（微生物学专业论文）大肠杆菌和铜绿假单胞菌中蛋白表达监测系统的构建.pdf

大肠杆菌和铜绿假单胞茵中蛋白表达监测系统的构建 中文手两要 2 0 世纪9 0 年代，人类基因组计划”的推进和完成，标志着“后基因组时代”的到 来，“功能基因组学 中蛋白质组学的研究提上了未来生命科学研究的日程。目前蛋白 质研究的主要方法是通过2 - d e 配合质谱对蛋白质的分离鉴定。虽然对蛋白质的研究技 术在不断地改进，但是目前的生物化学技术已不能满足研究蛋白质组所需要的高灵敏 度、高通量以及可规模化的要求，对于蛋白质组学的研究期待着新型的技术方法的突破。 本课题以大肠杆菌和铜绿假单胞菌为研究对象，采用了将带有r b s 的目的基因克隆 至缺失自身r b s 的报道基因i u x a b c d e 上游，构建二者共用r b s 的预期的蛋白表达监 测系统；报道基因的表达量取决于克隆基因的转录及翻译水平，利用发光值读取仪检测 c p s 值衡量目的基因蛋白质的表达量。对该监测系统进行验证，并将两种菌的全基因组 克隆至各自相应的监测系统中，建立反映蛋白质表达情况的荧光值数据库。 在大肠杆菌中，将重组载体p u c n o t - l u x 中得到的报道基因l u x a b c d e 克隆至蛋白 表达载体p p r o e xh t a 、p p r o e xh t b 、p p r o e xh t c ，初步构建得到大肠杆菌的蛋白表 达监测系统，命名为p p r o e xh t a - l u x 、p p r o e xh t b 1 u x 、p p r o e xh t c 1 u x 。报道基因 l u x a b c d e 在载体p p r o e xh t c l u x 中翻译时能够正确阅读；并在i p t g 梯度浓度条件下， 测定含有载体p p r o e xh t c 1 u x 的细菌发光量，由结果可知克隆到蛋白表达载体中的缺 失自身r b s 的报道基因l u x a b c d e 可以使用载体上游的t r c 启动子及其r b s ，并且该报 道基因的蛋白表达受到t r c 启动子调节因素的调节。测定预期的蛋白表达载体p p r o e x h t c l u x 中的报道基因i u x a b c d e 两侧的序列，结果表明载体p p r o e xh t c 与报道基因 l u x a b c d e 连接处的碱基序列与已知碱基序列相同。 在铜绿假单胞菌中，将从已构建的大肠杆菌蛋白表达监测载体酶切后得到的 l u x a b c d e 亿) 、l u x a b c d e 佑) 、觑叫b c d 匠亿) 克隆至去除原有报道基因，纵c 删船 的p m s 4 0 2 剩余载体中，初步构建铜绿假单胞菌蛋白表达监测系统，命名为p m s 4 0 2 一 l u x a b c d e ( a ) 、p m s 4 0 2 一i u x a b c d e ( b ) 、p m s 4 0 2 一l u x a b c d e ( c ) 。 在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中构建的蛋白表达监测方法可以实现高通量、高灵敏 度、规模化以及更直观地对蛋白表达的监测；该监测方法不仅可用于蛋白质组学的基础 理论性研究，而且可用于攻克重大疾病和开发生物医药等领域的实践应用性研究。 关键词：大肠杆菌，铜绿假单胞菌，蛋白表达监测系统 c o n s t r u c t i o no fp r o t e i ne x p r e s s i o nm o n i t o r i n gs y s t e mi n e s c h e r i c h i ac o l ik12a n dp s e u d o m o n a s a b s t r a c t g e n o m i c sh a sb e e nf o c u s e do nb yr e s e a r c h e r sd u r i n gt h e2 0 mc e n t u r y t h e np r o t e o m i c s w a sb e i n gt h em a i ns t u d y i n gd i r e c t i o ni nt h ep o s t g e n o m i ce r aa f t e rt h ea c c o m p l i s h m e n to f t h e h u m a ng e n o m ep r o j e c t ”v a r i o u sm e t h o d sl i k e2 - d et e c h n i q u ew i t hm a s ss p e c t r o m e t r y w e r eu s u a l l yu s e df o ri s o l a t i n ga n di d e n t i f y i n gp r o t e i n s h o w e v e r ，t h o s et e c h n i q u e ss t i l l c o u l d n tm e e tt h en e e d so fp r o t e o m ed e v e l o p m e n t t h e r e f o r e ，e x p l o r i n gah i g hs e n s i t i v ea n d l l i g h - t h r o u g h p u ta n dl a r g e s c a l er e s e a r c hm e t h o di si m p e r a c t i v ea n db e i n ge x p e c t e d i nt h i ss t u d y , e s c h e r i c h i ac o l i 饵c o l i ) a n dp s e u d o m o n a s a e r u g i n o s ap a o 1w e r es e l e c t e d a sh o s tc e l l sf o rc o n s t r u c t i n gap r o t e i ne x p r e s s i o nm o n i t o r i n gs y s t e m ，r e s p e c t i v e l y , u s i n gt h e r e p o r t e rg e n ew i t h o u ti t ss e l f - r b s s i n c et h er e p o r t e rg e n ec o u l ds h a r et h er b so ft h ec l o n e d g e n e ，t h et r a n s c r i p t i o n a la n dt r a n s l a t i o n a ll e v e l so ft h ec l o n e dg e n ew e r ed e p e n d e do nt h e i n t e n s i t yo fl u m i n e s c e n c es ot h a tt h ee x p r e s s i o no ft h ec l o n e dg e n ec o u l db ed e t e r m i n e db y d e t e c t i n gt h ec p s t ov e r i f yt h em o n i t o r i n gs y s t e mc o n s t r u c t e da b o v ea n df u r t h e rt oe s t a b l i s h t h ef l u o r e s c e n c ed a t a b a s ef o rt h ec o r r e s p o n d i n gp r o t e i no ft h ew h o l e g e m o n eo fe c o l ia n d p a o1w e r eg o i n gt ob es t u d i e di nt h ef o l l o w i n gr e s e a r c h t h ep r o t e i ne x p r e s s i o nm o n i t o r i n gv e c t o r sw e r ec o n s t r u c t e di ne c o l ia n db e e nn a m e d p p r o e xh t a - l u xa n dp p r o e xh t b - l u xa n dp p r o e xh t c l u x ，r e p e c t i v e l y p p r o e xh t c l u x w a st h ea p p r e c i a t ev e c t o rf o rt h ee x p r e s s i o no fl u x a b c d ei nc o r r e c t r e a d i n gf r a m e t h er e s u l t o fm e a s u r i n gt h ei n t e n s i t yo fl u m i n e s c e n c ei ne c o l ic o n t a i n i n gp p r o e xh t c 1 u xw i t hi p t g s h o w e dt h et r cp r o m o t e rc o u l dt r a n s c r i p tt h er e p o r t e rg e n el u x a b c d e , a n dt h ee x p r e s s i o no f t h el u x a b c d ea l s oc o u l db ei n d u c e db yt h er e g u l a t i n gf a c t o ro ft r cp r o m o t e r m e a n w h i l e ，t h e r e g i o na r o u n dt h es t a r tc o d o no fl u x a b c d eg e n eo fp p r o e xh t c l u xw a ss e q u e n c e dt o i n d i c a t et h a tt h es e q u e n c i n gr e g i o no fp p r o e xh t c l u xw a sm a t c h e dw i t he x p e c t e d b e s i d e s ， t h ep r o t e i ne x p r e s s i o n m o n i t o r i n g v e c t o r sw e r ec o n s t r u c t e di np a o1w h i c hn a m e d p m s 4 0 2 一l u x a b c d e ( a ) ，p m s 4 0 2 一l u x a b c d e ( b ) ，p m s 4 0 2 一i u x a b c d e ( c ) a sw e l l t h ep r o t e i ne x p r e s s i o nm o n i t o r i n gs y s t e m se s t a b l i s h e di ne c o l ia n dp a o 1i nt h i ss t u d y w e r en e wt e c h n i q u e sw h i c hc o u l da c h i e v eh i g h t h r o u g h p u ta n dh i g hs e n s i t i v ea n dl a r g e s c a l e d e t e c t i o n t h i sn e wm e t h o dc o u l db eu s e df o rn o to n l yp r o t e o m i c st h e o r ys t u d y , b u ta l s ot h e p r a c t i c a lf i e l d sl i k eb i o m e d i c a li n v e s t i g a t i o n k e yw o r d s ：e c o l i ，p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ，m o n i t o r i n gs y s t e mo f p r o t e i ne x p r e s s i o n 图表目录 图i大肠杆菌蛋白表达载体p p r o e xh t a 、p p r o e xh t b 、p p r o e xh t c 的图谱2 0 图2 载体p u c n o t 的图谱2 2 图3 报道基因l u x a b c 叩片段的获得过程图2 3 图4 大肠杆菌中预期蛋白表达监测系统构建步骤简图2 4 图5 测定梯度浓度的i p t g 条件下，菌体的培养和检测步骤图2 5 图6 载体p m s 4 0 2 图谱2 7 图7 铜绿假单胞菌中蛋白表达监测载体p m s 4 0 2 一l u x a b c d e 图谱2 9 图8p u c n o t 1 u x b f 分别被n o t i 和k p n i 酶切电泳图3 0 图9 质粒p u c n o t - l u x 被k p n i 酶切电泳图3 l 图1 0 p p r o e xh t a - l u x 、p p r o e xh t b - l u x 和p p r o e xh t e l u x 的n o t i 酶切图谱3 2 图1 1i p t g 调节下含p p r o e xh t c 1 u x 质粒的e c o l id h l 0 b 的o d 6 0 0 值的测定3 3 图1 2 i p t g 调节下含p p r o e xh t c 1 u x 载体的e c o l id h l 0 b 的c p s 值的测定3 3 图1 3 重组载体p p r o e xh t c l u x 中l u x a b c d e 起始位点两侧的测序序列图3 5 图1 4 ，口c z 基因( 含g m 抗性基因) 碱基序列图3 7 图1 5 缸以( 含g m 抗性基因) 基因p c r 扩增电泳图3 7 图1 6 铜绿假单胞菌中蛋白表达监测载体的酶切电泳图3 8 表1 实验所用细菌菌株或质粒1 4 a m p c p s d m s o d n a e d t a e c o l id h l o b g m h e p e s k a n l a e z m c s m i n o r p c r p a r b s r n a a s e s d s t c t e t m p 缩写对比表 氨苄青霉素 每秒钟化学发光 二甲基亚砜 脱氧核苷三磷酸 乙二胺四乙酸 大肠埃希氏菌d h l 0 b 菌株 庆大霉素 n 一2 一羟乙基哌嗪卜卜2 一乙磺酸 卡那霉素 b 一半乳糖苷酶基因 多克隆位点 分钟 复制起始位点 聚合酶链式反应 铜绿假单胞菌 核糖体结合位点 r n a 酶 十二烷基硫酸钠 四环素 t e 缓冲液 甲氧苄氨嘧啶 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：基蓬指导教师签名 洳c 年6 具f o 目 ， 乡缚 l 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西 北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 ： 思。 学位论文作者签名：厶哆 2 一罗年多月i o 日 西北丈学硕士毕业论文 第一部分引言 1 1 蛋白质组学研究的背景 2 0 世纪生命科学领域致力于基因组学的研究，前半个世纪以遗传学为代表，后半个 世纪以分子生物学为代表，最终以提出了“d n a 双螺旋结构 和“中心法则”而告捷。 基因组学的研究所得出的大量数据和新型技术推动着生物、医学等多个学科的迅速发 展。随着对大量生物体全基因组序列的确定，特别是2 0 世纪9 0 年代，具有划时代意义 的研究工程“人类基因组计划”的推进和完成，宣告着另一个时代“后基因组 时代”( p o s t g e n o m ee r a ) 的到来。基因组学研究的重心从“结构基因组学”( s t r u c t u r a l g e n o m i c s ) 到“功能基因组学 ( f u n c t i o n a lg e n o m i c s ) 的转移【。 通常情况下，生物的基因组只有少部分基因表达，而且基因表达的种类和蛋白表达 量的变化在生物处于不同的生存环境、不同的生存状态下有极大的差别。对于基因组的 测序，能够确定生物基因组内的全部基因，但对于基因组内的基因在何时以何种程度表 达，相互之间是如何影响表达的却无法得知。虽然人们发明了大规模基因表达检测技术， 如d n a 芯片、s a n g e r 等方法，但它们只能定性、定量地检测基因的表达产物m r n a ， 但从m r n a 到蛋白，又存在转运、降解、剪切拼接及翻译调控，对于蛋白质并不能有 个真实的反映。更何况，翻译得到的蛋白质的磷酸化、糖基化等修饰加工后得到的才是 执行基因功能的功能性蛋白质，所以，大规模、全方位的蛋白质研究势在必行。相对于 “基因组”的概念，“蛋白质组”的概念也应运而生了，它指的是一个完整生物所表达 的全套蛋白质的集合。2 0 0 1 年2 月，在公布人类基因组草图的同时，在n a t u r e 、s c i e n c e 上分别发表了“a n dn o wf o r t h ep r o t e o m e 和“p r o t e o m ei ng e n o m e l a n d ”，认为蛋白质 组学的研究将会是生命科学发展的新征程和主战场【2 ，3 1 。 蛋白质组学的研究将成为新世纪生命科学领域最大的战略资源，它的实用性和巨大 的市场前景，使得国际上的科研机构和企业都纷纷开展蛋白质组学的研究。蛋白质组学 的前沿方向大致分为以下几个方面：对于蛋白质组学研究的技术平台的发明和改进， 以及对获取的各种生物数据等信息的整合研究。生物体中已获得的基因水平和转录水 平的相关数据之后，再建立其蛋白质表达以及蛋白质组连锁群的研究。对于从整个基因 水平、转录水平和翻译水平来进行全面的研究，微生物中已有报道；但在高等哺乳动物 中却未见报道，对于人类组织、细胞的全面研究基本未有涉及。而对于人类的基因表达 调控规律的认识，仅仅依靠基因组草图是远远不够的，况且已获得的人类基因组草图中 第部分引言 约有1 7 万左右的基因纯属理论推测，这样就更需要从蛋白质水平加以检验和确认，因 此对于人类的蛋白质表达的研究势必成为下一步发展的战略性重点。以人类的重要 的生命活动或者人类重大的疾病为研究对象，进行生理或者病理体系或过程的比较蛋白 质组学的研究。近年来，蛋白质组学技术在研究细胞的增殖、异常分化、肿瘤形成等方 面进行了探索，涉及到白血病、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌等，分离鉴 定了一系列的肿瘤形成相关蛋白，为肿瘤的早期诊断、药物靶向性位点的发现、药物疗 效的判断以及预后提供了重要的基础和依据【4 j 在我国，自从1 9 9 5 年悉尼大学h u m p h e r ys m i t hi 实验室等4 家实验室合作，对至 今已知最小的自我复制生物m y c o p l a s m ag e n i t a l i u m 进行了蛋白质的大规模分离、鉴定并 发表了研究论文之后【5 】，国家自然科学基因委员会于1 9 9 7 年设立了重大项目“蛋白 质组学技术体系的建立”。同时在我国包括中国科学院生化研究所在内的许多研究单位 也先后启动和开展了蛋白质分离和鉴定技术的研究工作。经过这些年的努力，整体上我 过蛋白质组研究的技术平台有了飞跃的发展，对于不断涌现的新技术我国也有了很好的 追踪跟发展。在比较蛋白质组学的研究诸如一些重要的生理、病理体系的蛋白质组成分 的研究方面也取得了不少的成就【6 7 】，已进行肝癌细胞系及正常肝细胞蛋白质组的比较 分析研究，发现了两者间不同的蛋白表达群【s ，9 】。目前来说，对于蛋白质组的研究，相 关技术已经基本具备，而且也达到了实用化的水平，已经形成一定规模的专业队伍及专 门的研究机构。但蛋白质组在我国研究的规模和水平却难以适应我国基因组学等现代生 命科学前沿领域对蛋白质组学的广泛需求，难以提供我国生物技术产业与医药卫生事业 等应用领域的发展所急需的、有力的技术后盾，难以应对国际上在蛋白质组学这一“战 场”的激烈竞争。因此，如果我国能够综合考虑国际国内基因组与蛋白质组的研究现状 与趋势，相应于我国生命科学领域研究的优势，而且又不重复和追随国际已有的工作， 开展一些我国特色的研究方向，在某些领域孕育着新的突破1 1 0 ，1 1 】：蛋白质组学研究的 技术平台：对蛋白质结构和功能的研究技术以及流程的开发和建立。生物信息学的研 究：基于人类蛋白质组成分的结构确定与分析，对蛋白质功能的预测，基于蛋白质组有 关知识的积累，而对生命演化过程中的规律的发现和总结；建立人或者其他高等动物的 蛋白质组的数据库：选择l 一2 种具备重要生物学意义、且我国己完成大规模测序的组 织或细胞，制备其高分辨率的蛋白质组图谱并建立数据库。重大疾病中不同阶段的蛋 白表达的定性、定量比较，进而对差异性蛋白进行分离鉴定，和功能性分析，为重大疾 病的攻克提供理论基础。 2 西北大学硕上毕业论文 综上所述，国际国内对蛋白质组学的研究迫切需要突破性新技术的产生，本研究 将以大肠杆菌和铜绿假单胞菌为研究对象，通过分子生物学的方法分别在它们中构建一 种新的蛋白质表达监测系统，研究大肠杆菌和铜绿假单胞菌的蛋白质表达情况，用于揭 示它们的致病过程和耐药性形成机理；同时，对于蛋白质组学基础理论和实践应用领域 的研究都有重要意义。 1 2 蛋白质组学的研究方法 在生物体中，基因通过转录、翻译而表达产生蛋白质。生物体中蛋白质的表达是个 动态的过程，基因在生物处于不同的生长状态和不同的生长时期而表达发生变化；同时， 由于基因的转录拼接和翻译修饰而导致蛋白质表达的数目也远远大于基因的数目，故而 蛋白质组的研究比基因组的研究要复杂很多。近年来，尽管学者们致力于基因组的技术 研究，使得人们对基因的认识和知识积累有大幅度的提高，然而对于蛋白质组的研究也 并未停滞，通常采用2 - d e 配合质谱技术进行蛋白质的识别与鉴定，其流程为： 2 - d e 一蛋白质胶上原位酶切一m a l d i - t o f 质谱分析一肽质量指纹谱数据 库检索一蛋白质鉴定一已知蛋白或者电喷雾串联质谱分析一肽序列标签数据库 检索一蛋白质鉴定一已知蛋白或者蛋白质从头测序一获得新蛋白 1 2 1 蛋白质的分离技术 1 2 1 1 二维s d s - 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 二维s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳技术( t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ，2 - d e ) 的 使用起始于1 9 7 5 年【1 2 】。它的原理是首先在第一向基于蛋白质的等电点不同，用等电聚 焦分离，然后在第二向则按分子量大小的不同，用s d s p a g e 分离，把复杂蛋白混合物 中的蛋白质在二维平面上分开【1 3 】。2 - d e 技术是目前唯一的一种能够将数千种蛋白质同 时分离并展示的分离技术。最早使用的是载体两性电解质，p h 梯度进行等点聚焦，直到 八十年代中期固相化p h 梯度等电聚焦技术的发明【1 4 ”】，克服了载体两性电解质阴极漂 移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的p h 梯度，使得蛋白质的分析 鉴定的重复性和加样量得到极大的提高。 2 - d e 技术的优势体现在：2 d e 技术结合质谱可以同时实现大规模的蛋白质的分 离和鉴定。二维凝胶可以作为蛋白质的储存器，干凝胶上的蛋白质在室温下可保存数 月甚至数年。这对于一些稀少珍贵的组织样本的保存有十分重要的价值。2 d e 技术 相对廉价，m s 的分析和生物信息资源搜索可以通过共享资源或者有偿服务来实现。尽 3 第一部分引言 管2 - d e 在蛋白质组的研究中已获得了广泛的应用，但是2 - d e 技术当前仍然面临一些 挑战：作为一种蛋白质表达谱的展示方法，2 - d e 技术仍不能分离和检测很多低丰度 蛋白、碱性蛋白等。2 d e 的重复性虽然得到了很大的改善，但是相同的操作人员， 相同的样品，相同的仪器，操作结果也很难重复，而且该技术的操作也要经过专门的训 练，因此迫切需要一种自动化的新方法出现【1 6 】。通过2 - d e 技术分离得到的蛋白点也 不一定只代表一种蛋白质。 1 2 1 2 色谱技术 传统对蛋白质的研究所采用的是2 - d e 技术配合质谱技术而进行的蛋白质的分离鉴 定的经典技术路线。通过近年来进一步发展的利用色谱技术等可以在很大程度上克服了 2 - d e 技术的不足，尝试建立新的蛋白质组研究技术平台。如二维色谱或者亲和色谱等 配合质谱技术【1 7 】等多种模式。相较于2 - d e 技术，色谱技术的蛋白分离速度快很多，一 般在几个小时可完成全部分离；并且可以分离各种蛋白质，适用的范围更广；易于自动 化操作，和后续的质谱相连接；而且对于蛋白分离的重复性也很好。 ( 1 ) 二维色谱( 2 d h p l c m s ) 二维色谱分离蛋白质有多种组合模式，第一维色谱一般是离子交换色谱，也可是凝 胶过滤色谱，第二维通常是反相色谱。由于反相色谱采用有机溶剂作流动相，避免了盐 等添加剂对后续质谱分析的影响。为了提高二维色谱的分离速度和分辨能力，第二维的 反相色谱分离系统一般采用较短的色谱柱和较高的流速。整个分离系统采用一根离子交 换柱与两根反相色谱柱，通过多通道阀进行柱切换的模式操作。当蛋白质或多肽组分从 离子交换色谱柱上洗脱进入检测系统。两根反相色谱柱的轮流切换，使得被分离物可以 富集在柱的顶端。适当调整柱切换速度与流速，可以达到每分钟一个循环，一个色谱图。 为了减小死体积，采用细内径的管路并尽可能地减少管路的长度。采用这种分离方法被 证明有很好的重复性【1 8 】。 采用液相色谱的方法分离蛋白质和多肽有诸多的有点，如速度快，一般几个小时可 完成全部分离，而2 - d e 分离一般需要1 - 2 天；由于在溶液状态样品处理方便、快捷， 避免了2 - d e 从胶上回收样品的繁复操作，分析过程易于自动化和与质谱联接；对于各 种蛋白质均适用，包括疏水性、酸性、碱性、分子质量大于1 0 0k d a 、小于1 0k d a 的蛋 白质等。 ( 2 ) 同位素标记一亲和色谱技术 同位素编码亲和标签的色谱技术的产生可以使得细胞蛋白质实现定量分离与鉴定 4 两北大学硕上毕业论文 【1 9 】。人的细胞中约有2 万多个蛋白质【1 9 】，当用蛋白酶酶切以后，所产生的多肽混合物十 分复杂。现有的分离技术都很难实现完全的分离。采用同位素编码亲和标签技术，不但 可以实现对细胞差异表达蛋白质的定量分析，而且可以大大简化了被分析样品的复杂 性，为蛋白质组学技术方法的研究提供了新的思路。当采用i c a t 技术【1 9 , 2 0 1 进行蛋白质 的定量分离与鉴定时，首先要对蛋白质进行标记，然后进行蛋白酶切，对蛋白质酶切后 的多肽混合物进行亲和色谱分离，混合物中仅仅被同位素标记的肽段能够被色谱柱保 留，并进入质谱鉴定，其他大量的肽段都不被色谱柱保留。通过比较标记了重链和轻链 试剂肽段在质谱图中信号的强度，可以实现对差异表达蛋白质的定量分析，采用串联质 谱技术测定肽段的序列，从而实现蛋白质的鉴定。同位素编码亲和标签技术可以实现对 不同条件处理的细胞差异蛋白质的定量分析，大大简化了被分离样品的复杂程度，但该 方法的不足之处就在于无法分析和鉴定不含有半胱氨酸的蛋白质，而且，目前商品化试 剂的价位昂贵也影响了这一方法的普遍应用。 1 2 1 3 一维电泳( 色谱) 一质谱技术 传统所2 d - m s 技术有可能造成蛋白质的丢失。因此对一维电泳( 色谱) 一质谱的模 式分离鉴定蛋白质复合物或者全细胞蛋白质提取物也做了尝试。从生物样本中获得的蛋 白质混合物，采用免疫沉淀或免疫亲和提取的方法，获得蛋白质复合物。 一维s d s - p a g e 电泳对蛋白质复合物进行了分离，染色，胶上原位酶切， m a l d i t o f m s 分析肽质量指纹谱并鉴定蛋白质，或者对蛋白质复合物直接进行蛋白 酶切，对获得的肽混合物进行l c m s m s 分析，通过测定肽片段的序列鉴定蛋白质。 一维i e f 电泳技术配合m a l d i t o f m s 技术的方法也有报道【2 1 1 。 1 2 2 蛋白质的鉴定技术生物质谱技术 对于2 - d e 分离得到的蛋白质，如何进行快速、灵敏、准确的识别和鉴定，是蛋白 质组研究要解决的又一个问题。传统的质谱技术应用于挥发性化学物质的结构研究，而 用于蛋白质的研究，电子激发却容易导致蛋白质失活。但是到了2 0 世纪8 0 年代末期， 诞生的软电离质谱技术一电喷雾电离质谱( e k e c t r o s p r a yl o n z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y , e s i m s ) 2 2 1 和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( m a t r i x a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i n o n i s a t i o nt i m eo ff l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y , m a l d i t o f m s ) 【2 3 】，具有高灵敏度和高 准确度以及较为温和等特点，使质谱技术能为蛋白质组的研究突破瓶颈，提供更好的技 术平台。 5 第一部分引言 1 2 2 1 基质辅助激光解吸电离质谱( m a l d i m s ) m a l d i m s 是以m a l d i 作为离子源的【2 4 】。该离子源的基本原理是：将待分析物分 散于基质中并形成晶体，当使用激光照射该晶体时，基质分子吸收激光能量，样品解吸 附，基质样品之间产生电荷转移使样品分子电离。基质的使用是这一电离技术的关键， 基质吸收了激光的大部分能量并气化，同时将样品分子带入气相，样品分子只吸收少量 激光能量，这过程中基质是作为质子化或去质子化试剂的。常用的基质是一些小分子有 机酸。m a l d i m s 最适合分析多肽及蛋白质混合物。 ( 1 ) 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( m a l d i t o f m s ) m a l d i m s 用飞行时间( t i m eo ff l i g h t ，t o f ) 检测器作为质量分析器，所构成的 仪器就是m a l d i t o f m s 。t o f 检测器的质量分析范围是从几百d a 到1 0 0k d a 都可以 监测的。所以通过m a l d i t o f - m s 对胶上的蛋白质进行大规模鉴定是易于实现高通量 的识别和鉴定的。 ( 2 ) 反射m a l d i t o f m s 线性飞行管的m a l d i t o f m s 的质量分辨率和测量准确度不是很高。为了弥补这 一缺陷，在仪器的飞行管内多加一个反射电场，起到能量聚焦的作用。使得具有相同荷 质比但能量有细微差异的离子，在反射电场作用下飞行的时间相同，但离子会改变飞行 方向，延长了飞行的距离，从而达到提高仪器的分辨率和质量测量准确度的效果。而且 反射飞行时间分析器m a l d i t o f m s 可以分析m a l d i 源产生的母离子在飞行管道飞 行过程中发生裂解，丢失部分中性碎片，剩余“质量减少，但是飞行速度不变”的亚稳 离子。为了使离子能够转向并飞到反射检测器，反射电场的电压要大于加速电场电压。 但是这种反射检测的方法只能分析质量数1 0k d a 以下的离子。 ( 3 ) m a l d i t o f t o f 质谱仪( m a u ) i t o f t o f m s ) m a l d i t o f t o f m s 2 5 】是一种带有m a l d i 源和两个飞行时间质量分析器的质谱 检测仪器，是在传统的m a l d i t o f m s 基础之上改造而成的新型质谱仪。与源后裂解 测定多肽序列的方法相比较，m a l d i t o f t o f 可以对同一样品先进行肽质量指纹谱分 析，接着进行串联质谱分析，使得在微量样品水平上对蛋白质进行鉴定在很短的时间内 完成，并一次性采集获得完整的碎片离子质谱图。 ( 4 ) 带m a l d i 离子源的四极杆一飞行时间一串联质谱仪( m a l d iq q t o f ) 通过m a l d i t o f m s 可以测定肽质量指纹图谱，但有时所获得的肽指纹谱并不能 提供充分的信息加以鉴定蛋白质。又需要电喷雾电离串联质谱e s i m s m s 测定肽序列 6 两北人学硕士毕业论文 标签来进一步鉴定，但若将两种质谱分析分开进行，给样品的操作带来很多麻烦。而 m a l d iq q t o f m s t 2 6 1 就将肽质量指纹图谱分析和肽序列标签分析合并到同一台仪器 上，大大提高蛋白质分析鉴定的速度和通量【2 7 】。 1 2 2 2 电喷雾电离质谱( e s i m s ) 电喷雾电离方法【2 8 】是利用电场使质谱进样口处的毛细管柱流出的液滴带电，在n 2 气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面的电荷密度不断增加，直至产生的库 仑斥力与液滴表面张力达到一定极限而液滴爆裂，这一过程不断重复最终使得液滴呈现 喷雾状，而液滴表面的电场也非常的强大，使待分析物离子化并以带单电荷或多电荷的 离子形式进入质量分析器。电喷雾离子源可以和高效液相色谱( h p l c ) 技术在线联用， 在分析复杂混合物时很有优势，可以先分离再分析。 ( 1 ) 电喷雾质谱( e s i m s ) e s i m s 采用电喷雾的离子化方式，它常采用四级杆质量飞行器。e s i m s 可以和液 相色谱、毛细管电泳等高效分离手段联用，因而可以实现复杂化合物分离与鉴定的联机 操作。 ( 2 ) 电喷雾串联质谱( e s i m s m s ) e s i m s m s 是电喷雾离子源后连接串联质谱的仪器。它是通过测定肽序列标签对 蛋白质进行鉴定的方法，可以用于检测离子结构碎片的质荷比，能够提供离子的结构信 息，并将质谱测定的多肽序列与数据库中已有蛋白质的序列直接进行比较。这种方法特 异性高，可以实现对混合蛋白质的识别与鉴定，与h p l c 相连大大提高鉴定的准确度。 但操作复杂，获得结果速度慢。 1 2 3 蛋白质芯片技术 蛋白质芯片技术【2 9 1 ( p r o t e i nc h i p ，蛋白质微阵列技术，p r o t e i na r r a y ) 就是将一系列 的“探针蛋白以阵列的方式固定在特殊处理的基片上，然后将其与待测的样品进行杂 交，去除掉未结合的样品，只有那些与探针蛋白结合的蛋白才能保留在芯片上。保留色 谱和预活化芯片表面是蛋白质芯片两种常用的分离手段【砌。在蛋白质芯片技术中有两个 关键的影响因素：一个就是基片上固定的识别蛋白成分的探针分子。目前最明显有效的 蛋白探针分子是抗体【3 i j ，已经被广泛地应用与许多方面；另一个就是检测混合物中单个 蛋白与他们相应的识别分子间相互作用的方法，比如荧光标记等。c h i p e r g e n 应用生物 系统公司推出了p r o t e n c h i p t 3 2 1 与质谱技术相结合的技术平台表面增强激光解析离子 7 第一部分引言 化( s e l d i ) ，可以得到相互作用的多维蛋白质图谱。它与m a l d i 相比，可以获得可重 复的、统一的质谱图，并可用于定量蛋白质研究。 蛋白质芯片技术在蛋白质组研究方面的优势已十分明显，具有高通量、高灵敏度和 低上样量的显著特点，可用于蛋白质表达谱分析，也可研究蛋白质与蛋白质的相互作用， d n a 一蛋白质、r n a 一蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。但仍存在不足： 虽然可以通过蛋白芯片进行定量研究，但是该技术本身就存在一个“可定量”的范围， 得到的也只是一个相对的定量，还没有一个可以获得细胞或组织中蛋白表达的绝对准确 定量的技术【3 3 】。如何获得大量可以用做“探针 的蛋白分子，也是人们一个重大的挑 战。抗体芯片面临的最大困难是采取何种途径获得大量特异性各异的纯净抗体【3 4 1 7 基 片与基片修饰的选择。虽然蛋白质点样在一些基片上有成功的报道【3 5 1 ，但仍未找到一种 理想的基片及基片修饰方法，蛋白质固定到基片后仍面临活性丧失或降低等问题。尽 管目前有荧光染色等标记技术，但是蛋白质样品的标记仍然是蛋白质芯片技术发展的瓶 颈。 通过上述方法对大量生物学数据的累积将导致生物信息学出现。 1 2 4 生物信息学 生物信息学( b i o i n f o r m a t i c s ) 是随着人类基因组计划而发展起来的一门新兴的交叉 学科，综合运用数学、计算机科学和生物学的各种理论和工具，包含生物信息的获取、 处理、储存、检索、分析和解释等方面，进而阐明大量数据所体现的生物学意义。具体 来说，生物信息学实际上是以基因组d n a 序列信息作为起始，找到基因组序列中代表 蛋白质和r n a 基因的编码区；同时，阐明基因组中大量存在的非编码区的信息实质， 破译隐藏在d n a 序列中的遗传规律；在此基础上，归纳、整理与基因组遗传信息释放 及其调控相关的转录谱和蛋白质谱的数据，从而认识代谢、发育、分化、进化的规律【3 6 】。 生物信息学虽然以基因组信息学作为核心，但它在蛋白质组学的研究中的作用日益 凸显。通过上述的2 - d e 、生物质谱、蛋白质芯片等方法所获得的巨量数据如何运用生 物信息学理论方法去分析，进行蛋白质的种类、数量的鉴定，以及蛋白质空间结构的模 拟和功能的预测3 7 1 ，并将此类信息与生物体和生命过程的生理生化信息相结合，阐明其 分子调控机理，最终进行蛋白质、核酸的分子设计和个体化的药物设计，从而进一步还 原出生命运转和调控的整体系统的分子机制，这对于理解其生活史与进化特点也是极为 重要的。 8 西北人学硕上毕业论文 蛋白质组学研究中生物信息学的目标就是：将所获得的数据进行收集和整合后，建 立蛋白质研究相关的数据库和相应的分析软件。目前建立的应用较为广泛的蛋白质研究 相关数据库有：蛋白质数据库，比如 s w i s s p r o t t r e m b l ( h t t p ：w w w e x p a s y c h s p r o t 或h t t p ：w w w e b i a c u k s w i s s p r o t ) 3 8 】、p i r ( p r o t e i ni n f o r m a t i o n r e s o u r c e ，h t t p ：p i r g e o r g e t o w n e d 彬或h t t p ：w w w m i p s b i o c h e m m p g 。d e ) 1 3 9 1 等数据库。 蛋白质组数据库，比如a a i n d e x ( 氨基酸索引数据库，h t t p ：w w w g e n o m e a d j p d b g e t ) 、 g e l b a n k ( h t t p ：g e l b a n k a n l g o v ) 、p r e d i c t o m e t 柏1 等相关数据库。蛋白质序列基序的研 究：b l o c k s 数据库( h t t p ：b l o c k s f h c r c o r g ) 、c d d ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v s t r u c t u r e c d d c d d s h t m l ) 以及i n t e r p r o t 4 、p f a m t 4 2 1 以及p r o s i t e 4 3 j 等。蛋白质三维结构相关数 据库：目前通过诸如x 射线衍射晶体结构分析、多维核磁共振( 偶) 波谱分析和电子 显微镜二维晶体三维重构( 电子晶体学，e c ) 等物理方法得到蛋白质三维结构。相关数 据库有：p d b ( p r o t e i nd a t ab a n k ) 4 4 , 4 5 】、m m d b ( m o l e c u l a rm o d e