（微生物学专业论文）应用酵母双杂交体系筛选ifp35相互作用蛋白.pdf

ab s t r a c t i f p 3 5 i s a n i n t e r f e r o n - i n d u c e d p r o t e i n w it h l e u c in e z i p p e r d o m a in w h o s e e x p r e s s i o n i s r e g u l a t e d 妙i n t e r f e ro n s ( i f n ) . w h i le i t s s p e c i f ic f u n c t i o n i s n o t c l e a r . t h e p r im a ry s t u d y o f o u r l a b o r a t o ry f o u n d i f p 3 5 c o u l d i n t e r a c t w i t h b f v t r a p s - a c t i v a t o r b t a s , w h i c h i m p l i e s t h a t i f p 3 5 m a y p la y a n im p o r t a n t ro l e i n t h e c e l l u l a r a n t i - v i r u s p r o c e s s h o w e v e r , t h e m e c h a n i s m i n d e t a i l n e e d t o b e f u r t h e r e x p l o r e d . i t w o u l d b e h e l p f u l f o r f u rt h e r s t u d i e s o n t h e f u n c t i o n s o f i f p 3 5 a n d w o u l d b e o f g r e a t i m p o r ta n c e t o l e a r n t h e m e c h a n i s m s o f h u m a n a n t i - v i r u s p r o c e s s a n d s p e c i f i c f u n c t i o n o f i f p 3 5 d u r i n g t h i s p r o c e s s . b a s e d o n p r i m a ry w o r k o n i f p 3 5 , m a s s s c r e e n in g o f h u m a n c e l l f o r p r o t e i n s i n t e r a c t i n g w i t h i f p 3 5 u s i n g y e a s t t w o 一b r i d s y s t e m w a s p e r f o r m e d . t h e m a i n r e s u l t s a r e a s f o l l o w s : 1 . p g b k t 7 - i f p 3 5 w a s t r a n s f o r m e d i n t o y e a s t c e l l s . t h e r e s u l t s o f a u t o n o m o u s a l a c t i v a t i o n t e s t i n g s h o w e d t h a t t h e r e w a s n o a u t o n o m o u s a c t i v a t i o n o f i f p 3 5 , w h i c h i m p l i e s y e a s t t w o 勿b r id s c r e e n i n g c a n b e p e r f o r m e d ; 2 . c o m p l e t e d t h e m a s s s c r e e n i n g t e s t , a n d f o r t h e f i r s t t im e o b t a i n e d g r p 7 8 a n d e e f i a l w h ic h i n t e r a c t w i t h t h e b a i t p r o t e i n , p r e p a r i n g f o r fi n th e r r e s e a r c h w o r k ; 3 . g e n e s o f g r p 7 8 a n d e e f l a l w e r e s u c c e s s f u l l y c l o n e d fr o m h u m a n b c e l l c d n a l i b r a ry a n d v e r i f i e d ; 4 . g r p 7 8 a n d e e f l a l g e n e s w e r e c l o n e d i n t o t h e e u k a ry o t i c e x p re s s i o n v e c t o r p c m v - t a g a n d t h e f u s i o n p r o t e i n s w e r e e x p r e s s e d s u c c e s s f u l l y ; 5 . i n t e r a c t i o n s o f g r p 7 8 a n d e e f l a l w i t h i f p 3 5 i n 2 9 3 t c e l l s w e re v e rt i f i e d w i t h c o - i m m u n o p r e c ip i t a t i o n a s s a y ; 6 . i n t e r a c t i o n s o f g r p 7 8 a n d e e f l a l w i t h i f p 3 5 w e r e f ur t h e r p r o v e d 妙 t h e i r c o - l o c a t i o n i n h e l a c e l l s w h i c h w e re d e m o n s t r a t e d b y i m m u n o fl u o r e s c e n c e m ic r o s c o p e . b y u s in g t h e y e a s t t w o - h y b r i d s y s t e m , t w o p r o t e i n s i n t e r a c t i n g w i t h i f p 3 5 w e re c o n f i r m e d : g r p 7 8 a n d e e f l a l . t h e s u c c e s s f u l c l o n i n g o f t h e g e n e s o f t h e p r o t e i n s i n t e r a c t i n g w i t h i f p 3 5 w o u l d p a v e t h e w a y f o r fi u t h e r s t u d y o n t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m s o f i f p 3 5 b i o l o g i c a l a c t i o n a n d i t s a n t i - v i n e s m e c h a n i s m s . k e y w o r d s : i f p 3 5 ; y e a s t t w o - h y b r i d ;p r e c ip i t a t i o n ; i n t e r a c t i o n 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本:学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、 数字化或其它手段保存论文; 学校有权提供目 录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务; 学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版; 在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名: ia io 了 年 s a 10 fi 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文， 是本人在导师指导下， 进行 研究工作所取得的成果。 除文中己 经注明引 用的内 容外， 本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、 已 公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体， 均己 在文中以明确方式标明。 本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名: 7-0 7 年 s 月u日 第一章 前言 第一章 前 言 第一节 干扰素诱导蛋白 及i f p 3 5 的 研究现状 1 . 1 . 1 干扰素及其分类 干扰素 ( i n t e r f e r o n . i f n) 是动物细胞在受到某些病毒感染后分泌的具有多 种功能的宿主特异性蛋白 质，是一种由 单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。 具有广谱的抗病毒、影响细胞生长和分化、调节免疫功能等多种生物活性。 1 9 5 7 年英国 科学家i s a a e s 和l i n d e m n a n n 在研究病毒干扰现象时 发现， 当他 们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞时， 发现这些细胞产生了 一种可溶性物质， 这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的繁殖，因此，他们将这种物 质称为 “ 千扰素” 。 以 后科学家们进一步发现， 机体对入侵的 异种核酸( 包括病毒) 都产生干扰素以进行防御。当机体细胞受到病毒感染时，机体细胞产生干扰素， 千扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统。 根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、 抗原性和细胞来源， 可将其分为: i f n - a . i f n - p 、 i f n - y o a 型 干 扰 素 是由白 细 胞 产 生 的 : p 型 干 扰素 是由 成 纤 维 细 胞 产生 的: 7 型 干扰素是由 免疫系统中的 淋巴 细 胞 产生的。 i f n - 。 也 属于白 细胞源i f n 隶属于i f n - a 家族， 其结构和大小与其它i f n - a 稍有差异， 但抗原性有较大的不 同。 另外， i f n - u 是一种新型的纤维 细胞 源i f n 。 其中， 耐 酸的i f n - a , i f n - p , i f n - 。 与i f n - u 又合 称为i 型i f n; 对酸 敏 感 的i f n j y 称为i i 型i f n 或免 疫i f n . i f n - a 存在多种结构序列不同的亚型，目 前己 经鉴定的i f n a 亚型至少有2 3种。 由 病毒、微生物及其产物诱导产生的i 型i f n主要参与抗病毒、抗肿瘤活性， 如诱导合成抗病毒蛋白、 2 - 5 寡聚腺昔酸合成酶;由淋巴 细胞受有丝分裂原或 特异抗原刺激产生的i i 型i f n主要参与诱导m h c类抗原的表达和免疫调节效 应 ， 但 其 抗 病 毒 作 用 相 对 于i 型if n 比 较 弱 1,2 ,3 1 1 . 1 .2千扰素诱导的蛋白 干扰素处理的细胞会诱导许多蛋白 质的 产生。 最近的微阵列实 验分析显示， i f n - a 能够诱导3 0 0 多个基因的表达i 4 。 不过诱导的 水平因 基因、 细胞类型而异。 第一章 前言 其中 有些基因也能被i f n , y 、 双链r n a , l p s , t n f , i l - 1 以 及病毒感染所诱导。 己知的干扰素诱导蛋白包括抗病毒蛋白， 抗原呈递蛋白，趋化因子，g t p as e , 信号蛋白，热休克蛋白以及细胞凋亡蛋白。其中许多干扰素诱导蛋白的具体生 化以 及细胞学功能仍不明晰 1 5 . 6 1 1 . 1 .2 . 1 2 . 5 - 寡聚腺昔酸合成酶 2 , 5 一 寡聚腺昔酸合成酶是一组干扰素诱导合成的， 具有相似特性的， 需要 d s r n a作为辅因子的酶家族， 他们可以 催化a t p 聚合产生2 , 5 连接的2 , 5 - 寡聚 腺 昔酸i7 . 8 1 。 不同 种2 , 5 - 寡聚腺 昔酸 合成酶的同 工酶在结构上 类似， 可能 来源于同一祖先蛋白。 2 , 5 、 寡聚腺昔酸合成酶的己知功能是激活潜伏性的核糖核酸酶r n a s e l o 2 , 5 - 寡聚腺 昔酸合 成酶 催 化腺昔酸2 , 5 连 接在r n a s e l 的 氨基端 19 :。 三聚 或 更多聚腺昔酸活化r n as e l ，而单聚或双聚腺昔酸则没有活化r n as e l的功能， 但是太长的寡聚腺昔酸链对r n a s e l的活性有抑制作用。 在有病毒d s r n a存在 的情况下， d s r n a檄活2 , 5 一 寡聚腺昔酸合成酶，然后2 , 5 一 寡聚腺昔酸合成 酶活化r n a s e l ， 并由 此导致d s r n a的降 解。 细胞通过这一途径抵抗病毒感染。 最近发现2 , 5 - 寡聚腺昔酸合成酶的一种同 工酶9 - 2 ，除了具有催化合成2 , 5 - 寡聚 腺 普酸的 作 用外， 还可以 与 抗细胞凋 亡 蛋白b c 1 2 和 b c 1 x l通过 其 b h 3 域， 相 互 作 用 引 发 细 胞 凋 亡 10 1 1 . 1 .2 .2 r n a活化的蛋白 激酶 p k r ( t h e d o u b l e - s t r a n d e d r n a - d e p e n d e n t p rot e i n k i n a s e ) p k r 是一种广泛存在于哺乳动物细胞中的丝氨酸/ 苏氨酸蛋白 激酶， 在细胞 的生长、分化、增殖和死亡过程中起重要作用。p k r的启动子中含有干扰素结 合位点，其表达水平能够被千扰素诱导上调，故又被称为千扰素诱导的蛋白 激 酶，被认为是千扰素刺激细胞抗病毒反应的关键蛋白。此外， p k r信号系统中 还存在许多抑制和活化因子制约和调控p k r的功能。 p k r被双链r n a激活后，能使真核翻译起始因子e i f - 2 磷酸化，从而抑制 蛋白 合成并促进细胞凋亡， 还能激活转录因子n f - u b ，从而促进多种凋亡相关 第一章 前言 细胞因子的表达，在信号转导、凋亡、细胞生长分化和肿瘤形成过程中起着重 要的 作用 1 l . 1 2 . 1 3 1 n 泊印 a y 目时 趁 口， 2 . . . d。 吐 x 门 加加b wo n 可 七, . y 娜, c e s 亨 o w t h 自 山月 b 口 目 口 r p w o m忽 忿 o m 1a n 图1 . 1 p k r 的 细胞学 功能 14 1 f i g l . l c e l l a r a c t i o n o f p k r 1 4 1 1 . 1 .2 . 3 p 5 6 蛋白家族 p 5 6 ( i n t e r f e r o n - i n d u c e d 5 6 k d a p r o t e i n p 5 6 ) 是 千扰素诱导蛋白 家族成员 之 一， 又称为g 1 0 p 1 ， i f i t i ( i n t e r f e r o n - i n d u c e d p r o t e i n w it h t e tr a t r i c o p e p t i d e re p e a t s ) . i f i 5 6 ( i n t e r f e r o n - i n d u c i b l e p r o t e i n - 5 6 k d a ) , i f i - 5 6 ( i n t e r f e r o n - i n d u c i b l e p r o t e i n - 5 6 k d a ) ，i f n a i l g a r g - 1 6 ( g l u c o c o r ti c o i d a t t e n u a t e d r e s p o n s e g e n e s ) ， r n m 5 6 1 等 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 1 ， 在 人 和鼠 的 细 胞生 长 过 程中 ， 如 蛋白 合成与 翻译的 调 控 等，发挥重要的生物学作用，但其具体的功能尚未完全清楚. 1 9 7 9 年 最 早由 g u p ta l1 9 1等 用 千 扰素 在 人 和鼠 的 纤 维 母 细胞中 诱 导出 p 5 6 , s e n 等研究了 编码p 5 6 的m r n a的转录调节， 未用i f n诱导人的多种细胞不能检测 出p 5 6 的m r n a ，但经i f n处理后可快速诱导产生p 5 6 m r n a ，且m r n a水平 非常高 1 2 0 , 2 1 1 . 被i f n诱导的p 5 6 r n r n a升高 是短暂的， 约在i h 后开 始上升， 4 - 8 h 第一章 前言 内达到最高水平，1 6 h 后下降，半衰期大约为6 h 。另外双链r n a 、脂多糖 ( l ip o p o ly s a c c h a ri d e . l p s ) 和 病 毒 等也 能 诱 导 其 合 成 1 6 . 2 2 . 2 3 1 目 前发现p 5 6 与i n t - 6 , e i f 3 等蛋白 在体内能发生相互作用: 2 0 0 0 年， g u o 等首次以p 5 6 蛋白 为诱饵， 通过酵母双杂交技术筛选到p 5 6 蛋白与h i t 一蛋白具有相互作用. p 5 6 蛋白c 端的三个t p r s 基序是与i n t - 6 作用 的结合部位，并由 此推测p 5 6 在i n t 一蛋白的细胞生长调节活动中发挥了重要作 用124 1 通过与e i f 3 的p 4 8 亚单位相互作用， p 5 6 可以与e i f 3 结合而抑制它的功能。 p 5 6 结合到e i f 3 的p 4 8 _e单位，阻断其肤链的合成，导致包括p 5 6 蛋白自己 在 内 细 胞 蛋 白 的 合 成 被 抑 制 2 3 . 2 5 1 1 . 1 .2 .4 p 2 0 0 蛋白 家族 千 扰素 诱 导p 2 0 0 家 族 ( in te r f e r o n - in d u c i b le p 2 0 0 f a m ily . i f i 2 0 0 ) 是 千 扰素 诱 导产生的 众多蛋白 家族之一， 是一类核蛋白 。 干扰素诱导p 2 0 0 蛋白 家族是一类 具有高度同 源性，可以被i 型和i i 干扰素诱导的蛋白 质。它们对于细胞生长与 分化具有重要的调节作用。在结构上，该家族蛋白成员，包括6 个鼠类家族成 员和3 个人类蛋白 成员都有2 0 0 个氨基酸的 保守 序列，这也是i f i 2 0 0 家族的命 名原因。 干扰素诱导p 2 0 0 家族的蛋白结构上有着共同的特点，几乎所有的p 2 0 0 家 族的 蛋白 在蛋白 质序列的 氨基 端都 有一 个高 度保守 核定位序列 ( n u c l e a r l o c a l i z a t io n s i g n a l n l s ) 和 一 个 假 定 的d n a 结 合 区 域 26 1 . 在p 2 0 0 家 族 蛋白 的 结构域中还有一个高度保守的mf / l h a t v a t / s 结构域。 这个结构域的主要作用 是介导蛋白质之间相互作用和二聚化。这种结构的特点提示了该家族蛋白的重 要的 生 物 学调 节 功能 【2 7 1 。 而 且， 在多 数p 2 0 0 家 族蛋白 的 氨基 端 有9 0 个 氨 基酸 的 保守 区， 是与 凋 亡 及 干 扰素 反 应 相 关 蛋白 质家 族 ( d o m a i n in a p o p t o s i s a n d in t e r f e r o n r e s p o n s e . d a p i n ) 有 关的 结 构. 这 个 结 构 域 含 有5 个a 螺 旋结 构， 有 可能是 蛋白 质相互作 用的区 域(2 9 1 第一章 前言 己 有的 研究发现p 2 0 0 家族蛋白 在调 节细胞生长促进分化方面发挥作用， 这 个生物学功能主要通过其成员与相应的转录因子之间的相互作用来体现。 1 . 1 .2 . 5其他干扰素诱导蛋白 千 扰素诱导 蛋白1 0 ( i n t e r f e r o n 一 i n d u c i b l e p r o t e i n 1 0 , i p - 1 0 ) 是由 干 扰素 ( i f n 一 7 ) 和 / 或脂多 糖( l p s ) 所诱导 产生的 一 种细胞因 子， 属趋化因 子c x c类 e l r - ( 谷 氨 酸 一 亮 氨酸 精 氨 酸 ) 亚 族， 又 名c x c l 1 0 o i p - 1 0与 血 小 板因 子 4 ( p l a t e l e t f a c t o r - 4 , p f 一 4 ) 、 白 细胞介素8 ( i n t e r l e u k i n 一 8 , i l 一 8 ) 具有3 0 % 同 源 性， 故可首先预测它在炎症反应中发挥作用。 研究发现，i p - 1 0具有重要的生 物学功能，它可以 作为趋化因 子介导t h l 型炎 症反应而参与多种疾病的 发生， 如 肺结核、 系统 性红 斑狼疮 ( s l e ) 、 皮 肌炎、 类 风 湿性关 节炎、 病毒 性 肝炎等。 不仅如此， i p 一 1 0 还作为血管新生抑制因子抑制血管新生， 从而具有抑制肿瘤生 长 和 迁 移 、 参 与 血 管 重 塑 等 作 用 【29 . 30 . 3 1. 321 m x 蛋白是一类属于大g t p a s e 家族的 干扰素诱导的g t p a s e ， 其结构和功能 与动力蛋白非常类似，具有相似的特性如:巨大的分子量，自 我组装，定位于 细胞内 膜， 与g t p 具有较低的 亲和性以 及较强的g t p 水解能力。 m x g t p a s e 的 一个独特的性质是它具有广泛的抗r n a病毒， 包括布尼亚病毒属以及粘病毒属 ( 如流感病毒)。人mx a g t p a s e 在干扰素刺激后在细胞质内积聚，部分与内 质网结合。 在布尼亚病毒中， m x a干扰病毒核衣壳蛋白向高尔基体的运输， 抑 制病毒的 组 装。 在t h o g o t o 病毒 ( 一 种粘 病 毒) 中， m x a 抑制病毒 核酸向 细 胞 核的运输从而抑制病毒的转录和复制。两种情况下，g t p结合域以及c端结合 域 对 于m x a 行 使 功 能 至 关 重 要 14 1 1 . 1 . 3 i f p 3 5 的研究现状 i f p 3 5 是b a n g e f c , b o tt g e r e c 等 人 在1 9 9 4 发 现的 一 种 受 千 扰素 调 控 表 达 的蛋白 ， 在干扰素刺激后以点状聚集形式分 布于细胞质内。 蛋白 全长为2 8 2 a a , 大 小 为 3 5 k d a p 3 l e 氨基酸序列分析显示在i f p 3 5 的 氨基端存在一个亮氨酸拉链结构， 另外还存 在 两 个n m i1 i f p 3 5 结 构 域 ( n m i in t e r a c t io n d o m a in , n i d ) ， 介导n m i 与i f p 3 5 之间 第一章 前言 的相互作用及n m i 的亚细胞定位。研究还发现，干扰素刺激可以诱导i f p 3 5 在 包括单核/ 巨噬细胞，上皮细胞和成纤维细胞等多种细胞内的表达。 f p3 5 图1 .2 if p 3 5 的 结 构 3 4 1 f i g 1 . 2 s t r u c t u r e o f i f p 3 5 13 4 1 目前关于i f p 3 5 功能的研究还不是很深入， 文献报道i f p 3 5 与b - a t f , n mi 以 及c k i p 蛋白具有相互作用。 1 . 1 . 3 . 1 i f p 3 5 与 b - a t f 是a p - 1 转录因子家族的一种蛋白， 属于具有亮氨酸拉链基序( b z i p ) 的转录调控超家族的一员， 这类超家族具有亮氨酸拉链结构域，能够介导蛋白 之间的相互作用，具有结合d n a的能力。 b - a t f 不能够形成自 身同源二聚体， 但可以与j u n 的b z i p以类似f o s :j u n 异源二聚体的形式形成异源二聚体结合 d n a 。 但是由于b - a t f 缺乏转录激活域， 所以b - a t f : j u n 的作用并非转录激活 而 是 与f o s :j u n 异 源二 聚 体 竞 争 结 合d n a 从 而 达到 抑 制a p - 1 通 路的 作 用。 w a n g x等研究发现，在干扰素刺激后，b - a t f 能与i f p 3 5 结合形成异源二聚体并定 位于细胞核内， 暗示i f p 3 5 可能通过与b - a t f 形成异源二聚体的形式影响b - a t f 与j u n 异源二聚体的形成从而影响a p - 1 通路相关的转录调控3 5 1 1 . 1 . 3 . 2 i f p 3 5 与 n m i m y c 家 族成员因 其在细胞的 增 殖、 分 化 和 肿瘤细胞的 转化 过程中 起着重 要 的 作 用而引 起人们广泛的 兴 趣。 1 9 %年b a o等人 用酵母 双杂交系统 研究与m y c 相 互 作 用的 蛋白 时 发 现了 一 个 新 基因， 命 名 为n m i ， 即m y c / s t a t 相 互 作 用 蛋白 质 m i . n m i 定 位 于 人的 染 色 体2 2 g 1 3 . 3 ， 其 编 码 的 蛋白 质 可 与m y c 家 族 中 的 n - m y c , c - m y c , m a x 和f o s 相 互 作用， 在 酵 母 细胞中 还 能 结 合 别的 转 录 因 子， 第一章 前言 表明n m i 在转录调节方面有较普遍的作用。 n m i 没有内在的转录激活区， 通过 募 集 共 激活蛋白c b p / p 3 0 0 增强m y c / s ta t 的 转 录 活 性13 7 . 3 9 1 n m i 也是一种干扰素诱导产生的蛋白， 它与i f p 3 5 结构上同 样具有很高的相 似性。两者之间具有相互作用，这种相互作用是通过n i d结构域介导的。利用 免疫荧光，研究发现n m i 与i f p 3 5 在哺乳动物细胞内 共定位于细胞质，两者通 过相互作用形成一个大复合物3 0 0 - 4 0 0 k d a ，该复合物的形成能够阻止i f p 3 5 通过蛋白酶体介导的途径降解，即n m i 与i f p 3 5的相互作用阻止了i f p 3 5 的降 解， 从 而 扩大了i f n的 生 物 学 效果 13 9 . 4 0 1 ， 而 这 一 复 合 物的 形 成受i f p 3 5 磷 酸 化 的 影 响， 需 要i f p 3 5 的 去 磷 酸 化14 11 。 研 究 发 现， 在 干 扰素 诱导 的 细 胞凋 亡中 ， n m i 与i f p 3 5 形 成的 复 合 物能 够重 新 解 离 ， 这 一 过 程 与c a s p a s e 无 关， 但 是 是 细 胞 凋 亡 过 程中 独 特的 事 件 之 一 14 2 1 1 . 1 .3 .3 i f p 3 5 与c k i p - 1 酪蛋白 激酶2 相互 作用蛋白1 ( c a s e i n k i n a s e - in t e r a c t i o n p r o t e i n 1 . c k i p - 1 ) 是 近年来发现的一种重要分子，它具有调节细胞分化，细胞凋亡，细胞骨架以及 把c k 2 和a t m激酶富 集到细胞质膜等多 种功能。 全长的c k i p - 1 c d n a编码4 0 9个氨基酸， 分子量约为4 6 k d a 。 其蛋白 质 分 子的n端包 含一 个p h结 构 域( p le c k s t r in h o m o lo g y d o m a i n ) ， 它 与c k ip - 1 的 质 膜定 位 密 切 相关， 还 参 与c k i p - 1 与 其 他 蛋白 质的 相互 作 用 ( 如 与c k 2的 相 互 作 用 ) . 在其 分 子的c端 具 有 一 个 亮氨 酸 拉 链 基 序 少u c in e z ip p e r m o t i f) ， 它 可 介 导c k i p - 1 与 其 他蛋白 质的 相 互 作用 ( 如 与c - j u n / a p - 1 的 相互 作 用 ) 。 另 外c k i p - 1 还具有5 个p x x p基序( m o t i f ) ， 其中有2 个恰好与周期蛋白 依赖性激酶( c d k ) 和有丝分裂活化激酶的靶序列相一致， 暗示c k i p - 1可能与二者存在相互作用或 本身就是它们的底物。 研究发现c k i p - 1 能够通过n i d结构域与n m i 以及i f p 3 5 相互作用。 n m i 稳定i f p 3 5 ，而c k i p - 1 则通过抑制n m i 和i f p 3 5 的相互作用降低i f p 3 5 的稳定 性。与n m i 类似而与i f p 3 5 相反， c k i p - 1 能够抑制肿瘤细胞的生长以 及a k t 介 导 的 细 胞 存 活 4 3 . 4 4 第一章 前言 1 . 1 . 3 .4 i f p 3 5 与 b t a s 泡 沫病毒 ( f o a m y v i r u s , f v ) 属于 反 转录病 毒科泡沫病毒亚 科泡 沫病毒 属。 其基因组结构顺序与典型反转录病毒基本相同， 两端为长末端重复 序列 ( l o n g t e r m in a l r e p e a t s , l t r ) 所封闭。 l t r由 依次 排列的u 3 , r , u 5构成。 5 l t r之 后为结 构 基因 g a g , p a l , e n v ， 分别 编 码 g a g 蛋白 、 功能酶 和包膜糖 蛋白 。 此外， 在e n v 基因3 端与3 l t a之间存在2 - 3个开放阅 读框， 其产物为调节蛋白。 其中 第一个开 放阅 读框编码病毒的反式激活因 子 t a s 蛋白 ( t r a n s a c t i v a t o r o f s p u m a v i r u s , t a s ) 。 在牛泡沫 病毒( b o v i n e f o a m y v i r u s , b f v ) ， 该 蛋白 称为 b t a s . 亩 黔铆阮 峨 。 一_ . p_卜 .1 t 匕 9 o . n 。 ” 、 . 1 as u认q u .1 p o l 蛋 白由拼接产生的独立转录本表达:不编码转录后调控蛋白，而是通过某种特殊 的控制特定转录本出核的机制，完成转录后调控。 本实验室前期研究发现， b t a s 作为牛泡沫病毒b f v 的反式激活因子， 可在 体 外 直 接结 合 l t r 中 的 t a s 应 答 元 件 i i ( t a s - r e s p o n s i v e e l e m e n t i i , t r e i i ) 及 i p 中 的 第一章 前言 t as 应答元件i p ( t r e i p ) ， 不依赖细胞因 子的 介导。 t r e i i 与t r e i p 之间在结合 t as 的过程中存在着明显的竞争，表明b t as可能借助相似的机制结合两类不同的启 动子。另外前期研究还发现b t as 还能够通过激活n f - x b 信号通路行使自己的功 能。 为了进一步研究b t as的功能， 本实验室前期工作利用b t as作为诱饵蛋白， 利用酵母双杂交技术从人b细胞文库中获得了i f p 3 5 ， 并且在真核水平上验证了 二者的相互作用，暗示i f p 3 5 在细胞抗病毒过程中可能扮演者重要的角色。 第二节 酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是一种基于酵母的遗传学分析， 利用反式作用因子与d n a 顺式元件结合启动下游报告基因表达的一种实验系统。该系统由 报告基因，报 告基因 转录调控区 和反式作用因 子组成。目 前最常用的反式作用因 子是g a 1 4 蛋 白 ， 有8 8 1 个氨基酸，1 - 1 4 7 位氨基 酸 是其d n a特异性结合结 构 域( d n a - b d ) , 7 7 1 - 8 8 1 位氨 基 酸为 其 转 录 激 活结 构 域 ( d n a - a d ) ， 两 个结 构 域 只要 得以 靠 近， 并不需要共价结合， 其转录激活功能就能恢复。 本文利用的m a t c h m a k e r g a l a t w o - h y b r i d s y s t e m 3 中 ， b d 和a d 被 分 别 构 建 至 不同 的 质 粒中 ( 图1 .4 ) , 研究 者可以 将待研究的 两个基因 伍和均分别与b d , a d融合表 达， 通常 将与 b d 相 连的 称 为 诱饵 蛋白 ( b a i t p r o t e in ) ， 与a d 相 连的 称为 诱 捕蛋白 ( p r e y p r o t e i n ) . 如果这两个基因表达的蛋白 质间具有相互作用结合在一起， 就会使b d与a d两 结构域靠近，以非共价形式结合， 形成一个完整的转录因子，与d n a上游活化 序列结合，启动报告基因 ( a d e 2 , i i i s 3 , m e l i 或l a c z )的表达。 我们也就能通 过 报告 基 因 的 表 达情 况来 判 断 蛋白 质间 是否 具 有 相 互 作 用 4 6 ,4 7 1( 图1 .5 ) 第一章 前言 月 fi n d川 l 材 】 幼川 i ii刃 月门 f l n e o n0 i p a d w 叹晰 a v d n a - r d 已 1 41 月 ! mcs 酬滚 p g b k t 7 . 7 3比 畔 幻 盯月 h i n d i i i 0 成 均 mc s2 po n k s w . h a e p it o p e t a g c - m y c e p it o p e t a g 图1 .4 酵 母 双 杂 交 载 体 14 6 .4 7 1 f i g 1 . 4 t h e v e c t o r s o f y e a s t - t w o h y b r i d 14 6 ,4 7 1 洲 1 的 g m 目 目. . 5酵母双杂交 原理图” 6 ,4 7 1 f i g 1 . 5 t h e p r in c i p le m a p o f y e a s t - t w o h y b r id 14 6 , 4 7 1 第一章 前言 与以 往研究蛋白 质间 相互作用的 方法相比， 酵母双杂交系统具有独 特的 优 势: 1 , 酵母菌易于转化， 结果易于筛选， 而且内 源性酵母蛋白 极少与哺乳动 物蛋 白 结合， 避免 实验蛋白的 干扰: 2 、 真核酵 母细胞有 利于蛋白 质保持天然的折叠 状态，与体内 生理状态类似， 使融合蛋白 质之间的 相互作用更接近体内 真实水 平: 3 、酵 母双杂交系 统的 敏感性极高， 能检测到蛋白 质之间 结合常数低于 l m m o l / l 左右的微弱作用; 4 、 只需要对基因 进行操作， 构建质粒而不必纯 化蛋 白或准备抗体就能检测蛋白质间的相互作用。 酵母 双杂交系统的 用途主要有: 1 , 验证已 知蛋白之间的 相互 作用。 2 、 发 现 编码蛋白与蛋白相互作用特定区域的功能片段。可以对具有相互作用蛋白的基 因进行 截断， 再与b d 或a d融合表达， 进 一步确认相互作用的位置。3 、 最重 要的一 个用途是用于 筛选c d n a文库中 编码与己 知蛋白 相互作用蛋白 的基因 (4 0 ,4 11 由 于酵母 双杂交 本身原 理的限 制， 融合蛋白 必须要 进入核内 才能 活化转录。 在胞浆内 相互 作用蛋白、胞 外受体与 配体 的相互作 用以 及需要 核外翻译后修饰 的蛋白 间相互 作用就不一定能 在酵母 双杂 交系统中检测到。 此外，细 胞中 存在 的某些 无关蛋白 会与b d融合蛋白结合， 激 活报告基因， 导致假阳性。 再者， 融 合蛋白 的稳定 性，构象是否正 确， 融合蛋白 是否影响蛋白的相 互作用位点等情 况都可能影响 检测结果。 所以， 酵母双杂 交的结果并不 完全等同 于体内 细胞的 真实情况。在 酵母双杂交系统中能 相互作 用的蛋白在生理条 件下不一定 能真正 作用， 某些 相互作用的结构 域在实际 情况下可能无 法接 近，因 而需要结合其它 蛋白 质相互作 用的实 验方法 进一步确认。同 样，酵母双杂 交系 统没有检测到的 蛋白 的 相互作 用也不一定不 存在。 第三节 本研究的目 的和意义 1 . 3 . 1本研究的目的 干扰素是动 物细胞在受到某些 病毒感 染后分泌的具有多种功能的 宿主特异 性蛋白 质，具 有广谱的抗病毒、 影响细胞 生长和分化、调节免疫 功能 等多种生 物活性。这些 广谱的生物活性主要 是通过 诱导一些蛋白 的 表达来 进一步 行使功 第一章 前言 能的。 i f p 3 5 作为一种重要的千扰素诱导蛋白 ， 其本身在整个细胞功能活性中 所 扮演的角色仍不清晰。本研究在前期工作的基础上，希望利用酵母双杂交技术 获取细胞内与i f p 3 5 具有相互作用的蛋白 质， 对i f p 3 5 在细胞内的功能进行深一 步的探索，同时也希望能够对i f p 3 5 抗病毒感染的功能及其机制进行初探。 1 . 3 . 2本研究的意义 宿主细胞在受到外界刺激时会产生相应的反应，干扰素是其中一类具有重 要作用的物质。但是干扰素所引起的一系列细胞活性所涉及的蛋白 及信号通路 研究的并不透彻。深入研究干扰素诱导蛋白 及其相应的功能，对于认识人类本 身， 疾病治疗等等都具有重要的 现实意义。 i f p 3 5 作为一种重要的干扰素诱导蛋 白，寻找与其具有相互作用的蛋白 质并由 此对其功能进行探索其必要性显而易 见，因此，本工作的完成至少具有以下意义: 获取与i f p 3 5 具有相互作用的 细胞蛋白， 为进一步研究i f p 3 5 的功能奠 定基础; 对于这些蛋白的认识将会深化我们对于i f p 3 5 行使抗病毒功能的认知; 干扰素作为抗病毒过程中的 重要组成部分之一， 其诱导蛋白 的深入研 究， 将有可能为人类设计药物靶点， 治 疗某些疾病提供坚实的理论基础。 : 21 第二章 材料与方法 第二章 材料与方法 第一节 实验材料 2 . 1 . 1细胞 表2 . 1用于质粒转染的细胞 t a b l e 2 . 1 c e l l s u s e d f o r b f v 3 0 2 6 i n f e c t i o n a n d t r a n s f e c t i o n ce l l 表达s v 4 0 大t 抗原的、 腺病毒转化的 人胚胎肾 细胞系( 2 9 3 t ) 人子宫颈癌细胞系 ( h e l a ) 2 . 1 .2菌株 e . c o l i d h 5 a ， 一种用于铺制平板及培养质粒和粘粒的重组缺陷的 抑制型菌 株， 其基 因 型。 8 0 1 a c z a m 1 5 基因 产 物 可 与p u c 载 体 编 码的13 - 半 乳 糖昔 酶 氨基 端实现a 互补. 对转化的d n a既无修饰作用也无限制作用， 它能支持带有墟拍 突变的载体生长。其基因型为: s u p e 4 4 d i a c u 1 6 9 ( 0 8 0 1 a c z a m1 5 ) h s d r l 7 r e c a l e n d a l g y r a 9 6 t h i - 1 r e i a i 该菌株为本实验室 ( 分子病毒学实验室) 保存. a h 1 0 9 ， 第3 代 m a t c h m a k e r g a 1 4 双杂交系统中的酵母受体菌， 是p j 6 9 - 2 a 菌种的一种衍生菌，它可以在不同的g a l a上游激活序列 ( u a s )和t a t a盒 的 调控下使三个不同的报告基因 ( a d e 2 , h i s s , m e l t 或l a c z ) 得以 表达， 从 而减少利用酵母双杂过程中假阳性的产生。其基因型为: m a t a , t r p l - 9 0 1 , l e u 2 - 3 , 1 1 2 , u r a 3 - 5 2 , h i s 3 - 2 0 0 , g a 1 4 4, g a 1 8 0 4, l y s 2 五 介l 1 . g a l l u a s - g a l i t at a - hi s 3 , g a l lu a s- g a l 2t at a-