（作物遗传育种专业论文）线性基因表达框直接转化体系的优化和瞬时表达.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 线性d n a 直接转化方法因其易操作、转化效率高而且转化受体不受限制等诸多优 势在植物基因转化中已被广泛使用，所转化外源基因能够整合、表达并且稳定遗传给后 代。线性d n a 直接转化系统主要用于稳定转化，而在转化过程中，却存在着转化动力 不足的问题。为了提高转化效率，本研究以报告基因s 埘 p 和g 吣的线性d n a 片段 为转化表达框，研究不同物理化学因素包括表面活性剂、渗透处理、钙等处理对线性 d n a 转化表达框进入细胞核及其在细胞中瞬时表达效率的影响，以期建立一种以线性 d n a 片段为转化表达框、低成本高效率的瞬时表达直接转化体系，并进一步用于稳定转 化体系。 通过构建植物册g 即和g u s 基因双元表达载体，以洋葱下表皮为实验材料，借助 农杆菌瞬时表达系统，研究不同浓度的c a c l 2 、6 - b a 、2 , 4 d 、 s i l w e tl 7 7 、d o w c o m i n g q 2 5 2 11 和渗透处理对瞬时表达效率的影响。s m 钮p 和g 吣基因的瞬时表达结 果表明各种物理化学因素在不同程度上促进了农杆菌瞬时表达，且各因素的最佳处理浓 度依次为c a c l 2 ，0 5 m o l l ；6 一b a ，0 2 m g l ；2 ，4 - d ，0 2m g l ；s i l w e tl 一7 7 ，0 1 ；d o w c o m i n gq 2 5 2 11 ，0 1 o 。通过荧光表达强度和g u s 染色分析发现，农杆菌高渗处理能 较好的提高转化效率，0 1 o 的d o wc o m i n gq 2 5 2 11 和s i l w e tl 7 7 诱导也能提高农杆菌 转化效率，但效果较渗透稍差。 将农杆菌瞬时表达系统筛选出的各种物理化学因素的最佳浓度用于线性基因表达 框的转化。以洋葱下表皮为转化材料，对不同处理的线性s m g f p 和g u s 基因表达框的 瞬时表达分时段检测；同时检测f i t c 和s y b rg r e e ni 标记的g u s 线性基因表达框转 化后在细胞中的定位和荧光强度，并利用流式细胞仪对荧光标记基因进入细胞核的效率 进行定量分析。结果表明，洋葱组织块经过高渗处理1 5 - - - 2 0 r a i n 后，再在s m g f p g u s 线性表达框终浓度为1 0 0 n g m l 的m s 液体培养基中悬浮共培养1 5 一2 h 即能有效的将 s m g f p g u s 线性基因表达框转化入细胞核内，并在转换后3 6 h 左右得到高效的瞬时表 达，能快速建立瞬时表达系统。通过荧光标记基因的定位和定量分析，高渗处理是促进 线性表达框直接转化的最佳方法。 借助洋葱下表皮中优化的瞬时表达体系，将j m 钮l p 基因的线性片段转化烟草叶片 诱导的愈伤组织。烟草愈伤组织转化后与对照相比有很强的荧光差异。通过高渗转化法 处理的转化组愈伤荧光强度最强，且生长状态几乎不受影响，成活率高。通过对转化 t o 代植株的p c r ，r t p c r ，点杂交等分子检测发现，几种直接转化处理均能获得转基 因植株，其中高渗转化法获得的转化植株成活率和转化阳性率更高。本文建立的方法适 线性基因表达框直接转化体系的优化和瞬时表达 用于外源基因的直接转化，且不受转化受体的影响，在单子叶、双子叶植株、以及组织 和细胞中均能应用。通过瞬时和稳定表达优化出高渗直接转化线性基因表达框是国内的 首篇报道。 关键词：线性基因表达框；直接转化；高渗；表面活性剂；荧光标记 大连理工大学硕士学位论文 o p t i m i z a t i o no fd i r e c tt r a n s f o r m a t i o no fm i n i m a ll i n e a rg e n e c a s s e t t ea n di t se x p r e s s i o n a b s tr a c t d i r e c tt r a n s f o r m a t i o no fm i n i m a ll i n e a rg e n ec a s s e t t eh a sb e e nw i d e l yu s e di np l a n tg e n e t r a n s f o r m a t i o n , w i t ht h ea d v a n t a g e so fe a s i l yo p e r a t i o n ，h i g ht r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c ya n d w i d er a n g eh o s tw a n s f o r m a n t s e x o g e n o u sg e n ec o u l db ei n t e g r a t e di n t ot h eh o s td n a ， e x p r e s s e da n ds t a b l yi n h e r i t e dt op r o g e n i e s d i r e c tt r a n s f o r m a t i o no fl i n e a rg e n ec a s s e t t eh a s e v e rb e e nu s e di ns t a b l et r a n s f o r m a t i o n , h o w e v e r , i tr e m a i n su n c o n v i n c e db e c a u s eo fi t s i n s u f f i c i e n c ya n du n r e p e a t a b i l i t y u s i n gg e n e ss m g f pa n dg u sa st w ol i n e a rg e n ec a s s e t t e s ， t h e p r e s e n tw o r ka i m s a t e v a l u a t i n gd i f f e r e n tp h y r s i c o c h e m i c a lc o f a c t o r s 。i n c l u d i n g s u r f a c t a n t s o s m o t i ca n dc a l c i u mi o n , a n di m a g i n gt h ed e l i v e r ya n dl o c a l i z a t i o no ft h el i n e a r g e n ec a s s e r e st h r o u g ht r a n s i e n te x p r e s s i o ni nv i v o i tw a se x p e c t e dt oe s t a b l i s had i r e c t t r a n s f o r m a t i o ns y s t e mf o rt r a n s i e n te x p r e s s i o nw i t hm i n i m a ll i n e a rg e n ec a s s e t t e a n dm a y a l s oc o n t r i b u t et ot h ep o t e n ta p p l i c a t i o ni ns t a b l eg e n et r a n s f o r m a t i o n b i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o ro fs m g f pa n dg u sw e r ec o n s t r u c t e dt ot r a n s f o r mo n i o n e p i d e r m a lc e l l sm e d i a t e dv i aa g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s i e n tt r a n s f o r m a t i o ns y s t e m t h e t r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yo fg r a d i e n tc o n c e n t r a t i o no ft r a n s f o r m a t i o nc o f a c t o r s ，i n c l u d i n g c a c l 2 ，6 - b a ，2 , 4 一d ，s i l w e tl - 7 7 ，d o wc o m i n g q 2 5 211 ，a sw e l la so s m o t i ct r e a t e m e n tw e r e e v a l u a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a te a c hp h y s i c o c h e m i c a lf a c t o rh a da c t i v ee f f e c t so n a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o na n dt r a n s i e n t e x p r e s s i o n , a n dt h e o p t i m u i n c o n c e n t r a t i o no fw a s0 。5 m o l lo fc a c l 2 ，0 2 m g lo f6 - b a ，0 2m g lo f2 ，4 一d ，0 1 o s i l w e t 7 7 ， a n d0 1 d o wc o m i n gq 2 - 5 211 ，r e s p e c t i v e l y c o m p a r e dw i t ht h ee x p r e s s i o ni n t e n s i t yo f g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i na n dq u a n t i t yo fp t m c t a t eb l u es t a i 玛a g r o b a c t e r i u mi n f i l t r a t i o nw a s t h eo p t i m a lt r e a t m e n ti ni m p r o v i n gt r a n s f o r m a t i o ne f j f i c i e n c y 飞b et r a n s i e n te x p r e s s i o no fl i n e r3 m g f p g u sw a se v a l u a t e dt h r o u g ho b s e r v a t i o no f f l u o r e s c e n t s t a i ni n t e n s i t ya t3 0 m i n , 2 h , 6 5 , 1 2 1 1 , 3 6 h ，4 8 hp o s tt r a n s f o r m a t i o n c o m p a r e dw i t h t h ee x p r e s s i o ni n t e n s i t yo fg f pa n d q u a n t i t y o fp u n c t a t eb l u es t a i n s ，a g r o b a c t e r i u m i n f i l t r a t i o no b t a i n e dt h eh i g h e rt r a n s f o r m a t i o ne 伍c i e n c yc o m p a r e dw i t ht h ec o f a c t o r t r e a t e m e n t s m e a n w h i l e ，t h ed e l i v e r ya n do r i e n t a t i o no fl i n e a rt r a n s f o r m a t i o nc a s s e t t e sw e r e t r a c e dt h r o u g hf l u o r e s c e n ti n d i c a t o r so ff i t co rs y b rg r e e ni n l ee n t r yr a t eo ft h el i n e a r t r a n s f o r m a t i o nc a s s e t t ei n t on u c l e iw a sq u a n t i t a t i v e l ym e a s u r e db yf l o wc y t o m e t r y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee f j f i c i e n c yo ft r a n s i e n te x p r e s s i o ni nl o w e ro n i o ne p i d e r m a lw a s d r a m a t i c a l l yi n c r e a s e da f t e r15 2 0 m i nh y p e r t o n i ct r e a t m e n tf o l l o w e db v1o o n g m ll i n e a r i i i 线性基因表达框直接转化体系的优化和瞬时表达 d n ac o c u l t u r v a t i e di nm sl i q u i dm e d i u mf o r1 5 - 2 h , s u g g e s t i n gi t sf e a s i b i l i t yi nd i r e c t t r a n s f o r m a t i o no fl i n e a rg e n ec a s s e t t e t h el i n e a rs m g e n ec a s s e t t ew a st h e nt r a n s f o r m e di n t ot o b a c c ol e a fc a l l u sa n dt o t r a n g e n i cs e e d l i n g sw e r ef u r t h e ri d e n t i f i e db yt h ep c kr t - p c ra n dd o tb l o t t i n g h i g h r e g e n e r a t i o nr a t ea sw e l la sh i g h e rt r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yw a sa c h i e v e d o u rs t u d ym s t r e p o t st h e d i r e c th y p e r t o n i ct r a n s f o r m a t i o no f1 i n e rg e n ec a s s e t t ei nt r a n s i e n ta n ds t a b l e 一一一 一 e x p r e s s i o n k e yw o r d s ：l i n e a rg e n ec a s s e t t e ；d i r e c t t r a n s f o r m a t i o n ；h i g ho s m o s i s ；s u r f a c t a n t ； f l u o r e s c e n tl a b e l i n g i v 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目：线性基因塞达挺直接蕴化篮丕鲍优化狸蛭吐塞达 作者签名：翁巫卜 嗍：型l 年上月丘日 线性基因表达框直接转化体系的优化和瞬时表达 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 作者签名：刍盆! 塾压 导师签名：母汁移 日期：鎏! 年上三一月二l 日 日期：趔显年l 月卫二日 大连理工大学硕士学位论文 引言 植物转基因技术是当今国际农业生物技术研究开发、竞争的热点。目前已经发展了 许多用于植物基因转化的方法，可分为三大类：一类是载体介导的转化方法，即将目的 基因插入到农杆菌质粒，随着载体d n a 的转移而将目的基因导入植物基因组中；第二类 为基因直接转化法，是指通过物理或是化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因 组中，包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等物理方 法，以及p e g 介导转化法和脂质体法等化学方法；第三类为种质系统转化法，包括花粉 管通道法，胚囊、子房注射法，浸渍吸收法，花粉转化法等，通常借助花粉粒、花粉管 通道，或利用子房、幼穗、种胚等组织和细胞器，直接获得外源d n a 。但是，通过上述 传统转基因方法获得的转基因产品存在着潜在的生物安全性的问题。近年来，无载体、 无选择标记基因的线性转化系统因其基因构建容易、操作简单、并能够避免由载体骨架 或选择标记基因带来的安全性问题等特点而受到关注。目前，此类研究主要依赖于基因 枪法直接转化，存在着诸多不足，例如转化费用较高，转化面积小，对细胞的创伤大； 也有报道利用花粉管通道法实现线性片段的转化，但因为转化机理尚未清楚，可重复性 差，其可靠性一直存在着较大的争议。因此，探索具有生物安全性的线性d n a 片段进入 细胞核的基本途径，以及转化动力和转化机理成为线性d n a 片段直接转化亟待解决的问 题。 本研究将通过建立瞬时表达系统，考察含有报告基因的无载体线性表达框直接导入 植物组织的相关动力因素，及其在细胞内的定位，探讨线性基因表达框的转化机理，以 期建立一种新的高效、安全、便捷、经济的直接转化体系。 线性基因表达框直接转化体系的优化和瞬时表达 1 文献综述 1 1 常用的植物转基因技术及其发展和存在的问题 1 1 1 常用的植物转基因技术 植物转基因技术是指从动物、植物或是微生物中分离到的目的基因，通过各种方法 转移到植物基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、 优质等。 目前已经发展了许多用于植物基因转化的方法，这些方法可分为3 大类：一类是载 体介导的转化方法，即将目的基因插入到农杆菌的质粒等载体分子上，随着载体d n a 的转移而将目的基因导入植物基因组中。第二类为基因直接转化法，是指通过物理或是 化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中。物理法包括基因枪转化法、电激 转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等；化学法有p e g 介导转化法和脂质体 法等。第三类为种质系统法，有的也称之为生物媒体转化系统，即基因转移主要利用花 粉粒及花粉管通道，利用子房、幼穗及种胚注射外源d n a 等方法导入外源基因。它包 括花粉管导入法、子房、幼穗、幼胚注射法、细胞器导入法及染色体导入法等。另外， 在动物转化中建立了一种新型的r n a 小分子载体即p r n a 载体，具有分子量小，承载 量大、靶向性高等优点，目前主要用于动物基因治疗，其很好的自身优势也有可能用于 植物基因的转化【l 】。近1 0 年来，一种新型的无载体骨架序列的线性基因直接转化法得到 了很好的发展和应用。本文将对主要的传统转化方法和本实验中应用的新的直接转化法 进行一定的阐述。 ( 1 ) 根癌农杆菌介导基因转化 根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) t i 质粒基因转化系统是目前研究最多、理 论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。第一批能表达外源基因的转基因植物 是利用根癌农杆菌介导转化获得的。迄今所获得的近2 0 0 种转基因植株中8 0 以上是利 用根癌农杆菌转化系统产生的i 引。 根癌农杆菌为植物致病细菌，根癌农杆菌致病是由其所携带的t i 质粒引起的在植 物冠缨瘤中发现来自农杆菌的t d n a 片段，从而证明了遗传物质从农杆菌向植物中的 转移1 3 ，4 1 。根癌农杆菌介导的基因转化包括以下过程：根癌农杆菌在植物细胞表面的附 着、农杆菌与植物细胞的化学应答反应及信号传递、农杆菌毒力因子( v i r ) 的表达，t d n a 复合体的形成及转移和t d n a 在植物基因组中的整合1 5 】。美国的c h i l t o n 实验室和比利 时的g h e m 实验室最早利用细菌的强制性重组技术把目的基因插入到t i 质粒上【6 。但 大连理工大学硕士学位论文 由于该方法比较复杂而被另一种简单有效的方法所代替。这种方法就是我们现在常用的 双元质粒载体系统( b i n a r yv e c t o rs y s t e m ) 。t i 质粒由毒性区( v i r 区) 、结合区( c o n 区) 、 复制起始区( o f f 区) 和t 。d n a 区4 部分组成，其中与冠缨瘤生成有关的是v i r 区和 t - d n a 区。前者决定了t d n a 的加工和转移过程。t - d n a 可以将携带的任何基因整 合到植物基因组中，但这些基因本身与t d n a 的转移和整合无关，仅左右两端各2 5b p 的同向重复序列为其加工所必需。t d n a 两端的左、右边界各为2 5 b p 的序列，即边界 序? l j ( b o r d e rs e q u e n c e ) ，分别称为左边界( l b ) 和右边界( i 氇) 。该2 5 b p 边界序列属保守序 列，但通常右边界序列更为保守，左边界序列在某些情况下有所变化边，其核心部分是 1 4 b p ，可分为1 0 b p ( c a g g a t a t a t ) 及4 b p ( g a t t ) 两部分，是完全保守的。左边界缺失 突变仍能致瘤，但右边界缺失则不再能致瘤，这时几乎完全没有t d n a 的转移，这说 明右边界在t - d n a 转移中的重要性。v i r a 作为受体蛋白接受损伤植物细胞分泌物的诱 导，自身磷酸化后进一步磷酸化激活v i r g 蛋白；后者是一种d n a 转录活化因子，被 激活后可以特异性结合到其他v i r 基因启动子区上游的一个叫v 护框( v i rb o x ) 的序列， 启动这些基因的转录。其中，v i r d 基因产物对t - d n a 进行剪切，产生t - d n a 单链。 然后以类似于细菌接合转移过程的方式将t d n a 与v i r d 2 组成的复合物转入植物细 胞【8 】，在那里与许多v i r e 2 蛋白分子( 为d n a 单链结合蛋白) 相结合，形成t 链复合物 ( t c o m p l e x ) 9 ，m 】。在此过程中v i r e l 作为v i r e 2 的一个特殊的分子伴侣具有协助v i r e 2 转运和阻止它与t d n a 链结合的功能【1 1 , 1 2 】。实验表明，转基因植物产生的v i r e 2 蛋白 分子也能在植物细胞内与v i r d 2 t d n a 形成t 链复合物【l3 1 。之后，这一复合物在v i r d 2 和v i r e 2 核定位信号帆s ) 引导下以v i r d 2 为先导被转运进入细胞核。转入细胞核的 t - d n a 以单或多拷贝的形式随机整合到植物染色体上。 经过科学家二十多年的努力，使得农杆菌介导的植物转化更加方便，更加有效。同 时由于农杆菌介导的基因转化产生单拷贝及低拷贝的转基因产物，是一种“干净的”转化 技术，从而使得农杆菌介导的基因转化技术成为植物转化的首选工具。但是农杆菌介导 的基因转化在很大程度上还受植物组织培养及其再生能力的制约。几乎所有的农杆菌介 导的转化都需要经过组织培养及植株再生。而目前并非所有的植物都有很好的组织培养 和再生体系。另外，一些重要的经济作物、农作物的优良品种往往再生能力都很差，必 须同时借助其它转化方法如花粉管通道法【1 4 】，子房滴注法【1 5 】等。 ( 2 ) 基因枪法介导基因转化 基因枪法( p a r t i c l eg u n ) 又称微弹轰击法( m i c r o p r o j e c t i l eb o m b a r d e r m e n t ，p a r t i l e b o m b a r d e r m e n t 及b i o l i s t i c s ) ，是在2 0 世纪8 0 年代，为了转化农杆菌难以转化的植物而 开发的。k l e i n 等【l6 j 首次在洋葱上对细胞进行轰击实验，当用加速的钨粒对面积为1c m 2 、 线性基冈表达框直接转化体系的优化和瞬时表达 具有2 0 0 0 多个细胞的洋葱组织轰击时，约有9 0 的细胞同时被击孔，使表面吸附有烟 草花叶病毒r n a 的钨粒进入细胞，并在受体细胞中检测到病毒r n a 的复制。他们还用 这种技术将c a t ( c h l o r a m p h e r i c o la c e t y lt r a n s f e r s e ) 基因导入洋葱表皮细胞，从被轰击的 表皮组织的提取液中检测出很高的c a t 活性。1 9 8 8 年，m c c a b e 等用外源d n a 包被的 钨粒对大豆茎尖分生组织进行轰击，结果约有2 的组织通过器官发生途径获得再生植 株，并在、r 1 代植株中检测到了外源基因的表达”。这些成功的实验大大加快了基 因枪技术的应用与发展。2 0 世纪9 0 年代，该技术迅速发展，被成功的应用于获得不同 植物转基因植株。 其基本原理是将外源d n a 包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微 粒为高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源d n a 进入细胞后，整合到植物染色体上， 得到表达，从而实现基囚的转化。基因枪技术与其它遗传转化方法相比，具有以下优点： 无宿主限制：对双子叶和单子叶植物都可适用，对动物、微生物也同样适用。靶 受体类型广泛：不仅以原生质体、叶片等为靶受体，而且悬浮培养细胞、茎或根切段、 分生组织、子房等几乎所有具有潜在分生能力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击。 操作简便快速，甚至可以克服无菌困难。但该技术只是处于研究阶段，尚未成熟， 还有很多的不足，转入的基因拷贝数是随机的，常常多于一个拷贝，使导入的外源基因 表达水平降低或沉默，也容易导致一些较大片段的基因断裂。但其整合的机理尚不清楚， 得到的转化体往往是嵌合体，仪器价格也十分昂贵，推广使用存在一定的局限。 ( 3 ) 花粉管通道法介导基因转化 利用花粉管通道导入外源d n a 的技术，也称“花粉管通道法”( p o l l e n - t u b ep a t h w a y ) ， 是由周光宇等【l8 】建立并在长期科学研究中发展起来的。主要原理是授粉后使外源d n a 能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早 期胚胎细胞。这一技术原理可以应用于任何开花植物。该方法已用于转化矮牵牛u 圳及西 瓜【2 0 】的转化。也可以将农杆菌或是d n a 注射到含有处于减数分裂前期花粉母细胞的花 序中而不去除雄蕊。在这种情况下，外源d n a 可整合到配子基因组。该方法在大豆中 转化成功，并得到转基因植株，但是，转化效率比微粒轰击介导的大豆转化约低1 0 倍。 该技术由于具有无基因型限制和易于实现多基因转化的特点，可以在开花植物和不 同物种之间实现基因的转移，使受体物种在获得新的基因型的同时，也获得转基因所表 达的新的表现型性状。自创建以来，引起了国内外的广泛关注。中国目前推广面积最大 的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的，但是这一技术的研究一直充满着争议 和分歧，尽管已经通过这一技术培育出多种植物的新品种并已推广应用，但仍有许多科 大连理工大学硕士学位论文 学家持怀疑态度，因为许多理论问题还没有得到圆满的解释。如，外源d n a 怎样进入 卵细胞? 外源d n a 能否整合到卵细胞核d n a 上? 怎么样整合等一系列问题。 1 1 2 线性片段转化的研究进展 线性基因表达框的转化最早是2 0 0 0 年，f u 等【2 l 】将含有b a r 基因的质粒载体和从该 载体上获得的无载体骨架序列的b a r 基因最小表达盒的线性d n a 片段通过基因枪法分 别直接转化水稻幼胚，通过除草剂抗性筛选表明：无论是超螺旋的环状质粒还是线性的 质粒都是以复杂的方式整合到水稻基因组上，如出现了高拷贝整合和高频率的转基因片 段重排等；而无载体骨架序列的线性d n a 片段却都是以低拷贝( 1 2 个拷贝) 的方式整合 到水稻基因组上，而且基因一直稳定遗传到第四代，并且没有发现基因沉默现象。此外， 他们同时将分别含有h p t 和g u s 基因的最小表达盒通过基因枪法共同转化水稻组织，结 果发现在潮霉素抗性的植株中能够检测到g u s 活性，进一步证明，通过这种线性片段 转化也能实现筛选标记基因和非标记基因的共转化，而且共转化效率等同于使用超螺旋 质粒的共整合载体。 之后，2 0 0 2 年，l o c 等【2 2 】也将缺少载体骨架序列的线性d n a 片段通过基因枪法直 接转化水稻的愈伤组织；a g r a w a l 等【2 3 】用多基因线性片段转化水稻并获得基因的高水 平表达；v i d a l l 2 4 1 将线性片段首次用于葡萄的转化也获得成功：w u 2 5 1 ，g a o 2 6 】等人报道 了通过p c r 获得的线性基因片段用于花粉管通道法转化玉米和大豆获得成功。 另外，线性基因表达框是无标记无载体，去除了骨架序列的小分子d n a 片段，大 量转基因植物研究结果表明，线性基因表达框直接转化法是一种可靠的提高了生物安全 性的转化方法，有很广的应用前景。 1 1 3 转基因技术的发展和安全隐患 植物转基因技术是当今国际农业生物技术研究开发、竞争的制高点。在我国国家发 展改革委国家高技术产业化“十一五”规划的1 6 项重大专项中，有一项就是现代农 业专项，该专项提出要“重点发展转基因与分子标记辅助育种技术，推进一批优质、高 产、多抗农作物新品种的产业化”。最近一项报告指出，2 0 0 7 年，全球转基因作物种植 面积增加了1 2 ，达到1 1 4 3 亿公顷。 由于在安全性方面不可知的因素，转基因食品在很多国家受到限制。2 0 0 1 年1 月， 1 3 0 多个国家代表通过的生物安全议定书规定，基因改良产品的出口商必须在产品 上加“可能含有基因改良成分”标识，并要求标识转基因食品。同时规定各国有权禁止 进口认为可能对人类及环境构成威胁的基因改良食物。 一0 一 线性基因表达框直接转化体系的优化和瞬时表达 关于转基因作物的潜在生态风险早在1 9 9 2 年公布的生物多样性公约条款中就 已明确提出来，要求制定或采取办法酌情管制、管理或控制由生物技术改变的活生物 ( l m o 或g m o ) 在使用和释放时可能产生的危险，既可能对环境产生不利影响，从而影 响到生物多样性的保护和持续利用，也要考虑到对人类健康的危险。对环境产生不利的 影响，包括了对农田生态系统的影响，以及自然生态系统的影响，影响是多方面的。 转基因作物因为是人工制造的品种，我们可以把这些品种看作为自然界原来不存在 的外来种。一般说来，外来种对环境或生物多样性造成威胁或危险会有一段较长的时间。 有时需1 0 年的时间，或更长的时间。转基因作物商品化种植至今最长也就是5 - 6 年的 时间，一些潜在风险在这么短的时间内不一定能表现出来。可是有些风险在实验室水平 上已经证实。如m i k k e l s e n 等【2 7 】证实抗除草剂转基因油菜的抗除草剂基因可以通过基因 流在一次杂交、一次回交的过程转到其野生近缘种中。没有预料到的是转基因作物自身 变为杂草成为现实的时间来得如此之快。根据2 0 0 1 年8 月的报道，在加拿大主要的转 基因作物是耐除草剂的g m 油菜，但它们正在变成杂草。农民们正在与他们农田里的一 种新的有害植物作斗争。因为在他们农田里已出现了未种植过的g m 油菜，而这种植物 能抗常规使用的除草剂，要杀死它们还较困难。曼尼托巴大学的植物科学家m a r t i ne n t z 说，“g m 油菜传播的速度要比我们想到的要快很多，而要控制它是绝对不可能的”。加 拿大食品检验署已劝告农民们用另外的药剂来杀死他们。可是其它的药剂能把农民种的 作物杀死，在某些情况下，g m 油菜对这些药剂却具有抗性。这些g m 油菜真正成为所 谓的“超级杂草”1 2 引。 针对转基因植物的发展前景和面临的问题，我们需要从转基因的方法和选择安全 的、无标记无载体的基因或是安全的标记基因等方面，降低转基因植物可能带来的安全 隐患。 1 2 报告基因在植物转基因研究中的应用 报告基因( r e p o g e rg e n e ) 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物非常 容易被鉴定。可把它的编码序列和基因表达调控序列相融合形成嵌合基因，或与其他目 的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的 表达调控，筛选得到转化体。 作为报告基因，在遗传转化选择和筛选检测方面必须具备以下条件：己被克隆和 全序列己测定；表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转化的细胞中无相似 的内源性表达产物；其表达产物能进行定量测定。 一6 一 大连理工大学硕士学位论文 在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要有以下几种：绿色荧光蛋白( g r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i n s ，g f p ) 基因、p 葡萄糖苷酶( 1 3 g l u c u r o n i d a s e ，g u s ) 基因、荧光素酶 ( 1 u c i f e r a s e ，l u c ) 基因、新霉素磷酸转移酶( n e o m y c i n ep h o s p h o t r a n s f e r a s e ，n p t i i ) 基因、 氯霉素乙酰转移酶( c h l o r m n p h e n i c o la c e t y l t r a n s f e r a s e ，c a t ) 基因等。下面将对常用的报 告基因进行部分阐述。 ： ( 1 ) 绿色荧光蛋白基因的特点及应用 野生型g f p 由2 3 8 个氨基酸残基组成，分子量约为2 7 k d a ，能够在单独或者与其它 蛋白融合时产生荧光。而其最显著的特点是除了氧气之外，不需要其他辅酶。g f p 由 11 个p 片层组成桶状构成疏水中心，由c t 螺旋包含着的发光基团位于其中。这个发光基 团是由3 个氨基酸( s e t 6 5 、t y r 6 6 、g l y 6 7 ) 经过环化、氧化后形成的咪唑环，在钙离子 激发下产生绿色荧光。野生型g f p 吸收紫外光和蓝光，发射绿光，在3 9 5 n m 和4 7 0 n m 处有两个吸收峰，在5 0 9 n m 处有一个主发射峰。通常，g f p 在完整并形成正确构型时 能够发出荧光。通过对发光团区域和其他区域进行随机诱变，已经得到许多g f p 变体， 有的发蓝光而不是绿光( t y r 6 6 - - h i s ，t h r l 4 5 - - - - p h e ) 【2 9 】。有的发出的荧光比野生型 更强，如g f p s 6 5 t ( s e r 6 5 - - 参t h r ) 1 3 0 j 。变体g f p u v 比野生型亮1 8 倍，用长波长的紫外光 激发，很容易用肉眼观察，由于还含有其他的氨基酸突变，其翻译效率增加了【3 。通过 在g f p 基因中引用内含子或进行密码优化修饰，得到了一些特别适宜在某些物种中高 效表达的突变体，这些物种包括细菌、哺乳动物、非洲爪蛙、酵母、植物、果蝇等。 目前，g f p 已在烟草、小麦、大麦、燕麦、玉米、大豆、洋葱、甘蔗、菠菜等完整 的植株中获得稳定的表达。g e e s t 和p e t o l i n o 3 2 】将改造过的g f p ，在u b i 2 1 启动子的驱 动下通过基因枪转化玉米胚性愈伤，获得稳定表达的g f p 的转基因植株及其子代； z h a n g 和z e e v a a r t 3 3 】用s m 簖l p 建立了稳定的农杆菌介导的菠菜子叶转化及再生系统； p o n a p p a 等 3 4 j 用各种叩p 通过基因枪转化大豆胚性悬浮细胞，获得稳定表达。在这些实 验中，他们同时采用抗生素标记来筛选转基因植株，g f p 结合抗生素筛选还可以减少转 化过程中基因逃逸与嵌合体的数量1 3 5 1 。 在功能基因组研究中，需要对新基因在细胞和组织进行标记，以便跟踪细胞和组织 在发育过程中的变化，从而研究这些基因的功能。g f p 结合基因捕捉技术的应用，可以 从分子水平上揭示植物的发育机制，鉴定新基因、启动子及基因的表达方式等。同时， 由于g f p 分子量较小，它能与多种不同的蛋白质n 端或c 端融合而保持其天然蛋白的 特性，因此这是一种直观性很强的遗传标记物。通过与某单一序列的融合，可特异地进 行细胞核、线粒体、质体、内质网等细胞器的定位。 线性基因表达框直接转化体系的优化和瞬时表达 近年来，通过基因工程手段已经培育了多种转基因植物，有些品种已大面积推广。 然而这些遗传改良的植株可能会与生长在它们周围的某些近源杂草，通过花粉传播造成 外源基因的漂移。为了防止抗除草剂、抗病虫害等基因向周围环境扩散，g f p 标记显然 是一种最理想的检测手段。只需用手提紫外灯照射植物，就可以观察到含有g f p 的植 株发出绿色荧光，而不含外源基因的植株则否。h u d s o n 等f 3 6 】曾用g f p 标记花粉，实 时监测了转基因植物中的基因漂移和授粉过程。 ( 2 ) 1 3 葡萄糖苷酶基因的特点及应用 p 葡萄糖苷酶( 1 3 g l u c u r o n i d a s e ，g u s ) 基因g u s 存在于某些细菌体内，编码b 葡萄糖 苷酶，该酶是一种水解酶，能催化许多b 葡萄糖苷酯类物质的水解。其中很多水解产物 具有发色团或形成荧光物质，采用一些商业上提供的特种p 葡萄糖苷酶作为底物，其反 应产物可用分光光度计、荧光和组织化学的方法检测。编码p 葡萄糖苷酶的基因已经被 克隆和测序。大肠杆菌的g u s 基因是有g u s 位点编码，g u s 基因是从大肠杆菌中分离 克隆的，最初是用作基因表达的研究。g u s 基因的表达受g u s 底物的诱导。由于绝大 多数的植物细胞内不存在内源的g u s 活性，因而g u s 基因广泛用作转基因植物、细菌 和真菌的报告基因，尤其是在研究嵌合基因的构建及分析，g u s 基因3 端与其他机构 形成的融合基因也能够正常表达，所产生的融合蛋白仍具有g u s 活性，这对于研究外 源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了方便的条件，是较其他报告基因的又一大 优点【3 7 1 。 g 硼基因在根瘤菌豆科植物竞争结瘤的研究中取得了一系列的成果。随后g u s 基 因广泛应用于研究细菌植物联合共生体系，以及病原菌生物植物之间相互关系的研究 中。此外，还可以通过g u s 活性检测了解或研究g u s 基因是否转化进入植物细胞；g u s 基因在植物组织、细胞中的表达部位；植物细胞内的瞬时表达量及稳定表达量；外源基 因在植物细胞内的调控等【3 引。 ( 3 ) 荧光素酶基因的特点及应用 荧光素酶基因( 1 u c i f e r a s e ，l u c ) 是生物体内催化荧光素或脂肪荃氧化发光的一类酶 的总称。自然界有许多发光生物，最初荧光素酶是在萤火虫中提取到的，萤火虫荧光素 酶基因编码一条6 2 k d a 的多肽链，此后各国研究人员相继报道了对各种发光生物中荧光 素酶的研究。该酶是生物体催化自身发光的一种蛋白质，在活化剂m 9 2 + 的作用下，与 底物荧光素、a t p 、0 2 反应，形成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物，该复合物经过 氧化脱羧作用成为处于激活状态的氧化荧光素，同时发射光子，最大发射波长是5 6 2 n m 。 可用微光测定仪检测到非常弱的荧光素酶分子【3 9 1 。 大连理工大学硕士学位论文 l u c 基因作为一个报告基因的优点在于，检测的灵敏度高，检测迅速而且操作方便， 对于研究低水平表达的基因有较大的意义。由于生物中普遍缺少内源荧光，因此该基因 几乎不存在背景干扰问题。该酶的活性不需要转录后修饰，无二硫键，不需要辅助因子 和结合金属，几乎可以在任何宿主中表达。因此，目前l u c 最作为报告基因在植物基因 工程方面得到广泛使用【4 0 】。 ( 4 ) 新霉素磷酸转移酶基因的特点及应用 新霉素磷酸转移酶i i 烈p t i i ) ，n p t i i 催化许多氨基酸糖苷类的磷酸化反应。这种 反应将a t p 的7 磷酸基转到抗生素( 诸如新霉素、卡那霉素、庆大霉素和g 4 18 等) 分子 上，从而阻止了它们的靶位点核糖体的相互作用，起到解毒作用。n p t 1 1 分析是以q (