（作物遗传育种专业论文）甘薯胚性悬浮细胞培养中的体细胞无性系变异分析.pdf

摘要 以甘薯品种徐薯1 8 的3 个独立茎尖组织为外植体，建立了其胚性细胞悬浮培养系，对甘薯 胚性细胞悬浮培养和植株再生过程中产生的体细胞无性系变异进行了系统分析。 将长约0 5 m m 的茎失组织培养在添加2 0 m g l 1 2 , 4 - i ) 的m s 培养基上，诱导得到胚性愈伤 组织。将获得的胚性愈伤组织在含有2 0 m g l4 2 ，乒d 的m s 液体培养基中进行振荡培养，建立 了增殖迅速、分散程度良好的胚性细胞悬浮培养系。将3 个茎尖组织由来的胚性细胞分别悬浮培 养1 6 周、2 0 周和2 4 周后，将直径约1 0 m m 的细胞团转移到添加2 0 r a g l 2 ，4 - 1 ) 的m s 固体培 养基上，增殖成为胚性愈伤组织，并形成体细胞胚。将具有体细胞胚的胚性愈伤组织进一步转移 到添加1 0 r a g l 1 a b a 的m s 培养基上时，体细胞胚发芽形成小植株。由3 个茎尖组织分别获得 2 8 9 株、5 4 0 株和9 7 1 株完整再生植株。 从1 8 0 0 株再生植株中随机抽取5 2 5 株进行同工酶分析，结果表明。其中1 1 株再生植株的过 氧化物酶谱带与对照相比有明显差异占2 0 9 5 ：酯酶同工酶分析表明，有1 2 株再生植株谱带 与对照相比有明显差异，占2 2 8 6 ；在过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶谱带上同时发生变异的植 株有4 株，占o 7 6 2 。从1 8 0 0 株再生植株中随机抽取9 0 株和1 9 株同工酶发生变异的植株进行 r a p d 分析，用3 0 个随机引物进行扩增，发现在9 0 株再生植株中有5 8 株植株在2 0 个引物的扩 增产物中与对照有明显不同，占6 4 4 4 4 ，且其变异位点不同；1 9 株同工酶发生变异的植株中有 1 7 株在这3 0 个引物的扩增产物中与对照相比有明显不同。将这些再生植株移栽到大田，对其进 行形态学特征观察，发现部分植株的叶脉色和薯皮色发生了变异，分别占0 5 0 0 和3 9 4 4 ：干 物率分析表明，少量植株的干物率也发生了变异。 关键词：甘薯，细胞悬浮培养，体细胞无性系变异 a b s t r a c t e m b r y o g e n i cs u s p e n s i o nc u l t u r e so fs w e e t p o t a t oc v x u s h u1 8w e r ee s t a b l i s h e dt h r o u g ht h eu s eo f t h et h r e ed i f f e r e n ts h o o t p s t h es o m a c l o n a lv a r i a t i o ni nt h ep r o c e s so fe m b r y o g e n i cs u s p e n s i o n c u l t u r e sa n dp l a n tr e g e n e r a t i o nw a si n v e s t i g a t e ds y s t e m a t i c a l l y s h o o tt i p so fa b o u t0 5m mi n l e n g t hg a v er i s e t oe m b r y o g e n i cc a l l u s e so nm sm e d i u m s u p p l e m e n t e dw i t h2 0m g 。l 12 , 4 - d t h eo b t a i n e de m b r y o g e n i cc a l l u s e sw e r eu s e dt o i n i t i a t ec e l l s u s p e n s i o nc u l t u r e si nm sm e d i u mc o n t a i n i n g2 0m g 。l 12 , 4 - d r a p i d l y - g r o w i n ga n dw e l l - d i s p e r s e d c e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e sw e r ee s t a b l i s h e d s i x t e e nw e e k s ，t w e n t yw e e k s ，a n dt w e n t y - f o u rw e e k sa f t e rt h e i n i t i a t i o no fs u s p e n s i o nc u l t u r e sf r o mt h et h r e ed i f f e r e n ts h o o tt i p s ，c e l la g g r e g a t e sa b o u t1 0m mi n d i a m e t e rw e r et r a n s f e r r e dt om sa g a rm e d i u ms u p p l e m e n t e d 、v i t h2 0 m g l 2 , 4 - da n df o r m e d e m b r y o g e n i cc a l l u s e sw i t hs o m a t i ce m b r y o s t h ee m b r y o g e n i cc a l l u s e sw i t hs o m a t i ce m b r y o sw e r e f u r t h e rt r a n s f e r r e dt om s a g a rm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h1 0m g l - 1 a b a ，r e s u l t i n gi nt h eg e r m i n a t i o n o fs o m a t i ce m b r y o s t h ef r e q u e n c i e so fp l a n tm g e n e r a l l o nr e a c h e d1 0 0 i na l lt h r e es h o o tt i p s t h e c a l l u s e sw i t hs o m a t i ce m b r y o sa n dp l a n t l e t sw e r ef u r t h e rt r a n s f e r r e dt ot h eb a s a lm e d i u m ，r e s u l t i n gi n t h er e g e n e r a t i o no f2 8 9 ，5 4 0 ，a n d9 7 1p l a n t sf r o mt h r o ed i f f e r e n ts h o o tt i p s ，r e s p e c t i v e l y f r o mt h e1 8 0 0r e g e n e r a t e dp l a n t so fx u s h u1 8 ，5 2 5p l a n t sw e r es a m p l e dr a n d o m l yf o r t h e i s o e n z y m ea n a l y s i s t h er e s u l t ss h o w e dt h a to b v i o u sv a r i a t i o n si np e r o x i d a s ei s o z y m ep a t t e r n sw e l e f o u n di ni io ft h e5 2 5p l a n t s ( 2 0 9 5 ) o b v i o u sv a r i a t i o n so fe s t e r a s ei s o z y m ep a t t e r n se x i s t e di n1 2o f t h e5 2 5p l a n t s ( 2 2 8 6 ) ，a n di nt h e4p l a n t s ( 0 7 6 2 ) o b v i o u sv a r i a t i o n so fb o t hi s o z y m ep a h e m s w e r eo b s e r v e di nc o m p a r i s o nw i t ht h ec o n t r 0 1 r a p da n a l y s i sw a sc o n d u c t e df o rt h e1 9i s o e n z y m e v a r i a n t sa n dt h e9 0p l a n t ss a m p l e dr a n d o m l yf r o mt h e1 8 0 0r e g e n e r a t e dp l a n t s i tw a si n d i c a t e dt h a t2 0 o ft h e3 0r a p dp r i m e r su s e dg e n e r a t e dd i f f e r e n tp r o f i l e si n5 8o ft h e9 0p l a n t s ( 6 4 4 4 4 、c o m p a r e dt o t h ec o n t r o lp l a n t s ；a n da l lt h e3 0r a p dp r i m e r su s e dg e n e r a t e dd i f f e r e n tp r o f i l e si n1 7o ft h e1 9 i s o z y m ev a r i a n t sc o m p a r e dt ot h ec o n t r o lp l a n t s t h er e g e n e r a t e dp l a n t sw e r et r a n s p l a n t e di naf i e l d v a r i a t i o u s o fl e a fv e i nc o l o ra n dr o o ts k i nc o l o rw e r eo b s e r v e di n0 5 0 0 a n d3 9 4 4 o ft h e r e g e n e r a t e dp l a n t s r e s p e c t i v e l y a n a l y s i sf o rt h ed r ym a t t e rc o n t e n td e m o n s t r a t e dt h a tt h ed r ym a t t e r c o n t e n tw a sa l s oc h a n g e di nap a r to ft h er e g e n e r a t e dp l a n t s k e y w o r d s ：s w c e t p o t a t o ，e m b r y o g e n i cs u s p e n s i o nc u l t u r e s ，s o m a c l o n a lv a r i a t i o n i i f 7 7 4 4 7 1 本论文由 国家杰出青年科学基金( 3 0 2 2 5 0 2 8 ) 和国家“8 6 3 课题( 2 0 0 2 a a 2 4 1 0 3 1 ) 共同资助 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 奇碡 时间：知蟮年g 月移日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： j f裤时间：知拶年g 月膪日 导师签名； 时间：2 饥 年舌月f 9 日 主拦盔茎些墼篁圣，。，。，。些 1 文献综述 自1 9 0 2 年h a b e d a n d t 提出细胞全能性概念以来，在无数科学家的努力下，离体培养经过1 0 0 多年的历程后，其培养技术趋于完善，趋于成熟。近4 0 年来，随着植物组织培养技术的迅速发展， 不断发现在培养细胞和再生植株中存在着各种不同的变异体细胞无性系变异，其中许多变异 体在品种改良上颇有价值。因此，了解体细胞无性系变异的类型、来源、影响因素和遗传基础， 对利用体细胞无性系变异进行植物育种和品种改良具有深远的意义。 甘薯作为我国的第四大粮食作物，在农业和工业上起着重要的作用。甘薯由于遗传上的高度 杂和性和广泛存在的不亲和性，利用生物技术进行遗传改良具有重要的意义。甘薯体细胞胚胎发 生是甘薯离体培养植株再生的主要途径( 凌定厚等，1 9 8 7 ；刘庆昌等，1 9 9 6 ：袁妙葆等，1 9 9 1 ；李 俊明，1 9 8 6 ) 。l i u 等( 2 0 0 1 ) 建立了1 7 个甘薯品种的胚性细胞悬浮系，在进行悬浮培养2 0 周时， 其植株再生率达到1 0 0 。利用这样的有效植株再生系进行遗传转化、原生质体融合和细胞诱变 等工作具有重要的意义。甘薯组织培养过程中也存在着体细胞无性系变异的现象，所以开展甘薯 体细胞无性系变异的研究，探讨体细胞无性系变异在甘薯上发生的机理、来源、影响因素，利用 有价值的变异体进行甘薯的品种改良，对于甘薯育种工作具有重要意义。 体细胞无性系变异是植物组织培养过程中的普遍现象，这已在多种植物上得到证实。变异所 涉及到的性状相当广泛，包括数量性状和质量性状的变化及生化特性的变化等。从体细胞无性系 变异类型、变异起源、影响因素及遗传机理等方面进行研究，必定能揭示出体细胞无性系变异的 本质，为通过体细胞无性系变异选育植物新品种奠定良好的理论基础。 1 1 体细胞无性系变异的类型 s k i r v i n 等( 1 9 8 嘴体细胞无性系变异分为可遗传的变异( h e r i t a b l ev a r i 蕊o n ) 和外遗传变异 ( e p i g e n e f i cv a r i a t i o n ) 两类。前者指可以在有性世代和无性繁殖世代稳定保持的变异，后者指不 仅在有性世代、有时甚至在无性世代也不能稳定保持的变异。外遗传变异也称发育变异 ( d e v e l o p m e n t a l v a r i a t i o n ) 或非遗传变异( n o n h e r i t a b l e v a r i a t i o n ) ，即由于外部影响导致基因表达 的改变，从而引起表型上的变异。 对于可遗传变异，又可根据无性系变异在r 2 代是否分离而分为纯合变异( h o m o z y g o u s v a r i a t i o n ) 和杂合变异( h e t e o z y g o u sv a r i a t i o n ) 。纯合变异在r 2 代及以后世代均不出现分离，而杂合 变异在r 2 代出现分离，但一般在以后世代可以稳定传递。据变异性状的基因作用对数可分为单 基因、双基因和多基因变异。亦可根据基因的显、隐性将无性系变异分为显性突变和隐性突变。 除了核基因突变外，细胞质基因也可能发生突变，如y o s h i d a 等( 1 9 9 8 ) 在水稻品种日本晴的花 培后代中获得两个高杆突变体b 4 2 _ 3 及b 4 2 _ 4 8 。b 4 2 习与原亲本正反交f 1 均为高杆。而b 4 2 _ 4 8 则不同，当以b 4 2 _ 4 8 为母本时，f 1 为高杆，为父本时则f 1 的株高与原亲本相同，说明具有细胞 质效应。 中国农业人学硕t 学位论文 l 文献综述 1 1 1 体细胞无性系变异的起源 一般认为，植物体细胞无性系变异的起源有二，一是外植体中业已存在的、于再生植株中表 现出来的变异( p r e - e x i s t i n gv a r i a t i o n ) ，另一则主要是组织培养过程中诱导产生的变异( i n d u c e d v a r i a t i o n ) 。 1 1 1 1 外植体中既存的变异 在进行组织培养中体细胞无性系变异的研究时，不同研究者所用的实验材料是各种各样的， 几乎包括了植物体所有的组织和器官，而只是少数作者对培养前外植体中细胞核的倍性作过检查 ( b e n n i c i 等，1 9 7 6 ；c i o n i n 等，1 9 7 8 ) 。根据现有的资料，在自然界中正常生长的植物体的某些组 织内，的确不同程度地存在自发产生的变异细胞多倍体、非整倍体和染色体结构变异。 1 多倍体 在已经研究过的所有裸子植物和约1 0 的被子植物中，其体细胞停止在正常二倍体的分化状 态。即细胞停止在下次分裂的d n a 合成期之前，d n a 含量为2 c 。而在大多数被子植物中，至 少部分体细胞在分化过程中发生了染色体多倍化。多倍化的程度可能因组织而异，同一组织内的 细胞之间也不一致( 8 c ，1 6 c ，3 2 ( 2 ，6 4 c 等) ( a m a t o ，1 9 5 2 ) 。分生组织细胞可以一直维持精确的二 倍体状态，即使不再分裂，也停止于2 c ( g 1 ) 的水平。如果外植体包括了以上这些不同倍性的细胞 群体，那么外植体细胞启动分裂时。理论上它们都有可能进入分裂周期。 2 同体异数体 有些植物的体细胞染色体数目变化范围很大，组织由含各种不同数目染色体的细胞构成，这 样的个体称为同体异数体( a n e u s o m a t y ) 。同体异数体现象在野生植物和栽培植物中均有发生。例 如，生长在新西兰的草地早熟禾( p 。口p r a t e n s i s ) 种群中，几乎所有的个体均为同体异数体 ( s p e c k m a n n 等，1 9 7 2 ) 。水鬼蕉( h y m e n o c a l l i sc a l a t h i n u m ) ( s n o d ，1 9 5 5 ) 和茶镳子( r i b e sn i g r u m ) w a a r a m ，1 9 4 9 ) 根尖细胞的染色体数目分别为2 3 8 3 条和4 3 2 条。这两种植物的花粉母细胞， 有的在分裂前期形成两个纺锤体，结果形成四个独立的染色体数目减少的子细胞。值得指出的是， 即使在草地早熟禾中，分生组织的有丝分裂过程也未发现任何异常现象。a m a t o ( 1 9 8 5 ) 推测，可 能是非整倍体细胞独自作为一个群体通过正常分裂过程而繁衍。 1 1 1 2 组织培养过程诱导产生的变异 组织培养过程诱导产生的变异，可分为自发无性系变异和诱导无性系变异两种。 自发无性系变异：在植物体细胞组织培养中，从离体的茎、叶或芽等组织、器官的培养中， 由胚状体或原生质体产生的植株，经常能发现某些植株在形态、性状等方面与原来亲本不同的变 异体，如株高、分蘖、穗长、千粒重等，这种变异体经人工选择培养，即可培育成作物新品种。 据知，这种自发变异的产生，可能与取材部位以及同一部位不同体细胞的自发变异有关；也可能 与在组织培养条件下培养基中的不同组成物质及其含量的影响有关。此外，机械损伤和温度等物 理因素以及细胞的代谢产物等皆可引起细胞自发突变。 诱变无性系变异：在植物组织或体细胞培养过程中，如果有目的地利用物理、化学因素对培 2 中国农业大学硕士学位论文 1 文献综述 养的植物组织或体细胞进行处理，诱发其遗传性状发生变异，然后根据育种目标对变异材料筛选、 鉴定、加工以培育新品种或新种质，这就是诱导无性系变异育种( 简称诱变育种) 。 1 _ 1 2 影响体细胞无性系变异的因素 一般认为体细胞无性系变异发生频率为1 3 ( s k i r v i n 等，1 9 9 4 ) ，但也有表型变异率高达 9 0 的报道，如香蕉( 王正询等，1 9 9 7 ) 。此外，一些农艺性状也会发生变异，如香蕉c a v e n d i s h 无性系变异中有8 0 属于矮化变异( i s r a e l i 等，1 9 9 6 ) 。m c m e a n s 等( 1 9 9 8 ) 发现苹果( m a l u s p u m i l a ) g a l a 和r o y a lg a l a 的离体再生植株比嫁接植株直立，丰产性有所下降。大量研究表明，影响植 物体细胞无性系变异频率的因素很多，包括源植株的基因型、外植体来源、生长调节物质及附加 物、离体培养时间及再生方式等( 陈纯贤等，1 9 9 4 ：刘进平等，2 0 0 1 ) 。但在不同植物上其研究 结果不尽相同，有时甚至相互矛盾。 i i 2 i 植株的基因型 研究表明，不同基因型体细胞无性系变异的频率不同，有些品种容易发生变异，而有的则不 易发生变异。如朱秀英等( 1 9 9 0 ) 齐j 2 0 个基因型水稻的成熟或未成熟胚无性系变异后代研究发现， 8 0 8 的无性系变异率高，而金早4 号最低。金润渊等( 1 9 9 1 ) 在耐冷突变体的研究中发现。品种 耐冷性变异频率与其供体的耐冷性有关，供体品种耐冷性愈强，其体细胞无性系中耐冷变异体愈 少，感冷变异体愈多：相反供体品种的耐冷性愈弱，其体细胞无性系中的耐冷突变体则愈多，感 冷变异体少。 陈举林等( 2 0 0 4 ) 通过5 个雄性不育材料再生植株及其后代的变异研究，结果标明，随着世 代的推进，其雄性不育发生株率由r l 代的3 1 3 6 增加到r 5 代的9 7 0 8 ，株型也趋于正常。不 同材料雄性不育株率的变异频率不同。刁现民等( 2 0 0 2 ) 用7 个谷子的优良品种的雌雄蕊形成期 的幼穗为外植体进行愈伤组织诱导及植株再生，发现不同基因型间r 2 株系变异频率差异很大，r 豫 谷1 号最低，为4 3 ；c 4 4 5 变异频率最高，达3 2 9 ，说明基因型对变异频率的影响很大。 1 1 2 2 外植体来源 来自同无性系的外植体( 如茎尖、腋芽等) ，在理论上其遗传物质组成是一致的，但由于 外植体中含有不同类型的细胞，如来自韧皮部薄壁组织、皮层及木质部薄壁组织，这些不同类型 的细胞可能在遗传物质构成上有些差异。茎尖、腋芽等具有分生组织的外植体，其变异率低于叶 片、裉段和茎段等未分化形成分生组织的外植体。受伤的外植体比未受伤害的外植体变异率高， 倍性高或染色体组染色体数目较多的外植体发生体细胞无性系变异的频率也较高。不同品种相同 外植体、同一品种的不同外植体及外植体的生理状态也明显影响变异率。 马国斌等( 2 0 0 3 ) 分别以西瓜未成熟种子子叶和幼苗子叶为外植体，对西瓜体细胞无性系变 异迸彳亍了研究，结果表明，在未成熟种子子叶的再生植株中除二倍体外还鉴定出了较高比率的四 倍体，没有发现更高倍数的多倍体；而在幼苗子叶的再生植株中只出现了二倍体没有发现四倍体。 在一部分被鉴定为二倍体或四倍体植株的根尖细胞中，虽大部分细胞为二倍体或四倍体细胞，但 也存在一定比率的亚倍体、四倍以上的多倍体( 六倍体l 倍体) 和超倍体细胞。a d e l b e r g 等( 1 9 9 0 ， 1 9 9 4 ) 对甜瓜子叶再生四倍体的条件进行研究，发现从子叶近胚端子叶组织再生的植株四倍体频 率显著高于从子叶其他部位再生的植株。郑瑞丰等( 1 9 9 7 ) 以成熟种子胚和幼穗为外植体进行组 织培养，得到的无性系后代在各个性状上都有一定的变异，并且幼穗培养总体较胚培养变异要大。 1 1 2 3 植物生长调节剂及附加物 生长调节剂种类和含量以及培养基中的附加物是影响体细胞无性系变异的重要因素之一。 2 ，4 _ d 是植物组织培养中常用的植物生长调节剂，被培养植物组织在含有2 ，4 _ d 等生长调节剂的 培养基中生长时间越长，越容易引起组堵后代的无性系变异。2 ，4 - d 和6 - _ b a 最容易诱导变异， 但它们的作用机制还不是很清楚( s h o e m a k e 等，1 9 9 1 ) 。m a y 和s i n k ( 1 9 9 5 ) 的研究结果表明，植 物细胞在含有2 冉- d 培养基上所形成的组培苗有明显的染色体组型异常现象，而在含有n a a 的 培养基上所形成的组培苗则染色体组型变异不明显。郭启高等( 2 0 0 0 ) 在对西瓜子叶离体培养过程 中，在芽再生培养基中仅添加6 - b a ，出现较高的四倍体诱导频率，通过对根尖细胞染色体数目 的检测，发现有些品种的四倍体诱导频率达4 0 - 5 0 。 k u m a r 等( 1 9 9 9 ) 发现利用m s 基本培养基，草莓( f r a g a r i aa l l a n a $ $ a ) 品种p o c a h o n t a s 在含 1 5 m m o l l j6 b a 的培养基上再生出的植株，其变异水平比在含5 , u m o l u 16 - - b a 的培养基上再生 的植株高。柠檬( c i t r u sl i m o n ) 品种f e m m i n e l l o 对干枯病( t r a c h e o m y c o t i cd i s e a s e ) 病原菌 p h o m a t r a c h e i p h i l a ( p e t t i ) k a n c e tg h i k | 较敏感。g e n t i l e 等( 1 9 9 3 ) 用干枯病的病原菌产生的毒素( 妇d ) 作选择 压。筛选出了抗病的f e m m i n e l l o 柠檬愈伤组织和植株。y o s h i d a 等( 1 9 9 8 ) 在水稻花药培养中发现， 在高渗透压的培养基上再生的植株二倍体比例增加。在含有2 9 2 m m o l l 1 的甘露糖醇的培养基上 单倍体、二倍体和多倍体的比例分别为3 7 、7 7 和3 ，而在4 3 8 m m o l l - 1 的甘露糖醇的培养基 上单倍体、二倍体和多倍体的比例分别为1 9 、8 3 和7 。 1 1 2 a 离体培养时间及再生方式 研究表明，随着胚性愈伤组织选择培养时间的延长和继代次数的增多，体细胞胚变异频率逐 渐升高，再生能力却逐渐下降。赖钟雄等( 2 0 0 1 ) 在龙眼的研究中发现，经过长期继代培养的龙 眼胚性愈伤组织，其中有少量的胚性愈伤组织团发生了染色体数目变异的现象。主要是由正常的 二倍体( 2 n = 2 x = 3 0 ) ，突变为三倍体( 2 n = 3 x = 6 0 ，2 n = 3 x = 4 5 ) 和四倍体( 2 n = 6 x = 6 0 ) ，其中以2 n = 3 x = 4 5 以及2 n = 4 x = 6 0 居多，而且还发现三倍体的细胞在染色体异常细胞中所占的比例较大。 y o s h i d a 等( 1 9 9 8 ) 在花药培养研究中发现，继代时间延长，再生植株中二倍体植株的比例增加。 不进行继代培养的植株中单倍体、二倍体和多倍体的比例分别为5 7 、4 3 和o ；继代4 6 周 愈伤组织植株再生中单倍体、= 倍体和多倍体的比例分别为2 0 、8 4 和3 ；而继代2 0 周的愈 伤组织植株再生中，这3 种倍性植株的比例分别为7 、8 5 和1 1 。同时发现，随着继代时间 延长，无性系后代的株高、抽穗期、穗长、穗重、穗数和子粒重6 个性状的变异率增加，继代2 0 周的无性系变异率为8 8 而继代4 6 周的无性系变异率为6 3 。m u l l e r 等( 1 9 9 0 ) 乖j 用r f l p 研 究不同培养时问对无性系变异的影响，发现长期培养( 6 7 d ) 的愈伤组织植株再生的r n 卫标记多态 性为2 3 ，而短期培养( 2 8d ) 的r f l p 标记多态性为6 3 ，长时间培养增加体细胞无性系d n a 的多态性。川棉2 3 9 胚性愈伤组织在培养6 个月、1 2 个月及1 8 个月时将获得的幼苗进行移栽， 成活后移入大田，对得到的植株进行分析发现，随着继代时问的延长，再生能力逐渐下降，畸形 胚发生频率和再生植株变异频率却逐渐增大f 薛美凤等，2 0 0 2 ) 。 4 中国农业大学硕士学位论文 1 文献综述 不同再生方式对体细胞无性系变异发生的频率也有影响。郑瑞丰等( 1 9 9 7 ) 以成熟种子胚为 外植体，用二种培养方式即胚培养直接成苗、胚经愈伤组织成苗。对无性后代在生育期、株高、 粒重及有效穗等方面的遗传变异的研究发现，各性状中以株高、有效穗的变异最大，其余性状均 有一定的变异。其中，胚培养直接成苗变异率要比胚经愈伤组织成苗低。y a m a g i s h i 和o t a n i ( 1 9 9 6 b ) 以t n o t o h l k a r i 的成熟胚为材料，研究结果表明，通过原生质体培养而来的植株中多倍体的频率 ( 3 3 7 0 ) 比直接由悬浮细胞再生而来的( 3 6 ) 高。刁现民等( 1 9 9 9 ) 用谷子雌雄蕊形成期 的幼穗为外植体进行不定芽途径植株直接再生和愈伤组织诱导，结果发现由幼穗经不定芽诱导再 生的植株在r ：代未发现变异系，而经愈伤组织培养后却出现了变异系。 1 1 2 5 生化因素 植物组织培养过程中的生化变异常被忽视，除非进行专门检验测试。在不同植物的组织培养 过程中，已有几种生物化学变异被鉴定出来了，有的还具有遗传性。如植物组培后代中碳代谢变 异引起的叶绿体光合能力下降、淀粉合成减少等现象，就是典型的生物化学变异。 1 1 2 6 培养过程中的理化因素 研究表明，在体细胞无性系变异过程中用理化因素处理可以提高雄性不育突变频率。不同品 种水稻在不同发育时期，用不同剂量的”7 c s q , 射线处理，结果发现，用剂量为2 5 8 库仑，千克( 1 0 0 0 伦琴，千克) 的”c s - ? 射线处理带绿点的愈伤组织效果最好，用离体诱变技术可以在短时间【2 3 年) 内产生水稻雄性不育系，而且诱发频率较高，平均为o s 6 ( 肖辉海等，2 0 0 3 ) 。 植物组织培养中的体细胞无性系变异是组培过程中不同因素综合作用的结果。植物的基因型 和组织器官的不同，组培后代的变异程度也不同，如菊花叶片组培后代中的变异机率高于花瓣组 培后代，而在花瓣组培后代中，不同的基因型之间的变异程度差别很大。对同一个组织或器官的 组织培养发现，不同的植物激素所引发的无性变异程度也有较大差异，如在苹果茎尖组织培养过 程中，高浓度的6 - b a 会诱导组培后代矮化。植物组织培养过程中植株的再生过程也是植物激素 的积累过程。般来讲，组培的增殖率( p r o l i f e r a t i o nm i e ) 越高，植物激素在植物体内的积累量也 相对较多，产生无性系变异的机率也就越大。菠萝繁殖率达到每月3 0 至5 0 株时，其变异率是不 可接受的；当繁殖率降为每月4 株时，其变异率就降到正常水平( s m i t h 等，1 9 9 0 ) 。 1 1 3 体细胞无性系变异的遗传基础 体细胞无性系变异的发生有其遗传学基础，具体表现在细胞水平上的染色体数目和结构变异 与分子水平上的基因突变、碱基修饰、基因扩增或丢失、基因重排以及转座子的激活而影响核及 细胞质基因的表达等。 1 1 3 1 体细胞无性系变异的细胞学基础 1 细胞的全能性 植物组织培养的理论基础是细胞的全能。眭( t o t i p o t e n c y ) ，即被分离的组织( 细胞) 在一定的条件 下具有分化形成新植物体的功能。植物组织培养的过程实质是细胞全能性的表达过程。为实现这 一过程植物已分化形成的细胞组织一外植体( e x p l a n t ) 先经脱分化( d e d j 彘n 出妇) 产生愈伤组织 5 ( c a l l u s ) ，然后愈伤组织进行再分化d i f f e r e l i a t i o n ) 产生植物器官并发育成新的植物体。理论上经 过组织培养后再生出的新的植株是一样的，因为它们的遗传背景是一样的。 2 体细胞无性系变异与愈伤组织和不定芽的关系 植物组织培养中体细胞无性系变异与愈伤组织的形成和不定芽的分化有密切关系。植物组织 培养过程中的器官形成需经两个发育阶段，这两个阶段的主要区别在于是否形成愈伤组织。新生 器官由愈伤组织诱导产生的阶段称为间接器官形成，即由植物组织( e x p l a n o - - - 愈伤组织( c a l l u s ) - * 拟分生组织( m e 积e m o i c l 卜器官原基( o r g a n p d m o r d i u m ) 。在这种由愈伤组织到器官形成的过程中， 增加了细胞内染色体变异的机率，从而导致无性系变异产生。而由植物组织一拟分生组织一器官 原基的直接器官形成过程，未经愈伤组织而直接由体细胞分化成器官，则可降低无性系变异机率。 由于愈伤组织形成和继代培养过程中，愈伤组织细胞处于相对无组织的单个独立状态，或联系松 散的团块状态，细胞对所处的物理和化学环境胁迫的缓冲适应能力差，细胞的d n a 复制和染色 体分裂在这种胁迫环境下，处在一种相对“慌乱”的状态，从而导致d n a 复制和染色体分裂错误。 刁现民等( 1 9 9 9 ) 在谷子的研究中发现，由幼穗经不定芽诱导再生的植株在r 2 代未发现变异系， 而经愈伤组织培养后却出现了变异系 另一方面，本研究中同一愈伤组织中形成的不同苗簇、不 同单株的变异与否表现不同，如c 1 有3 个苗簇，其c 1 2 发生了变异，而c 1 1 和c i - 3 未发生变 异；c 3 有5 个苗簇，c 3 1 为不育变异，c 3 4 却发生了穗长变异；c 4 形成7 个苗簇，只有c 4 - 5 发生了变异。同一原始愈伤组织来源的不同再生苗簇或单株，有的发生变异，有的不变异或出现 不同的变异，也说明变异发生在愈伤组织培养增殖过程中。可见只有经过外植体脱分化形成愈伤 组织和愈伤组织继代，才能形成明显的无性系变异。 3 体细胞胚胎发生 体细胞胚胎发生是高等植物的重要特性。植物的韧皮部，木质薄壁组织等部位的细胞都可形 成体细胞胚，进而分化形成植株。不同部位的体细胞分化形成的组培后代的变异程度也不同 ( s h r v i n ，1 9 9 3 ) 。另有研究表明，在植物细胞胚胎发育过程中，由胚前限定细胞( p r c e m b r y o g e n i c d e t e r m i n e dc e n s ) 直接发育成的体细胞胚一般可产生相对一致的无性系，即体细胞无性系变异机率 较小，而由诱导胚胎限定细胞( i n d u c e de m b r y o g e n i cd e t e r m i n e dc e l l s ) 发育成的胚胎细胞常会产生较 高的体细胞无性系变异。 4 体细胞无性系的细胞学变异染色体数目和结构变异 在组织培养过程中，由于细胞分裂繁殖的速度快，导致异染色质复制落后，结果引起在分裂 后期形成染色体桥及断裂，也可能由于染色体复制完成而不能及时分配到予细胞中而使染色体数 目增加，形成多倍体。因此无性系再生植株的细胞学变异，包括染色体数目和染色体结构变异两 个方面。染色体数目变异又包括倍性变异和非整倍体变异。小麦愈伤组织形成及植株再生过程中 以及马铃薯原生质体植株再生过程中，出现染色体数目的广泛变异( 吴鹤鸣等，1 9 9 2 ；李士生等， 1 9 9 1 ：李耿光，1 9 9 2 ：w i n f i e l d 等，1 9 9 3 ) 。马国斌等( 1 9 9 9 ) 用子叶、真叶和未成熟子叶分别做 外植体，诱导出的甜瓜再生植株的根尖细胞染色体数目均存在明显变异，在外植体的再生植株中， 除二倍体外，还鉴别出亚倍体、多倍体和超倍体。何欢乐等( 2 0 0 2 ) 以两个甜瓜品种为材料，经 6 中国农业大学硕士学位论文 1 文献综述 不定胚诱导再生植株发现，再生植株中存在一定的变异，随着继代培养时间的增加，染色体数目 变异率从3 3 增加到3 0 ，变异幅度也从2 n = 2 3 2 4 增加到2 n = 1 3 4 8 。单春华等( 2 0 0 2 ) 对草 莓的再生植株的研究中发现其体细胞约有2 0 发生染色体数目的变异，其中既有染色体数目的 增加，也有染色体数目的减少。黄素华等( 2 0 0 3 ) ) 6 j 荔枝胚性愈伤组织及其体细胞胚发生过程中的 培养物的染色体进行观察，除了正常的二倍体细胞外，也出现单倍体、三倍体、四倍体和非整倍 体变异的细胞。 a h l o o w a l i a 等( 1 9 8 5 ) 研究表明，小麦体细胞无性系s c 。代再生植株形态及产量发生明显变 异，经细胞学检测，有的无性系染色体数目发生很大变异，表现为非整倍体、多倍体和混倍体； 有的无性系染色体结构发生变异，除有单价体之外，还出现多价体，如三价体、四价体或五价体 以及异型二价体，后期i 染色体桥和染色体断片，这是染色体发生易位和缺失的结果。 在组织培养过程中常出现非整倍体，多数是由于多极纺锤体出现、染色体不分离或落后染色 体以及核裂等所致。 在一个分裂的细胞中如果出现三极或多极纺锤体时，必然导致染色体的不均衡分离与染色体 数目变异。胡含等( 1 9 8 2 ) 检查小麦花粉培养获得的愈伤组织及再生花粉植株根尖细胞染色体，由 于三极纺锤体的形成，使部分细胞成为非整倍体和混倍体。染色体的不分离或落后染色体等出现 在分裂后期，当细胞进入分裂末期，落后染色体或不分离的染色体留在一个子细胞内，就成为染 色体数多于母体细胞的超倍体细胞，而另一个细胞则为亚倍体细胞。m o h a n t y 等( 1 9 8 6 ) 检查玉米 愈伤组织细胞染色体，由于落后染色体和染色体分裂不同步等，导致形成了非整倍体和多倍体细 胞。 染色体的断裂和重组，也是植物组织和细胞培养物中经常观察到的一种现象任关林等，1 9 8 9 ； k a r p 等，1 9 8 4 ；f o r o u g h i - w h h t b 等，1 9 7 9 ) 。由于染色体断裂和重组，不仅可以使断裂或重组位 点处的基因及其功能的丢失，而且还可以使邻近的通常能够转录的那部分基因的功能发生变化， 或使未能表达的静止基因得以表达。例如，染色体的重组可以使控制性状的显性等位基因丢失或 停止表达，从而使隐性等位基因得以表达。s i m i n o v i t c h 认为这种现象是由于培养诱导的半合子体 的结果( l a r k i a 等，1 9 8 1 ) 。 据s u n d e r l a n d 报道，核裂经常导致双核出现。甚至像在红花菜豆的胚培养愈伤组织中那样， 双核细胞中7 0 有核裂现象。核裂出现频率较高的材料中，多倍体、亚多倍体和非整倍体细胞出 现的频率也相应的提高( 张冬生，1 9 8 9 ) 。 胡含( 1 9 8 2 ) 认为纺锤体融合和核内复制则产生加倍的整倍体或多倍体。在花粉愈伤组织发育 的晚期，可能发生不完全的胞质分裂，而产生各种异常的有丝分裂，其中纺锤体融合和核内复制 则导致产生加倍的整倍体或多倍体。 染色体结构变异主要是由于染色体断裂后经过修复和重新连结所形成的易位、倒位、缺失和 重复。在小麦( d a v i e s 等，1 9 8 6 ) 、水稻( 凌定厚等，1 9 8 7 ) 和大麦( 袁妙葆等，1 9 9 1 ) 的再生 植株中均发现有易位系的存在，说明染色体结构变异是存在的。张恩让等( 2 0 0 4 ) 在5 个大蒜品 种再生植株的染色体中出现了染色体桥、染色体粘连和交叉等现象。在无性系再生植株中，染色 体数目和结构变异越多其受的代谢损伤就越严重，生长势越弱，在育种中的实际应用价值就越 低。而且，在马铃薯、甘蔗、小麦和水稻的众多表型发生变异的无性系中，它们的染色体数目和 结构并未发生变化。说明细胞学的变异只能解释少数较极端的无性系变异而更多的无性系变异 7 则可能是d n a 水平上的变异。 1 1 3 2 体细胞无性系变异的分子基础 1 基因突变 所谓基因突变是指d n a 序列中碱基发生了变化，导致由一种遗传状态转变为另一种遗传状 态。基因突变被认为是体细胞无性系变异的重要来源之- - ( k h a l i d 等，1 9 8 9 ) 。植物组织和细胞经 离体培养后，经过愈伤组织的脱分化和再分化过程，常常会引起基因发生突变。单基因突变在许 多作物上已表现出来，并且大多数是可稳定遗传的。对玉米( b e n z i o n 等，1 9 8 6 ) 、烟草( e v a n t ，1 9 7 6 ) 和水稻( y o s h i d a ，1 9 9 8 ) 的观察表明，单基因突变的再生植物后代表现出典型的孟德尔隐性遗传。 l a r k i n 等( 1 9 8 4 ) 研究表明，小麦体细胞无性系再生植株后代籽粒颜色和芒长的变化是由显性基因 突变成隐性基因造成的，而麦醇溶蛋白谱带的变化则是由隐性基因突变成显性基因或共显性的结 果。张怀刚等( 1 9 9 7 ) 对通过小麦幼穗为外植体，在未添加诱变剂的m s 培养基上离体培养出的 植抹进行检测，发现控制小麦高分子量谷蛋白亚基g 缸j 基因的g l u a i 和g u b 1 位点都发生了 突变，且发现同源染色体的等位基因易发生相同突变，突变体多是纯合基因型。 近年来，分子生物学技术被用来检测这种单基因突变。b r e t t e l l 等( 1 9 8 6 ) 从玉米再生植株中 提取出d n a ，通过s o u t h e r n b l o t 分析，发现一