 6 空冷冻干燥法( 简称冻干法) 4 1 。其中真空低温干燥和喷雾干燥法制备的浓缩型 发酵剂，一般活菌含量偏低；而冻干法制备的浓缩型发酵剂，不仅活菌含量高， 而且保藏和运输方便，机械化程度高，便于工业化批量生产，是当今浓缩型发酵 剂的主要类型。 冻干法的基本原理是：菌体与保护介质混溶形成细菌悬浮液，在共融点以下 预冻，然后，在低于三相点压力的高度真空状态下，使悬浮液中的冰晶升华，除 去悬浮液中的多余水分，获得一定含量的干燥发酵剂【2 4 、2 5 1 。在冻干过程中影响 发酵剂细胞存活率及贮藏稳定性的主要因素有：营养基质、培养条件、收获期、 起始细胞浓度、冻干保护介质、冷冻速度、干燥过程、残留水分、包装形式、保 藏温度等m 。 研究表明，乳酸菌与保护介质混溶后的起始细胞浓度达到1 0 1 2 m l 。1 时，可获 得较高的细胞冻干存活率。k i l a r a 认为，高浓度细胞可降低每个细胞暴露在介质 中的面积，从而抗冷冻干燥能力提高【2 4 】。 冻干保护介质的选择是最为关键的因素，它不仅影响发酵剂在冻干过程中的 细胞存活率，也影响保藏期间的细胞稳定性。保护介质可分为两种：一是小分子 量的化合物如氨基酸、有机酸、低分子的糖类和糖醇类等；二是大分子的物质如 蛋白质、多糖、聚乙烯砒咯烷酮和其他的合成聚合物等。小分子量的保护剂都有 共同的特性，即每个分子都包含不少于3 个可形成氢键的( o h 、- n h 2 、= n h 、 = o ) 或可电离的( 酸性的或碱性的) 功能基团哳1 。甘油和一些醇类，虽然它们 对冷冻伤害有很好的预防作用，但由于它们的极强的吸湿特性，一般不用作冻干 保护剂；大分子保护剂的物理化学特性目前还不清楚，但它主要是保护细胞的表 面免受伤害，冻干过程中对细胞有一定的保护作用，但大分子保护剂单独使用时， 在保存期间对细胞的保护效果却不明显，如果合适的大分子和小分子保护剂配合 使用，将会加速干燥且能在干燥和保存期间维持较高的细胞存活率【2 ”。作为小 分子量的保护剂应具有很强的亲水性，其结构应具备3 个以上氢键，对于糖、醇 而言应具有5 个以上的羟基【2 4 】，在冻干过程中，可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸 基团或与菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构的完整性【2 8 】。 水活度( a w ) 是影响冻干发酵剂贮藏稳定性的重要因素。研究表明，冻干 发酵剂的a w 值为o 1 或含水量为15 一3 0 为宜。如果含水量 3 o ，发酵剂 贮藏稳定性降低；而含水量 c b 。通 过本实验所得最佳优化组合为a 3 b l c 2 。取最佳处理组合所得菌体计 数结果见表8 。 3 3 2 添加缓冲盐对s t 菌的增菌研究 添加缓冲盐对s t 菌增菌的试验结果见表7 。 由表7 可知在此实验过程中各因素对结果的影响为：c a b 。通过本 实验所获得的最佳优化组合为a 3 8 3 c 1 。取最佳处理组合所得菌体计 数结果见表8 。 3 3 3 增菌研究结果 综合以上增菌研究，取每组处理的最佳试验组合，进行活菌计数， 结果见表8 。 表7s t 菌增菌结果表 工a w t h e r e $ u l t0 f e n h a n c e m e n tc u l t u r e o ns t 表8 不同处理对菌体增殖的影响 t a b 8 i n f l u e n c eo fd i f f e r e n tt r e a t m e n to nl a c t i ca c i db a c t e r i ag r o w t h 由表8 可以看出，流加碱法增菌总体效果上要优于缓冲盐法增 菌，可能是因本试验是建立在改良m r s 培养基的基础上。而改良m r s 培养基中本已有一定的缓冲体系，最终导致了缓冲盐法弱于流加碱 法。 3 4 菌体富集条件的研究 3 4 1 离心法菌体富集试验结果见表9 。 试验结果表9 表明：离心条件最好的是1 0 m i n 、6 0 0 0 r m i n ，上清夜中几乎没 有菌体存在，而2 0 m i n 、4 0 0 0 r m i n 效果与其比较接近，从菌体离开培养基的时 间、离心速度对菌体的伤害和节能的角度，可选择2 0 m i n 、4 0 0 0 r r a i n 作为悬浮 液制备的离心条件。 表9 不同离心条件对乳酸菌的离心效果 t a b 9 t h ec e n t r i f u g a l i s ee f f e do f d i f f e r e n tc o n d i t i o n so f n t r i f u g m i o nl a c t h ca c i db n c t e r i a 3 4 2 膜浓缩菌体富集的研究 不同压力条件下膜过滤对乳酸菌发酵液的浓缩效果见表1 0 。 表1 0 膜过滤对乳酸菌发酵液的旅缩效果 。t a b i o 。t h e c o n c e n t r a t e e f f e c t o f f i l t r a t i o n w i t h f i l m 一o n l a c t i c a c i d b a c t e r i az y m o t i c f l u i d 。 浓缩条件 浓缩比 菌体浓度 ( 1 0 6 个i n t l ) 由表l o 可知，中空膜组件浓缩乳酸菌发酵液浓缩倍数有限，导致浓缩液中 含有大量的水分，菌体浓度较低，浓缩液中最高活菌数为4 6 1 1 0 6 个m l ，这样 的浓缩液所制得的冻干发酵剂明显菌体浓度不够，最终导致发酵剂不达标。 3 5 乳酸菌预冻处理的研究 本试验采用了三个不同的温度进行预处理温度筛选，结果见表1 1 。 表1i 乳酸菌预冻处理温度的筛选 t a b l l t h es e l e c to fp r e - t 3 o z e nt e m p e r a t u r eo l ll a c t i ca c i db a c t e r i a 通常认为，对活性物质影响较大的温度是- 4 0 0 c 或以上，而低于- 4 0 ，温度 对样品的影响就很小，所以在样品温度降至- 4 0 。c 前的控制是非常重要的“。由 试验结果可知，在一2 0 1 2 条件下冷冻对乳酸菌细胞的伤害较小，故在研究设定 的温度条件下一2 0 为适宜预冻温度。 3 6 乳酸菌冻干保护的研究 不同保护剂对乳酸菌的冻干存活率影响结果见表1 2 ，1 3 。 从表1 2 、1 3 中可以看出，在加入保护剂 6 5 后，乳酸菌的存活率都有不同 程度的提高，在l b 菌的冻干保护中与空白对照相比蔗糖、甘油、谷氨酸钠、v c 葡萄糖等均使冻干存活率提高了2 3 倍，乳糖、n f m + 麦芽汁、1 0 n f m +