（农业昆虫与害虫防治专业论文）十种小蠹虫同工酶的比较研究.pdfVIP

摘要 应用聚丙烯酰胺；疑胶垂直板电泳方法，对柏肤小蠢p h l o e o s i n u sa u b e ip e r r i s 、建 庄油松梢小蠹c r y p h a l u st a b u l a e f o r m i sc h i e n z h u a n g e n s i st s a ie tl i 、桦边材小蠹s c o l y m s r a t z e b u r g ij a n s o n 、纵坑切梢小蠢b l a s t o p h a g u sp i n i p e r d al i n n a e u s 、十二齿小蠹4 符 s e x d e n t a t u sb 1 ) e r l l e r 、六齿小蠹la c u m i n a t u s g y l l e n h a i 、重齿小蠹ld u p l i c a t u s s a h a l b e r g 、中重齿小蠹上m a n n s f e l d iw a c h t l 、落叶松八齿小蠢ls u b e l o n g a t u s m o t s c h u l s k y 、云杉八齿小蠹正t y p o g r a p h u sl i n n a e u s1 0 种小蠹虫的酯酶fe s t ) 同工 酶、过氧化物酶( p o d ) 同工酶、苹果酸脱氢酶( m d h ) 同工酶进行了比较研究。 结论如下： f _ s t 同工酶酶谱清晰，酶带数目较多且稳定性好。除建庄油松梢小蠹幼虫和成虫 共有酶带较少外，其余每种小蠢虫的幼虫和成虫都有多条r f 值相同的酶带，并且各 自的特征谱带明显，体现出幼虫和成虫之问具有共性。多数小蠹虫幼虫酶带数目多于 成虫，说明幼虫酶活性高于成虫。e s t 同工酶r f 值相似系数和聚类分析结果表明属 间差异明显大于种间差异。6 种齿小蠢具有r f 值相近的酶带，且r f 值较大，与其他 种的酶带有明显区别。 p o d 同工酶酶谱缺乏稳定性，酶带数目较少，活性也较e s t 同工酶低。柏肤小 蠹幼虫、六齿小蠢幼虫、建庄油松梢小蠹成虫未出现p o d 同工酶酶带。其他7 种小 蠹虫幼虫和成虫具有相同r f 值的酶带数也较少。p o d 同工酶r f 值相似系数和聚类分 析结果表明属间差异大于种间差异。重齿小蠹与中重齿小蠹p o d 同工酶酶带非常相 似，不易区分。 m d h 同工酶酶谱有拖带现象，酶带数目比e s t 同工酶和p o d 同工酶都要少。 属问差异明显，种间差异不大。 关键词：小蠢虫：聚丙烯酰胺凝胶电泳；迁移率；酯酶同工酶；过氧化物酶同工酶； 苹果酸脱氢酶同工酶 a c o m p a r a t i v es t u d y o ni s o e z y m eo f1 0k i n d so fb a r kb e e t l e b s t r a c t e s ti s o e n z y m e s ，p o di s o e n z y m e s ，m d hi s o e n z y m e si nt e ns p e c i e so fb a r kb e e t l e ， p h l o e o s i n u sa u b e ip e r r i s ，c r y p h l u st a b u l a e f o r m i sc h i e n z h u a n g e n s i st s a ie tl i ，s c o l y t u s r a t z e b u r g ij a n s o n ，b l a t o p h a g u sp i n i p e r d al i n n a e u s ，p s s e x d e n t a t u sb o e r n e r , l a c u m i n a t u sg y l l e n h a l ，互d u p 矗c a t u ss a h a l b e r g , lm a n n s f e l d iw a c h t l ，ls u b e l o n g a t u e m o t s c h u l s k y , 工t y p o g r a p h u sl i n n a e u s 。w e r es t u d i e db yt h ev e r t i c a ls l a bp o l y c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e t i c ( p a g e ) t h er e s u l ts h o w e dt h a te s ti s o e n z y m e sb a n d sw e r ec l e a r , v a r i f o r ma n ds t a b l e t h e r e w e r ee n z y m eb a n d sw i t hi d e n t i c a la n dd i s t e n c tr fw h i c hc o u l db eu s e dt od i s t i n g u i s ht h e b a r kb e e t l e s p e c i e se x c e p t i n g t h el a r v a ea n da d u l to fc r y p h l u s t a b u l a e f o r m i s c h i e n z h u a n g e n s i st s a ie tl i i tw a ss h o w e dt h a tt h e r ew & ss s l n ec h a r a c t e r i s t i cb a n d b e t w e e nl a r v a ea n da d u l tw i t h i nas p e c i e s t h en u m b e ro fe n z y m eb a n do fl a r v a ew a sm o r e t h a nt h a to fa d u l ta n de s ti s o e n z y m e si nl a r v a es t a g ew a sm o r ea c t i v et h a nt h a ti na d u l t s t a g e t h ed i f f e r e n c eo fe s ti s o c n z y m e si nt h eb a n dn u m b e gr e l a t i v em o b i l i t y , s t a i n i n g i n t e n s i t ya n db a n db r e a d t ha m o n gg e n e r aw a sg r e a t e rt h a nt h a ta m o n gs p e c i e sw i t h i na g e n u s s i xs p e c i e so fz p sh a ds o m ee n z y m eb a n d sw i t ht h es i m i l a rr f v a l u ea n da l s ot h e r e w e r es o m er e m a r k a b l ed i s t i n c tb a n d sa m o n gt h es p e c i e s c l u s t e r i n ga n a l y s i sp r o v e dt h a t s i xs p e c i e si ni p s g e n u sh a dc l o s er e l a t i o n s h i pa n d t h ed e n d r o g r a mi m p l i c a t e da p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po ft h et e ns p e c i e s p o di s o e n z y m e sb a n dw a ss t a b l el e s s ，f e w e rn u m b e r sa n dl e s sa c t i v ec o m p a r e dw i t h t h eb a n d so fe s ti s o e n z y m e s t h el a r v a eo fp h a u b e ip e r r i s ，la c u m n a t u ag y u e n h a la n d t h ea d u l to fct a b u l a e f o r m i sc h i e n z h u a n g e n s i st s a ie tl ih a dn op o di s o e n z y m e sb a n d t h eo t h e rs e v e ns p e c i e sh a dp o di s o c n z y m e sb a n d s b u tt h e r ew e i el e s ss i m i l a rb a n d s b e t w e e nt h el a r v a ea n da d u l ti nas p e c i e s t h ed i f f e r e n c eo fp o d i s o e n z y m e si nt h eb a n d n u m b e r , r e l a t i v em o b i l i t y , s t a i n i n gi n t e n s i t ya n db a n db r e a d t ha m o n gg e n e r aw a sg r e a t e r t h a nt h a ta m o n gs p e c i e s p o d i s o c n z y m e sb a n do fl d u p l i c a t u ss a h a l b e r ga n d 王 m a n n s f e l d iw a c h t lw a sa l m o s ts a m e ，s oi tw a sd i f f i c u l tt ob eu s e dt od i s t i n g u i s ht h e s p e c i e s t h eb a n do fm d hi s o e n z y m e sw a sn e i t h e rc l e a rn o rs t a b l ea n dt h en u m b e rw a sl e s s t h a nt h a to fe s ti s o e n z y m e so rp o di s o e n 2 y m e s t h ed i f f e r e n c ea m o n gg e n e r aw a s s i g n i f i c a n t , b u tn o ta m o n gs p e c i e sw i t h i nag e n u s k e yw o r d s ：肋r 七b e e t l e ；v e r t i c a l s l a b p o l y c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e t i c ( p a g e ) ；毋；e s t i s o e n z y m e s ：p o di s o e n z y m e s ：m d hi s o e n z y m e s d i r e c t e db y ：p r o f d u a nl i q i n g ( p h d ) a p p li c a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：l i a n gl i a n g ( e n m l o 甜) ( a g r i c u l t u r a l c o l l e g e ，i m n m o n g o l j a a g r i c u l t u r a l u n i v e r s i t y ，h u h h o t0 1 0 0 1 8 ，c h i ) 缩略语表 t e m e d ( n n n n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e ) p a g e ( v e r t i c a ls l a bp o l y c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r c m e ) e s t ( e s t e r a s e ) p o d ( p e r o x i d a ) l d h ( l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ) m d h ( m a l a t ed e h y d r o g e n a s e ) a p ( a m m o n i u mp e r s u l f a t e ) p m s r n m e t h y l p h e n a z o m i u mm e t h y ls u l f a t e ) 四甲基乙二胺 聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳 酯酶 过氧化物酶 乳酸脱氢酶 苹果酸脱氢酶 过硫酸铵 n 甲基吩嚷甲基硫酸盐 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 1 1 同工酶电泳技术在小蠹虫研究中的目的和意义 小蠹虫隶属鞘翅目c o l e o p t e m 、多食亚目p o l y p h a g a 、小蠹科s c o l y t i d a e ，为重要 的森林害虫之一。1 9 8 4 年殷蕙芬、黄复生、李兆麟在中国经济昆虫志中记载了 我国分布的小蠢虫，共计4 亚科2 3 属1 6 5 种昆虫，但生产上带来严重危害的种类则 为数较少：。 小嚣虫一般1 年l 代，仅少数种类或在其南方部分地区发生2 代或多代。多数以 成虫越冬，少数以幼虫或蛹越冬，次年成虫出现期因虫种及地区而不同。由于雌成虫 一生能多次产卵，故各虫态重叠现象普遍，区分世代不易。小蠢虫表现出较为特殊的 “配偶”和繁殖方式，即一雄一雌和一雄多雌配偶。一雄一雌式的种类，由雌虫先在 树皮蛀孔侵入，咬蛀母坑道，再招致雄虫进入并交配产卵。一雄多雌式则由雄虫先蛀 造交配室，诱引多数雌虫先后进入。交配后的雌虫分别自交配室朝不同方向蛀造母坑 ( 随配偶雌虫数而异) ，在两侧咬卵室、产卵。幼虫孵出后。自母坑道两侧向外蛀食， 随虫体增长而扩大其蛀道，逐渐形成明显的子坑道。老熟后在坑道末端咬蛹室化蛹， 羽化后咬羽化孔外出。一个完整的坑道系统包括：侵入孔、交配室、母坑、卵室、子 坑、蛹室及羽化孔。有些种类多次交配，自母坑向外咬筑系列交配穴。 小蠢虫的坑道系统因虫种而异，除少数种类“借用”其他虫种坑道繁殖外，都有 其“固定”形式，因而在鉴定上是重要依据。通常分为：纵坑、横坑、星形坑、梯形 坑、共同坑。小蠹虫一般为荦食性或寡食性，仅取食一种或几种树木，以针叶树为主， 有的种类为多食性( 材小蠢) 。除选择树种外，选择的寄主部位也不同，表现出明显 的垂直分布。同时，小蠢虫还表现出某种水平分布，即分别选择树皮、韧皮部或木质 都繁殖。小蠹虫主要为害生理衰弱和濒死树木，少数种类为害健康立木。 随着我国改革开放不断深入以及加入世界贸易组织，进出境货物( 包括木材) 量 越来越多，口岸检疫越来越重要。口岸检疫时从木材中经常截获到一些小蠹虫幼虫， 根据外部形态在幼虫期鉴定分类比较困难，鉴定出来也具有不准确性。通常是把幼虫 在室内饲养为成虫再进行分类鉴定，饲养条件要求较高，很难饲养成功。即使获得的 是成虫，由于虫体微小，鉴定所用的形态特征如前胃板、生殖器、鞘翅等特征难以准 确掌握，鉴定结果极易出现错误。口岸的各类物品接受检疫时由于等待检疫结果，常 有积压现象，这与口岸害虫检验检疫要求快速、准确是相悖的。如果运用同工酶电泳 技术对小蠹虫幼虫和成虫进行研究分析，得出特征酶谱，那么在实际工作中无论截获 的是幼虫还是成虫，鉴定都可立即进行。在方法、药剂标准化的前提下，查阅标准图 谱就可得鉴定结果，全过程般只需5 6h 。因此，探索用同工酶电泳技术鉴定小蠢 虫种类，对于口岸检疫工作的顺利进行和防止检疫性小蠹虫入境、定殖、扩散具有非 常重要的科学意义和经济价值。 !+ 种小蠹虫同工酶的比较研究 1 2 同工酶电泳技术概况 同工酶一词最早是在1 8 9 5 年由f i s c h e r 提出的f 2 】，但没有关于同工酶的完整定义。 直到1 9 5 9 年m a r k e r t 和m o i l e r 发现l d h ( 乳酸脱氢酶同工酶) 在不同组织、不同个 体以及不同种里的不同形式的存在，由此将同工酶( i s o z y m e ) 定义为催化同一生化 反应的、在电场中的运动性质有所不同的一组酶，具有组织、发育及物种的特异性。 这是由于构成酶蛋白亚基( 肽链) 的氨基酸顺序和组成有所不同而造成的1 3 】。同工酶 有广义和狭义之分，早期同工酶的概念是广义的。指所观察到的全部酶带。包括了不 同基因座位和同一基因座位的不同等位基因所编码的同一种酶，以及转录后的酶变体 等所有酶电泳后的表现型。狭义的同工酶定义是仅指由不同基因位点所编码的同一种 酶的不同形式1 4 j 。1 9 6 9 年p r a k a s h 等提出把同一基因位点的不同等位基因所编码的一 种酶的不同形式叫做等位酶( a l l o z y m e ) ，把它从广义的同工酶概念中分出来。而转录 后产生的酶变体，属次生性的同工酶，它们中有的可能是由实验条件引起的分子变化， 未必都存在于天然生物体内，没有相对应的编码基因，不作为同工酶【5 6 】。 1 9 3 7 年t i s e l i u s 率先利用电泳技术研究蛋白质。到了2 0 世纪5 0 年代，电泳技术 丌始应用于酶蛋白的研究。1 9 5 5 年s m i t h i e s 建立淀粉凝胶电泳方法，研究了家蚕 b o m b y x m o r i i l 、蓖麻蚕a t t a c u s r i c i n i 以及意蜂a p i s m i l l e f e r a 血淋巴虽白质的成分1 7 1 。 6 0 年代酶电泳技术被引入群体遗传学。7 0 年代同工酶电泳技术开始大量应用于昆虫 学研究。8 0 年代是应用同工酶电泳技术研究分类的黄金时期。昆虫学家采用各种电 泳方法对昆虫的酶类进行比较研究。 同工酶电泳技术的基本原理是根据电荷性质差异，通过蛋白质电泳或色谱技术和 专门的染色反应显示出同工酶的不同形式，从而鉴别不同基因型【8 】。目前，分离同工 酶的技术主要是凝胶电泳。凝胶电泳是以凝胶作支持物的，不仅可以把迁移率差别大 的各种组份分开，而且还可以借助分子筛的作用把迁移率差别小的各组份分开。它还 有防止对流、降低扩散的能力。此外它还有一定大小的孔洞，电泳时能和移动的颗粒 相互作用，主动参与分离过程。电泳的基质主要是采用淀粉凝胶、琼脂糖凝胶、醋酸 纤维、聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺 在催化剂与加速剂四甲基乙二胺( t e m e d ) 的作用下聚合交联成具有酰胺基侧链的 脂肪族大分子化合物。这种具有三维网状结构的支持物能起到分子筛的作用，蛋白质 分子根掘分子量的大小和构型以及所带电荷的不同在分子筛效应与电泳效应协同作 用下得到分离，所以聚丙烯酰胺凝胶电泳具有样品用量少，分辨率高，重复性好的优 点。电泳方法主要有水平板电泳、圆盘电泳以及垂直板电泳，其中以聚丙烯酰胺凝胶 垂直板型电泳( p a g e ) 应用最为普遍。研究的同工酶有酯酶同工酶( e s t ) 、乳酸脱 氧酶同工酶( l d h ) 、节果酸脱氢酶同工酶( m d h ) 等。 醅酶同工酶( e s t e r a s ei s o z y m e ) 是能水解酯键并且在生物体内存在最为广泛的一 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 种酶，是多态现象较为复杂的酶系之一，在种系的鉴定中具有很重要的参考价值。酯 酶通常是以单体或二聚体的形式发挥作用1 9 1 。它是生物体内变异最大的酶系。目前， 已发现的酯酶有2 0 种，其中有一部分能用组织化学方法证明。昆虫中最重要的酯酶 有乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶等。乙酰胆碱酯酶是昆虫体内突触传导的重要媒介，一旦 受到抑制，昆虫将中毒死亡。羧酸酯酶的主要功能是催化羧酸酶酯的降解。由于e s t 同工酶在昆虫体内含量高、组成复杂，且受不同基因的控制；因而，e s t 同工酶酶谱 也就比较复杂，在不同物种之间的差异明显，可用于群体及种间的比较研究。e s t 同 工酶谱带丰富清晰，在较低阶元中具有分类鉴剔特征。同一属中各种间的e s t 同工 酶谱带相似程度明显高于不同属种闻的相似程度。较高分类单元之间e s t 同工酶谱 带相似程度低于较低分类单元之间的相似程度1 1 0 】。这是因为酯酶是一种非特异性的 酶，受外界和内部环境影响较大。高级阶元分化时间早，各基因位点独立进化时间长， 因而容易产生趋同或趋异现象，在这种情况下，e s t 同工酶谱带差异与系统进化是不 一致的。在低级阶元的分类中，e s t 同工酶位点独立进化时间相对较短，加之阶元内 类群基本属于同一生态型，其酶谱的差异和相似是真实的，尤其对于遗传结构上分化 较大而外部形态变化不大的种类之间，e s t 同工酶具有鉴别性的意义。p o d 同工酶 存在于动物、植物中，是生物体重要的酶类之一。p o d 可利用h 2 0 2 作为氧化供氢体， 参与多种生理生化反应，它在昆虫中的研究较少。m d h 同工酶是三羧酸循环中重要 的脱氢酶之一，也是三羧酸循环中脱氢氧化的最后一步，它广泛存在于动、植物中。 1 3 同工酶电泳技术在昆虫学研究中的应用 1 9 5 7 年自从h u n t e r 和m a r k e r t 创立了同工酶酶谱( z 舯o g r a m ) 技术以来，同工 酶的研究得到了很大的发展。同工酶成为了研究昆虫的遗传变异、物种进化及种属鉴 定的重要生化手段【9 j 。同功酶出现后很快在医学、生理学、分类学、病理学、遗传学 及育种学中获得了日益广泛的应用i l u 。在昆虫学领域内有关同工酶方面的研究日益增 多，涉及膜翅目的蜜蜂1 1 厶1 5 1 、赤眼蜂1 1 8 1 8 】：直翅目的蝗虫【1 9 埘l ：鞘翅目的瓢虫1 2 s - 2 9 1 、 天牛1 3 0 - 3 6 1 、象甲【期、小蠢i 强删、叶甲1 4 1 刈；双翅目的按蚊1 4 5 卅；半翅目的猎蝽 4 8 - 5 4 1 、 盲蝽f 5 5 l 、花蝽i 删；同翅目1 5 7 , s g l ；蚤目1 5 9 1 ；蜚蠊目l 删等。 1 3 1 遗传变异和遗传结构分析 生物的遗传变异是生物群体内多态等位基因存在的反映，是生物进化的先决条 件，也是同工酶技术在研究生物分类及系统进化中得以应用的理论基础1 6 1 l 。同工酶电 泳技术能分辨出同工酶和等位基因酶，根据酶带的变化推断出基因位点和等位基因的 不同，计算出基因频率、多态位点的百分数以及平均每个位点的等位基因数、有效数、 杂合度等指标，进而了解每个种分布区范围内各群体的遗传变晃和遗传结构，并且通 4 十种小蠢虫同工酶的比较研究 过同工酶变异大小的比较可以推断种群演化历史及迁徙方向。邹平和叶辉( 1 9 9 9 ) 对 纵坑切梢小蠢b l a s t o p h a g u s p i n i p e r d al i n n a e u s 的4 个自然种群的9 个同工酶比较研 究中表明种群间有遗传差异，这种差异可能与不同蠹害程度之间存在一定的内在联系 i 删。黄原( 1 9 9 0 ) 分析了6 7 种蝗虫的3 0 条酶带，推测蝗虫e s t 同工酶由4 个基因 位点控制1 1 。近年来，e s t 同工酶作为鉴别害虫抗药性的特征和指标，从而获得了 抗性和种群间遗传变异的基本资料。 ，3 2 亲缘关系和鉴定种类 在昆虫种群或物种亲缘关系的研究中。用同工酶电泳技术获得等位基因频率的差 异，转换成两个种群间的遗传距离和遗传相似性，结合形态特征，进行聚类分析，从 生化和数值分类两方面探讨类群之间的亲缘关系。小稻蝗o x y ai n t r i c a t ef s t a l ) 等9 种 蝗虫的e s t 同工酶电泳结果显示，9 种蝗虫都有各自特有的酶带。依形态特征分类归 为不同科间的种相似性差异较大，同科同属的种之间e s t 同工酶高度相似。稻蝗属 的小稻蝗d i n t r i c a t e ( s t a l ) 与无齿稻蝗d a d e n t a t aw i l l e s e 相似性较高，达3 0 ；蚱 蜢属的科氏蚱蜢a c r i d ak o z l o v im i s t s h 和中华蚱蜢a c i n e r e at h u n b e r g 相似性也较高， 达到了3 6 。9 个种所处分类等级相差甚远，没有出现共有酶带i 驯。天牛亚科c e r a - m b y c i n a e 和沟胫天牛亚科l a m i i n a e 幼虫消化道中肠组织纤维素酶同工酶研究的结果 表明，亚科间、族间差异较大；族内属间的酶谱差异也较大；属内种间酶谱较接近， 但每种各具其特征谱带，彼此易于区分 3 2 l 。6 个地理种群的松毛虫赤眼蜂e s t 同工 酶酶谱有明显的差别，但都存在2 条共有酶带，其中的1 条主带可能为松毛虫赤眼蜂 的特征酯酶带。不同种群间e s t 同工酶的差异可作为综合考察松毛虫赤眼蜂种型的 一个生化指标【1 6 l 。李绍文( 1 9 8 9 ) 对马铃薯叶甲属的马铃薯叶甲l e p t i n o t a r s ad e c e m l i - n c a t a 、胡颓子叶茄叶甲l t e x a n a 等6 种叶甲的等位基因酶研究表明，蒺藜叶甲l p e n i n s u l a r i s 、蒺藜四条叶甲t l a s c a l a n a 、柔毛茄叶甲厶r u b i g i n o s a 和马铃薯叶甲之 间的亲缘关系很近，遗传相似度在0 8 7 9 - 0 7 7 1 之间。膜苞菊叶甲l 1 i n e o l a t a 和其他 5 个种的亲缘关系较远。6 个种的亲缘关系的远近和食性、地理分布无明显的相关性。 经等位基因酶测定，证明所测定的是亲缘关系紧密的6 个种1 4 l l 。g a l l a n t 等( 1 9 9 7 ) 对黾蝽科拟浆大黾蝽a q u a r i u sr e m i g o i d e s 和浆大黾蝽a r e m i g 括( s a y ) 杂交后代的8 个 杂种屠群的杂合体的等位基因酶进行分析，结果表明在3 个嗣工酶座位上的基因频率 有显著差异，但这2 种问较科内其他种有更近的亲缘关系l 蜊。异色瓢虫1 0 种色斑型 的e s t 同工酶研究表明，在同一生态环境下不同色斑型的酶带位置、迁移率及活性 均有明显不同，并且相似的色斑型表现相似酶谱：在不同生态环境下相同色斑型的酶 谱不同：同工酶酶谱还可用于同一色斑型的雌雄个体的区分上j 。同工酶在昆虫的不 同发育阶段也有所不同，南方小花蝽和微小花蝽无论是成虫还是若虫的e s t 同工酶 内蒙古农业大学硕士学位论文 s 酶带数目、位置、迁移率、活性强弱均有较大差异。南方小花蝽成虫酯酶活性比微小 花蝽强。两者无迁移率相同的酶带：南方小花蝽若虫酶带数比微小花蝽蓿虫多3 条酶 带，活性也强于微小花嬉若虫。两种小花娉豹成虫与若虫其酯酶电泳图谱也不相同， 可能是不同虫态生理变化而导致酯酶变化的结果【5 6 l 。 1 3 3 近缘种的识别 传统的形态分类是分类学的主流，但它常遇到一些困难。如近缘种的识别问题。 这些种类形态差异甚微，较难区分，而同工酶电泳方法就能弥补这些不足。朱昌亮和 叶炳辉( 1 9 9 1 ) 对嗜人按蚊a n o p h e l e sa n t h r o p o p h a g u s 和中华按蚊a s i n c n s i s 2 个近缘 种不同发育阶段的e s t 同工酶进行电泳分析，结果证明嗜入按蚊和中华按蚊均以幼 虫e s t 同工酶酶带最多其他依次为蛹、成虫和卵。2 种蚊虽形态相似，不易区分， 但是不同发育阶段e s t 同工酶均有差别1 4 ”。在近缘种棉铃虫h e l i o t h i sa r m i g e r a 和烟 青虫援a s s u l t a 的e s t 网工酶研究中，2 近缘种均具有较高活性，酶带数目爸不撼同， 易于区分f 6 3 j 。姜仲雪和盂祥锋( 1 9 9 4 ) 对秆野螟属的亚洲玉米螟o s t r i n i af u r n a c a l i s ( g u e n e e ) 、欧洲玉米螟dh u b i l a l i s ( h a b a e r ) 等5 种近缘种4 种酶的同工酶分析后，根 据酶谱的差异，绘出了秆野螟属5 种近缘种的亲缘关系图，并计算了他们之间的遗传 距离。根据前人得出亚种遗传距离在0 2 3 左右的结论，认为宁夏苍耳螟ns p 是欧洲 玉米螟的一个亚种m 1 。 1 3 4 解决类群的分类问题 传统分类依据外部形态特征，结合生理和生态差异来进行属种的划分。由于分类 学家对形态性状的理解和看法不同，对种类的分类存在看法不一的问题。运用同工酶 电泳技术就能很好的解决这一争端。李庆( 1 9 9 6 ) 在对小筒天牛族的菊小筒天牛 p h y t o e c i ar u f i v e m r i s6 a 蛳e r 、黑角瘤简天牛l i n d aa t r i c o r n i sp i c 和构筒天牛o b e r e a f u s c i p e n n i sr u f o t e s t a c s e ap i c 成虫的纤维素酶同工酶研究表明，3 种天牛成虫的同工酶 酶谱与脊天牛族的苎麻天牛成虫的酶谱差异较大p 2 j 。前3 种有一酶带等电点接近，而 与苎麻天牛的酶带等电点相差甚大。综合分析认为b r e u n i n g ( 1 9 9 6 ) 根据天牛成虫后 胸前侧片为宽阔的楔形而将脊天牛族和小简天牛族合并为一个楔天牛族是不恰当的， 认为分为2 个族更合理。 1 3 5 昆虫幼虫的鉴别 同工酶电泳结果可用于物种的鉴别以及识别一个物种不同发育阶段的幼体幼虫 至成虫的同工酶以酶带数减少为主要趋势，这是由于幼体阶段孺更多且活性强的酶参 与幼虫的形成及早期幼虫体内新组织的生成3 0 j 阱) 3 种瘤背豆象幼虫的e s t 同工酶 6 十种小蠢虫同工酶的比较研究 在酶带数、迁移率、酶带宽窄及酶活性强弱上有明显差异，各有其特征性酶谱。鹰嘴 豆象酶带有8 条，分布集中，迁移率在0 2 1 0 4 2 之间。绿豆象酶带迁移率在o 0 5 o 3 6 之问，酶带数最多，有9 条，说明3 种幼虫中绿豆象的e s t 同工酶种类最多。灰豆 象有5 条酶带，迁移率在o 2 4 0 4 6 之间，酶带明显比其他2 种豆象的宽，说明各条 酶带的酯酶含量最多。备条酶带染色都较浅，表明灰豆象酯酶活性比其他2 种豆象弱 3 7 j o 由于幼虫不同龄期酶的活性有差别，所以除具有种的特征性谱带外，各龄期的酶 谱均有差异。华山松大小蠢不同龄期幼虫的e s t 同工酶在酶带数、迁移率等方面均 有个体差异。随着龄期增长，酶带条数也有所增加口”。 一般昆虫在幼虫期依据外部形态来鉴别分类比较困难，即使鉴别出来也具有不准 确性。通常把幼虫在室内饲养为成虫再进行分类鉴定，这样既费时又费人力和物力， 尤其是不适合对口岸水果和蔬菜中那些检疫性、危害性害虫的检验检疫工作。 1 3 6 与昆虫行为活动的关系 昆虫的行为活动是由昆虫的遗传特性和各个时期的生理变化决定的，而昆虫体内 的遗传特性和生理变化又与昆虫同工酶有明显的关系。云南纵坑切梢小蠹在聚集后成 虫e s t 同工酶酶谱的e s t 2 、e s t 3 、e s t 6 和e s t 7 ，特别是e s t 6 和e s t 7 酶带颜色较聚集 静的深，而且明显清晰。通过聚集化合物对梢上( 非聚集时期) 成虫的刺激试验，证 实聚集化合物能够诱导松小蠢体内的e s t 同工酶发生变化，说明纵坑切捎小蠢e s t 同工酶的差异与其聚集彳亍为活动有较密切的关系，纵坑切梢小蠢聚集行为是受体内酶 作用的结果【姗。杨秀芬和宗良炳( 1 9 9 1 ) 对异色瓢虫抱卵与未抱卵雌虫e s t 同工酶 的研究表明，抱卵的酶带数多予未抱卵的酶带数，并且未抱卵的在b 区没有酶带出 现。认为昆虫体内的生理变化可以通过e s t 同工酶检测出来，且与昆虫的行为活动 密切相关【2 8 l 。 2 材料与方法 2 i 试验材料 2 1 1 虫体材料 本试验所采用的虫体材辩为柏肤小蠹p h t o e o s i n u sa u b e ip e m s 、建庄油松梢小蠢 c r y p h a l u st a b u l a e f o r m i sc h i e n z h u a n g e n s i s1 a ie ti a 、桦边材小蠢s c o l y t u sr a t z e b u r g i j a n s o n 、纵坑切梢小蠹b l a s t o p h a g u sp i n i p e r d al i n n a e u s 、十二齿小蠢毋孵s e x d e n t a t u s b o e m e r 、六齿小蠹za c u m i n a t u sg y l l e n h a l 、重齿小蠢zd u p l i c a m ss a h a l b e r g 、中重齿 小蠢zm a n n s f e l d iw a c h t l 、落叶松八齿小蠢zs u b e l o n g a t u sm o t s c h u l s k y 、云杉八齿小 蠹zt y p o g r a p h u sl i n n a e u s 。其中柏肤小蠹和建庄油松梢小蠢采于2 0 0 5 年6 月，其余 8 种小蠹虫采于2 0 0 6 年7 月。活虫体经低温冷冻致死后保存于_ 4 5 6 c 冰柜内备用。l o 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 种小蠢虫种类、寄主及来源地见表l 。 表11 0 种小蠹虫种类、寄主及来源地 种类采集寄主寄主来源地 2 1 2 试验药品及仪器设备 试验药品为：t r i s ( 三羟甲基氨基甲烷) 、a c t ( 丙稀酰氨) 、b i s ( 甲叉双丙稀酰氨) 、 t e m e d ( 四甲基乙二胺) 、a p ( 过硫酸铵) 、n b t ( 硝基四唑蓝盐) 、p m s ( n - 甲基吩嗪 甲基硫酸盐) 、n a d ( 辅酶i ) 、g l y ( 甘氨酸) 、h c i 、t r i t o n x 1 0 0 、n a h e p 0 4 2 h 2 0 、 n a 2 h p 0 4 - 1 2 h 2 0 、n a c 0 3 h 2 0 、d l - 苹果酸、蔗糖、溴酚蓝、醋酸、乙酸钠、丙酮、o - 醋酸萘酯、8 醋酸萘酯、坚牢蓝r r 盐、联苯胺、无水乙醇。 仪器设备为： d y y - 1 2 型电脑三恒多用电泳仪( 北京六一仪器厂) d y y - i i l 2 8 b 型失芯式垂直电泳槽( 北京六一仪器厂) u n w e r s a l 3 2 r 型离心机( 进口) 恒温水浴锅( 北京长源试验设备厂) p h b - 4 酸度计( 上海精密科学仪器有限公司) s a r t o r i u sb s l l 0 s 电子天平( 北京塞多利天平有限公司) 移液枪 组织匀浆器 8 十种小蠹虫同工酶的比较研究 2 2 试验方法 2 2 1 样品制备 取冷冻虫体，成虫去鞘翅和腹部，用蒸馏水洗净吸干后称重，按重量体积比 ( 1 ：8 ) 加入缓冲液冰浴匀浆。缓冲液组成：5 0 m m o i l l i r i s h c l 。o 2 5 t r i t o r t x 一1 0 0 ， p h 7 0 。冰浴匀浆2 0 m i n 后于4 。c 下，1 2 5 0 0r r a i n 离心1 5 m i n ，取上清液加入等体积 4 0 蔗糖溶液作为测试酶源放入冰箱中保存备用。 2 2 2 电泳 使用d y y - 1 2 型电脑三恒多用电泳仪和d y y - m 2 8 b 型夹芯式垂直电泳槽。电极 缓冲液为t r i s - g l y p h 8 3 。e s t 同工酶电泳分离胶浓度为8 ，p h 8 9 ，p o d 同工酶 和m d h 同工酶电泳分离胶浓度为7 5 ，p h 8 9 ；浓缩胶浓度均为2 5 ，p h 6 7 。两 种凝胶均采用四甲基乙二胺一过硫酸铵的化学聚合法进行凝胶。凝胶厚度为1 5 r a m ， 点样量为t 0 i t l 。e s t 同工酶电泳初始电流为1 5 m a ，当前沿指示剂涌出浓缩胶面时， 电流升至2 3 m a 。p o d 同工酶和m d h 同工酶电泳电泳初始电流为1 0 m a ，当前沿指 示剂涌出浓缩胶h 时电流升至2 0 m a 。电泳至前沿指示剂溴酚蓝距凝胶末端约l e n a 时止，全过程需5 - 6 h 。每个处理重复3 次。 2 2 3 染色 电泳结束后取下凝胶，置于染色液中。3 种同工酶染色方法见表2 。将染色后的 凝胶用蒸馏水冲洗，保存于7 醋酸固定液中。 裹2e s l 、p 、- d h 同工酶染色液配方爱染色方法 内蒙吉农业大学硕士学位论文 9 2 2 4 酶谱记录 染色后的凝胶立即拍照，测量相对迁移率( 值) ，相对迁移率根据下式进行计 算： r f 2 x l x 2 x t 为固定染色后凝胶中酶蛋白区带的迁移距离 x 2 为固定染色前凝胶中指示剂的迁移距离 3 结果与分析 3 1 小蠢科1 0 种小蠢虫的形态特征 5 属小蠹虫形态特征见表3 ，齿小蠢属6 种小蠢虫分种见检索表， 表3 小蠹科5 属小蠹虫形态特征 齿小蠹属i p s6 种小蠢虫分种检索表： 1 翅盘两侧各有三齿，其中第3 齿最大，雌虫各齿尖锐，雄虫第3 齿扁形，末端分叉： 额中部有2 列小瘤六泼小蠢上a c u m i n a l u sg y l l c n h a l 1 0 十种小蠢虫同工酶的比较研究 翅盘两侧各有四齿或六齿2 2 翅盘两侧各有四齿3 翅盘两侧各有六齿，其中以第4 嚣最大，尖端呈钮扣状” 十二齿小蠢l 豫趔胁f 讲淞b o c m c r 3 第2 与第3 齿着生于共同的基部4 第2 与第3 齿不着生于共同的基部，各自独立5 4 第2 与第3 齿相距甚近，且位于第1 、4 两齿的当中，齿间距离可用1 2 、3 _ 4 表 示中重齿小蠹zm a n n s f e 脑w a c h d 第2 与第3 齿相距较远，齿间距离可用1 2 、3 、4 表示 重齿小蠢zd u p l i c a t u ss a l l a i b e r 8 5 额下部中央有一大颗瘤；鞘翅列间部光滑无刻点：翅盘底面不光亮，好像涂有蜡 膜云杉八齿小蠹i = t y p o g r a p h u sl i n n a e u s 额面无大颗瘤：鞘翅列闻部显著宽于刻点沟，上有一列稀的刻点：翅盘有光泽 落砰松八齿小蠹上s u b e l o n g a t u sm o t s c h u t s k y 3 21 0 种小蠹虫e s t 同工酶的比较分析 3 2 11 0 种小蠢虫属间及种闻e s t 同工酶的比较分析 1 0 种小蠹虫e s t 同工酶r f 值及e s t 同工酶酶谱见表4 、表5 、表6 、袭7 和图