（动物遗传育种与繁殖专业论文）皖西白鹅催乳素基因（PRL）编码区序列克隆及多态性分析的研究.pdf

摘要 动物垂体前叶分泌的催乳素( p r o l a c t i n ，p r l ) 具有广泛的生物学效应，在家禽 中p r l 主要涉及到其繁殖性能。我国地方禽种强就巢性是其产蛋量低的主要因素之 一。大量研究表明，禽类p r l 表达量的上升与就巢行为的起始和维持具有密切的相 关性。 皖西自鹅是我国优良的中型鹅品种，素以体型大、早期生长发育快，抗病力强， 耐粗饲、耗料少，肉质好等特点，尤其是其产绒量高，羽绒品质好而享誉国内外。皖 西白鹅为季节性产蛋，且就巢性极强，因此导致其产蛋量低下。本研究采用候选基因 法，选择与就巢性状关系密切的p r l 基因，通过比较基因组学方法，应用d n a s t a r 和p r i m e rp r e m i e r5 0 软件，共设计了7 对引物对皖西白鹅p r l 基因的编码区序列进 行克隆测序；运用p c r s s c p 技术对皖西自鹅p r l 基因外显予1 、2 和5 片段分别进 行多态性分析并结合测序，检测其基因突变位点，并分析基因多念性及与皖西白鹅产 蛋量| b 的相关性。同时，对莱茵鹅p i l l 编码区序列作了相应的测定以进行比较研究。 克隆了皖西白鹅和莱茵克p r l 基因完整的编码区序列( g e n b a n k 登录号： d q 0 6 2 5 7 l ，d q 0 6 6 7 3 3 ) 。序列比较分析表明，皖西白鹅p r l 编码区序列与莱茵鹅的 同源性为9 9 ，与家鸡和野鸭同源性分别为9 4 平1 j8 8 。氨基酸序列分析表明，皖 西自鹅与莱茵鹅氨基酸序列完全相同，与野鸭序列比较有4 个氨基酸钱基的变化，但 与家鸡的序列差异则较大。 对皖西白鹅和莱茵鹅p r i ，基因第1 、2 和5 外显子进行多态性检测结果表明， 外显子1 扩增片段经s s c p 检测不存在多态性，第2 、5 外显子均发现有s n p 位点。 皖西白鹅p r l 基因外显子2 的c 1 9 6 t 突变导致编码的m e t 6 7 l e u 氨基酸残基变化， 而外显子5 的t 4 9 2 c 突变为同义突变；莱茵鹅p r l 基因外显子2 的c 1 7 0 t 突变导致 编码的h i s 5 7 a r g 氮基酸贱基改变，t 5 0 l c 为同义突变：皖西白鹅和莱茵鹅内含子2 的t c 突变在同一位点。 群体遗传分析表明，皖西白鹅p 3 引物检测的两个等位基因，频率分别为o 4 2 3 7 和o 5 7 6 3 ，p 6 引物检测的两个等位基因频率分别为o 9 6 1 8 和o 0 3 2 8 ；而菜茵鹅p 3 和p 6 引物检测的等位基因频率分别为o 9 1 2 5 、0 0 8 7 5 和o 5 7 5 、o4 2 5 。皖西白鹅在 p 3 和p 6 引物检测的多态位点的p i c 分别为o 3 7 2 1 和o0 7 0 8 ，经x2 适合性检验，群 体在两位点均处于h a r d y w e i n b e r g 不平衡状态：莱茵鹅在p 3 和p 6 引物榆删位点的 p i c 分别为0 1 4 6 9 和o 3 4 9 3 ，两位点均处于h a r d y w e i n b e r g 平衡状态。 在有产蛋记录的皖西白鹅群体中，外显子2 检测的三种基因型频率分别为 o 3 2 8 2 、0 1 9 0 8 和0 4 8 1 0 ，对应的产蛋量分别为1 9 7 4 、2 0 4 3 和2 12 4 。最小二乘分 析表明，基因型与产蛋量间无显著相关性( p o 0 5 ) 。皖西白鹅p r l 基因外显子5 检 测的多态位点是否会影响产蛋性能，有待进一步研究。莱茵鹅群体( 4 3 只) 总产蛋 量为1 4 6 0 枚，平均产蛋3 3 9 5 枚，与皖西白鹅的平均产蛋量( 2 0 5 8 枚) 差异达极显 著水平( 仁3 0 7 6 ) 。 关键词：皖西白鹅，p r l 基因，克隆测序，s n p ，p c r s s c p a b s t r a c t p r lw h i c hs e c r e t e df r o ma n t e r i o rp i t u i t a r yg l a n dh a se x t r e m e l yb r o a ds p e c t r u mo fb i o l o g i c a lr o l e p r lm a i n l yr e l a t e dt or e p r o d u c t i o ni na v i a ns p e c i e si n c r e a s e dc o n c e n t r a t i o no fp r o l a c t i np l a y sar o l ei n t h ec e s s a t i o no fe g gl a y i n ga n db r o o d i n e s sd u r i n gt h ea c t i v ep e r i o do fl a ys t u b b o r nb r o o d i n e s so fl o c a l a v i a ns p e c i e sm a i n l ya t t r i b u t e st ot h e i rl o we g gp r o d u c t i o n i ng e n e r a l ，p r lw a sr e g a r d e da so n eo ft h e f a c t o ri ni n t r i g u i n gb r o o d i n e s s a saf i n em i d b o d i e ds p e c i e s ，w a n x i w h i t eg o o s eh a st h ec h a r a c t e r so fl a r g eb o d y ，g r o w t hf a s ta t e a r l yt i m e ，s t r o n gd i s e a s er e s i s t a n c e ，b e a rc o a r s ef e e da n dh i g hm e a tq u a l i t y e s p e c i a l l y , w i t hh i g hd o w n p r o d u c t i o na n dq u a l i t y ，w a n x i w h i t eg o o s ew a sw e l lk n o w ni n t e r n a t i o n a l l yh o w e v e r , s e a s o n a le g g l a y i n ga n dh i g hb r o o d i n e s ss t r o n g l yi n h i b i ti t se g gp r o d u c t i o n i nt h i ss t u d y , p r lg e n ew h i c hr e l a t e dt o b r o o d i n e s sw a ss e l e c t e da sc a n d i d a t eg e n eb yg e n o m ec o m p a r i s o n ，7p a i ro fp r i m e r sw a sd e s i g n e d u s i n gp r i m e rp r e m i e r 5 0a n dd n a s t a rp r o g r a m m ei nc l o n i n gt h ew h o l ep r lc o d i n gr e g i o no f w a n x i w h i t eg o o s e p c r - s s c pm e t h o da l o n gw i t hf r a g m e n ts e q u e n c i n gw a su s e do nt e s t i n gg e n e m u t a t i o na te x o nl ，2a n d5s i t ec o r r e l a t i o nb e t w e e nm u t a t i o ni np r lg e n ea n de g gp r o d u c t i o nw a s a n a l y z e d m e a n w h i l e ，s e q u e n c i n go fp r lc o d i n gr e g i o na n dm u t a t i o nd e t e c t i o na tg e n ec o d i n gw a sa l s o a n a l y z e do nr h i n eg o o s et om a k ec o m p a r i s o nw i t hw a n x i - w h i t eg o o s e t h ec o m p l e t ep r lc o d i n gr e g i o no fw a n x i w h i t eg o o s ea n dr h i n eg o o s ew a sc l o n e d ( g e n b a n k a c c e s s i o nn u m b e r ：d q 0 6 2 5 7i ，d q 0 6 6 7 3 3 ) b yt h em e t h o do fg e n o m i cc o m p a r i s o n h o m o l o g i ca n a l y s i s s u g g e s t e dt h a tt h eh o m o l o g yo fw a n x i w h i t eg o o s ep r lc o d i n gr e g i o nw i t hr h i n ep r lc o d i n gr e g i o n w a s9 9 ，a n d9 4 ，8 8 w i t hc h i c k e na n dd u c kp r lc o d i n gr e g i o nr e s p e c t i v e l y p o l y m o r p h i s m so fe x o ni ，2a n d 5o nw a n x i w h i t eg e e s ea n dr h i n eg e e s ew e r ea n a l y z e dt h e r e s u l t ss h o w e dt h a t n op 0 1 ) 7 m o r p h i cs i t e ? a sd e t e c t e da te x o na m p l i f i e df r a g m e n t s n p s “e r ed e t e c t e d a te x o n2a n d5f r a g m e n ta m p l i f i e db yp 3a n d p 6pr i m er e s p e c t i v e l y ci9 6 tm u t a t i o ni nw a n x i w h i t e g o o s ep r lg e n er e s u l t e dt om e t 6 7 l e ua m i n oa c i dc h a n g e w h i l et 4 9 2 cw a sas y n o n y m o u sm u t a t i o n c7 0 tm u t a t i o ni nr h i n eg o o s ep r lg e n er e s u l t e dt oh i s 5 7 a r ga m i n oa c i dc h a n g ea n dt s 0cw a sa s y n o n y l n o u sm u t a t i o n as a m et cm u t a t i o nw a sa l s od e t e c t e di ni n t r o n2o fw a n x i - w h i t eg o o s ea n d r h i n eg o o s ep r lg e n eat cm u t a t i o nv c a sd e t e c t e da tt h es a m es i t ea ti n t r o n 2i nw a n x i - w h i t eg e e s e a n dr h i n eg e e s ep r lg e n e g e n e t i ca n a l y s i ss u g g e s t e dt h a t ，a m o n gw a n x i w h i t eg o o s ep o p u l a t i o n m ，t w oa l l e l ef r e q u e n c i e s d e t e c t e db yp 3p r i m e rw e r e0 4 2 3 7a n do 5 7 6 3r e s p e c t i v e l y , a l l e l ef r e q u e n c i e sd e t e c t e db yp 6w e r e o9 6 18a n do 0 3 2 8r e s p e c t i v e l y i nr h i n eg o o s ep o p u l a t i o n ，a l l e l ef r e q u e c i e sd e t e c t e db yp 3 a n d p 6 w e r e0 9 1 2 5 ，0 0 8 7 5a n do5 7 5 ，04 2 5r e s p e c t i v e l y p o l y m o r p h i ci n f o r m a t i o nc o n t e n t ( p i c ) o f p o l y m o r p h i cs i t e si nw a n x i w h i t eg o o s ep o p u l a t i o nd e t e c t e db yp 3a n dp 6p r i m e r sw e r eo 3 7 2 1a n d 0 0 7 0 8r e s p e c t i v e l y x 2f i t n e s s t e s ts u g g e s tt h a tt h ep o p u l a t i o nw e r ei nt h es t a t eo fh a r d y - w e i n b e r g d i s e q u i l i b r i u ma tt h et w os i t e p i co fp o l y m o r p h i cs i t e si nr h i n eg o o s ep o p u l a t i o nd e t e c t e db yp 3a n d p 6p r i m e r sw e r e014 6 9a n d0 3 4 9 3r e s p e c t i v e l y , s h o w e dt h a tt h ep o p u l a t i o nw a si nt h es t a t eo f h a r d y - w e i n b e r ge q u i l i b r i u m a tt h et w os i t e s i nw a n x i w h i t eg e e s ep o p u l a t i o nw i t he g gp r o d u c t i o nr e c o r d s ，t h r e eg e n o t y p ef r e q u e n c ya te x o n 2 w e r e0 3 2 8 2 0 1 9 0 8a n d0 4 8 1 0w i t hc o r r e s p o n d i n ge g gp r o d u c t i o n1 9 7 4 - t - 3 6 9 ，2 0 4 3 4 1 3a n d 2 1 2 4 3 9 2r e s p e c t i v e l y l e a s ts q u a r ea n a l y s i ss h o w e dt h a tg e n o t y p e sd e t e c t e db yp 3p r i m e rh a dn o s i g n i f i c a n tr e l a t i o nw i t he g gp r o d u c t i o n f u r t h e rr e s e r c hi sn e e d e do nw h e t h e rp o l y m o r p h i s md e t e c t e da t e x o n 5h a sr e l a t i o nw i t he g gp r o d u c t i o n t h et o t a le g gp r o d u c t i o no f4 3r h i n eg e e s ew a s14 6 0w i t ht h em e a ne g gp r o d u c t i o no f3 3 9 5 ， w h i c hh a das i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew i t ht h em e a ne g gp r o d u c t i o no f w a n x i w h i t eg e e s e ( 2 0 5 8 ) b ytt e s t k e y w o r d s ：w a n x i w h i t eg o o s e p r o l a c t i ng e n e ，c l o n i n g s e q u e n c i n g ，s n p , p c r - s s c p v 安徽省教育厅自然科学基金重点项目资助 ( 编号：2 0 0 5 k j l3 3 z d ) t h ep r o j e c tw a sf i n a n c e db yp r o v i n c i a ln a t u r a ls c i e n c e f o u n d a t i o no fm a jo ri t e mf r o m a n h u ie d u c a t i o n a li n s t i t u t i o n ( n o 2 0 0 5 k jl3 3 z d ) 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：础名霾- 时问：万年，月“同 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：盘蠡幺囊 时| - 日j ： 年；月衫同 第一导师签名熟里坠 时| 1 刨：年月 占f 1 文献综述 1 催乳素( p r l ) 的结构与功能研究 催乳素( p r o l a c t i n ，p r l ) 是垂体前叶嗜酸细胞分泌的多肽类激素，根据p r l 基 因敲除的动物模型，p r l 是产乳和繁殖等功能所必需的”：。随着研究的不断深入，更 多有关p r l 的功能被发现：调节体内渗透压平衡，生长发育，内分泌与代谢；脑与行 为；繁殖、免疫调节和保护等“1 。 1 1p r l 的基本结构 p r l 是由单基因编码的2 3 k d 的多肽类激素，几乎存在于所有脊椎动物中。除了 脑垂体前叶催乳素细胞分泌p r l 外，其他细胞和组织( 泪腺、胸腺、脾脏、某些淋巴 细胞等) 也可以分泌p r l ”1 。已报道的禽类催乳素前体含2 2 9 a a ，其中包括3 0 a a 的信 号肽序列和1 9 9 a a 的p r l 成熟蛋白。1 。p r l 多肽链中6 个半胱氨酸形成了3 个分子内 二硫键，并在氨基末端形成一个特有的二硫环“3 。p r l 中有四个保守区是其主要功能 结构域。p r l 的二级结构研究表明它含有5 0 的a 一螺旋，形成四个反平行的螺旋结 构。3 。 p r l 与g h 、p l 在结构和功能上非常相近，三者均属于造血因子家族，都具有四 个。一h e l i x ，与相应受体结合的胞外域也高度保守。每个螺旋含2 5 3 2 个残基，在 第l 、2 及3 、4 螺旋间有较长的延伸片段，形成上上下下的拓扑结构。p r l 分子在组 织蛋白酶d 的作用下，在t y r “i 与l e u “6 及t r p “8 与s e r “。问可自发发生蛋白酶解。切 除三肽( l e u v a l t r p ) 及二硫键断裂后，p r l 可产生n 端1 6 k d 和c 端6 k d 的小片段 “”：。p r l 在翻译后修饰可产生多种变体，如糖基化、磷酸化、二聚化、多聚化及蛋白 酶切的1 6 k d 产物。 1 2p r l 的功能研究进展 1 2 1p r l 与禽类就巢和繁殖的研究 研究表明，禽类的就巢性与血浆p r l 水平上升有关“。血浆p r l 浓度上升到一定 的程度可引发母禽的产蛋停止和就巢( s h a r p ，1 9 9 8 ) 。火鸡在产蛋期间p r l 水平较高， 在就巢期间水平最高”“。有就巢性母鸡垂体内催乳素含量比无就巢性的多，将p r l 注射给母鸡，可使母鸡就巢，而这种诱导效应只在天然有抱性的品系中发挥作用。 s h a r p ( 1 9 8 8 ，1 9 8 9 ) 等用抗鸡p r l 及v i p 的抗体对鸡进行被动免疫，成功地终止了 鸡的就巢行为”“；y o u n g r e n 等( 1 9 9 1 ) 用绵羊的p r l 诱导出火鸡的就巢行为。另 外，m a r c h 等( 1 9 9 4 ) 采用鸡p r l 的重组融合蛋白对矮脚鸡进行主动免疫，发现鸡血 浆中出现了抗p r l 的抗体并减弱了鸡的就巢行为的表现“i 。方弟安等( 2 0 0 5 ) 对皖西 白鹅繁殖周期中p r l 水平测定结果表明，就巢期的p r l 水平显著高于休产期和产蛋期 “。p r l 在就巢期阅抑制禽类的性腺活动，显著降低性腺重量，从而抑制生殖活动。 研究表明鸟类p r l 抑制繁殖性能可能在下丘脑一垂体一性腺轴的各个水平上。高水平 的p r l 可以直接抑制卵巢卵泡的发育和垂体促性腺激素的分泌，导致血液l h 水平下 降“”：下丘脑促性腺激素释放激素g n r h ( i 及i i 型) 的合成减少，使得卵巢萎缩，排 卵停止，最终产蛋停止( p e t e re la 1 ，2 0 0 3 ) 。然而，性腺萎缩程度因家禽品种而异。 从上述研究中得知p r l 对就巢的发生和维持有重要的作用并可导致母禽产蛋停止。 从而，禽类就巢的研究转向了对p r l 的基因结构及其表达调控的研究，p r l 基因 由此被认为是与禽类繁殖性状相关的候选基因。 1 2 2p r l 对生殖生理的调控作用 孕早期蜕膜上的p r l 及p r l r 都有丰富的表达。“，p r l 可刺激妊娠黄体l h c g 受 体的表达，促进自身受体的表达，可以与f s h 、l h 协同作用优化c a m p 和p 4 的合成。， 揭示p r l 可能通过自分泌旁分泌机制调节蜕膜局部环境及机体内分泌状态。 1 2 3p r l 的免疫调节及其它作用 p r l 是一种具有免疫刺激作用的激素。近年来的研究表明，免疫细胞可以表达 p r l r ，p r l 对免疫细胞的功能具有重要的影响，并与许多免疫相关疾病的发生、发 展有密切关系。免疫细胞本身可合成、分泌p r l 。p r l 在机体内的免疫神经一内分泌 调节网络中发挥重要作用，它不仅可以通过内分泌机制影响免疫系统的功能，而且还 作为一种由免疫系统所产生、释放的细胞因子，以旁分泌和自分泌方式调节淋巴细胞 的反应。 在哺乳动物中，p r l 主要起促进乳腺生长、发动和维持泌乳的功能。在少数动 物( 如小鼠、大鼠) 中，它具有促进黄体分泌的作用。在禽类，p r l 是促进换羽的 关键激素，火鸡的p r l 水平在全部雏禽孵出后2 4 h 内急剧下降，此时就巢行为转变为 护雏的母性行为。1 。 1 3p r l 结构与其功能问的关系 血浆中p r l 异构体己证明具有特殊的功能，就巢期f h j7 0 的血浆p r l 被糖基化， 性成熟前和刚刀：产时6 0 糖基化。休产期和换羽期间糖基化率分别是3 8 和3 3 。”1 。 说明糖基化程度的高低和p r l 的水平呈j 下相关，也与就巢性产生关联。s e t 和t h r 残 基的磷酸化导致p r l 失活。另外，n 端1 6 k 的p r l 异构体主要提高纤溶酶原激活物抑 制剂的m r n a 和蛋白水平，从而抑制血管的形成；1 6 kp r l 还可破坏p r l r 与p r l 的结 合位点，促进内皮细胞凋亡等功能“”5 。n 端酶解2 3 k 或1 6 kp r l 产生的1 4 1 ( p r l 样蛋 自办具有抑制内皮细胞增殖的作用。 1 4p r l 的调节及作用方式 p r l 主要由泌乳细胞和垂体前叶细胞分泌。p r l 分泌受f 负反馈调控，但主要受 下丘脑分泌的多巴胺( d o p a m i n e ，d a ) 等抑制因子的调控：”1 0 1 ，d a 抑制v i p 与d 2 受体结合的刺激作用，从而抑制了p r l 的释放。主动或被动免疫p r l 或v i p 已用于改 变p r l 的分泌水平。r e d d ye ta 1 ( 2 0 0 2 ) 证明从1 7 至3 6 周使用溴隐停( d a 阻断剂) 降低血浆p r l 水平可明显增加产蛋量。p r l 的合成调控包括很多小分子，如激素，神 经传导元件，神经肽等”“。 p r l 与细胞膜上的特定受体p r l r ( p r o l a c t i nr e c e p t o r ) 相结合从而引发多种生物 效应1 。j a k - s t a t 途径是p r l 行使其功能的主要途径。对大鼠的研究发现，p r l 与其 长型受体结合后，受体二聚化后激活与p r l 关联的胞质内j a n u s 激酶一2 ( j a k 2 ) 磷酸化， 或使信号传导和转录激活蛋白( s t a t l 家族) 磷酸化，激活的蛋白移位到细胞核内，启 动8 一酪蛋白、b 一乳球蛋白等目标基因的转录，这些蛋白因子介导p r l 的促黄体细胞 分化和其他作用。在某些种类的细胞中，p r l 可通过r a s r a f m a p k 途径、酪氨酸激 酶( p t k 途径) 、蛋白激酶c ( p k c ) 途径以及c a m p 途径等发挥作用 4 t o 2p r l 基因结构及多态性研究进展 2 1p r l 基因结构 目前已阐明了2 0 多种脊椎动物p r l 基因的一级分子结构。”州，在人类已被定位 于第6 号染色体。“，猪p r l 基因定位于7 号染色体( 7 p i1 2 1 2 ) ”“，大鼠和小鼠的 p r l 基因已定位于1 3 号染色体1 ，牛催乳素基因定位于第2 3 号染色体”，y - wm i a o 等利用与浚基因紧密连锁的r a p d 标记( m s u 0 0 2 0 ) 把催乳素基因定位于鸡第2 号染色 体”。根据对鸡、火鸡、鸭及其它哺乳动物的p r 基因全序列的报道，p r l 基因由5 个外显予和4 个内含子组成。在5 端有两个p i t l 结合位点，分别位于近端的一3 0 - - 1 7 5 和远端的一l5 0 0 1 8 0 0 ”。加拿大k a n a n s a k nn 等在g e n b a n k 上阐述了分别位 于近端和远端的三个启动子区域：p r o m o t e r l ：3 5 l 6 8 0 ( g e n b a n k ：a b 0 3 0 6 3 8 ) ， p r o m o t e r 2 ：6 7 2 9 5 8 (g e n b a n k ：a b 0 3 0 6 3 7)，p r o m o t e r 3 ：2 0 8 9 2 4 2 6 ( g e n b a n k ：a b 0 3 0 6 3 6 ) 。已证明近端区域与由p i t l 蛋白引起的启动子区域3 驱动的 p r l 基因在垂体前叶细胞中转录的关系十分密切”“。 p i t - ib i n d i l l gs i l 。 一t 口 口 二 口口3 e o n23 45 幽lp r l 是川一级站均_ i 盘蚓 f i g u r e l5 s t r u c t u r e m a po f p r lg e n e 2 2p r l 基因的表达 p r l 基因表达在转录水平上受到两个启动子调控”1 。近端启动子即垂体促进子 j 十 ， 覆盖转录启始位点上游5 k b ，外显子l b 处的r n a 聚合酶帽化位点2 5 0 b p 是转录所必 须的。第二启动子即垂体外启动子，包含外显子l a 上游的3 k b ，早期认为指导淋巴 细胞和脱膜p r l 表达。不同启动子，产生长度差1 3 4 b p 的m r n a ，但编码相同的蛋白 质。p i t l 可在泌乳细胞及前泌乳细胞中表达“，并协同些调节因子与p r l 启动子 结合激活p r l 转录。p i t l 可与p r l 远端增强子结合，应答雌二醇效应。p i t 一1 与e r 在c o s i 细胞中共表达导致与p r l 远端增强子融合的报告基因表达；与p r l 近端启动 子结合的调节元件同样可与p i t 一1 结合，通过c a m p 和t h r 调节p r l 转录诱导效应”“。 2 3p r l 基因多态性研究进展 近年来，通过p c r - - r f l p 及p c r - - s s c p 等方法，己检测出p r l 基因存在着丰 富的多念性。根据a n d r z e jd y b u s 的报道，不同品种家鸡问催乳素前体e d n a 的碱基 有较大的差异，主要集中在5 端、3 端非编码区以及信号肽区域：而在催乳素e d n a 结构基因中，碱基的差异较小p 。鸡的催乳索前体信号肽裂解位点有高度保守性，与 牛、人、鼠相同【5 。对粤黄鸡、丝毛乌骨鸡及伊莎蛋鸡催乳素基因e d n a 克隆与序列 分析表明，由前两者的催乳素前体的e d n a 片段推导的氨基酸序列中信号肽裂解位点 跟肉用仔鸡、矮脚鸡及火鸡的一样，为l e u p r o i l e c y s ，而伊莎蛋鸡的信号肽裂解 位点则不一样，为p r o p r o il e c y s ，推测这一突变可能是导致伊莎蛋鸡无就巢性的 主要原因( 周敏2 0 0 1 ) 。 p r l 基因多态性能改变激素的表达、功能及对受体的反应性，影响人及动物一系 列表型性状。周敏等在粤黄鸡、丝毛乌骨鸡及伊莎蛋鸡p r l 基因e d n a 的序列中发现 改变信号肽裂解位点的碱基突变( c r ) ”“。额尔和花等采用p c r - - s s c p 技术检测到 基因编码区8 0 5 2 位点的t c 突变和非编码区8 1 1 3 b p 位点的g c 突变。r sj i a n g 等( 2 0 0 4 ) 对莱航鸡、丝羽乌骨鸡、粤黄鸡p r l 基因5 侧翼调控区进行了同源性分析， 发现莱航鸡在近端启动子区域的一3 7 8 一3 5 5 处存在一个2 4 b p 片段的插入i “，根据崔 建勋等的统计分析，推断2 4 b p 片段的存在抑制了鸡p r l 基因的转录表达，进而抑制 了就巢的发生，使得产蛋性能处于高水平。詹慧琴等应用r f l p 技术检测到三个品 种家鸡c p r l 基因内含子2 中存在一个1 c 的突变”。 加拿大k a n a s a k nn 等( 2 0 0 0 ) 将肉鸡催乳素基因5 端三个启动子区域与火鸡5 端侧翼片段进行序列对比，发现肉鸡远端序列中有一约6 0 0 b p 的序列在火鸡中没有对 应序列1 。 人类催乳素基因在远端启动子区存在高度多态性，对淋巴细胞及子宫内膜上皮细 胞p r l 的转录具有不同的作用，并且在p r l 的免疫调节上有重要作用。在予宫内膜基 质细胞及淋巴细胞p r l 启动区g 1 1 4 9 t 位存在一个g t 突变，推测这一突变与全身性 红斑狼疮及周期性流产有关( a s t e v e n se ta l ，2 0 0 3 ) 。用e 2 诱导小鼠产生的乳腺瘤细 胞中表达的p r l 近端启动子区一3 6 位存在一个c a 突变，导致乳腺瘤细胞高水平表达 p r l 基因( w ux u e m e i ，2 0 0 0 ) 。a l v i n c e n t 等( 1 9 9 7 ) 采用p c r r f l p 技术分析绵羊第2 内含子，发现l t a e l i i 及m s ei 酶切在萨福克羊中产生两种新基因型；a ，l v i n c e n t 等同 时对7 个品种猪p r l 基因进行分析，g s t ui 酶切发现两个多态位点、三种单倍型。 t l v a r d ye ta l 检测到水貂p r l 第3 内含子存在c g 突变。荷斯坦牛p r l 基因第3 外 显子存在一个a g 突变( 1 0 3 a a ) ，推测这一突变对奶牛的产乳量及乳脂率具有显著的 促进效果( a n d r z e jd y b u s ，2 0 0 2 ) ，同时在牛的e x o n4 区共检测到6 个沉默突变的s n p 位点( b r y mp e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。牦牛的5 侧翼区检测到一个a l ui 位点( o uj i a n g t a oe ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。 引言 我国是水禽生产大国，水禽产量占世界的6 0 以上。2 0 0 4 年我国鹅的存栏量为 2 2 8 亿只，位居世界首位，当年出栏鹅4 9 4 亿只，占世界鹅出栏量的9 2 7 ，鹅肉产 量达1 9 7 4 万吨。 中国是世界上驯化饲养鹅最早、品种资源最丰富的国家之一。我国饲养鹅的历史 大约有3 1 0 0 多年，由于从古至今我国人民的养鹅、爱鹅、食鹅的习惯，再加上幅员 辽阔，各地自然生态条件复杂多样及不同时期的经济文化背景不同，对鹅的选择利用 目的不同，逐步形成了具有不同遗传特性和生产性能的优良地方品种。分布于东北地 区的吉林白鹅、籽鹅、豁眼鹅等，平均年产蛋量可达1 0 0 枚以上；分布于西南地区的 四川白鹅，年产蛋量在7 0 枚左右；两我国的一些中大型鹅种，平均年产蛋量均不超 过3 0 枚，且表现出较强的就巢性和产蛋季节性。迄今为止，国内进行的有关提高鹅 繁殖性能的研究主要集中在通过常规选育和杂交提高后代繁殖性能，或采用生殖激素 内分泌调控等方法来提高鹅的产蛋量。 影响鹅繁殖性能的因素较多，鹅的就巢性是影响其繁殖性能的一个主要因素。因 此消除就巢性，提高鹅的产蛋量是当前提高鹅繁殖力的有效方式之一。研究表明，就 巢性受二对显性基因( a a c c ) 控制并受其它微效多基因的影响，且在公鹅中不表现。 虽然通过常规选育即可剔除就巢性，但需要较长的时问。因此，可通过与就巢基因相 关的分子标记，经辅助选择等手段快速减弱母禽的就巢性，进而提高母禽的产蛋量。 大量研究表明，p r l 对就巢的发生和维持有重要的作用，从而禽类就巢的研究转 向了对p r l 的表达调控的研究，p r l 基因从此被认为是与禽类繁殖相关的候选基因， 禽类就巢的基因研究也就主要集中在p r l 基因上。目前，国内外相关实验室正在从事 p r l 基因的结构和突变及其与就巢和产蛋性能之间的关系的研究。 随着生物技术的广泛应用，d n a 多态位点的检测变得更为直接和快速。s n p ( s i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ) 指的是基因组中单个核苷酸发生变异引起的d n a 序列多态性，包括单个碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式。s n p 标记具有高密度、 代表性、遗传稳定性及容易实现自动化分析等特点【旧，因此，近年来被广泛研究。 分析s n p 位点的方法有多种，如s s c p - - s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ， h a - - h e t e r o d u p l e xa n a l y s i s ，d g g e - - d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e l e l e c t r o d h o r e s i s ，d h p l c d e n a t u r i n gh i g h p r e s s u r e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，c c m c h e m i c a lc l e a v a g eo f m i p a t c h ，e m d e n z y m a t i cm u t a t i o nd e t e c t i o n ，b e s s b a s e e x c i s i o ns e q u e n c e s c a n n i n g ，此外，在一些基因组序列较为丰富的物种中还可以通过比较现有的数据库 中已有的序列检测s n p 。 p c r s s c p 技术的特点：原理简单，操作简便技术容易掌握，实验步骤少，周期 短；灵敏度高仅单个碱基的差异也可检测出来；适用于大样本的筛选；更适宜于对 功能基因进行研究：对原始材料要求不高，且所需量较少。基于p c r s s c p 技术的以 上特点，本实验采用了p c r - s s c p 技术对皖西白鹅p r l 基因序列进行多态性分析。 近年来国内外对催乳素基因多态性及其变异与生产性能相关性分析虽有一些研 究，但这些研究大多集中在对猪、奶牛、鸡等动物。有关鹅p r l 基因序列尚未登录， 对鹅p i l l 基因序列的多态性及与生产性能相关性分析的研究也末见报道。 皖西白鹅是我国优良的中型鹅品种，属国家级畜禽品种资源保护品种。皖西白鹅 素以体型大、早期生长发育快，抗病力强，耐粗饲、耗料少，肉质好等特点，尤其是 其产毛量高，羽绒品质好而享誉国内外。作为我省优良品种的皖西自鹅为季节性产蛋， 平均每年产2 3 期蛋，年产蛋量仅在2 0 枚左右，且母鹅就巢性极强，只有少数鹅( 3 4 ) 无就巢性、产蛋较多( 3 0 ；4 0 枚) ，俗称“常蛋鹅”，但因不符合当地自然抱孵 的繁殖习惯，多被淘汰。随着养鹅业的发展，鹅的生产方式发生了变化，当前皖西白 鹅低产蛋量已成为其产业化发展的瓶颈。 本研究利用多对引物扩增的方式，序列比较法克隆皖西白鹅p r l 基因编码区全 序列，并对p r l 基因第l 、2 和5 外显子的序列变异及与产蛋性能的关联进行研究， 同时以莱茵鹅作为对照品种进行相同序列测定与分析，旨在克隆鹅p r l 基因编码区 序列和从皖西白鹅群体筛选催乳素基因中的单核苷酸多态( s i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m ，s n p ) ，为进一步建立s n p 分型，研究催乳素基因多态性及使用标记 辅助选择( m a r k e r a s s i s t e ds e l e c t i o n ，m a s ) 等手段，保护皖西白鹅这一优良品种和 提高其繁殖性能提供依据。 材料与方法 1 实验材料 1 1 试验动物 皖西白鹅1 3 1 只，莱茵鹅4 0 只，均选自安徽省皖西白鹅原种场，所采血样均为 2 m l 只，a c d 抗凝，1 m 1 用裂解液保存，l m l 冻存于一2 0 。 1 2 菌株与克隆载体 本研究所用菌株见表l ： 表1 ：转化所用菌株 t a b l e 卜b a c t e r i a ls t r a i nf o r t r a n s f o r m a t i o n 菌株名称 b a c t e r i a ls t r a i n 表型及基因型 p h e n o t y p e g e n o t y p e h s d sg a l ( xc l t s 8 5 7i n d ls a m 7n i n 5l a cu v - 5 - t 7 皋吲1 ) p m d 1 8 t 克隆载体购自t a k a r a 公司 1 3 药品与酶 大连宝生物工程有限公司：t a q d n a 聚合酶，d n t p ，t 载体连接试剂盒；a m r e s c o 公司：丙烯酰胺( a c r y l a m i d e ，a c r ) ，n ，n 一亚甲基双丙烯酰胺( b i s a c r y l a m i d e ，b i s ) ，过 硫酸胺(