（内科学专业论文）蛋白质微阵列生产用琼脂糖修饰玻片制备的条件优化.pdf

中文摘要 中文摘要 蛋白质微阵列生产用琼脂糖修饰玻片制备的条件优化 东南大学医学院附属中大医院肾内科 研究生金世辉导师刘必成 目 的：蛋白质微阵列载体的选择和表面修饰是影响微阵列质量的关键因素之一，蛋白 质微阵列载体不但要能固定足够量的蛋白质还要使固定在其表面的蛋白质保持天然活 性。在过去的研究中发现，琼指糖膜具有三维多孔结构，经过水化后在其内部形成丫固 液状态的水凝胶结构，这种三维、多孔结构以及湿润的微环境不但能固定足够的蛋白 质同时呵以防止蛋白质变性失活。该实验的目的就是以琼脂糖修饰的玻片作为蛋白质微 阵列载体，建立一种以琼脂糖修饰玻片为载体的蛋白质微阵列制备的优化方法。并比较 琼脂糖修饰玻片和醛基修饰玻片以及氨基修饰玻片对蛋白质固定效率的优劣。 方法：配制不同浓度的琼脂糖溶液，加热沸腾后铺在洁净的玻片上，烘箱烤干后制成 微阵列载体。将羊i g g 固定在经过活化的载体表面，经过洗涤、判闭，再加入c y 3 标记 的兔抗羊i g g ，孵育，洗涤后用共聚焦激光扫描仪获取图像，检测各点的荧光强度，根 据荧光强度确定最佳琼脂糖浓度，最佳n a l 0 4 浓度，最佳固定时间以及封闭时问等实验 条件，并和醛基修饰表面以及氨基修饰表面进行比较。 结果：当琼脂糖浓度为1 2 、n a l 0 4 浓度为2 0 m m o l l 、固定时间为l 小时、孵育时间 为4 5 分钟时，蛋白质在载体上的固定效率和反应活性最高。在固定的抗体浓度相同的 情况下琼脂糖修饰玻片荧光强度是醛基修饰玻片的2 6 倍，是氨基修饰玻片的9 倍。 结论：本实验确立了蛋白质微阵列生产用琼脂糖修饰玻片制各的优化条件，用该优化条 件制备的琼脂糖玻片更适合用于蛋白质微阵列载体。 关键词：蛋白质微阵列；载体；琼脂糖。 1 l 英文摘要 e n g l i s h a b s t r a c t 0 p t i m i z i n g0 ft h ep r e p a r a t i o nc o n d i t i o no f a g a r o s em o d i f i e dg l a s ss l i d ef o rt h e p r o d u c t l 0 n0 fp r o t e i nm i c r o a rra y s i n s t i t u t eo fn e p h r o l o g y ，z h o n gd ah o s p i t a l ，s o u t h e a s tu n i v e r s i t ys c h o o i o fm e d i c i n e ，n a n j i n g ，2 1 0 0 0 9 ，c h i n a c a n d i d a t e ：j i ns h i - h u i s u p e n ，i s o r ：p r o f e s s o rl i ub i c h e n g 0 b j e c t i v ee 伍c i e mi r m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e si sak e yf a c t o ri nd e t e r m i n i n gt h e o v e r a l ls u c c e s so fap r o t e i nm i c r ( ) a r r a y m o s to ft h em i c m a 盯a y sa r eb a s e do ns u r f a c c sa 1 1 d f o m l a t st h a th a v e b e e nu s e df o rd n aa r r a y s ， g l a s ss l i d e sc o a t e d b ye p o x y o r a l d e h v d e t e r m i n a t e da l k y l s i l a n e so rb yp o l y l y s i n ec a na l s ob eu s e dt oi 1 m o b i l i z ep r o t e i n s ， a n t i b o d i e sa i l da i l t i g e n s b u tp r o t e i ni m m o b i l e z e do nm e s es l l r f a c e st u r n st od e n a t u r e a g a m s e 丘l mh a sat h r e e d e m e n s i o n a ls t n 】c t u r ew i mt i n yp o r e si ni t t h i sp o r o u ss t n l c t u r ee n a b 】e s a g a r o s e 丘l mt oh o l dm u c hm o r ep r o t e i nm o l e c u k sa n dw a t e ra sw e l l s oa g a r o s ef i l mc o a t e d g l a s ss l i d e sn o to n l yh a v eab i gp r o t e i nl o a d i n gc a p a c i t yb u tc a nm i n i m i z et h ed e n a t u r a t i o no f 血ei m m o b i l i z e dp r o t e i n t h i ss t u d yi st oe s t a b l i s ha no p t l i n i z e dm e t h o df o rp r c p a r i n gp r o t e i n m i c m a r r a yu s i n ga g a r o s e 例mc o a t e d9 1 a s ss l i d e sa i l dc o m p a r ei t sp r o t e i ni m m o b i l i z a t i o n e m c i e n c yw i t ha l d e h y d eg l a s ss l i d ea n da m i n og l a s ss l i d e m e t h o d sc l e a n2 l a s ss l i d e sa r ec o a t e d 、v i md i 虢r e n tc o n c e n t r a t i o no fa g a r o s em m ， g o a ti g gw a si m m o b i l i z e do m ot h es u r f a c eo ft h ea g a r o s em o d i f i e dg l a s ss l i d eb ya m i c m a r r a ya r r a y e la f t e rw a s h i n go f rt h e 吼b o u n dp m t e i na n db l o c k i n gt h er e a c t i v eg m u po n t h es u 渤c e s ，c y 3 - c o n j u g a t e da 1 1 t i - g o a ti g gw a sa d d e d a f t e r i n c u b a t i n w a s ha g a i nb e f o r e t h es l i d e sw e r es c a n n e dw i t hi a s e rc o n f b c a ls c a n n e r t h eo p t i m a la g a r o s ec o n c e n t r a t i o n ， n a l 0 4c o n c e n t r a t i o n ， i m m o b i l i z i n gt i m e ，i n c u b a t i n gt i m ew e r ed e t e r m i n e db ya v e r a g es p o t s i 口a li n t e n s i t i e s t h ep r o t e i nl o a d i n gc 印a c i t yo ft l l ep r o t e i nm i c r o a r r ys p o u e do nt h r e e d i 疵r e n ts u b s t r a t e sw e r ei n v e s t i g a t e da n dc o m p a r e d r e s u i j t sw h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fa g a r o s ea n dn a l 0 4 啪s1 2 a n d2 0 m l l r e s p c c t i v e l ya n d t h ei m m o b i l i z i n gt i m ew a so n eh o u r ，m ei n c u b a t i n gt i m ew a s4 5m i n u t e st h e a g a r o s ec o a t e dm a s ss l i d e sb a s e dp r o t e i nm i c r o a m yp e r f 0 n e dt l l eb e s t a n di th a da2 6 f o l d a 1 1 d9f o l dl l i 曲e rp r o t e i n1 0 a d i n gc a p a c 毋l a l la l d c h y d eg l a s ss l i d e sa n d 锄i n og l a s ss l i d e s b a s e dm i c r o a r m y s c o n c l u s i o nt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sh a sb e e ne s 诅b l i s h e da n dt h ea g a r o s ef i l m c o a t e dg l a s ss l i d e sa r em o r es u i t a b l ef o rp r o t e i nm i c r o a r r a yp r e p a r a t i o n k e yw o r d sp r o t e i nm i c r o a r r a y ；s u b s t m t e ；a g a r o s ef i l mc o a t e dg l a s ss l i d e s i i i 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：缝丝痉日期：堕! ! ! ! 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研 究生院办理。 研究生签名：金鲨蠲：导师签名 日期：拉。占，【f 刚茜 ) 1 刖舌 蛋白质微阵列是在d n a 微阵列技术基础上发展起来的以蛋白质为研究对象的一项新 技术，该技术具有平行性、高通量、灵敏度高、样品用量少、检测速度快等优点。随 着人类后基因组的到来，人们开始着眼于对蛋白质进行更深入的研究。而蛋白质微阵列 作为一项有力的蛋白质研究工具而受到人们的重视，近年来许多作者利用蛋白质微阵列 技术进行了基础及临床研究。如k o 乜1 和b e i o r 。”等用抗体蛋白质微阵列对细胞表型的变 化进行了研究；w a n g 等h 1 用前列腺组织特异性单克隆抗体制成抗体蛋白质微阵列结合 s e l d i ( s u r f a c e e n h a n c e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ) 技术找到并鉴定了前列腺组 织特异性膜抗原；t a m 畸1 和l i n 畸1 等用抗体微阵列研究了细胞因子的变化；m i l l e r 等口1 用 蛋白质微阵列鉴别出了5 种在前列腺癌患者血清中表达有显著差异的蛋白质；c u o 等哺1 用 蛋白质微阵列对血清中的肌钙蛋白i 进行检测，检测灵敏度达到1 n g m l ，为急性心肌梗 死的早期快速诊断提供了一种简便有效的辅助手段。许多作者还用该技术进行了蛋白质 组学研究1 0 1 。 但相比d n a ，蛋白质的化学成分、结构和功能更为复杂多变。固定在微阵列载体表 面的蛋白质容易变性失活，因此，寻找合适的载体和表面修饰方法以使单位面积上固定 足够量的蛋白质并保持其天然构象成为研制蛋白质微阵列的关键步骤之一瞄1 。近年来人 们尝试了多种微阵列载体包括滤膜、塑料、玻片、金属膜等。 各种滤膜如硝酸纤维膜、聚偏氟乙烯膜( p v d f ) 以及聚苯乙烯塑料等是以物理吸附 的方式将蛋白质固定在其表面的。这类载体应用很广，并且操作安全简单，但是蛋白质 在膜或塑料板表面的物理吸附机制还不十分明确，通常认为与疏水作用有关，而且这种 作用力很弱，所以蛋白固定不够牢固，在后续实验过程中，容易被洗脱；同时，由于疏 水作用，蛋白质容易变性失活：物理吸附方法还有敏感性低，精度差，可导致分子构象 发生变化等缺点。 玻片由于具有廉价、表面光滑、荧光背景低、性能稳定等诸多优点1 ，已经成为d n a 微阵列最常用的载体。现在玻片也广泛应用于蛋白质微阵列的制作。要使蛋白质样品固 定在玻片载体表面，必须先对玻片表面进行物理、化学修饰，通过引入活性基团使玻片 表面可以和蛋白质的某些基团结合，从而使蛋白质固定在其表面。玻片表面修饰可大致 分为两类n 2m 1 ：二维表面修饰，三维表面修饰。 l 查堕奎兰堡三! 三兰垡笙茎 聚赖氨酸修饰、氨基修饰、醛基修饰、环氧基修饰、链霉亲合素修饰等都可以归为 二维表面修饰。由于是通过共价键或特殊分子间的高亲合力把蛋白质固定在其表面，所 以该类载体对蛋白质的固定牢固，蛋白质的构象变化较少，有利于保持蛋白质的天然活 性3 。二维表面修饰的载体制作相对简单，点样点密度较高。但是该类载体对蛋白质的 固定量仍不理想，固定在上面的蛋白质溶液容易蒸发而导致蛋白质变性。 三维表面修饰是在玻片表面包被一层凝胶或树突状多聚物，这些凝胶或多聚物又可 以通过化学反应引入活性基团。以共价结合和物理吸附的方式把蛋白固定在载体表面。 这种三维结构的载体对蛋白质的固定量比二维平面载体大得多，而且凝胶的固一液环境 使固定在上面的蛋白质不易失去活性。 所以三维修饰表面是近年来较受注目的一种修饰方法，近来不少实验也证实三维凝 胶修饰表面对蛋白的固定量比二维表面修饰的固定量显著提高，而且固定在其上面的蛋 白质更大限度地保持了天然构象和活性。琼脂糖是从海藻中提取的多聚糖，可以和水组 成任意比加热后溶解，广泛用于生命科学实验研究n5 1 。在玻片上包被一层琼脂糖膜成为 微阵列载体，这种载体不但制作简单，成本低廉，和现有的d n a 微阵列检测系统相兼容， 而且荧光背景低。同时凝胶的多孔结构以及其固液特性最大限度地保持了固定在上面 的蛋白质的天然构象和活性。该实验就是选用具有三维表面结构的琼脂糖修饰玻片作为 载体，建立制备该载体的最优化条件，并和醛基修饰玻片以及氨基修饰玻片这两种常用 的二维修饰方法进行比较，衡量其对蛋白质固定效率的优越，从而为蛋白质微阵列载体 的选择提供进一步的理论依据。 文献综述 文献综述 随着人类基因组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e c th g p ) 的提前完成，一个以蛋白质 为中心的后基因组时代也就是蛋白质组时代已经到来n 引。为了在蛋白质水平上对各种生 物学功能以及各种疾病的发生机理更为全面了解，人们的研究重点在逐渐转向于用各种 基于蛋白质的检测手段来研究蛋白质的结构、功能、翻译后修饰以及蛋白质之间的相互 作用n 引。蛋白质微阵列技术就是近年来兴起的一项以蛋白质为研究对象的新技术n8 。蛋 白质微阵列技术具有平行性、高通量、灵敏度高、样品用量少、检测速度快等优点。 但相比d n a ，蛋白质的化学成分、结构和功能更为复杂多变。固定在微阵列载体表面的 蛋白质容易变性失活，因此，寻找合适的载体和表面修饰方法以使单位面积上固定足够 量的蛋白质并保持其天然构象成为研制蛋白质微阵列的关键步骤之一n 引。近年来人们尝 试了多种微阵列载体包括滤膜、塑料、玻片、金属膜等，以下就各种载体以及其表面修 饰技术做一综述。 l 塑料和滤膜 各种滤膜如硝酸纤维膜、聚偏氟乙烯膜( p v d f ) 以及聚苯乙烯塑料等是蛋白质微阵 列最简单也是较早使用的载体。这类载体具有来源广泛，价格便宜，操作简单等优点， 此类载体通过简单的物理吸附把蛋白质固定在其表面，所以不需要特殊的表面处理，而 且固定量较大乜引。所以有相当部分研究单位和公司以这类材料作为载体，如美国 b i o r a y t e c h 公司出售的细胞因子微阵列就是以膜为载体的乜。 h u a n g 乜2 1 用h y b o n de c l 膜为载体，制作了能同时检测六种细胞因子的抗体微阵列， 不但有着很好的特异性，敏感度也达到了p g m 1 ，其中对白介素一2 ( i l 一2 ) 的检测限达 到2 5p g m 1 。 用聚苯乙烯塑料制成的9 6 孔板也常被用来作为蛋白质微阵列载体乜引。m 0 0 d 等幢4 1 以 9 6 孔板为载体，利用免疫夹心法的原理研制了一种可以在一个孔内同时检测7 种细胞因 子的微阵列。s i l z e l 等乜5 1 以同样的方法把不同亚型的i g g 固定在聚苯乙烯载体表面制成 的微阵列显示出了和传统e l i s a 相似的敏感性和特异性，而且样品用量大大减少，所需 抗体量仅仅是e l 工s a 的1 1 0 0 。 然而，这类载体的缺点也是显而易见的乜0 ，首先，由于蛋白质是物理吸附在载体表 面的，所以固定不够牢固，在后续实验过程中，容易被洗脱；其次，点在膜上面的蛋白 质样品溶液容易发生扩散导致不同蛋白质之间相互干扰，所以这些膜的表面往往不能满 不雨大学坝士学位论文 足蛋白质微阵列高密度的要求，再次，塑料载体的疏水表面使吸附在上面的蛋白质更容 易变性，从而使固定在上面的蛋白质活性大大减弱：最后，物理吸附过程不易控制， 不同蛋白质的吸附能力不同，信躁比也较低。 最近一项研究乜7 3 通过测量全血中的细胞因子比较了以膜为载体的蛋白质微阵列和 传统的e l i s a 两种方法，发现在用e l i s a 测定1 6 种细胞因子时，只有工f n y 在最低检测限 以下，其他1 5 种都能测出，而当用膜微阵列测定2 0 个细胞因子时，只有i l 一6 ，i l 一8 ，m i p l b 能够测得结果。这说明在对复杂的生物样品如血清进行测量时以膜为载体的蛋白质微 阵列仍缺乏足够的敏感性。以上种种不足限制了这类载体在蛋白质微阵列领域中的应 用。其他生物相容性更好的载体正在逐步取代这类载体。 2 玻片及其表面修饰方法 玻片由于具有廉价、表面光滑、低荧光背景、性能稳定等优点乜引，已经被广泛应用 于蛋白质微阵列的制作。要使蛋白质样品固定在玻片载体表面，必须先对玻片表面进行 物理、化学修饰。玻片表面的物理化学修饰可大致分为两类乜引：二维表面修饰，三维表 面修饰。 2 1 二维表面修饰 以玻片为载体的二维表面修饰如聚赖氨酸修饰，氨基修饰，醛基修饰，环氧基修饰， 链霉亲合素修饰等都可以归为此类。这类载体大部分通过共价键或特殊分子间的高亲合 力把蛋白质固定在其表面，所以蛋白质结合牢固，由于蛋白质通过少数共价键而固定在 载体上，蛋白质的构象变化较少，有利于保持蛋白质的天然活性口引。聚赖氨酸修饰玻片 虽然不是通过共价键固定蛋白质的，但由于聚赖氨酸修饰玻片广泛地作为d n a 微阵列的 载体，且制作简单，具有较高的信躁比，以及均一的点样形态等优点，仍有许多蛋白质 微阵列以聚赖氨酸修饰玻片作为载体b 。例如，t a n g 等口2 1 比较了氨基修饰玻片、聚赖 氨酸修饰玻片和琼脂糖修饰玻片，他们先在载体上点样不同浓度的人工g g ，然后再用c y 3 标记的兔抗人i g g 做为检测分子和人i g g 结合，激光共聚焦扫描仪获取图像，结果发现聚 赖氨酸修饰的玻片背景最低，且在一定人工g g 浓度范围内，聚赖氨酸修饰玻片显示了更 好的荧光强度一浓度相关性。a n g e n e n d t 等妇通过比较多种载体以及其表面修饰方法发 现，聚赖氨酸修饰的玻片上点样点的形态比较均一，点间变异系数( 1 1 ) 小于其他载 体和表面修饰方法( 如聚丙烯酰胺凝胶载体在没有经过p b s 预先处理时点间变异达3 7 ) 。 但是聚赖氨酸修饰玻片同其他二维载体表面一样，敏感度不佳，最低检测限较高。h a a b 等乜3 1 报道了用聚赖氨酸修饰玻片为载体的抗体微阵列来研究1 1 5 对抗原抗体的相互作 4 文献综述 用，但在玻片表面固定抗体时拖尾现象很明显，而且在点的内部抗体的分布也是不均匀 的，微阵列表面蛋白质样品点样形态的不均匀可以产生交叉反应，影响结果的正确性和 精确性。特别是当把成百上千种不同的抗体高密度地固定在载体表面时，这一因素对实 验的影响更为突出。 醛基修饰玻片也是在d n a 微阵列中广泛应用的载体，现在这一方法也在蛋白质微阵 列中的到了应用。该方法通过醛基和蛋白质上的氨基形成s c h i f f 碱而把蛋白质共价固定 到载体表面，由于蛋白质表面通常含有多个氨基，这些基团都能和载体表面的醛基结合， 所以蛋白质在表面的固定是无序的，这使固定在上面的抗体能够和各个方位的待测抗原 物质结合。玻片表面上未反应的醛基用小牛血清白蛋白( b s a ) 封闭，同时在载体表面 形成的b s a 分子层作为分子屏障防止了其他分子和微阵列载体的非特异性结合。 m a c b e a t h 和s c h r e i b e r 口钉在醛基修饰的玻片上以每c m 2 1 6 0 0 点的密度点样三种不同的抗 体，研究了抗原抗体之间的相互作用，验证了微阵列的特异性和敏感性。但是用b s a 封 闭后，由于b s a 分子层的屏障作用，阻碍了小分子物质和微阵列上探针的结合，为了克 服这一点，m a c b e a t h 和s c h r e i b e r 先在载体表面结合一层b s a 分子，然后用n ，n 一二琥 珀酰胺碳酸( n ，n7 一d i s u c c i n i m i d y lc a r b o n a t e ) 进行活化，b s a 上的赖氨酸，天门冬 氨酸，谷氨酸残基活化后可以和小分子物质上的氨基共价结合而把蛋白质探针固定在载 体上面，然后再用甘氨酸封闭未反应的活性基团，他们用这种载体研究了酶和底物以及 蛋白质和小分子物质间的作用。 环氧基修饰玻片是一类较新的蛋白质微阵列载体，其表面的环氧基活性很强，不但 可以和氨基反应，还可以和蛋白质表面的其他基团如羟基、巯基、羧基等反应口引。 k u s n e z o w 等3 6 1 通过对经过氨丙基三甲氧基硅烷( a m i n o p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n ea p t s ) ， 巯丙基三甲氧基硅烷( m e r c a p t o p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n em p t s ) 丙基三甲氧基硅烷 ( g l y c i d o x y p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n eg p t s ) 和多聚赖氨酸修饰的7 0 0 多张玻片进行了 详细的比较分析，结果各种玻片表面修饰方法中，经2 5 丙基三甲氧基硅烷处理的环氧 基玻片最为理想。 总的来讲，二维表面修饰的载体制作相对简单，点样点形态较为均一，在目前应用 比较广泛。但是该类载体对蛋白质的固定量仍不理想，固定在上面的蛋白质容易变性。 2 2 三维表面修饰 在玻片表面包被一层凝胶或树突状多聚物，然后再在这些基质上引入活性基团，从 而在玻片表面形成了三维立体结构。这种三维结构的载体相比二维载体表面有以下几个 气 东南大学硕士学位论文 优点：首先，由于三维多孔结构，载体表面和蛋白质的接触面积大大增加，从而对蛋白 质的固定量也比二维平面载体大得多；其次，凝胶内的湿润微环境使固定在上面的蛋白 质溶液不易蒸发，从而更好地保持了蛋白质的活性减少了蛋白质的变性失活。 m i r z a b e k o v 等7 1 用聚丙烯酰胺在玻片表面构建了具有三维立体结构的凝胶微阵列 载体，他们把含有一种连结分子的3 聚丙烯酰胺溶液铺在硅烷化的玻片上，然后在其表 面覆盖一层紫外线隔离膜，隔离膜上整齐排列了多个l o o 1 0 0um 的正方形小窗口，然 后置于紫外线下照射使暴露的聚丙烯酰胺凝固，未凝固的聚丙烯酰胺用水冲洗掉，从而 在玻片表面上构建了整齐排列的1 0 0 1 0 0 2 0um 大小的聚丙烯酰胺凝胶小块，这些凝 胶块之间相隔2 0 0um 。玻片上的聚丙烯酰胺凝胶经过戊二醛活化引入醛基，蛋白质或 抗体就可以通过聚丙烯酰胺上的醛基而固定在载体上。该蛋白质微阵列不但可以研究抗 原抗体反应，还可以研究酶和底物的相互作用。而且由于这些凝胶块互不相连，点在不 同凝胶块表面的蛋白质样品不会出现交叉反应。 m i l l e r 等m 1 在聚丙烯酰胺包被的玻片( a c r y l a m i d e _ b a s e dh y d r o g e l 刊) 和连接 有感光分子( l h y d r o x y s u c c i n i m i d e 一4 一a z i d o b e n z o a t eh s a b ) 的聚赖氨酸修饰玻片 ( p o l y l 一1 y s i n e h s a bs l i d e s ) 上点样1 8 4 种抗体制成抗体蛋白质微阵列，结果发现以 聚丙烯酰氨包被玻片为载体的微阵列产生的信一躁比是聚赖氨酸的6 倍，而且前者的检测 灵敏度也大大高于后者，前者能检测出样品中的7 8 种抗原物质，而后者只能检测出2 3 种。 y u 口们等先在玻片上包被一层琼脂糖膜，然后用高碘酸钠( n a i o 。) 把琼脂糖上的羟基 氧化为醛基，再在此基础上引入双功能基团分子戊二醛，戊二醛上一端的醛基就可以和 蛋白质上的氨基形成s h i f f 碱从而把蛋白质固定在载体表面。 然而，这种三维结构的表面修饰载体荧光背景较强口2 l 。其中重要的原因之一就是该 载体的三维多孔结构使非特异性结合的蛋白质滞留在其中不易洗脱，同时这些三维结构 的载体本身就具有较高的荧光背景。 三维修饰表面是近年来较受注目的一种修饰方法，显著增加的蛋白质固定量以及有 利于保持蛋白质活性是这类载体的主要优点。但该类载体制作复杂，不同实验之间以及 同一实验内部变异较大n 0 j 。 3 金膜以及分子自组装技术 近年来，分子自组装技术( s e l f a s s e m b l yt e c h n 0 1 0 9 ys a m ) 在生物芯片以及生物 传感器领域愈加受到人们的重视。所谓分子自组装就是分子与分子在一定条件下依赖非 文献综述 共价键分子间作用力( 氢键、范德华力、静电力、疏水作用力、一堆积作用、阳离子 一兀吸附作用等) 自发连接成结构稳定、高度有序的分子聚集体的过程h 1 。根据载体的不 同可以选择相应的表面活性剂、两性分子以及溶液介质，在金膜、银膜、二氧化硅等表 面上自组装一层或多层自组装分子膜h 引。其中由于金膜容易制作，性质稳定，可以引入 不同的功能分子等特点而广泛应用于分子自组装技术。在金膜表面可以自组装单层自组 装膜或逐层自组装膜，这些膜上的功能分子的活性基团就可以和蛋白质表面的活性基团 共价结合从而把蛋白质固定在载体表面。 k n 0 1 l 等n 在金膜表面先用含有羧基的硫醇化合物自组装一层单分子膜，再用一端 带有氨基另一端带有生物素分子的双功能分子通过羧基和氨基的共价结合构建另一层 自组装分子层，然后利用链霉亲合素和生物素的亲和作用再连结一层链霉亲合素。那么 这种载体可以把带有生物素标记的抗原或抗体固定在其表面。 然而，这种直接在金属膜上通过分子自组装技术构建的载体同样是二维的，也存在 着点样在上面的蛋白质容易变性的问题，因此有些研究单位和公司着眼于在三维平面上 进行分子自组装，进行载体表面修饰。这样的三维结构的载体表面和生物样品的接触面 积增大，可以固定更多的蛋白质，而且这种三维载体的湿润环境更能保持蛋白质的天然 活性。这些三维结构的基质通常是多孔金、凝胶、多聚物等。 b e n t e r s 等h 们构造了一种树突状三维活性表面。他们先在玻片上用氨丙基三乙氧基 硅烷( a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e ) 进行硅烷化引入氨基，再通过氨基结合一个双功能 分子d i s u c c i n i m i d y l g l u t a r a t e ( d s g ) 或l ，4 一p h e n y l e n e d i i s o t h i o c y a n a t e ( p d 工t c ) ，然 后连结上表面带有6 4 个伯氨基的星形的树突状分子，这些树突状分子再次连结上d s g 或 p d i t c 分子作为手臂分子。他们在该载体表面点样链菌亲合素蛋白，然后和c y 3 标记的双 链d n a 一生物素探针结合，结果显示点样形态高度均一。 但这类载体荧光背景较强，其原因之一是点样点以外的区域和蛋白质的非特异性结 合较明显，为了解决这一问题，也为了减少点样的蛋白质溶液向相临区域扩散，z h o u 等 n 5 1 在三维凝胶表面铺上一层临时的疏水分子屏障，在蛋白质固定后，这种疏水分子屏障 又能被洗去。 尽管以金膜为载体的分子自组装技术是一种更为理想的蛋白质微阵列载体，但是分 子自组装技术复杂，载体通常采用金、银、铂等贵重金属，同时对这些载体表面的平整 度等要求也很高，自组装分子需要在溶液中完成自组装过程，而溶液的种类、温度、p h 值等都对自组装膜有着直接的影响h 6 1 所以采用这类载体制作的蛋白质微阵列较昂贵， 东南大学硕士学位论文 还不适合大范围应用。 3 本实验要解决的问题 综上所述，至今为止还没有一种载体能够满足所有要求，人们在选择某种载体的时 候要充分考虑到该载体的优缺点以及其适用范围。由于三维凝胶修饰表面不但对蛋白质 的固定量较大，而且有利于保持蛋白质的天然活性，能够满足大多数蛋白质微阵列载体 的要求，是近年来较受关注的一种修饰方法。琼脂糖是从海藻中提取的多聚糖，可以和 水组成任意比加热后溶解，广泛用于生命科学实验研究n5 。在玻片上包被一层琼脂糖膜 成为微阵列载体，这种载体不但制作简单，成本低廉，和现有的d n a 微阵列检测系统相 兼容，而且荧光背景低。同时凝胶的固液特性最大限度的保持了固定在上面的蛋白质 的天然构象和活性。人们正在尝试利用该载体构建蛋白质微阵列，该实验就是要选用具 有三维表面结构的琼脂糖修饰玻片作为载体，建立制备该载体的最优化条件，并和醛基 修饰玻片以及氨基修饰玻片进行比较，衡量其对蛋白质固定效率的优劣，从而为蛋白质 微阵列载体的选择提供进一步的理论依据。 材料和方法 1 1 主要试剂 材料和方法 1 1 1 小牛血清白蛋白( b s a ) ：武汉博士德公司分装。 1 1 2 琼脂糖：美国s i g m a 公司。 1 1 _ 3 羊i g g ：北京中山生物公司。 1 1 4 c y 3 标记兔抗羊i g g ：美国s i g m a 公司，武汉博士德分装 1 1 5 高碘酸钠：n a l 0 4 分析纯，上海试剂厂。 1 1 6 戊二醛：分析纯，上海试剂厂。 1 1 7 丙三醇：分析纯，南京化学试剂厂。 1 1 8 试剂配制用水为m i l l i q 超纯水。 1 1 9 3 - a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e ：美国s i g m a 公司。 1 1 1 0 磷酸盐缓冲液( p h o s p h o r i t i sb u 行e rs o l u t i o n ，p b s ，0 o i m o l l ，p h7 4 ) ：称取n a c l8 9 ， k c l o 2 9 ， n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 03 4 9 9 ，k h 2 p 0 40 2 9 溶于5 0 0m l 双蒸水中，充分搅 拌、混匀，测p h 值7 4 ，定容至1 0 0 0 m l ，备用。 1 2 主要器材 1 2 1 p i x s y s 5 5 0 0 点样仪：c m p 3 点针c a r t e s i a nt e c h 工n c 1 2 2 扫描仪( s c a n a r r a y 5 0 0 0 ) ：美国p a c k a r db i o s c i e n c e 公司。 1 2 3 微型离心机：e p p e n d o r f 公司。 1 2 4 摇床：南京大学生产。 1 2 5 电子分析天平( f 4 1 0 0 4 ) ：上海精科天平仪器公司。 1 2 6 可调取液器2 “12 0 12 0 0 ml o o o 1 ：法国e p p e n d o r f 公司。 1 2 7 m i l l i q 超纯水系统：美国m i l l i p o r e 公司。 1 2 8 图像分析软件：q u a i l t a n m ys o 胁a r ev e r s i o n 3 0 0 0 。 1 3 实验方法 1 3 1 玻片的清洗：取玻片，放入洗衣粉溶液中浸泡l 小时，用毛刷刷净后用去离子水 冲洗3 遍，置于6 0 0c 烘箱中烤干。 9 乐甬大学坝士学位论文 _-_-_i_-_-_-_-_-_-_-_-_-_-_-_-_-_-_ 1 3 2 玻片表面的氨基修饰：清洗好的玻片浸入含有 l 3 一a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e 的9 5 丙酮水溶液1 0 分钟，取出后，玻片用丙 酮洗3 遍，每次3 分钟，再用去离子水冲洗3 遍，每次3 分钟，最后在1 2 0 。c 烘 箱烘干，置于干燥处保存。 1 3 3 玻片表面的醛基修饰：将氨基修饰的玻片放入含3 一4 的戊二醛磷酸盐( p b s ) 缓冲液( 0 0 1 m ，p h 7 4 ) 中，在室温下浸泡2 小时，取出后先用p b s ( 0 0 1 m ，p h 7 4 ) 洗三遍，然后用去离子水冲洗3 遍，用氮气吹干，置于干燥处保存。 1 3 4 玻片表面的琼脂糖修饰： 1 3 4 1 分别配制0 6 、0 8 、1 o 、1 2 、1 4 的琼脂糖溶液，微波炉煮沸3 分钟 完全溶解： 1 3 4 2 将2 m l 琼脂糖溶液覆盖在6 0 。c 预热的清洁玻片上； 1 3 4 3 琼脂糖凝固后，玻片在3 7 。c 下过夜干燥； 1 3 4 4 使用前用n a l 0 4 溶液室温下活化3 0 分钟，超纯水彻底冲洗三遍，并用氮气流 吹干，室温干燥处保存。 1 3 5 微阵列的封闭：称取1 克小牛血清白蛋白，溶于1 0 0 m 1 p b s 中配成1 小牛血清白 蛋白磷酸盐溶液( 1 b s a p b s0 0 l mp h 7 4 ) 作为封闭剂。封闭液覆盖载体表面 3 7 0 c 进行封闭，封闭后用p b s 洗涤微阵列三遍，每次5 分钟。 1 3 6 抗体微阵列的制备和分析： 1 3 6 1 为了避免在实验中荧光强度出现饱和现象，首先确定最佳非饱和羊i g g 浓度， 将原始浓度为1 0 m m l 的羊i g g 样品，用含2 0 甘油的p b s 溶液倍比稀释为 1 ：2 、l ：4 、1 ：8 、1 ：1 6 、1 ：3 2 、l ：6 4 、1 ：1 2 8 、1 ：2 5 6 等浓度，在琼脂糖修饰的玻片 上，按浓度下降的次序点样，每一浓度点1 列8 点，形成8 8 的阵列，在湿盒 中3 7 固定2h 后，用p b s 漂洗3 次，每次5 分钟；之后用含1 b s a 的p b s 溶液3 7 封闭1 小时，再用p b s 漂洗3 次，每次5 分钟；然后在点样区加1 5 m c y 3 标记的兔抗羊i g g ( 1 ：1 2 0 ) ，3 7 避光孵育l 小时，然后用p b s 漂洗3 次， 每次5 分钟，氮气流吹干后，用扫描仪扫描，获取荧光图像，图像后处理采用 图像分析软件( q u a n t a r r a ys o r w a r ev e r s i o n 3 0 0 0 ) 进行分析，根据平均荧光强度选 取非饱和点样浓度。 1 n 丝塑塑查鲨 1 3 6 2 之后选用确立的非饱和浓度的羊i g g 重复上述步骤，依次衡量不同浓度琼脂 糖，不同浓度的n a l 0 4 溶液，不同固定时间以及不同孵育时间等实验条件对蛋 白质固定效率及反应活性的影响。 1 3 6 3 琼脂糖修饰玻片和醛基修饰及氨基修饰玻片的比较：取利用最佳条件制备的琼 脂糖玻片和醛基化玻片以及氨基化玻片各3 张，分别点样8 8 阵列，根据平均 荧光强度比较两种载体对蛋白质的固定效果。 1 3 7 统计学方法：以上试验均重复三次，数据取三次试验结果的平均值，数据以均数 标准差( x s ) 表示。统计学处理采用s a s6 1 2 软件进行单因素方差分析 ( o n e w a y a n o v a ) ，以p 0 0 5 作为显著性界限。 东南大学硕士学位论文 结果 1 不同浓度羊i g g 对荧光强度的影响：载体对蛋白质的固定量是有限的，在一定范围 内蛋白质固定量和蛋白质样品的浓度成正比，当达饱和浓度时，固定量就不再增加。 琼脂糖玻片对抗体的固定范围见图1 ，可见在羊i g g 稀释浓度为1 ：2 ( 5 0 0 0 ug m 1 ) 时 荧光强度达到最大，因此琼脂糖修饰玻片对抗体固定的饱和浓度是5 0 0 0 ug m 1 。在 之后的实验中选取该值范围内的l ：1 6 ( 6 2 5ug m 1 ) 为后继实验的点样浓度。 7 0 0 0 0 6 0 0 0 0 餐5 0 0 0 0 架 糕4 0 0 0 0 3 0 0 0 0 2 0 0 0 0 l o g ( 羊i g g 浓度) 图1 羊i g g 浓度对数一荧光强度曲线 f i 昏l t h ec u r v eo fi o 鲠9 0 a ti g g n c e n t n 幽璐) v e 聃u s 日u o 代s c e n c ei n t e n s i 姆 结果 2 不同琼脂糖浓度对荧光强度的影响：见图2 ，随着琼脂糖浓度的增加，载体对抗体的 固定的量随之增加，但当琼脂糖浓度大于1 2 时，荧光强度下降，因此，琼脂糖的 最佳浓度是1 2 。 o 6 o 8 1 - 帆1 2 1 4 3 0 0 0 0 警2 0 0 0 0 紫 杈 1 0 0 0 0 o oo 5 1 0 1 5 2 0 琼脂糖浓度 图2 不同琼脂糖浓度对抗体固定的影响 f i g 2 t h ee f l b c to fa g a r o s ec o n c e n t r a t i o ho t h e i m m o b i i 妇删 i o ne m c i e n c yo fg 啦“g g 东南大学硕士学位论文 3 不同n a i o 。浓度对荧光强度的影响：高碘酸钠可以氧化琼脂糖上的羟基为醛基，醛基 可以和蛋白质上的氨基形成共价键，从而把蛋白质固定在载体表面。这里分别用o 、 1 0 、2 0 、5 0 、1 0 0 咖o l l 的高碘酸钠活化3 0 分钟，结果见图3 ，可见随着高碘酸钠浓 度的增高，荧光强度随之增强，在2 0 i i l r n 0 1 l 时，荧光强度达到峰值。 0 m m o 阴 1 0 m m o l l2 0 m m o l ，i卯m m o l l1 0 0 m m o 坍 鏊2 0 0 0 0 采 糕 0 0 2 04 06 08 01 0 01 2 0 高碘酸钠浓度( m o l l ) 图3 用不同高碘酸钠浓度活化对抗体固定的影响 f i g 3t h ee f f e c to f 1 0 4 c o n c e n t r a 伽no nt h e i m m o b i l i z a t i o ne m c i e n qo fg o a “g g 结果 4 不同固定时间对蛋白固定的影响：蛋白质在载体表面的固定达到最佳需要一定的时 间，这里选择3 0 、6 0 、9 0 、1 2 0 、1 5 0 分钟等固定时间。结