（微生物学专业论文）薯蓣内生真菌生物活性及其与宿主细胞共培养的初步研究.pdf

果。 学位论文独创性声明 本人郑重声明 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已 经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了 谢意。 作者签名：盈堡玉 日 期：生生：! 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子 版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文 进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行 检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解 密后适用本规定。 作者签名： 日期： j 舭 南京师范大学硕士学位论文薯蓣内生真菌生物活性及其与宿主细胞共培养的初步研究 摘要 植物内生真菌可产生多种生物活性物质且数量庞大，是一类具有潜在开发价 值的微生物新资源。但至今，对内生真菌的研究既不深入也不系统，所研究的植 物类群大约只有数百种，有待于迸一步开发利用。薯蓣是重要的药用植物，利用 薯蓣愈伤组织、细胞培养合成薯蓣皂甙元是解决野生薯蓣因过度采挖而面临枯竭 的方法之一，但因其产量太低而至今未能实现工业化生产。根据近年来的研究成 果，一般认为植物内生真菌与其宿主是协同进化的，作为内共生物可以产生与其 宿主相同或相似的生理活性物质，因此，这为将薯蓣细胞与其内生真菌进行共培 养，探索模拟二者的共生关系以促进薯蓣细胞合成薯蓣皂甙元提供了理论基础。 本研究通过组织分离法从盾叶薯蓣( d i o s c o r e a z i n g i b e r e n s i s ) 的根茎、种子、叶 和茎等部位分离了内生真菌并进行了形态鉴定，开展了薯蓣内生真菌抗氧化活性 和抑菌活性等生物活性的初步研究和产黄酮类化合物及皂甙类化合物内生真菌 的筛选。又以薯蓣茎段诱导了愈伤组织，进而建立了薯蓣悬浮细胞系，初步构建 了薯蓣内生真菌与薯蓣悬浮细胞的共培养体系，比较了共培养体系、单独培养的 薯蓣悬浮细胞系和薯蓣内生真菌中的皂甙元含量、抗氧化活性及抗氧化代表酶酶 活性的差异。 从盾叶薯蓣( dz i n g i b e r n s i s ) 各部位共分离到5 0 株内生真菌，初步鉴定有 1 9 株分属于盐霉属( a s p e r g i l l u s m i c h e l ie xf r ) 、须壳霉属( p y r e n o c h a e t a d e n o t ) 、 刺孢壳属( c h a e t o m e l l af u c k e l ) 、侧孢霉属( s p o r o t r i c h u ml k e xf r ) 、棒束梗霉 ( 1 s a r i ap e t s e xf r ) 、假黑粉霉属( c o n i o s p o r i u ml k e xf r ) 和简梗孢霉属 ( c h r o m o s p o r i u mc o r d a ) ，其余菌株因不产孢而暂未鉴定。将此5 0 株薯蓣内生 真菌分批接种至马铃薯葡萄糖液体培养基中于2 7 、1 2 0 r m i n 摇床中振荡培养7 天，收获菌丝及发酵液。利用碘量法检测到4 株菌株的菌丝及发酵液的乙醇提取 物有抗氧化活性，其中分离于根茎的薯蓣内生真菌菌株e d t 5 和分离于种子的菌 株e d s 。的发酵液的乙醇提取物的抗氧化活性较高，且在一定范围内，随着其浓 度的增加，抗氧化活性增强，表明这两个菌株具有用于天然抗氧化物质生产的潜 在价值。利用生长速率法和孢子萌发法检测到分离于根茎的e d t 3 、e d t 4 、e d t 5 和分离于种子的e d s l 、e d s 3 、e d s 。等6 株菌株的发酵液对棉花黄萎病菌 ( v e r t i c i l l i u md a h l i a e ) 等6 种植物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发有抑制作用， 4 南京师范大学顽士学位论文薯蓣内生真菌生物括性及其与宿主细胞共培养的初步研究 其中e d s 3 和e d s 。两个菌株的发酵液的混和液对此6 种植物病原真菌的菌丝生 长和孢子萌发有更好的抑制作用。利用t l c 、 珀l c 和显色反应等方法筛选到一 株产黄酮类化合物的菌株e d s 4 及两株产皂甙类化合物的菌株e d s 3 和e d t 5 。 e d s 4 菌株发酵液的乙醇提取物经h p l c 检测有一个峰的保留时间( 5 7 1 7 ) 和芦 丁标准品的保留时间( 5 7 3 1 ) 基本相同，其显色反应结果也与黄酮类化合物的 特征性显色反应结果相一致，因此初步推测e d s 。菌株发酵液的乙醇提取物中含 有黄酮类化合物。e d s 3 和e d t 5 菌株菌丝提取物在薄层层析中的r f 值与薯蓣皂 甙元标准品的r f 值相一致，显色反应结果也与皂甙类化合物的特征性显色反应 结果相一致，因此初步推测e d s 3 和e d t s 菌株菌丝提取物中含有皂甙类化合物。 在薯蓣内生真菌和薯蓣悬浮细胞共培养的研究中，以薯蓣茎段诱导的愈伤组织色 泽鲜嫩、质地疏松，培养3 0 天后其薯蓣皂甙元含量为2 7 1 3 i x g g d w ；薯蓣悬浮细 胞比较均一稳定，培养3 0 天后其薯蓣皂甙元含量为l7 3 2 吲g d w ；将薯蓣悬浮细 胞种子液接入新鲜培养液中振荡培养7 天后接入e d t 5 菌丝得到了比较稳定的共 培养体系，培养3 0 天后其薯蓣皂甙元含量为2 1 6 7 1 t g g d w ：同时，相对于单独培 养的薯蓣悬浮细胞和薯蓣内生真菌e d t 5 ，共培养体系细胞内的抗氧化酶活性较 高，而其滤液中的抗氧化酶活性较低；碘量法实验表明共培养液的抗氧化活性高 于薯蓣悬浮细胞液，表明决定抗氧化活性的不是抗氧化相关酶系，而是内生真菌 产生的可分泌到细胞外的其它抗氧化活性物质。 关键词：盾叶薯蓣；内生真菌；共培养；薯蓣皂甙元；黄酮类化合物；抗氧化； 抑菌作用 南京师范大学硕士学位论文薯蓣内生真菌生物活性及其与宿主细胞共培养的初步研究 a b s t r a c t e n d o p h ”i cf u n g u sc a np r o d u c em a n yk i n d so fb i o a c t i v es u b s t a n c ea n dal a r g e n u m b e ro fe n d o p h y t i cf u n g ie x i s t si np l a n t ，s oi ti san e wm i c r o o r g a n i s mr e s o u r c e w h i c hh a sl a t e n tv a l u ef o re x p l o i t a t i o n b u tu n t i ln o w , t h er e s e a r c hf o re n d o p h y t i c f u n g u si sn o tt h o r o u g ha n ds y s t e m a t i c ，t h e r ea r eo n l yh u n d r e d so fp l a n tw h i c hh a d b e e ns t u d i e df o ri t 、s oi tn e e d sm o r er e s e a r c h d i o s c o r e ai sa ni m p o r t a n tp l a n tg e n u s o fm e d i c i n a lm a t e r i a lw h i c hf a c e sb e i n ge x h a u s t e db e c a u s eo ft o om u c hp l u c k i n g o n ew a yt od e a lw i t ht h i s p r o b l e mi s t o s y n t h e s i z ed i o s g e n i nb yt h ec a l l ia n d s u s p e n s i o nc u l t u r e dc e l l so fd i o s c o r e a ，b u ti td i dn o tr e a l i z ei n d u s t r i a l i z a t i o nb e c a u s e o fi t sl i t t l e p r o d u c t i o n r e s e n t r e s e a r c hs h o w e dt h a t e n d o p h y t i cf u n g i w e r e c o e v o l u t e dw i t hi t sh o s ta st h er e s u l to fs y m b i o s i s ，t h e ym a yp r o d u c et h es a m eo r s i m i l a rc o m p o u n da st h e i rh o s t s ob a s e do na b o v e m e n t i o n e d ，i ti si m p o s s i b l et o i m p r o v e t h ep r o d u c t i o no fd i o s g e n i n b yt h ec o c u l t u r eo fd i o s c o r e aa n di t s e n d o p h y t i cf u n g ii no n ec u l t u r es o l u t i o n ，w h i c hs i m u l a t e st h e i rs y m b i o s i s i nt h i s p a p e r , e n d o p h y t i cf u n g iw e r ei s o l a t e df r o mt h el e a f 、s t e m 、s e e da n dr o o t s t a l ko f d i o s c o r e az i n g i b e r e n s i sa n di d e n t i f i e db a s e do i lm o r p h o l o g i c a l t a x o n o m y t h e a n t i o x i d a n ta c t i v i t ya n dt h ef u n g i s t a s i so ft h em e t a b o l i t eo ft h e s ee n d o p h y t i cf u n g i w e r ep r e l i m i n a r ys t u d i e da n dt h ee n d o p h y t i cf u n g iw h i c hc o u l dp r o d u c ef l a v o n o i d s a n dd i o s c i nw e r es e a r c h e d a tt h es a n l et i m e ，t h ec a l l iw e r ei n d u c e df r o mt h es t e mo f dz i n g i b e r n s i sa n dd z i n g i b e r n s i sc e l l sl i n eu n d e rs u s p e n s i o nc u l t u r ew e r ef o r m e d o n es t r a i no ft h e s ee n d o p h y t i cf u n g ia n ddz i n g i b e r n s i ss u s p e n s i o nc u l t u r e dc e l l s w e r es u c c e s s f u l l yc u l t i v a t e dt o g e t h e ri nt h es a m ec u l t u r es o l u t i o n ，t h ed i o s g e n i n p r o d u c t i o na n da n t i o x i d a n ta c t i v i t ya n da n t i o x i d a s ea c t i v i t yo fc o c u l t u r es y s t e ma n d s u s p e n s i o nc u l t u r e dc e l l sl i n eo fdz i n g i b e r n s i sa n dt h ee n d o p h y t i cf u n g io fd z i n g i b e r n s i sw e r ec o m p a r e d 5 0s t r a i n so fe n d o p h y t i cf u n g iw e r ei s o l a t e df r o md z i n g i b e r n s i s t h e yw e r e i d e n t i f i e da s a s p e r g i l l u sm i c h e l ie xf r 、p y r e n o c h a e t ad en o t 、c h a e t o m e l l af u c k e l 、 印o r o t r i c h u m l k e xf r 、i s a r i ap e m e xf r 、c o n i o s p o r i u ml k e xf r a n d c h r o m o s p o r i u mc o r d ae x c e p t31s t r a i n sw h i c hd i dn o tb ei d e n t i f i e df o rt h e yc o u l dn o t 6 南京师范大学硕上学位论文 蔷蓣内生真菌生物活性及其与宿主细胞共培养的初步研究 p r o d u c es p o r e s t h e s ee n d o p h y t i cf u n g iw e r ec u l t u r e du n d e r2 7 。c ，1 2 0 r m i nf o r7 d ， t h e nt h em y c e l i aa n dt h ef e r m e n t e db r o t hw e r eg a i n e df o rd e t e c t i o n ，t h ea n t i o x i d a m a c t i v i t yo fc o m p o u n de x t r a c t e db ye t h a n o lf r o mt h em y c e t i aa n dt h ef e r m e n t e db r o t h o ff o u rs t r a i n sw e r ef o u n db yd e t e c t i n gp o v t h ee x t r a c tf r o mt h ef e r m e n t e db r o t ho f e d t 5 ，w h i c hw a si s o l a t e df r o mt h er o o t s t a l ko fdz i n g i b e r n s i s ，a n de d s 4 ，w h i c hw a s i s o l a t e df r o mt h es e e do fd z i n g i b e r n s i s ，s h o w e dv e r ys t r o n ga n t i o x i d a n ta c t i v i t y , a n d w i t h i nc e r t a i nr a n g e ，i t sa n t i o x i d a n ta c t i v i t yw e r ee n h a n c e dw h e nm o r ee x t r a c tw e r e a d d e d t h i ss u g g e s t e dt h a te d t sa n de d s 4h a dl a t e n tv a l u eu s e df o re x p l o i t i n g n a t u r a la n t i o x i d a n tc o m p o n e n t t h ef e r m e n t e db r o t ho fs i xs t r a i n sh a dd i f f e r e n t i n h i b i t i n gr a t e t o t h e m y c e l i ag r o w t ha n dt h es p r o u t i n go fs i xk i n d s o fp l a n t p a t h o g e n i cf i m g is u c ha s v e r t i c i l l i u md a h l i a e t h e yw e r ee d t 3 ，e d t 4a n de d t 5 ， w h i c hw e r ei s o l a t e df r o mt h er o o t s t a l ko fd z i n g i b e r n s i s ，a n de d s ，e d s 3a n de d s 4 ， w h j c hw e r ei s o l a t e df r o mt h es e e d 。e - y , w h i c hw a sm i x t u r eo ft h ef e r m e n t e db r o t ho f e d s 3a n de d s 4 ，h a dh i g h e ri n h i b i t i n gr a t e st ot h em y c e l i ag r o w t ha n dt h es p r o u t i n go f s i xp l a n tp a t h o g e n i cf u n g i o n es t r a i n ( e d s 4 ) w h i c hp r o d u c e sf l a v o n o i d sa n dt w o s t r a i n sf e d s 6a n de d t s ) w h i c hp r o d u c ed i o s c i nw e r ef o u n db yd e t e c t i n gt h ee x t r a c t o ft h em y c e l i aa n dt h ef e r m e n t e db r o t ho ft h o s ee n d o p h y t i cf u n g ib yt l ca n dh p l c a n dc o l o rr e a c t i o na n a l y s i s t h er e s u l to fh p l cs h o w e dt h a tt h ec o m p o u n de x t r a c t e d b ye t h a n o lf r o mt h ef e r m e n t e db r o t ho fe d s 4 h a do n e p e a kw h i c ht a l l i e dw i t hr u t i n a n dt h e r e s u l to fc o l o rr e a c t i o nw a sc o i n c i d et of l a v o n o i d s ，s oi tw a si n f e r e d p r e l i m i n a r i l yt h a tt h ef e r m e n t e db r o t ho fe d s 4c o n t a i n e df l a v o n o i d s o ri t ss i m i l a r c o m p o u n d t h er e s u l to f t l cs h o w e dt h a tr f o f t h ee x t r a c tf r o mt h em y c e l i ao f e d t 5 a n de d s 3t a l l i e dw i t hd i o s g e n i na n dt h e r e s u l to fc o l o rr e a c t i o nw a sc o i n c i d et o d i o s c i n ，s oi tw a si n f e r e dp r e l i m i n a r i l yt h a tt h ee x t r a c to ft h em y c e l i ao fe d t sa n d e d s 3c o n t a i n e dd i o s c i no ri t ss i m i l a rc o m p o u n d t h ec a t l ii n d u c e df r o mt h es t e mo f d z i n g i b e r n s i sw e r ef l e s ha n dt e n d e ra n dt h ec o n t e n to fd i o s g e n i ni n3 0 d a y - c u l t u r eo fi t w a s2 7 1 3 9 9 g d w t h es u s p e n s i o nc u l t u r e dc e l l sl i n eo f dz i n g i b e r n s i sw a sg o o da n d t h ec o n t e n to fd i o s g e n i ni n3 0 d a y - c u l t u r eo fi tw a s1 7 3 2 1 x g g d w e d t sc o u l d b e s u c c e s s f u l l yc u l t i v a t e dw i t hd z i n g i b e r n s i ss u s p e n s i o nc u l t u r e dc e l l sw h i c hh a db e e n c u l t u r e df o r7 df i r s t l y t h ec o n t e n to fd i o s g e n i ni n3 0 d a y c u l t u r eo fc o - - c u l t u r ew a s 7 南京师范大学硕士学位论文薯蓣内生真菌生物活性及其与宿主细胞共培养的初步研究 2 1 6 7 “g g d w t h ea c t i v i t yo f a n t i o x i d a s ei nt h ec e l l so f c o c u l t u r es y s t e mw a sh i g h e r t h a nt h a t i ndz i n g i b e r n s i ss u s p e n s i o nc d t u r e dc e l l sl i n ea n de d t 5 b u ti tw a s c o n t r a t yf o rt h ef e r m e n t e db r o t ho fc o c u l t u r es y s t e m p o v ( m e q k g ) o fl a r dc o p e d w i t ht h ee x t r a c to ft h ef e r m e n t e db r o t ho fc o c u l t u r es y s t e mw a sl o w e rt h a nd z i n g i b e r n s i ss u s p e n s i o nc u l t u r e dc e l l sl i n e ，i ts h o w e dt h a tw h a td e c i d et h ea n t i o x i d a n t a c t i v i t yw a sn o ta n t i o x i d a s eb u tc e r t a i nc o m p o u n de n d o p h y t i cf u n g is e c r e t e d k e y w o r d s ：d z i n g i b e r n s i s ，e n d o p h y t i cf u n g u s ，c o c u l t u r e ，d i o s g e n i n ，f l a v o n o i d s ， a n t i o x i d a n ta c t i v i 吼f u n g i s t a s i s 8 南京师范大学硕卜学位论文薯蓣内生真菌生物活性披其与宿主细胞共培养的初步研究 一、综述 1 药用植物内生真菌的研究 内生真菌( e n d o p h y t i cf l m g u s ) 是指那些在其生活史中某一段时期生活在活 的植物组织内，对植物组织不引起明显病害症状的真菌。这个定义包括那些在其 生活史中的某一阶段营表面生的腐生真菌和对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原 真菌和菌根菌( p e t r i n i ，1 9 9 1 ) 。内生真菌在植物体内是普遍存在的，其数量相 当庞大。掘估计，内生真菌的总数可能超过1 0 0 万种( p e t r i n i ，1 9 9 1 ) 。自1 9 9 3 年s t r o b e l 等从短叶红豆杉( t a x u sb r e v i f o 加n u t t ) 的韧皮部中分离出一株能产生 紫杉醇的内生真菌以来【，】，从药用植物中分离并筛选能产生与其寄主植物相同或 相似的生理活性物质的研究成为了国内外学者广泛重观的领域。我国科学家在这 方面也做了许多有益的工作，邱德有等( 1 9 9 4 ) 从云南红豆杉( r y u n n a n e n s i s ) 韧皮部中分离出一个具有产紫杉醇的能力菌株1 3 1 ，中山大学王伟等( 1 9 9 9 ) 从南 方红豆杉( fc h i n e n s i sv a t m a i r e i ) 韧皮部分离得到6 个能分泌紫杉烷类化台物 的菌株f 4 l ，1 9 9 6 年以来，张玲琪等分别从抗癌药用植物长春花( c a t h a r a n t h u s r o s e u s ) 、桃儿七( s i n o p o d o p h y l l u mh e x a n d r u m ) 等植株中分离到产抗癌药物长春 新碱和鬼臼毒素类似物的内生真菌【5 。i 。此外，张玲琪等( 1 9 9 9 ) 在德国鸢尾( i r i s g e r m a n i c a ) 根状茎中分离得到产鸢尾酮的内生真菌1 8 1 。陈双林等( 2 0 0 3 和2 0 0 4 ) 分别从银杏( g i n k g ob i l o b a ) 和杜仲( e u c o m m i au l m o i d e s ) 中分离到能产黄酮类 物质的内生真菌 9 - 1 0 1 。另外，有些植物如云南红豆杉( 丁y u n n a n e n s i s ) 、长春花 ( c a t h a r a n t h u sp o s e r s ) 等。一些真菌的存在会对其组织培养过程中的细胞活性 成分的增加有明显的影响。高微微和郭顺星研究了开唇兰小菇、石斛小菇、兰小 菇等3 种小菇属内生真菌对兰科濒危药用植物铁皮石斛、金线莲生长的促进作用 “】。他们采用植物无菌原球茎及试管苗与真菌进行双重培养，观测原球茎增殖及 苗的生长情况。结果表明接种了3 种内生真菌后，铁皮石斛苗的生长量高于对照 3 5 倍，石斛小菇、兰小菇对铁皮石斛原球茎增殖也有明显促进作用( p 0 0 5 ) ， 接种3 种真菌的金线莲茁，侧芽及侧根数均显著高于对照。江东福等( 1 9 9 5 ) 在 真菌和龙血树血竭形成关系的研究中发现真菌对龙血树血竭形成有促进作用 1 2 1 。由此可见，药用植物内生真菌在开发生物活性物质、提供新的药源上是一 类具有较高价值和较大潜力的重要的微生物资源。 9 南京师范= 学硕上学位论文薯蓣内生真菌生物活性段其与宿主细胞共培养的枷步研究 2 薯蓣皂甙元的特性与功能 薯蓣皂甙元是薯蓣属植物中薯蓣皂甙( d i o s c i n ) 的配基，其结构如图l ，主 要以薯蓣皂甙的形式与纤维素结合存在于细胞壁中。 圈l 薯颈皂甙和署预甚甙兀的结构 f i git h es t r u c t u r eo f d i o s c i na n dd i o s g e n i n 薯蓣皂甙元是合成多种甾体激素和甾体避孕药比较理想的前体，世界各国生 产的甾体激素6 0 以上以它为原料，鬲体激素药物应用广泛，常用于治疗风湿性 关节炎、心脑血管疾病，在抗肿瘤、避孕、止血、消炎抗菌和杀虫等方面也占有 重要的位置，在农业生产和畜牧业中也有广泛的应用，如养蚕、调节植物生长、 调节家畜的发情、分娩和诱导泌乳等。甾体激素药物业的发展十分迅速，美国仅 皮质激素类就有6 0 多种药品上市。简体避孕药对我国计划生育的基本国策的 执行有着重要作用。从1 9 5 8 年开始，我国也建立了以薯蓣皂甙元为主要原料的 甾体激素药物工业，目前国内有众多厂家利用其生产甾体激素类药物和甾体口服 避孕药，是药品生产中仅次于抗菌素的一个重要领域。 3 盾叶薯蓣的资源分布、生物活性和组织培养 薯蓣科( d i o s c o r e a c e a e ) 是单子叶植物，约1 0 属6 5 0 种，广泛分布于全球 热带和温带。薯蓣植物是一类极其重要的药用经济作物，3 0 多种药用薯蓣体内 含有薯蓣皂甙元( d i o s g e n i n ) 。薯蓣皂甙元又称薯蓣皂素，是合成甾体激素类药 物的重要原料。其结构经改造和合成后，可得到数千种不同的甾体激素类药物， 被医药界称作“药用黄金”。我国仅有薯蓣属，约5 0 种，其中1 7 种，1 亚种，2 变种含有薯蓣皂甙元。盾叶薯蓣( d i o s c o r e a z i n g i b e r e n s i sc h w r i g h t ) 又名黄姜， 为我国特有的薯蓣物种。其根茎内薯蓣皂甙元的含量最高达1 6 i 5 【i ”，是目前 世界上最好的激素类药源植物。 i o 南京师范大学硕上学位论文 薯蓣内生真菌生物活性及其与宿主细胞共培养的初步研究 3 1 资源分布 盾叶薯蓣( dz i n g i b e r n s i s ) 分布于东经9 8 。5 3 1 1 2 。5 07 ，北纬2 3 。4 2 3 4 。l o 内，为我国特有的薯蓣物种，生长在河谷及低、中山丘陵的落叶阔 叶与常绿阔叶混交林或稀疏的常绿林的灌木林内。由于长期大量采挖，野生资源 日益衰竭，质量下降，皂甙元含量从2 降至1 ，皂甙元熔点低于1 9 5 。因此， 近年来对其引种栽培日益受到重视。周雪林等( 1 9 8 2 ) 对野生盾叶薯蓣的资源进 行了调查【i “，并进行了引种实验，发现野生盾叶薯蓣以四川盆地和云贵高原为 界可分成不连续的两片，一片分布于横断山脉地区的金沙江、澜沧江、怒江沿岸 峡谷地带，主要是云南和四川西南部，另一片分布在秦岭以南，南岭阻北的大巴 山、武当山、米仓山等地区和嘉陵江、汉水、沅江、资水等流域的低、中丘陵地 带，主要是湖南、湖北、陕西南部、甘肃东南部和四川东部，其中以湖北西北部 的武当山地区和陕西东南部的安康、石泉一带分布的盾叶薯蓣所含皂甙元较高。 周雪林等( 1 9 8 9 ) 还对盾叶薯蓣进行了多年引种栽培的研究，掌握了它的生物特 性【1 “，总结出一套适合大田种植的栽培技术。对南京、江苏宜兴、江苏大丰、 浙江仙居等四地栽培根茎的生长量、皂甙元含量进行了比较，结果以浙江仙居二 年生栽培品单株生长量最高达5 5 0 2 9 ，皂甙元含量以江苏宜兴3 年生栽培品最 高，达5 3 9 。怀志萍等( 1 9 8 9 ) 采用简单相关、多元回归及逐步回归分析等方 法对我国湖南、湖北等2 7 个县的盾叶薯蓣皂甙元含量与7 个气候生态因子的关 系进行了分析研究【1 6 1 ，结果表明，年降水量和年平均5 c m 土温为影响盾叶薯蓣 皂甙元含量的主要因素，盾叶薯蓣皂甙元的合成与积累的最适气候生态条件为： 年降水量8 0 0 9 0 0 m m ，以8 5 0 m m 最佳，年平均5 c m 处土温1 5 。c 1 7 ，以1 6 。c 最佳。我国现有的3 个主要盾叶薯蓣栽培基地为湖北郧西5 3 0 0 。6 6 5 0 k m 2 ，陕西 安康3 3 0 0 k m 2 ，湖北安化2 0 0 0 2 5 0 0 k m 2 。但由于这些基地的产量和效益低下，已 严重制约着盾叶薯蓣人工栽培的发展。另外河南洛阳、南阳地区也有大面积栽培 的盾叶薯蓣旧。 3 2 药理研究 盾叶薯蓣( d z i n g i b e r n s i s ) 以根状茎入药，具有祛湿、清热解毒之功效，民 间用于治疗皮肤急性化脓性感染、软组织损伤、蜂蜇、虫咬及各种外科炎症，根 状茎还有强身壮骨的作用，现代研究认为它还有其它方面的作用。、灭钉螺的 南京师范大学硕士学位论文薯蓣内生真菌生物活性及其与宿主细胞共培养的初步研究 作用。刘汉成等( 2 0 0 1 ) 进行了盾叶薯蓣杀灭湖北钉螺卵的实验研究f 】引。采用 药液浸泡法对不同发育阶段的螺卵细胞进行卵化阻滞实验，结果表明，1 0 m g l 药液浸泡4 8 h 对1 d 和5 d 卵龄螺卵具有良好的杀灭作用，杀灭l d 卵龄螺卵的有 效率可达8 0 ，其l d 5 0 为1 0 2 8 m g l ( 斜率b = 1 9 7 6 7 ) 。杀灭2 0 d 卵龄螺卵的有 效率小于5 ；测定的生物效应与螺卵的卵龄呈负相关。糜留西等( 1 9 9 6 ) 应用 盾叶薯蓣根粉进行小规模的现场灭螺实验，结果表明，浸杀和喷洒分别为1 0 0 9 m 3 和5 0 9 m 3 的药浓量，施药后7 d 活螺平均密度下降率均在9 0 以上，且有效地抑 制钉螺上爬。其结果与录硝柳胺药效相卦”】。、抗肿瘤作用：李忌等( 1 9 9 9 ) 采用m t t 法以长春花新碱( v c r ) 为阳性对照，研究了薯蓣皂甙( d i o s c i n ) 等6 种天然甾体化合物对肝癌s m m c 。、人宫颈癌h e l a 和胃癌m g c 。细胞的抑制作用， 薯蓣皂甙的抑肿瘤活性证实为大于长春花新碱( v c r ) 2 0 oh uk e ( 1 9 9 6 ) 报道 薯蓣皂甙的前皂甙配基a 、薯蓣皂甙和纤细皂甙在体外对肿瘤细胞系k 5 6 2 具有 毒作用 2 ”。m o a l i c 等( 2 0 0 1 ) 研究了薯蓣皂甙元对人骨肉瘤1 5 4 7 细胞系的增殖、 细胞周期、凋亡的作用以及环氧化酶c o x 的表达和活性【2 2 j 。结果表明，薯蓣皂 甙元能抑制1 5 4 7 细胞的生长，使细胞分裂周期停止在g 1 期，诱导了细胞的凋 亡。同时还观察到给药后随着时间的推移，p g e 2 的合成增加。另据报道薯蓣皂 甙能显著抑制人类白血病细胞素h l 6 0 的生长，诱导细胞分化和凋亡，而且对其 它肿瘤细胞系也有类似的作用【2 3 1 ，薯蓣皂甙显著地抑制h e l a 细胞的增殖，当给 予薯蓣皂甙后，h e l a 细胞以时间和剂量依赖关系呈现凋亡 2 。、薯蓣皂甙还 有抗炎、抑菌、平喘、降血脂等作用，盾叶薯蓣中所含的水溶性皂甙能增加冠脉 血流量和营养心肌，改善末梢循环从而增加心肌血氧供应，它还能降低总胆固醇、 甘油酸三酯胆固醇，提高高密度脂蛋白胆固醇水平，对纠正脂质代谢紊乱，防 治动脉粥样硬化起有益的作用，它也有降低全血及血浆粘度的作用。 3 3 化学成分 盾叶薯蓣( dz i n g i b e r n s i s ) 根茎含薯蓣皂甙元( d i o s g e n i n ) ，又名薯蓣皂素， 是目前世界上合成3 0 0 多种甾体激素和避孕药的原料。刘承来等( 1 9 8 4 ) 从其干 燥根茎的乙醇提取物得到4 个甾体化合物阳，即表拔葜皂l 甙元( e p i s m i l a g e n i n ) ， 延令草次甙( t r i l l i n ) ，结构为3 - o ( b - d 葡萄吡喃糖) 一薯蓣皂甙元【3 一o 一( b - d g l u c o p y r a n o s y l ) 一d i o s g e n i n ，薯蓣皂甙元双葡萄糖甙( d i o s g e n i n - d i g l u c o s i d e ) ， 1 2 南京师范大学顾士学位论文薯蓣内生真菌生物活性及其与宿主细胞菸培养的初步研究 结构为3 - o fb 葡萄吡喃糖( 1 4 ) 1 3 d 一葡萄吡喃糖】一薯蓣皂甙元 3 - o 一 1 3 d g l u c o p y r a n o s y i ( 1 4 ) b d g l u c o p y r a n o s y l d i o s g e n i n ，纤细皂甙( g r a c i l l i n ) ， 结构为3 - o b d 葡萄吡哺糖( i 一3 ) a l 一鼠李糖( i 一2 ) 】- b - d 一葡萄吡喃糖 _ 薯蓣皂甙元 3 - o 一 b - d - g l u c o p y r a n o s y l ( 1 3 ) 一 一l r h a m n o p y n o s y i ( 1 2 ) 】 b d g l u c o p y r a n o s y i ) - d i o s g e n i n ) 。他们( 1 9 8 5 ) 又从其新鲜根茎的甲醇提取物分 离到薯蓣皂甙元棕榈酸酯( d i o s g e n i np n m i t a t e ) 、b 谷甾醇( b s i t o s t e r 0 1 ) 、纤 细皂甙( g r a c i l l i n ) 、原纤细皂甙( p r o t o g r a c i l l i n ) 和原盾叶皂甙( p r 。t o z i n g i b e r e n s i s s a p o n i n ) ，其中原盾叶皂甙为一新甾体皂甙【2 “，结构为3 - o a l 鼠李吡喃糖( 1 3 ) 一【0 d 一葡萄吡喃糖( 1 2 ) 】一b d 葡萄吡哺糖卜2 6 一o 一 b d 葡萄吡喃糖) 一 薯蓣皂甙元 3 。o a - l - r h a m n o p y n o s y l ( 1 3 ) 【p - d g l u c o p y r a n o s y l ( 1 2 ) 】- p d g l u c o p y r a n o s y l 2 6 o b d - g l u c o p y r a n o s y l 一d i o s g e n i n ) ，后2 个原始皂甙含 量较高，占总皂甙9 0 。样品放置过程中由于酶解等原因，可使原始皂甙水解为 次级甙，因此，为了获得植物中的原始皂甙采用鲜植物样品为宣。但原始皂甙酶 解后除原纤细皂甙酶解得到纤细皂甙外，未能得到预期的原盾叶皂甙的次级甙， 其原因需进一步深入探讨。唐世蓉等( 1 9 8 3 ) 从盾叶薯蓣根中分得2 种水不溶性 三糖皂甙( a 和1 3 ) ，以及两种水溶性四糖皂甙( c 和d ) 蜊。a 为新皂甙，暂 定名为盾叶皂甙a ( z i n g i b e r e n i n a ) ，结构为薯蓣皂甙元- 3 - o 0 d 一葡萄吡喃糖 ( 1 - - 2 ) 】o n l 鼠李吡哺糖( 1 3 ) - o b - d 一葡萄吡哺糖甙，b 为纤细皂甙 ( g r a c i l l i n ) 异构物，c 为原盾叶皂甙a ( p r o m z i n g i b e r e n i n a ) ，d 为原盾叶皂甙 b ( p r o t o z i n g i b e r e n i nb ) 。 3 4 愈伤组织和细胞培养 植物组织培养是应用无菌培养的方法培养植物的一个离体部分，也即是一种 将自然环境中分离出来的植物组织或细胞放入合成培养基中，在无菌条件下使之 生长或发育的方法。组织培养方法为解决药物生产中的某些问题开辟了广阔的前 景。药用植物的有效成分一般都从植物体提取而得，其产量和质量难免要受到植 物的遗传性、生长条件、收获时间、贮藏和运输、生态和环境等因素所影响，如 果能采用类似培养微生物产生抗菌素的方法生产有效成分，就可克服这些缺点， 这对生长条件要求严格、生长缓慢、产量低、价值贵重的药用植物种类更有意义。 如近年来已大量培养人参组织，并提取其有效成分人参皂甙。因此利用组织和细 南京师范大学硕上学位论文薯蓣内生真菌生物活性及其与宿主细胞共培养的静j 步研究 胞培养技术生产药用成分，探索天然药物生产工业化的途径是当前药物生产的一 个新方向，随着太规模人工培养技术的成功，就有可能用组织培养法或细