（动物遗传育种与繁殖专业论文）肉兔微卫星标记遗传多态性分析及其与体重性状的相关研究.pdf

摘要 本试验选用1 6 对小鼠微卫星引物，通过其在家兔基因组上进行多念性扩增，计算 出这些微卫星标记座位的等位基因频率、多念信息含量、群体杂合度：通过标记多态性 与体重性状的最小二乘分析和多重比较，进行了分子标记与体重性状的相关分析。结果 表明： 所选1 6 对微卫星引物中，有5 对扩增出产物并呈现出一定的多态性，且所有扩增 结果都能重复。微卫星标记座位平均检测到4 2 个等位基因( 2 7 个) ，5 个微卫星标记 的平均多态信息含量为0 5 4 4 8 ，平均杂合度为0 6 0 5 1 。 通过最小二乘分析标记与生产性能的关系，检测到5 个标记d 1 m i t 3 0 、d 7 m i t 6 2 、 d 7 m i t 8 2 、d 9 m i t 4 6 、d 1 4 m i t l 与肉兔的三种体重性状( 初生重、2 1 同龄体重、3 5 同龄 体重) 存在显著相关( p o 0 5 ) 。品种内：在新西兰兔中d 7 m i t 8 2 基因型b c 所对应的3 5 日龄体重最小二乘均值最高；加尼福利亚兔中d 9 m i t 4 6 基因型d g 所对应的2 1 同龄体 重最小二乘均值最高，d 1 4 m i t l 基因型a b 所对应的初生重、3 5 同龄体重最小二乘均值 最高，基因型b c 所对应的初生重的最小二乘均值最低；天府黑兔中d 1 m i t 3 0 基因型 b c 所对应的初生重最小二乘均值最高：从总群体的分析来看，标记d 1 m i t 3 0 中基因型 c c 与初生重、2 1 日龄体重性状存在相关：基因型d d 与2 l 闩龄体重性状存在显著性差 异；基因型e e 与3 5 日龄体重间存在显著性差异；d 7 m i t 6 2 基因型a b 所对应的3 5 同 龄体重最小二乘均值显著高于基因型a a 、b b ：标记d 7 m i t 8 2 中基因型b d 与初生重和 2 1 日龄体重性状之间具有相关性；基因型a a 、a c 、b d 与3 5 同龄体重性状存在相关： 标记d 9 m i t 4 6 中基因型c e 、b c 、d g 与2 lf i 龄体重性状存在显著性差异( p o 0 5 ) ；基 因型a c 、b e 、d e 、b c 、c e 、e e 与3 5 同龄体重性状存在相关( p o 0 5 ) 。 说明了d 1 m i t 3 0 、d 7 m i t 6 2 、d 7 m i t 8 2 、d 9 m i t 4 6 、d 1 4 m i t l 四种微卫星标记可作为 肉兔体重性状连锁分析的侯选遗传标记，为进一步肉兔体重性状的q t l 定位以及分子 标记辅助选择等研究提供理论依据。 关键词：内兔体重性状微卫星标记多态性相关分析 a b s t r a c t s i x t e e nm i c r o s a t e l l i t ep r i m e r ss e l e c t e df r o mm o u s eg e n o m ed a t a b a s ew e r ea n a l y z e df o r p o l y m o r p h i s mi nr a b b i t a l l e l ef r e q u e n c i e s w e r ee s t i m a t e db a s e do nb a n dp r e s e n c eo r a b s e n c e a v e r a g eh e t e r o z y g o s i t y ( h ) a n dp o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o nc o n t e n t ( p i c ) w e r e c a l c u l a t e db ya l l e l ef r e q u e n c i e s ，a n dt h e n ，l i n k a g ea n a l y s i sb e t w e e nc h a r a c t e ra n dm a r k e r sb y l e a s ts q u a r e sm e a n sa n dt h ec o r r e l a t i o na m o n gt h e3c h a r a c t e r so f b o d yt r a i t si n4b r e e d so f r a b b i tw e r es t u d i e d t h er e s u l ti n d i c a t e ： 5p a i r so fm i c r o s a t e l l i t ew e r ep o l y m o r p h i ca n dc o u l dg i v ec o n s i s t e n c e t h ea v e r a g e m a r k e ro f a l l e l e sd e t e c t e db yap a i ro f p r i m e r sw a s4 2 t h ea v e r a g ev a l u eo f p i cw a so 5 4 4 8 a n dt h ep o p u l a t i o n h e t e r o z y g o s i t yo f t h e m i c r o s a t e l l i t em a r k e r sw a so 6 0 1 5 w ef o u n dt h e r ew e el i n k a g e sa m o n g5m a k e r sa n d3c h a r a c t e r si nr a b b i tt h r o u g hl e a s t s q u a r e sm e a n s a n a l y s i si ne a c hb r e e d ，l e a s ts q u a r e sm e a n so f3 5 d a yw e i g h tf o rd 7 m i t 8 2 b cw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s ef o ra b ，c ci nn e w z e a l a n d l e a s ts q u a r e sm e a n so f 2 1 - d a yw e i g h t f o rd 9 m i t 4 6d gw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s ef o rb b ，b d ，d d ，a n d d f i nc a n i f o r l i a n l e a s ts q u a r e sm e a n so f b i r t hw e i g h tf o rd 1 4 m i t la bw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a n t h o s eo f o t h e rg e n o t y p e s i n c a n i f o r l i a n l e a s ts q u a r e s m e a n s o f b i r t h w e i g h t f o r d l m i t 3 0 b cw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s eo fo t h e rg e n o t y p e si nt y f o i nb e l g i a n ，l e a s ts q u a r e s m e a n sf o re a c ho f m a r k e r sg e n o t y p e sw e r en o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c e si nb i r t hw e i g h t ，2 1 d a yw e i g h t ，3 5d a yw e i g h t ，9 0d a yw e i g h ta n da v e r a g ed a i l yg a i nf r o mb i r t ht o9 0d a y a n a l y s i si ne a c hb r e e d ，g e n o t y p ec cw a sl i n k e dw i t hb i r t hw e i g h ta n d2 1 - d a yw e i g h t ，d d a n de ew e r el i n k e dw i t h21 d a yw e i g h t ，3 5d a yw e i g h t i nd 7 m i t 6 2 ，g e n o t y p ea ba n da a ， a c ，b do fd 7 m i t 8 2a n da c ，b e ，d e ，b c ，c e ，e eo fd 9 m i t 4 6w e r el i n k e dw i t h3 5d a y w e i g h t ；g e n o t y p eb d o fd 7 m i t 8 2a n dc e ，b c ，d go fd 9 m i t 4 6w e r el i n k e dw i t h2 1 - d a y w e i g h t e x p l a i n e dd 1 m i t 3 0 ，d 7 m i t 6 2 ，d 7 m i t 8 2 ，d 9 m i t 4 6 ，d 1 4 m i t lm i c r o s a t e l l i t em a r k e rc a n b eu s e da st h ea n a l y t i cm a r k e r si nr a b b i ti nm e a tc h o o s e st oi n h e r i tt h em a r k e r ，f o rq t lf i x e d p o s i t i o na n dm a r k e ra s s i s t a n c es e l e c te t c o ft h ef u r t h e rm e a tr a b b i tw e i g h tf o r mt h er e s e a r c h p r o v i d e st h et h e o r i e sa c c o r d i n g t o k e yw o r d s ：r a b b i t ，b o d yw e i g h t ，m i c r o s a t e l l i t e ，p o l y m o r p h i s m ，c o r r e l a t i o na n a l y s i s 2 1 前言 自2 0 世纪8 0 年代以来，随着分子生物学技术的快速发展，各种畜禽的分子水平分 析已成为广大动物遗传育种学家研究的热点，其目的是为了建立饱和基因图谱，进行标 记辅助选择，向高产、优质、抗病、高效的现代畜牧业靠近，以及保护人类赖以生存的 生物多样性。目前用于畜禽遗传育种研究的分子标记主要有限制性片段长度多态性 ( r f l p ) 、随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 、d n a 指纹、微卫星d n a 、单核苷酸多态性( s n p ) 等。一个理想的遗传标记应具有数量大、分布广、呈扶显性遗传、遗传稳定、检测快速 方便、准确度高、重复性好等特点。相比之下。微卫星d n a 标记在目前畜禽遗传育种 中应用较广，也较深入。 1 1 微卫星d n a 标记 微卫星是近十年发展起来的一种新型的分子遗传标记，具有数量大、分布广且均匀、 多态信息含量高、检测快速方便以及适合自动化和半自动化分析等优点。目前已被广泛 用于动植物基因图谱的构建、功能基因及q t l 定位、标记辅助选择、血缘关系鉴定、 遗传多样性评估、系统发生树的构建等方面。 微卫星d n a 由侧翼序列和串联重复核心序列组成，其串联重复的核心序列长度一 般为1 6 b p ，其中最常见的是双核苷酸重复，i i 口( c a ) n 和( t g ) n 。每个微卫星d n a 的核 心序列结构相同，重复单位数目l o 6 0 个。微卫星标记的基本原理是根据微卫星序列两 端互补序列设计引物，通过p c r 反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不 同，因而能够用p c r 的方法扩增出不同长度p c r 产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根 据分离的片段大小决定基因型并计算等位基因频率。 1 1 1 微卫星d n a 的多态性 微卫星d n a 的多态信息含量十分丰富，通过对微卫星d n a 多态性的研究，可在 生产中选取数个与生产性能相连锁的微卫星标记，在这些位点上对所研究品种或品系进 行分析，计算父本与母本问的遗传距离来进行杂种优势预测，或者直接通过统计模型来 分析生产性状与微卫星的相关性以及其他研究。 1 1 1 1 微卫星d n a 多态性形成的机制 微卫星位点是由微卫星的核心序列与其两侧的侧翼序列构成。侧翼序列使微卫星位 点具有特异性，微卫星d n a 本身重复单位数的变异是形成微卫星位点多态性的基础， 这种多态性的信息含量比较丰富。一般认为，微卫星重复数的多态性是由减数分裂过程 中的不平衡交换、有丝分裂中姐妹染色单体的不等量交换以及复制时期d n a 滑动引起 单一重复单位的增加或缺失等因素造成的。因此，一般来蜕，一个微卫星d n a 的核心 序列重复数越高，其等位基因数也就越多，即多念性愈高。 1 1 1 2 微卫星d n a 多惫性的研究方法 微卫星多态性分析有两种方式：一种是对于已有的微卫星d n a ，可在数据库中直 接寻找适合的引物，对基因组进行p c r 扩增和测序凝胶电泳来分析微卫星d n a 的多念 性。另一种是对于未知序列，则要先建立基因文库，然后用人工合成的寡核苷酸探针杂 交，获得阳性克隆，提取质粒后利用载体插入位点两端的已知序列设计引物，再去测定 插入片段的序列，即可清楚的知道某一微卫星位点及其侧翼序列结构，最后在微卫星 d n a 两端侧翼序列选出合适的p c r 引物，检测基因组样品中微卫星d n a 的多态性。 再进一步分析计算等位基因在研究群体中的基因频率及群体中各位点的杂合度等。 1 2 微卫星的保守性 大多数微卫星具有种特异性和家系特异性。多数研究认为，微卫星核心序列的变异 属于同步突变模式，即每一次增加一个或几个重复序列，导致新的等位基因出现。m o o r 等( 1 9 9 1 ) 用牛的微卫星引物分别在羊、马及人的基因组中进行扩增发现：在羊中5 6 的 引物可扩增出特异产物，其中4 2 的扩增产物表现多念性，而在马和人中则未扩增出多 态产物。d i e t z 等( 1 9 9 3 ) 还直接将从羊的基因组中分离出的7 个微卫星位点中的5 个定位 到牛的基因图谱上。b r e e n 等( 1 9 9 4 ) 用家马的1 3 个微卫星位点侧翼引物成功地从蒙古 野马的基因组中扩增出了多态性产物。l e v i n 等( 1 9 9 5 ) 用4 8 个鸡微卫星位点的引物，以 火鸡的基因组为模板进行扩增发现：9 2 的引物能扩增出产物，3 3 的扩增物经鉴定是 与鸡同样的微卫星，其中约2 8 表现出多态性。然而同样的实验。l i u 等( 1 9 9 6 ) 的结果 要悲观的多：8 8 对引物结果发现6 9 1 ( 6 1 ) 有扩增产物，其中3 7 个在三个不同的家系 中表现为单念，仅8 个表现出多态性，且其中5 个位点杂合性不高。 从目前的资料看，可以确定微卫星位点在紧密相关的物种问具有位罱保守性，但在 多大程度上具有保守性，以及这种保守性或保守位点的多态性在不同的目、科、属间是 否存在差异有待进一步研究。微卫星标记位置保守性的发现对微卫星的研究有十分积极 的意义，我们可以避免直接从基因文库中筛选微卫星位点的烦琐性，在一个物种微卫星 研究中利用另一个物种的研究结果，从而更快、更准确地找到该物种中更多的微卫星位 点，以便用于遗传作图及其他用途。 4 1 3 家兔分子遗传研究现状 家兔饲养是畜牧业中比较年轻的一个产业，生产中普遍使用的是引入品种与地方品 种进行二元或三元杂交。与其他畜禽如猪、牛、羊、鸡等相比较，对家兔的研究尤其是 有关分子遗传的研究非常少，对与生产性状有关的基因及其标记研究在园内还未见报 道。因而如果能将家兔的生产性能与基因组研究结合起来，找到与生产性能连锁的遗传 标记，对生产性状的改良有望得到提高。 1 3 1 家兔基因图谱研究现状 随着分子生物学技术的快速发展，畜禽基因组分析已逐渐成为广大动物遗传育种学 家研究的前沿，其目的是将各物种的全部遗传物质尽可能详细地描述，并制成遗传连锁 图谱，标明各基因位点和标记位点在染色体上的相对位置、排列顺序，为确定这些遗传 位点间如何相互作用提供遗传基础。相对来说，兔与猪、牛、羊、鸡等畜禽的基因组研 究比较起来较少。 ： 1 3 1 1 家兔连锁图谱研究现状 1 9 0 0 年孟德尔遗传理论被重新发现后，关于家兔遗传研究的报道开始出现。c a s t l e 在1 9 0 5 1 9 4 0 年问对家兔毛色、毛发结构等方面做了大量的遗传研究。他在1 9 1 9 年首 次报道了荷兰兔毛色基因d u 与显性白色花斑基因e n 连锁。到6 0 年代，许多免疫遗传 标记已加到家兔遗传图谱上。到8 0 年代，开始了生化研究，但很少放入遗传图谱。在 1 9 9 4 年，f o x 提出了由1 0 个连锁群的6 9 个位点构成的一张连锁图，其中有1 1 个位点 已定位在常染色体上，5 个位点位于x 染色体上。 1 3 1 2 家兔物理图谱研究现状 基因的物理定位一方面可以将连锁群定位到染色体上，另一方面可以比较家免与其 它动物的染色体同源性。家兔的基因定位也不如人、鼠、猪、牛、羊等进行的深入。物 理定位的第一个家兔基因是p t ( 主要控制神经系统疾病的基因) ，被定位于x 染色体上 ( 0 s e t o w s k a ，1 9 6 7 ) 。g e l l i n 等( 1 9 8 5 ) 将酪蛋白a 基因和d 基因定位在1 2 号染色体q 2 4 区， 这是在家兔常染色体上定位的第一个基因：定位的第二个基因是肌酸激酶大脑型( c k b b ) 基因，出m a l l o n c y 等( 1 9 8 8 ) 将之定位在兔2 0 q 1 3 - q 1 4 ，同时将c k b b 定位在人的1 4 q 强 上。肌酸激酶肌肉型( c k m m ) 基因已通过分子原位杂交被定位到 1 9 q ll q 1 2 ( p a m a n i n _ d e l o n 等，1 9 8 9 ) 。s o d i 、s o d 2 、r b i 、t y m s 和t k i 己分别被定 位到6 、1 2 、8 、9 、1 9 号染色体上( n l e m i e u x 等，1 9 9 2 ) 。家兔类b 珠蛋白基因簇( h b b c ) 由- ，t - ，6 - ，p - 珠蛋白基因( h b e 、h b g 、h b d 、h b b ) 组成，已被定位到l 号染色体 q l 如q 2 1 上。编码家兔磷酸化酶激酶q 、1 3 亚基的p h k a 定位于x 染色体长臂近着丝粒 端和p h k b 定位于5 号染色体的相同位景。另外，g 6 p d 、g l a 、p g k 和t r a 3 也得知 位于x 染色体上，但确切位置还未定( x u 等，1 9 8 9 , d e b e c k e r 等，1 9 9 2 ) 。c h k o s 等 ( 1 9 9 6 ) 使用荧光原位杂交将磷酸钠转运基因( n t p i 和n t p 2 ) 分别定位在1 2 p i 1 和3 p l ie 最近，对家兔某些基因的克隆也有报道。使用特定的人l g a l s 3 c d n a 作为引物结 合r t - p c r 技术，可将家兔l g a l s 3 基因的完整编码区序列克隆出来，该基因编码区为 7 2 6 b p ，翻译成2 4 2 a a 的多念链。l g a l s 3 的碳水化合物识另i i k ( c 端) 与其它哺乳动物 同源性较高，而n 端的保守性较低。c a r l yw a u i s 等( 1 9 9 5 ) 从家兔基因组文库中将生长 激素基因克隆出来并测定出其碱基序列。家兔g h 与其它哺乳动物的类似，出5 个外显 子和4 个内含子组成，与其它啮齿目和偶蹄目动物一样，单个基因起作用，而象灵长类 有明显的类g h 基因族。兔g h 的氨基酸序列与猪g h 类似，而与反刍动物、灵长类 g h 有明显区别。 1 3 2 家兔分子遗传标记研究 采用d n a 分子标记在家兔上进行研究的报道更少。兔子微卫星研究由r i c o 等( 1 9 9 4 ) 开始，通过克隆找到4 个位点，s 0 1 0 3 、s 0 1 0 8 、s 0 1 2 8 、s 0 1 3 0 ；随后m o u g e l - f 等( 1 9 9 7 ) 使用6 对寡核苷酸混合物作为探针，从牛基因组文库中获得包含重复序列的6 个克隆 ( s a t 5 、s a t 7 、s a t 8 、s a t l 2 、s a t l 3 和s a t l 6 ) ，并从e m b l 基因组文库中克隆出另外3 种 微卫星位点( s a t 2 、s a g 、s a m ) ，在7 只野兔d n a 中进行p c r 扩增，发现这9 个位点均 有3 - 7 个等位基因，而且呈孟德尔遗传。s u r r i d g e - a k 等( 1 9 9 7 ) 从欧洲野兔基因组文库中 克隆出2 个多态微卫星( s 0 1 3 3 、s 0 1 4 4 ) ，这2 个位点和另外4 个以前报道的多态位点 ( s ol 0 3 、s 0 1 0 8 、s 0 1 2 8 、s 0 1 3 0 ) 均在另外2 0 种兔形目动物中得到扩增。 l i t h ，h a v a l l 等( 1 9 9 6 ) 对e m b l 基因组数据库进行搜索，发现家兔的遗传图谱上共有 1 8 1 个微卫星标记。d n a 序列上大约每2 3 k b 有一个微卫星标记，双核苷酸重复序列 是最普遍的微卫星标记，其次是三核苷、单核苷、四核苷重复序列，其长度分别为2 6 b d 、 2 3 b p 、2 3 b p 、2 2 b p 。最常见的重复单位是a g ，然后是a 、a c 、a g g 、c g g ，而其他 哺乳动物最常见的微卫星序列为( t c ) n 。其中6 1 的微卫星标记d n a 序列上的非编码 区，1 5 在编码区，而2 2 在散布的重复序列中。 利用随机扩增多态d n a ( r a p d ) 对家兔核基因组进行研究也有报道。k o h m c 等 ( 1 9 9 8 ) 使用2 0 种1 0 b p 寡核苷酸( g c 含最为5 0 - 8 0 ) ，对从兔肉提取的d n a 进行扩增， 结果含8 0 g c 的1 0 种引物中有8 种显示特异带。杨丽萍( 1 9 9 9 ) 采用r a p d 技术对布列 6 塔尼亚兔( 4 个品系) 、新西兰白兔、加利福尼亚兔进行了分析，并对影响家兔r a p d 分 析的因素进行研究。根据多态性结果，计算了各品种间、品种内的遗传相似度，发现加 利福尼亚兔品种内的相似最高，为o 9 2 0 9 ，品种最纯。品种问的遗传相似范围在0 6 6 7 3 0 8 1 5 8 ；同时利用u p g a m 、n j 法进行聚类分析，发现布列塔尼亚d 系与新西兰白兔、 加利福尼亚兔亲缘关系较近，a 系与b 系间亲缘关系较近。 在家兔的线粒体基因组上也有一些研究。h e t c h 等( 1 9 9 0 ) 通过r f l p 分析，推测家兔 m t d n a 总长度为1 7 3 k b ，存在4 个a v a l 酶切位点，其他酶切位点如下：b a m hi2 个、 b e li6 个、c l ai2 个、e c o r v1 个、h i n di i i7 个、h p ai4 个、p s ti2 个、p v u i l 2 个、 s a ci3 个、x b ai2 个。秦树臻等( 1 9 9 3 ) 用9 种限制性内切酶对福建黄兔线粒体d n a 进 行分析，也得到相似的结果。g i s s i 等( 1 9 9 8 ) 通过酶切、克隆、测序分析了家兔m t d n a ， 得到了家兔m t d n a 的第一条全序列，长度为1 7 2 4 5 b p 。 总之，不管与其他畜禽相比，还是从研究取得的成果来看，对家兔的分子研究均较 少，尤其是在生产性状上。为了向高产、优质、抗病、高效的畜牧业靠近，为了保护人 类赖以生存的生物多样性，在家兔上寻找到更多的分子标记，使家兔的基因图谱构建、 基因定位、标记辅助选择和遗传多样性分析等能够得到更深入、更广泛、更全面的研究， 从而提高家兔的各项生产性能指标，创造更大的畜牧业经济效益。 1 4 本研究的目的和意义 1 4 1 目的：本试验通过微卫星标记在相近物种间具有一定保守性的研究手段，利用小 鼠上与体重性状相关的微卫星d n a 引物在家兔基因组中进行扩增，并对扩增产物的多 态信息含量进行检测，然后挑选其中多念信息含量丰富的微卫星标记，通过微卫星的多 态性研究手段，在肉兔上对体重性状进行相关分析。 1 4 2 意义：由于微卫星具有保守性的特点，大大减少了在家兔基因组中检测微卫星位点 的工作量，加快了不同物种间比较基因图谱以及家兔饱和基因图谱的制作速度，并且通 过分析微卫星多态性位点与生产性状的关系，为迸一步寻找影响这些性状的q t l 提供 新的资料，进行分子标记辅助选种，以提高家兔的生产性能，从而加快我国家兔分予水 平的研究。 2 试验材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 试验兔群及性能测定 试验家兔取自四川农业大学科研兔场的健康兔群，选择新西兰白兔、加尼福利亚兔、 比利时兔、天府黑兔4 个肉兔品种，每一品种的纯繁后代在相同的饲养管理条件下进行 饲养，专职人员管理。每一品种样本数为3 0 只。记录初生重、2 1 同龄体重、3 5 同龄体 重、9 0 日龄体重，计算初生至9 0 同龄平均开增重。 2 1 ，2 试验用仪器设备 p c r 扩增仪( tg r a d i e n t ，德国b i o m e t r a ) 、台式高速冷冻离心机( 上海) 、多功 能暗箱式紫外透射仪( z f 9 0 x 型，上海顾村电光仪器厂) 、微型旋涡混合仪( 上海) 、 高压灭菌锅( y x q s g 2 8 0 型，四川成都医疗器械厂) 、垂直板电泳仪( p r o t e a ni i ， b i o r a d ) 、脱色摇床、循环水浴箱( m o d e le 4 8 6 0 ，b i o r a d ) 、一2 0 冰箱( m e d i c a l f r e e z e r ， 日本s a n y o 海尔) 、- 7 0 c 冰箱( h a r r i s ) 、电子天平( s h a n g p i n gf a 2 0 0 4 ，上海天 平仪器厂) 、烘箱、超纯水仪( w a t e r p r o p s ，l a b e o n c o ) 、凝胶成像分析系统( b t s 2 0 m ， 英国u v i t e c ) 及凝胶图形分析软件( u v lb a n d ) 、微机、超声波洗涤仪等。 2 1 3 主要试剂及配制 t a q d n a 聚合酶、p c rb u f f e r 、m g c l 2 、微卫星引物、d n t p 、去离子甲酰胺、甲叉 双丙烯酰胺、过硫酸胺、t e m e d 、琼脂糖、硼酸、甲醛、溴酚兰、e b 、尿素、过硫酸 胺、a g n 0 3 、n a o h 、二甲苯青f f 、四硼酸钠、t r i s 、浓h c l 、蛋白酶k 、s d s 、e d t a 、 饱和酚( p h 8 0 ) 、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇等。 抗凝剂：t r i s3 0 3 9 ，e d t a9 3 1 9 ，s d s2 8 0 9 ，加灭菌水溶解，定容至2 8 0 m l t r i s - h c l 贮存液( 1 m o l lp h8 o ) ：1 2 1l g i r i s 碱，溶于8 0 m l 水中，加4 2 m l 左右浓 盐酸，调节p h 到8 0 ，定容到1 0 0 m l ；分装后灭菌 e d t a 贮存液( 0 5 m o l lp h 8 o ) ：在8 0 m l 水中加入1 8 6 1 9e d t a n a 2 h 2 0 ，剧烈搅 拌；以n a o h 调p h 到8 0 ；定容到1 0 0 m l ，分装后灭菌 s t e 溶液( p h8 o ) ；t r i s - h c l 贮存液( 1 0 m m o l l ) 3 m l ，e d t a 贮存液( 1 m m o t l ) 4 0 m l ，n a c l0 2 9 2 6 9 ，定容到10 0 m l ，分装后灭菌 5 x t b e 缓冲液：5 0 0 m l 水中加入5 4 9t r i s 、2 7 5 9 硼酸、2 0 m le d t a 贮存液，加水 定容到1 0 0 0 m l 1 0 s d s 溶液：称取1 0 9s d s ，n a 9 0 m l 超纯水；6 8 加热溶解，加微量盐酸调 p h 至中性 上样缓冲液( 1 ) ：o 5 m g 溴芬兰、8 0 m g 蔗糖，加水2 0 0 k t l 上样缓冲液( 2 ) ：0 9 8 9 去离子甲酰胺、2 0 ) , t le d t a 贮存液、0 2 s t a g 二甲苯青f f 、 0 2 5 m g 溴芬兰，加水至l m l 4 0 丙烯酰胺贮存液：1 9 0 9 丙烯酰胺、1 0 9n , n 一旺甲双丙烯酰胺，溶于3 0 0 m l 水 中，3 7 0 溶解：加水至5 0 0 m l ，棕色瓶4 0 保存 0 1 a g n 0 。溶液：l ga g n 0 。用水溶解后，定容到1 l 四硼酸钠显色液：1 5 9n a o h 、0 1 9 9 n a 2 8 4 0 t h 2 0 、4 m l 甲醛，加水至l l 2 2 试验方法 采集血样，抽提新西兰白兔、加尼福利亚兔、比利时兔、天府黑兔的基因组d n a ， 用所选微卫星引物对基因组d n a 进行p c r 扩增，扩增产物以8 变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳结合银染法进行检测；根据每一个体所显示的条带，计算基因频率、群体内杂合度、 多态信息含量，利用最小二乘法对各微卫星标记基因型与四个肉兔品种内初生重、2 1 日龄体重、3 5 日龄体重、9 0 日龄体重，初生至9 0r 龄平均同增重，5 个体重性状进行 相关分析。 2 2 1 血样的采集 吸取0 5m l 抗凝剂于已灭菌的一次性注射器中，从每只个体耳缘静脉采集血样l m l ， 转移至已灭菌的1 5 m le p p e n d o r f 管中，立即用冷藏箱( 4 ) 运回实验室，一7 0 0 保存。 2 2 2 微卫星引物的选择与合成 在小鼠基因图谱中选择l 号、4 号、5 号、6 号、7 号、9 号、1 1 号、1 3 号、1 4 号、 1 7 号染色体上与体重性状相关的微卫星引物，共计1 6 对，由上海生物工程技术服务有 限公司进行合成。微卫星引物的选择原理主要是依据： i ) 家兔的基因组研究较少，已经发现的分子标记数量十分有限，且大多是与免疫、疾 病以及遗传多样性等有关的研究。而与生产性状有关的基因及其标记的研究在国内还未 见报道； 2 ) 小鼠与家兔具有一定的染色体同源性，在分类学上关系较为亲密；在现代基因组学 研究中，小鼠作为主要的实验模型，并且小鼠的基因图谱中已经定位的基因、标记为数 较多，研究也十分深入； 3 ) 微卫星作为目前应用最广、最深入的分子标记，具有保守性特点，使其能跨物种进 9 行使用。微卫星标记引物序列及其有关参数见表1 。 标记i d重复单位 d i m i t 3 0 表1 微卫星标记座位的引物信息 t a b l e1i n f o m a r i o no f f i v em i c r o s a t e i l i t el i m 9 2 + 浓度 退火温度 引物序列( 3 ，5 ，) ( m m )( ) 1 55 5 t g a a c c d a c c a t g c t g t t t g g g c t g c g r 丌c t a a g g d 6 m i t l $ 3 ( a ) 3 0 1 ，25 8 t t c t c a ，w o a a c a c l a o a a c a n g 4 a a a c a c a g g 删6 a a a a c 爿崩翻捎翻 d 7 m i t 8 2 ( c a b s i 85 8 g g a c a c g g t g l c a t a a g c t g a g l a g a a a g c a t g t g g g g d 1 i m i t l 2 5 ( c a ) 2 0 1 85 8 c a a t g g a g g a g c t 丌g g a a a g a c a c t o o ：r | h 兀c t c c t g c 0 g a c t g c a g a a a c c a g g g a a g d l1m i t l2 7 ( c a ) 1 9 ( n ) 9 1 2 5 8 t c t t c c t g 唧t a 腓a a g t t c c g a 几t n = c a g g t a a g t g g c g d 1 3 m i t 3 5 ( t g ) 2 3 1 8 6 2 c a c a r a c l g t g a g t g c a c a 引物选自“m o u s eg e n o m ed a t a b a s e ”( h t t p ：w w w m g d e o m ) 2 2 3 基因组d n a 的提取 实验前先对所用器具、试剂、耗材进行高压灭菌消毒。具体步骤如下： 1 ) 取1 5 0 b i 全血或白细胞5 0 b i ( 或约0 0 3 克的组织，用剪刀剪成糊状) ： 2 ) 加入4 5 0 p is t e 缓冲液( 3 0m m t r i s - h c l ，2 0 0m me d t a ，5 0m m n a c l ，p h8 o ) 和 终浓度分别为l 的s d s 和3 0 4 0 l 的蛋白酶k ； 3 ) 充分混匀后置5 6 温箱中消化过夜，每隔3 0 m i n 轻轻摇匀一次，至澄清； 4 ) 加入等体积的水饱和酚，缓慢混匀3 0 m i n ，7 0 0 0 转m i n 离心l o m i n ，上清液转至另 一干净的t 5 m le p p e n d o r f 管中； 5 ) 加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇= 2 5 ：2 4 ：1 的混合液缓慢混匀抽提3 0 m i n ，7 0 0 0 转m i n 离心l o m i n ，上清液转至另一干净的e p p e n d o r f 管中； 6 ) 再加入等体积的氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 缓慢混匀抽提2 0 m i n ，7 0 0 0 转m i n 离心1 0 m i n ， 上清液转至另一干净的e p p e n d o r f 管中； 7 ) 加入等体积的异丙醇，一2 0 沉淀2 小时以上，1 2 0 0 0 转m i n 离心l o m i n 后，弃上清： 8 ) 用预先冷却的7 0 酒精溶液洗涤沉淀卜2 次，弃上清： 9 ) 将d n a 样品置于真空干燥器干燥l o 一2 0 m i n 左右( 视管中乙醇残留量多少适当调整干 燥时问) ： 1 0 ) 根据沉淀的量加入适量( 5 0 2 0 0 “i ) t e ( p h8 0 ) 缓冲液溶解，置4 c 冰箱溶解过夜； 1 1 ) 将d n a 样品放入6 8 。c 水浴2 0 m i n ，灭活d n a 酶，防止d n a 降解： 1 2 ) 用0 8 的琼脂糖凝胶检测总d n a ，并使用d n a 定量仪( g e n eq u a n ti i ) 定量其浓度 及纯度。要求d n a 纯度( o d 值) 在1 3 0 0 以上，蛋白质含量在0 3 0 0 ug ul 以下。 如若d n a 不纯，可使用饱和酚、酚氯仿重新抽提。 1 3 ) 根据所测值，将模板d n a 用t e 缓冲液或去离子水稀释至2 5 7 5 n g p l 含量的工作液， 4 冰箱待用或- 2 0 保存。 2 2 _ 4p c r 反应体系和反应0 0 0 0 条件 在一个无菌的o 5 m le p p e n d o r f 管中分别按顺序加入以下p c r 试剂( 按2 5 9 l 反应体 积加样) 表2p c r 扩增体系的组成 t a b l e2 c o m p o n e n t s o fp c r a m p l i f i c a t i o ns y s t e m 组份 c o m p o n e n t 体积 v o l u m e 1 0 x 扩增缓冲液( m 9 2 + ) 2 5ul 4 种d n t p 混合物，终浓度为2 5 m m o l l2 5ul 上下游引物 2 0 “l t a q d n a 聚合酶1 0ul 模板d n a ( 1 0 l o o n g ) 1 0ul 加水 1 1 0u l p c r 反应条件：9 4 c 预变性1 0m i n 9 4 变性3 0s e c 5 5 。c 或其他温度退火lr a i n 7 2 延伸l m i n 3 4 个循环 7 2 再延伸7r a i n 2 2 5 p c r 产物的检测 2 2 5 1 琼脂糖凝胶电泳 用1 0 琼脂糖凝胶( 含e b ) 电泳检i 舛| l 微卫星扩增产物是否在所需的长度范围内以 及是否有扩增产物，具体方法是：取4 1 x l 产物加2 t t l0 0 2 5 溴芬兰溶液混匀，然后点样， 5 v c m 电压电泳，约4 0r a i n 左右取出，于暗箱式紫外透射仪上进行观察。 2 2 5 2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 1 电泳玻璃板及间隔片的清洗：沈涤剂清沈、自来水冲洗、双蒸水冲沈、晾干；无水 乙醇擦拭，晾干； 幻将玻板、间隔片等模具组装好并旋紧； 3 1 取4 0 m l6 变性聚丙烯酰胺溶液，加入2 0 过硫酸铵1 5 0 i t l 及t e m e d2 7 t l ，混匀， 用5 0 m l 注射器吸取胶溶液，排除气泡，灌胶； 4 ) 插入适当的梳子，避免产生气泡，室温下聚合2 3 h ： 5 ) 轻轻拔除梳子，用注射器冲洗加样孔，然后用1 t b e 冲洗； 6 ) 加入l t b e 缓冲液； 7 ) 打开与垂直电泳槽循环水装置相连的水浴箱，调节水温至4 5 。c ： 8 ) 取4 “l 扩增产物，加入2 p l 上样缓冲液，混匀后9 4 c 变性8 m i n ，然后于冰盒上迅 速冷却5 m i n ，用微量进样器点样( 同时作一个d n am a r k e r ) ； 9 ) 打开电泳仪电源，5 0 0 v 恒压电泳，电泳时间由指示剂位置来确定。 2 2 5 3 银染法检测电泳结果 1 ) 电泳结束后，关上电泳仪、恒温水浴箱，放出电泳缓冲液，小心分开玻璃板，将胶 置于盛双蒸水的瓷盘中，沈胶3 遍，每次5 m i n ，洗去尿素； 2 ) o 1 a g n 0 3 染色1 0 m i n ( 脱色摇床轻摇) ； 3 ) 双蒸水洗l o s e c ； 4 ) 四硼酸钠显色液显色至最后一批带显现出来( 脱色摇床轻摇) ； 5 ) 双蒸水洗两遍； 6 ) 0 7 5 碳酸钠显色直到带型最清晰； 7 ) 照相，记录条带情况。 2 3 统计分析 2 3 i 等位基因频率( a l l e l ef r e q u e n c i e s ) 微卫星呈共显性遗传，其基因型直接反映表型，因此，根据电泳结果统计分析出每 一个体的基因型值，经过简单计算即可计算出群体内微卫星位点的等位基因频率及群体 在某微卫星座位的杂合度和各个微卫星的杂合度。 2 3 2 群体杂合度( h e t e r o z y g o s i t y ，h ) 根据n e i 等( 1 9 7 4 ) 公式计算： 兰p _ 1 日 _ j 一芝尸f 2 j t l ，z l 式中，m 为某微卫星位点所具有的等位基因数；p i 为某群体第i 个等位基因的基因 频率。 2 3 3 多态信息含量( p o l y m o r p h i s m i n f o r m a t i o nc o n t e n t ，p i c ) 1 1 n 一im p ，c 生一e p i2 一e 2 p , 2 坷2 1 = 1，；l j = i + l m lm ：2 2 p i p j ( 1 一p 何) i - ij + i + l 式中，m 为某微卫星位点所具有的等位基因数；p i 、巧为某群体第i 、j 个等位基 因的基因频率。 2 3 4 微卫星标记基因型与体重性状的相关分析 通过下面的模型进行最小二乘方差分析。采用s a s 统计分析软件中的g l m ( g e n e r a l l i n e a rm o d e l s ) 过程处理。 最