（动物遗传育种与繁殖专业论文）利用多重PCR进行丝羽乌骨鸡产蛋量与微卫星标记的相关分析.pdf

旧川农业大学2 0 0 4 硕士论文 摘要 本试验利用多重p c r 结合荧光全自动检测技术，研究丝羽乌骨鸡b m 、b f 两个蛋 用新品系的微卫星多念性以及它们与开产同龄、3 0 0 日龄产蛋量、周产蛋量等2 5 种性状 的相关关系。从鸡l 号染色体和z 染色体上筛选出1 8 对微卫星标记，进行多重p c r 扩 增，并对引物组合的反应体系进行优化，在f l 群体中检测到1 3 个标记位点分别与2 5 种性状中的1 9 种性状有不同程度的相关，并进行同一标记不同基因型问的多重比较， 同时还计算了产蛋性状间的表型相关。结果表明： ( 1 ) 通过多重p c r 反应体系及组合的优化，使多重p c r 组合试验获得成功； ( 2 ) 所选用的与性状相关的1 3 个微卫星座位都符合盂德尔共显性遗传规律，其杂合度 在0 1 9 8 , - 0 7 7 5 之间，平均为o 4 3 9 ，2 3 位点的杂合度 o 6 0 ；多态信息含量在0 ，4 0 8 。0 8 5 1 之问，平均p i c 为o 6 9 8 ，其中8 4 6 的p i c 0 5 ；等位基因数平均为8 5 4 个；表明这 些微卫星标记易于检测、多态性强，是目前较为理想的遗传连锁分析工具； ( 3 ) 共检测到1 3 个微卫星标记与1 9 种产蛋量性状之间存在显著或极显著的相关，为 产蛋量性状的迸一步q t l 定位和标记辅助选择育种提供参考依据； ( 4 ) 经过一个世代的选育，3 0 0 日龄产蛋量和开产日龄都达到了差异极显著的水平，群 体的平均杂合度和变异系数也减小了，表明该群体的整齐度得到了一定程度的提高，选 育效果明显； ( 5 ) 丝羽乌骨鸡开产日龄与3 0 0 日龄产蛋量间存在极显著的负相关；各周产蛋量与3 0 0 日龄产蛋量成极显著的正相关；开产日龄与1 9 _ _ 2 5 周累计产蛋量成极显著的负相关， 这为丝羽乌骨鸡新品系的进一步选育提供了重要的参考价值。 关键词：丝羽乌骨鸡产蛋量微卫星相关分析多重p c r 四川农业大学2 0 0 4 硕士论文 a b s t r a c t c o m b i n i n gt h et e c h n i q u eo fm u l t i p l e x - p c ra n dt h ef l u o r e s c e n ta u t o m a t e dd i c t i o n ，t h e p o l y m o r p h i s mo fm i c r o s a t e l l i t ew a sp e r f o r m e di nn e w s t r a i n so fb ma n db fi ns i l k i e s i n a d d i t i o n ，t h el i n k a g ec o r r e l a t i o nb e t w e e nm i c r o s a t e l i t em a r k e r sa n dc h a r a c t e r so f t h ea g ea t f i r s t e g g 、t h ee g gp r o d u c t i o no f3 0 0d a y s 、t h ee g gp r o d u c t i o no faw e e ke t a lw a sa l s o a n a l y z e d 1 8 p a i r s o fm i c r o s a t e l l i t e p r i m e r sw e r e s c r e e n e df r o mc h r o m o s o m e1 a n d c h r o m o s o m e z ，t h ep r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oa l l o wo p t i m a lp e r f o r m a n c eo f t h em a r k e r s ，i n s e t sc o n t a i n i n gm u l t i p l em i c r o s a t e l l i t e s ，o na b l 310 0s e q u e n c e r s w ed e t e r m i n e dt h e r ew e r e c o r r e l a t i o na m o n g1 3m i c r o s a t e l l i t em a r k e r sa n d1 9c h a r a c t e r si n2 5e g gt r a i t st h r o u g hl e a s t s q u a r em e a n s a tt h es a m et i m e ，w ec a l c u l a t e dc o r r e l a t i o na m o n g c h a r a c t e r so f e g gt r a i t si n s i l k i e s w ec a nd r a ws o m ec o n c l u s i o na sb l o w ： 1 ) t h r o u g hm u l t i p l e x - p c r r e a c t i o n s y s t e m ，w e s u c c e e di n c o m b i n i n gm u l t i p l e x p c r p r i m e r st om 出o p t i m a lp e r f o r m a n c e ； 2 ) t h e13 m i c r o s a t e l l i t em a r k e r sl o c iw h i c hl i n k e dw i t h e g g t r a i t sa c c o r d e dw i t ht h e c h a r a c t e r so fm e n d e l i a nc o i n h e r i t a n c e ，t h eh e t e r o z y g o s i t i e sr a n g e df r o m0 1 9 8t o0 7 7 5 ， t h em e a n so f h e t e r o z y g o s i t y i so 4 3 9 w i t h2 3 o fl o c ih a v i n gah e t e r o z y g o s i t i e so f 0 6 0 ； t h ep o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o nc o n t e n d ( p i c ) r a n g e df r o mo 4 0 8t oo g 皇i ，i nw h i c h8 4 6 o fl o c ih a dap i co fm o r et h a no 5 0 t h em e a n so fp i ci s0 6 9 8 ；t h ea v e r a g en u m b e r o fa l l e l e sf a rt h e13p o l y m o r p h i cm a r k e r sd e s c r i b e dw a s8 5 4 t h i si n d i c a t e dm i c r o s a t e l l i t e m a r k e r sc a nb eu s e di nl i n k a g ea n a l y z ei d e a l l y ； 3 ) t r o u g hl e a s ts q u a r em e a n s ，1 3m i c r o s a t e l l i t em a r k e r sa n d1 9c h a r a c t e r so fe g gt r a i t s r e r ed e t e c t e d ，w h i c hw e r ec o r r e l a t i o no rc o r r e l a t i o ns i g n i f i c a n t l y t h i si n d i c a t e d ：t h e m i c r o s a t e u i t em a r k e r sd e s c r i b e da r ep a r t i c u l a r l yw e l ls u i t e df o rp e r f o r m i n gq t l a n d m a s ； 4 ) d i f f e r e n c ea m o n gp a r e n t a n df1i s s i g n i f i c a n t i nt h e a g e a tf i r s t e g ga n dt h ee g g p r o d u c t i o no f 3 0 0d a y s ，t h eh e t e r o z y g o s i t ya n dv a r i a t i o nf a c t o rd e c r e a s e d ，t h i si n d i c a t e d t h a tt h es e l e c t i o ne f f e c ti ss i g n i f i c a n tt h r o u g ho n eg e n e r a t i o ns e l e c t i o n ； 5 ) t h e r ew e r es i g n i f i c a n t l yn e g a t i v ep h e n o t y p i cc o r r e l a t i o nb e t w e e n t h ea g ea tf i r s te g ga n d t h ee g gp r o d u c t i o no f3 0 0d a y s ；ap o s i t i v ep h e n o t y p i cc o r r e l a t i o nw a sf o u n da m o n gt h e 四川农业大学2 0 0 4 硕l 论文 e g gp r o d u c t i o n o f3 0 0 d a y s a n dt h e e g gp r o d u c t i o n i n e v e r yw e e k an e g a t i v e p h e n o t y p i cc o r r e l a t i o nw a sf o u n d b e t w e e nt h ea g ea tf i r s te g ga n dt h ea c c u m u l a t e de g g p r o d u c t i o n o f1 8 一一2 1 w e e k k e y w o r d s ：s i l k i e s e g g t r a i t sm i c r o s a t e l l i t e m u l t i p l e x p c rl i n k a g ea n a l y s i s 1 1 1 四川农业大学2 0 0 4 硕士论文 1 前言 家禽育种的目的是；获得在未来农场经济和社会条件下比现有家禽世代更有效地生 产所需产品的新一世代家禽。过去家禽的改良“直沿用以数量遗传学为理论基础的常规 育种方法，通过个体及其亲属的表型值。借助育种值估计的方法，选择优秀遗传材料。 由f 经历了长期的选择，家禽的生产性能已经达到了相当高的水平，呈现了遗传进展递 增率呈下降的趋势，采用传统的育种方法很难取得突破性进展，且传统的育种方法存在 周期长( 培育一个品种往往需要几年或者更长的时间) ，选择效应小且不稳定的缺点，特 别是对一些数量性状的选择。 数量性状大多数是有微效多基因控制的，控制数量性状的基因位于q t l ，一旦掌握 了家禽的q t l ，遗传选择将会更迅速，更准确。数量性状表型为基因和环境共同作用的 结果，在进行“基因型”选择育种值估计过程中，难以消除环境和上位效应的影响，这 是影响数量性状选择效果的重要原因。因此，如何消除环境影响，了解单个基因的作用 及基因间的相互作用，实现真正的基因型选择一直是育种学家们努力的方向。标记辅助 选择( m a s ) 这一新的育种方法正是这种努力的结果。鸡产蛋量性状的表型测量仅限于 成熟的母鸡，如果在遗传选择中增加未成熟母鸡q t l 的标记辅助选择，可缩短世代间 隔( e d w a r d s 等。1 9 9 4 ) 、提高选择的准确性( s o l l e ra n d b e c k m a n n ，1 9 8 3 ：h i l l e l 等，1 9 8 9 ) 、 提高选择效应( k o n i n g a n dw e l l e r ，1 9 9 4 ) ，尤其是通过传统的选择方法难以提高的性状 ( m e u w i s s e n & g o d d a r d1 9 9 6 ；v a nd e rb e e k & v a n m e n d o n k1 9 9 6 ) ，而且可以在家禽 的任何日龄得到其遗传信息，从而加速群体产蛋量的遗传进展，提高改良的速度。还可 以进行标记辅助导入，使有利基因从一个群体导入另一个群体，并能够控制导入的比例 和程度进一步提高育种效率( d e v i c e n t e 等，1 9 9 4 ) 。 八十年代，国际上的动物育种己进入分子水平，根据英美等西方发达国家政府和国 际粮农组织的预测，2 1 世纪全球畜牧业的9 0 畜禽品种都将通过分子育种提供。分子 遗传标记因其信息含量大、标记丰富且可覆盖整个基因组而使连锁的研究和应用进入了 一个快速发展的新时期。数量性状基因定位对分子标记的要求是：中性( n e u t r a l ) 、共显 性( c o d o m i n a n t ) 、准确性( u n e q u i v o c a l ) 和广泛分布于整个基因组( 莫惠栋，1 9 9 6 ) 。 微卫! 呈标记是符合上述特征的首选标记。利用微卫星标记可以找到与数量性状基因位点 连锁的基因标记和位点本身，估计各位点对表型的贡献值及相互关系。通过识别基因型， 直接利用影响个体表型的基因，从而尽快提高其生产性能。 四川农业大学2 0 0 4 硕1 _ 论文 2 文献综述 2 1 微卫星标记与家禽遗传育种 微卫星d n a ，又称短串联重复序y t j ( s h o r tt a m d e mr e p e a t s ，s t r ) 或简单序列重复 ( s i m p l es e q u e n c er p e a t s ，s s r ) ，是以1 6 b p 的短核苷酸为基本单位，首尾相连组成的 串联重复序列。这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中，呈随机均匀分布。在真 核生物中大约每隔1 0 5 0 k b 就有一个微卫星( t a u t z 。1 9 8 9 ) ，h i l l e l 等( 1 9 8 9 、1 9 9 0 ) 发 现在鸡品系内和品系间存在高度变异的微卫星d n a 序列，在某些情况下，它与具有商 业意义的品质特性相连锁。研究表明，在哺乳类动物中似乎每个基因都存在至少一个微 卫星标记，它们不仅大量分布于基因的间隔区和内含子中，而且还分布于基因的外显予 和调控区( 如启动子、增强子) 内。根据微卫星本身的结构，w e b e r 等( 1 9 9 0 ) 将微卫星分为 三类，即完全重复型、不完全重复型、复合重复型。微卫星序列最早有s k i n n e r ( 1 9 7 4 ) 在蟹中发现( s k i n n e r 等，1 9 7 4 ) ，1 9 8 6 年a l i 等用合成的微卫星寡核苷酸做探针用于人 的d n a 指纹分析后获得成功使这种重复序列开始受到重视( a l i 等，1 9 8 6 ) ，八十年代 后期p c r 技术的发展、序列分析的自动化使这种重复序列优于其它标i 己如r f l p 、r a p d 等的许多特点充分展露出来，成为目前数量最多、应用最普遍的d n a 标记系统。随着 现代养禽业的迅速发展，传统的育种技术已经难以满足其要求，分子数量遗传学的产生 及其应用给家禽遗传育种研究带来了生机，而分子遗传标记的发展则为分子数量遗传学 的研究提供了必要的工具。微卫星d n a 标记以其优良的特性及其简便的操作，受到广 大研究者的青睐，逐渐发展成为基因图谱构建及群体遗传结构分析研究中不可缺少的遗 传标记之，并在基因诊断、物种的演变追踪、q t l 分析、系谱的确定等方面显示出巨 大的应用价值。 2 1 1 微卫星标记的结构特点 ( 1 ) 微卫星d n a 在真核生物基因组中数量多且均匀分布 据估计，真核生物基因组中大约每隔l 1 5 个k b 中就存在一个微卫星标记，禽类 基因组中，微卫星分布的密度相对较低，大约每2 0 3 9 k b 中有一个微卫星标记，原因可 能是家禽基因组中所含的非编码d n a 相对少于哺乳动物所致( m o r a n 等，1 9 9 3 ；p r i m m e r 等，1 9 9 7 ) 。鸡中至少有1 0 ，0 0 0 个以上微卫星位点，而且除着丝粒及端粒区域外，均 匀分布于整个基因组。 ( 2 ) 微卫星呈共显性遗传、遗传稳定、突变率低 2 四川农业大学2 0 0 4 硕士论文 许多研究表明，微卫星位点遵循孟德尔遗传规律，等位基因间呈现出共显性遗传的 特点( e l l e g r e n m 等，1 9 9 3 ；g r o e n e n 等，1 9 9 5 ) ，这种特点在对后代进行基因分型时 能很容易区分出纯合子和杂合予，克服了显性遗传标记不能区分出纯合予和杂合子的不 足。同时微卫星位点的突变率低，仅为l o _ 4 1 0 ，而且核心序列碱基数越少，突变率 越低。而同为共显性遗传的小卫星的突交率嘲为5 1 0 - 2 ，是微卫星突变率的】0 0 1 0 0 0 倍。因此，微卫星较小卫星d n a 具有更高的遗传稳定性，这使其在物种起源、遗传作 图、性状连锁分析及基因定位等研究中具有更高的精确性和可靠性。 ( 3 ) 微卫星d n a 具有很强的保守性 在一些起源相近的物种中，微卫星d n a 具有很强的保守性。从牛的基因组中筛选 出的用于扩增微卫星d n a 的p c r 引物中5 6 可用于羊，3 可用于马( m o r e 等，1 9 9 1 ) ， d i e t z 等还直接将从羊的基因组中分离出的7 个微卫星位点中的5 个定位到牛的相应同 线群中( d i e t z 等，1 9 9 3 ) 。b r e e n 等( 1 9 9 4 ) 用家马的1 3 个微卫星位点的侧翼引物从蒙古 野马的基因组中扩增出与家马多态性相当的多态产物。l e v i n 等用鸡的微卫星扩增火鸡 的基因组d n a ，9 2 能够产生p c r 产物，3 3 的扩增产物经过鉴定是与鸡同样的微卫 星，其中约2 8 表现出多态( l e v i n 等，1 9 9 5 ) 。杨澜等用5 个牛微卫星引物对4 个山羊 品种进行p c r 扩增，结果有三个获得产物，其中两个标记座位有2 个等位基因，个 有1 0 个等位基因( 杨澜等，1 9 9 8 ) 。c r a w f o r d 和v a i m a n 等的研究证明，牛、绵羊和山 羊的染色体有很高的相似性，而且牛和绵羊的微卫星引物能在山羊上检测出多态性。 k r i k p a t i c 等利用人、小鼠和牛的共有序列合成的引物，成功扩增了胰岛素生长园子 i ( i g f 1 ) 5 区在猪和牛上一个保守的微卫星位点，结果发现在猪上等位基因的变异差 异极显著( p o 0 1 ) ，这说明人和实验动物序列信息可以为其它动物的遗传标记的发现 提供简便途径。这种种属间的强保守性简化了微卫星标记的搜寻，使得我们在一个物种 的研究中可以利用另一个物种的研究结果，从而能更快更准确地找到该物种中更多的微 卫星标记，节约资金和时间。 ( 4 ) 微卫星d n a 具有丰富的多态性 微卫星的多态性是由于重复单位数的变异形成的。同一个体基因组两条同源染色体 中，相对位置两侧翼序列间所包含的重复单位数相同即p c r 产物长度也一样，则个体 在该微卫星位点上的基因型是纯合的，否则为杂合基因型。研究发现微卫星核心序列 重复数越大，其变异越大，等位基因数也越多( e l l e g r e n m1 9 9 3 ：m a 等，1 9 9 6 ) 。目前观 察到的微卫星位点等位基因数的变动范围：猪2 1 6 个牛2 1 8 个，鸡2 1 3 个( g r o e n e n 州川农业大学2 0 0 4 硕七论文 等，1 9 9 5 ；m a 等，1 9 9 6 ：j e r r y 等，1 9 9 7 ) 。如此多的等位基因数为微卫星标记提供 了丰富的多态性，其多态信息含量( p o l y m o r p h i s m i n f o r m a t i o nc o n t e n t ，p i c ) 可以高达o 7 以上，比r f l p 高，与小卫星、r a p d 的0 7 - 4 ) 9 相当，能够满足遗传作图、连锁分 析、基因定位等对高多态性遗传标记的要求。 ( 5 ) 微卫星d n a 检测容易、可以进行自动化、半自动化大规模操作 微卫星扩增产物通常的长度为2 0 0 个b p 左右，这样的长度使其很容易进行p c r 扩 增。：近几年来兴起的荧光标记p c r 电泳检测手段更为先进，既可阻选用一个引物做单 个的p c r 反应，也可以选用不同的引物进行多重p c r ，一次检查多个座位，同时p c r 产物可以用a b l 3 7 3 进行全自动电泳测序仪分型，确定片段的大小。p c r 的高度灵敏、 高特异性、操作的简便、省时使得微卫星标记的检测也十分方便而且准确。此外可以利 用微卫星两端单拷贝的侧翼序列将微卫星特异地定位于基因组的特定部位，即微卫星可 以做为一种序列示踪位点，其检测可以进行自动化，大大减轻了工作强度、提高了工作 效率。 2 1 2 微卫星标记在家禽遗传育种上的应用 ( 1 ) 家禽遗传连锁图谱和物理图谱 由于鸡具有世代间隔短和能够产生大量的全同胞家系的特点，成为构建遗传图谱的 一种优秀模型动物( c r o o i j m a n s 等，1 9 9 6 ) 。而建立精细遗传图谱的关键是获得足够的、 高度：多态性的遗传标记。微卫星标记有其他标记不可替代的优点，是构建遗传连锁图谱 的主要工具。目前已经有大量的遗传标记被定位到鸡的遗传连锁图上，其中大部分是微 卫星标记( c r o o i j m a n s 等，1 9 9 4 、1 9 9 6 ；c h e n g ，1 9 9 5 ) ，物理图谱是用已经定位到d n a 序列上的s t s 为路标，以d n a 的实际长度为图距所构建的基因组图谱。由于微卫星标 记是一种s t s 标记，可以帮助遗传连锁图谱向物理图谱的过渡，因此被广泛用于各种动 物物理图谱的构建( k n a f i b 等，1 9 9 3 ) 。 ( 2 ) 家禽群体遗传结构、亲缘关系及起源 张细权等( 1 9 9 6 ) 利用5 个多态性徽卫星位点研究家鸡品种的遗传结构和亲缘关系 时发现，各个品种间微卫星位点的等位基因频率可以反应出品种间的特异性。t a k a h a s h i 等( 1 9 9 8 ) 利用微卫星d n a 多态性对日本1 0 个本地品种间的遗传关系及其起源进行了 研究，v a n h a l a 等( 1 9 9 8 ) 也利用9 个微卫星标记对3 个自来航杂交系、3 个兰德雷斯 ( l m a d r a c e ) 品系、1 个洛岛红品系及其一个肉仔鸡杂交系间的遗传变异和遗传距离 四川农业大学2 0 0 4 硕卜论立 进行了估计。 ( 3 ) 制作家禽d n a 指纹图 利用微卫星制作d n a 指纹图，通过分析进行个体、品系、品种的鉴定是微卫星的 最早应用之一。在家禽方面，这种微卫星指纹图的研究报道不是很多。h a b e r f e l d 等( 1 9 9 1 ) 报道，用来源于牛基因组文库的一个微卫星探针r 1 8 1 检测家鸡和绵羊高度多态位点的 d n a 指纹，发现有较好的多态性。将该微卫星探针与j e f f e y s 所筛选的小卫星探针3 3 6 以及( g t ) 1 2 ( g t g ) 5 两个微卫星寡聚核苷酸所产生的结构相比较，发现微卫星探 针的结果同( g t ) 1 2 ( g t g ) 5 的结果有相同模式。而j e f f e y s 所筛选的小卫星探针3 3 6 产生的结果却有所不同。 ( 4 ) 定位家禽功能基因和数量性状位点 利用微卫星标记与某些功能基因或q t l 问的连锁关系，可将一些功能基因或q t l 定位在染色体上或连锁群中。在家禽中，这方面已经有一些研究。c r o o i j m a n s 等利用两 个微卫星位点m c w 4 5 和h u j l 0 将鸡的m y h e 基因定位于e 2 1 连锁群，利用微卫星位点 m c w 5 1 将c a l b 0 4 定位于e 6 和c 1 7 连锁群。t o y e 等( 1 9 9 7 ) 对鸡的c o m p t o n 国际 参考群体中孕酮受体基因5 区的一个五核萤酸微卫星进行扩增，通过连锁分析，将p g r 基因定位定位到l 号染色体上。 ( 5 ) 用于标记辅助选择和标记辅助渗入 通过一些与重要经济性状连锁的微卫星标记，可以在生命早期对该性状进行选择， 也可以在两种性别中同时进行选择。这样，世代间隔得以缩短，选择强度得以提高。标 记辅助导入，是指在d n a 标记的辅助下，将一个或多个优良生产性状基因( 主基因或 q t l ) 从一个品种导入另一个品种，并通过反复回交，使主基因或q t l 基因达到一定 的频率。利用微卫星标记可以清楚了解导入基因的频率，并防止有害基因渗入。 此外，微卫星标记还可用于家禽品种资源的保护，即利用与目标基因有紧密连锁关 系的微卫星标记，通过有意识的选留和保护，从而达到保种的目的。微卫星标记还可以 用作探针，与原位杂交技术相结合。对家禽微型染色体进行鉴别。 2 2 家禽遗传图谱的研究 自1 9 9 0 年美正式启动人类基因组计划以来，对生物基因图谱、基因测序的研究成 为当代遗传学研究的热点之一。2 0 0 1 年，人类基因组测序已经完成，2 0 0 2 年，完成了 鼠的基因组测序，现在鸡的基因组测序在进行中。鸡因世代间隔短，可以形成较大的全 四川农业大学2 0 0 4 硕士论文 同胞家系，因而鸡是被用做遗传作图技术的极好材料。在鸡基因图谱的构建中，重要的 罩程碑就是参考家系的构建，世界上许多研究小组分别构建了自己的参考家系，目前， 世界上较有影响、并在鸡连锁图谱分析及基因定位中发挥重要作用的资源参考家系主要 有：美国密西根州立大学c o m p t o np o p u l a t i o n - ab a c k c r o s so f t w op a r t i a l l yi n b r e dw h i t e l e g h r o n ( b u m s t e a d a n d p a l y g a ，1 9 9 2 ) ；英国动物健康研究所e a s tl a n s i n g p o p u l a t i o n a b a c k c r o s sb e t w e e n p a r t l yi n b r e dr e dj u n g l ef o w la n da ni n b r e dw h i t el e g h o r n ( c r i t t e n d e n 等，1 9 9 3 ) ；荷兰w a g e n i n g e n 大学w a g e n i n g e n r e f e r e n c e p o p u l a t i o n ac r o s sb e t w e e nt w o e x t r e n a e c o m m e r c i a lb r o i l e rd a ml i n e s ( g r o e n e n 等，1 9 9 8 ) 。前两个回交群体在第一届国 际遗传学会家禽基因定位研讨会上作为国际参考侯选群得到了公认，使用三种不同的作 图群体已经产生了三种不同的连锁图谱，第一类连锁图谱完全使用d n a 标记，该图谱 根据c 参考群体，只包括r a l f 标记( b u m s t e a d 等，1 9 9 2 ) 。第二类连锁图谱根据e 参考群体，主要包括r f l p 、r a p d 、c r i 标记，自那以后使用两个群体做了大量的微卫 星标记( c h e n g 等，1 9 9 5 c r o o i j m a n s 等，1 9 9 7 ：g i b b s 等，1 9 9 7 ) $ ba f l p 标记( k n o r r 等，1 9 9 9 ) 。第三类图谱( g r o e n e n 等，1 9 9 8 ；h e r b e 娼s 等，1 9 9 9 ) 只根据大量的f 2 群 体，只包括微卫星标记和a f l p 标记。结合三个作图群体的鸡的所有基因型数据的公认 的遗传连锁图谱已经产生( o r o e n e n 等，2 0 0 0 ) 基因型数据是有使用e 参考群体( c r i t t e n d e n 等，p o u l t r ys c i e n c e7 2 ：3 3 仁3 4 81 9 9 3 ) 和c 参考群体( b u m s t e a d 等，1 9 9 2 ) 的实验室和 使用w 群体的w a g e n i n g e n 大学的育种小组提供的，资料( s c h m i d 等，2 0 0 0 ) 表明：图谱 上的标记已经达到了1 9 6 5 个，分布于5 0 个连锁群，基因组总的遗传长度是3 8 0 0 c m 。 e a s tl a s i n g 图谱包含了1 1 8 6 个标记，分布于4 9 个连锁群，其中5 1 2 个是微卫星标记， 大约3 0 0 个基因已经被作图。c o m p t o n 群体包含4 2 0 个标记，分布于3 6 个连锁群。 w a g e n i n g e n 群体包含4 7 1 个标记，分布于2 8 个连锁群。在世界上2 0 多个实验室的合作 下已经产生了2 0 0 0 多个标记的遗传连锁图( s c h m i d 等。2 0 0 0 ) ，1 0 0 0 多个微卫星标记已 经被作图，这些微卫星标记是作图的关键。目前，鸡遗传图谱上已经有1 0 0 0 多个基因 和2 0 0 0 多个微卫星标记已被鉴定，因此可以获得一个详细的鸡基因组框架图，使得有 足够的信息来进行广泛的q t l 分析( g r a h a m eb u l f i e l d ，2 0 0 4 ) 。 2 3 数量性状的基因定位与家禽分子育种 2 3 1 数量性状的基因定位 g e l d e r m a n n ( 1 9 7 5 ) 提出了控制数量性状的数量性状位点的概念，鸡育种所针对的 四川农业大学2 0 0 4 硕士论文 大部分性状是数量性状，这些性状大多数是由微效多基因控制的，控制数量性状的基因 位于q t l 。鸡的基因组大约包括3 0 0 0 0 多个基因，这些基因分布于3 9 对染色体上，q t l 定位是在这些位点上确定性状基因的第一步。近年来在欧美等国家人类基因组计划的带 动下，对动物重要经济性状的基因定位已经成为了国际前沿研究课题。近二十年来，各 种d n a 标记技术尤其是微卫星标记( 微卫星标记有多态信息含量高、在基因组中分布 广泛、均匀、数量充足、并能够使分析机械化、自动化、电脑化等优点) 以及相关生物 技术的发展和完善为高密度、覆盖面广的连锁图谱的构建、q t l 定位奠定了基础。数量 性状：基因定位的基本技术路线是：( 1 ) 选择具有相对数量性状的纯系a 和b ，进行杂交 和自交，获得分离世代f 2 、b c l 或重组群体d h ( 加倍单倍体) r i l ( 重组近交系) 等； ( 2 ) 检测世代群体中每个个体的标记基因型和数量性状值：( 3 ) 分析标记基因型和数量 性状之间是否存在连锁，发现q t l 和估计q t l 的有关遗传参数。 2 3 2 分子标记与数量性状相关分析的原理 分子标记与数量性状相关分析具体分为下列两种方法： ( 1 ) t b 分析法( t r a i t b a s e dm e t h o d ，以数量性状为基础的分析法) ：t b 分析法判断连 锁关系的标准是数量性状高表型组和低表型组间存在分子标记基因频率的显著性差异。 原理是：由于性状有目的的选择，改变了与该性状有连锁关系的分子标记在分离群体中 的随机分布状态，使标记的等位基因频率发生相应的变化，当q t l 等位基因与某一标 记基因连锁时，由于相关联的结果，必然导致高低表型个体问标记基因频率的差异。因 此，在高低两类选系中基因频率具有显著差异的标记座位被认为与q t l 连锁在一起；( 2 ) m b 分析法( m a r k e r - b a s e dm e t h o d ，以分子标记为基础的分析法) ：根据分离群体中标记 基因型之间数量性状差异是否显著，来确定标记座位与q t l 的连锁。现今常用的m b 分析法主要有：单标记分析法( s i n g l em a r k e r a n a l y s i s ) ：即通过方差分析、回归分析 或似：然比检验，比较不同标记基因型数量性状均值的差异。如存在显著差异，则说明控 制该性状的q t l 与标记有连锁。此法不需要完整的分子标记连锁图，在早期研究中用 的较多。区间作图法( t n t e r v a lm a p p i n g ) ：指利用相邻的连锁标记作为分析单元，利 用两侧的标记信息运用似然函数法来分析标记区间内q t l 存在的概率。复合区间作 图法( m d t i p l em a r k e r a n a l y s i s ) ：即利用多个位点的标记信息，通过多元回归分析将区 间定位和区间检验结合的方法。z e n g ( 1 9 9 3 ) 提出该法要点：对某一特定标记区间进行 检测时，将与其它q t l 连锁的标记也拟合在模型中以控制背景遗传效应。假定不存在 上位效应和基因型与环境的互作效应，用类似于区间作图的方法获得个参数的最大似然 四! l 窒些查兰! ! 1 4 碗_ 芝堡_ 史 一 估计值，计算似然比，绘制各染色体的似然图谱，根据似然比统计量的显著性，获得 q t l 可能位置的标记区间。 2 3 3 家禽的分子育种 随着鸡饱和遗传图谱的构建以及高效统计方法的应用，在q t l 研究的基础上又出 现了以d n a 分子标记技术为主的鸡经济性状标记的分子育种。畜禽分子育种是依据分 子遗传学和数量遗传学理论，应用现代分子生物技术在分子水平改良畜禽品种的新型学 科。该学科e t 前可分为两大研究内容：一是转基因育种；二是基因组育种。转基因育种 的研究已进行了十几年，成功的例子不多。动物基因组育种很可能成为未来畜禽品种改 良的主要手段。与常规育种技术只能够利用加性效应的基因座位相比，基因组育种能够 利用包括具有互作效应和上位效应的一切有利的基因座位来改良动物的生产性状，它主 要包括标记辅助选择和标记辅助渗入。 标记辅助选择是基因组计划研究带来的一种新的育种方法。通过标记辅助选择，即 利用标记信息准确地追踪与q t l 关联的基因从亲代向子代的传递，可以加速选择效果， 在一定程度上提高了选择的准确性、缩短世代间隔、从而提高了选择反应。它通过对遗 传标记的选择，间接实现对控制某性状的q t l 的选择，从而达到对某性状进行选择的 目的。m a s 可以更深入地研究数量性状的遗传，使遗传学的研究有了新的突破，并在 此基础上应用于鸡的育种实践，是现代生物技术与常规方法的结合，m a s 是选种方法 的又一次飞跃。它实现了真正意义上的d n a 水平的基因型选择，克服了传统育种方法 的周期长、效率低、预计性差等缺点，是育种方法上的一种突破。 2 4 家禽产蛋性能研究的进展 2 4 1 乌骨鸡产蛋性能的研究 乌骨鸡开产日龄一般为1 7 0 2 0 5 天，比专用蛋鸡( 1 5 3 2 天) 要迟5 0 天左右，且 其产蛋量低，年产蛋量仅有7 5 1 0 5 枚，只有商品蛋鸡的三分之一。与商品蛋鸡的产蛋 性能有显著的差异。李房全( 1 9 9 8 ) 对余干黑羽乌骨鸡经过四个世代的选育。开产日龄有 2 0 2 2 3 天提前到1 5 6 6 4 天，3 0 0 日龄和5 0 0 日龄的产蛋量分别有5 7 5 个和1 2 1 个提高到 6 5 4 5 个和1 5 6 8 3 个。杜金平等( 1 9 9 9 ) 报道了综合选择后的金水乌鸡种鸡，自丝羽产蛋 数在1 8 0 个以上，白丝羽快长系和黑丝羽年产蛋数均达1 7 0 个以上。经四川省“九五” 重点攻关项目丝羽乌骨鸡新品系及商用配套系的选育五个世代的选育后，其生产性 能已经得到很大程度的提高，其中自羽母系开产目龄t 4 9 天，3 0 0 目龄产蛋量1 “个( 杜 四川农业大学2 0 0 4 硕士论文 晓惠等，2 0 0 0 ) 。赵小玲等( 2 0 0 3 ) 对丝羽乌骨鸡白羽母系第六世代和第七世代进行方差 分析，结果表明第六和第七世代产蛋性能问有极显著的差异。四川省“十五”畜禽育种 攻关项目课题组( 2 0 0 2 ) 测定了丝羽乌骨鸡3 0 0 日龄的产蛋量为9 6 7 0 个，开产日龄为 1 5 6 天，经过一个世代的选育其开产同龄为1 4 7 天，3 0 0 日龄产蛋量为1 0 7 2 6 个。因此， 在提高乌骨鸡的产蛋性能方面还有很大的潜力。 2 4 2 鸡产蛋规律的研究 产蛋曲线数学模型是表示产蛋与时间的函数，它从动态角度上研究和认识产蛋率随 时间而变化的规律。关于家禽产蛋曲线的数学模型国内外有过许多报道：干高雄首先使 用伽玛函数描述鸡的产蛋曲线。m c m i l l a n 提出了分室模型描述鸡的产蛋曲线。史宪伟 ( 1 9 9 3 ) 分别用线性模型( l i n e a rm o d e l ) 、伍德模型( w o o dm o d e l ) 以及分室模型( m c m i l l a n m o d e l ) 对鸡的产蛋曲线进行了拟合，3 种模型拟合的r 2 值( 拟合度) 分别为：0 8 3 3 9 、0 8 4 4 8 和o 9 3 8 9 。吕敏芝等( 1 9 9 5 ) 对樱桃谷种鸭进行研究，分析了产蛋率与月龄之间的回归 关系，1 9 9 8 年又利用二次曲线方程、对数曲线方程和l o g i s t i c 方程分别对仙湖3 号鸭b 系1 1 个月的产蛋量与性成熟体重之间的回归关系进行了拟合，结果表明三个方程均能 较好的拟合它们之间的关系，相关指数r 2 都在0 9 以上。王祖铭( 1 9 9 6 ) 用多项式回 归拟合曲线，证明三次曲线具有较好的拟合度，复相关指数在0 9 5 以上。卢立志等( 2 0 0 2 ) 用w o o d 模型拟合了绍兴鸭、卡基康贝尔鸭和高邮鸭三个品种6 8 周龄的产蛋率，拟台 的r 2 值( 拟合度) 分别为o 6 0 9 8 、0 5 3 3 8 、o 7 9 3 5 。周海龙等( 2 0 0 3 ) 利用丝羽乌骨鸡6 个月的产蛋记录对a l i & s e h a e f f e r 等( 1 9 8 7 ) 所提出的月产蛋模型进行拟和，相关系数 达到o 9 9 3 0 。国外也发表了了许多描述产蛋量的数学模型见表1 ： 9 四川农业大学2 0 0 4 硕士论文 表1 数学模型表 t a b l e l ： s c r e e n i n g o f m a t h e m a t i c a lm o d e l s 2 4 3 鸡产蛋性能的分子遗传学研究 2 4 31 微卫星标记与乌骨鸡产蛋量的相关研究 孙桂荣等( 2 0 0 2 ) 选用1 2 对微卫星引物对丝羽乌骨鸡基因组d n a 进行扩增，计 算了这些微卫星标记座位的等位基因频率、多态信息含量、群体杂合度，并对微卫星标 记多态性与产蛋性状进行了最小二乘分析和多重比较，同时计算了四个月连产蛋量、开 产体重、开产蛋重、开产曰龄、3 0 0 日龄产蛋量、5 0 0 日龄产蛋量之间的表型相关，并 发现l 号染色体上的x 8 2 6 8 7 与5 0 0 日龄产蛋量相关。周海龙等( 2 0 0 3 ) 选用1 0 对微卫 星标记对丝羽乌骨鸡新品系b f 、k f 共1 2 0 个个体基因组d n a 进行了产蛋性能的微 卫星标记分析，检测到一些标记的基因型与月产蛋量、偶数月产蛋量、奇数月产蛋曩间 存在显著相关，同时还利用m t d f r e m l 法，运用动物模型估计出丝羽乌骨鸡各产蛋性 状的遗传力和遗传相关，对于3 0 0 日龄产蛋量，在1 0 个微卫星位点中，有6 个位点的 基因型间有显著的差异。 2 4 3 2 多重p c r 技术在鸡基因组研究上的应用 黄银花等( 2 0 0 1 ) 在利用多重p c r 进行鸡全基因组扫描中，应用多重p c r 结合半 自动化荧光标记d n a 分析技术从3 2 8 个微卫星标记筛选出分布于2 3 条常染色体和l 条 性染色体、覆盖3 0 8 0 c m 、包含在3 0 个引物组合中的1 7 0 多个多态微卫星标记，平均 o 四川农业大学2 0 0 4 硕土论文 标记密度为1 8 c m ，并优化了这些引物组合的反应条件；胡晓湘、黄银花等( 2 0 0 3 ) 在 对中国农业大学鸡资源群进行基因组扫描的研究中利用p c r 结合荧光半自动检测技术 对中国农业大学鸡资源家系的一个包括4 4 0 个个体的三代群体进行了大规模基因组扫 描，：分析了5 5 个微卫星位点，利用5 5 个微卫星