（微生物学专业论文）青霉q7植酸酶phya基因的克隆及其结构分析.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 掰 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或 机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅：本人授权山东大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) ：斛名：域日 期： 山东大学硕士学位论文 摘要 植酸及其盐类是谷物、豆类和油料等作物中磷和肌醇的主要存贮形式，同时 对保持肌体磷的平衡起着重要的作用。单胃动物体内由于缺少能够分解植酸及其 盐类的植酸酶，降低了对饲料中磷的利用率。植酸酶是催化植酸及其盐类的一类 酶的总称，它能够提高单胃动物对饲料中磷的利用率，从而解决由于磷资源的浪 费所引起的问题。 本文采用形态观察和真菌1 8 s r d n a 同源性比较的方法对从土壤中分离到的 青霉q 一7 进行了菌种鉴定，结果表明，青霉q 一7 属于褶皱青霉组的缓生青霉 p e n i c i l l i u m t a r d u mt h o r n 。 把青霉q 一7 总d n a 用s a u 3 ai 部分酶切，回收2 。5 k b 大小的d n a 片断。 回收样品与用b a m hi 酶切过的p u c l 9 质粒相连，构建基因文库，采用p c r 方法 筛选目的基因。将所得目的基因克隆至载体p m d l 8 - t 上，构建了重组质粒 p m d l 8 一y p h y a 。对p m d l 8 一y p h y a 上插入的植酸酶基因外源片段进行了测序和序 列分析。测序结果表明：青霉q 一7 植酸酶结构基因由1 5 2 1 个核苷酸残基组成， 编码4 7 2 个氨基酸，与报道的大小基本相同。将该序列提交n c b ig e n b a n k ，获 得a c c e s s i o nn u m b e r 为a y 6 4 0 2 3 5 。对植酸酶进行的同源模建表明青霉q 一7 植 酸酶属于组氨酸酸性磷酸酶家族。 把植酸酶基因连接到毕赤酵母穿梭载体p p i c 9 上构建了重组质粒 p p i c 9 p h y a 。将其电击转化毕赤酵母s m d l l 6 8 得到重组转化子，p c r 扩增证实了 植酸酶基因已整合到酵母基因组中。 关键词：缓生青霉植酸酶植酸酶基因毕赤酵母穿梭载体 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t p h y t i ca c i da n dp h y t a t e sa r et h ep r i n c i p l es t o r a g ef o r m so ， p h o s p h o r u sa n dm y o i n o s i t o li nc e r e a lg r a i n s ，s o y b e a n sa n do i l s e e d s ， w h i c hp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nk e e p i n gt h eb a l a n c eo fp h y s i c a l p h o s p h o r u s d u et ol a c ko fp h y t a s e ，m o n o g a s t r i ea n i m a l sa r ei n c a p a b l e o fh y d r o l y z ep h y t i ca c i da n dp h y t a t e s ，r e s u l t l e gi nt h ed e c r e a s e du s a g e o fp h o s p h o r u si nf e e d s p h y t a s e sa r eas p e c i a lc l a s so fp h o s p h a t a s e s t h a tc a t a l y z et h e s e q u e n t i a lh y d r o l y s i so fp h y t a t e ss oa st oe n h a n c i n gt h eu t i l i z a t i o no f p h o s p h o r u si nf e e d sa n di m p r o v i n gt h ep r o b l e m sc a u s e db yt h ew a s t eo f p h o s p h o r u sr e s o u r c e i nt h i ss t u d y ，m o r p h o l o g i co b s e r v a t i o na n dh o m o l o g o u sc o m p a r is o n o f1 8 s r d n ao ff i l a m e n t u sf u n g iw e r ee m p l o y e dt oi n d e n t i f yt h ei s o l a t i o n a c q u i r e d f r o ms o i l ，t h er e s u l t ss h o w st h a tt h et a r g e t e ds t a i nw a s p e n i c i l l i u m t 盯d u mt h o m w en a m ei tp e n i c i l l i u mq 一7 g e n o m i cd n ao fp e n i c i l l i u mq - 7w a si s o l a t e da n dp a r i t i a l l yd i g e s t e d b ys a u 3 ai t oc o n s t r u c tg e n o m i cl i b r a r y ，t h ed e s i r e d2 - 5 k bf r a g m e n t s w e r er e c l a i m e da n d1 i n k e dw i t hp u c l 9v e c t o rc u t t e db yb 孤鼬i ，p c r t e c h n o l o g y w a su s e dt os c r e e nt h e g e n o m i cl i b r a r y t h et a r g e t t e d f r a g m e n tw a ss u b c l o n e di n t op m d l 8 一tv e c t o ra n dr e c o m b i n a n tp l a s m i d d m d l 8 - t p h y aw a ss u c c e s s f u l l yc o a s t r u c t e d t h eh e t e r o l o g o u sp h y hw a s s e q u e n c e da n da n a l y z e d ，t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tp h y ac o n s i s t so f1 5 2 1 n u c l e o s i d e sa n de n c o d e s4 7 2a m i n oa c i dr e s i d u e s ，w h i c hi sa p p r o x i m a t e l y t h es a n l ew i t hp h y ar e p o r t e d s u b m i t t e dt h es e q u e n c et og e n b a n ka n da n a c c e s s i o nn u m b e ra y 6 4 0 2 3 5w a so b t a i n e d h o m o l o g ym o d e l1i n g s h o w st h a t t h i sp h y t a s e b e l o n g st ot h ef a m i l yo fh i s t i d i n ea c i d i t y p h o s p h a t a s e t h ep h y ag e n ew a ss u b c l o n e d t op j c h i a p a s t o r i ss h u t t l ep l a s m i dp p i c 9 r e c o m b i n a n tp l a s m i dp p i c 9 一p h y aw a sc o f l s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t o 2 些查查兰堡主兰垡丝兰 p i c h i ap a s t o r i ss m d l1 6 8b ye l e c t r o p o r a t i o n r e c o m b i n a n t sw e r eo b t a i n e d a n d i d e n t i f i e db yp c r s h o w i n gt h a tp h y dh a s b e e ni n s e r t e di nt h 伊 c h r o m o s o m eo fp i c h i ap a s t o r i k e yw o r d ：p e n i c i l l i u m t a r d u mt h o r n ，p h y t a s e ，p h y dg e n e ，s h u t t l ev e c t e r o fp i c h i ap a s t o r i s 3 山东大学硕士学位论文 第一章前言 ， 植酸( i p 6 ) 是谷物、豆类和油料等作物中磷和肌酵的主要存贮形式【1 1 ，同 时对保持肌体磷的平衡起着重要的作用。以植酸磷形式存在的磷因单胃动物体内 缺乏能分解植酸磷的酶而难以被利用，从而造成许多问题：1 造成磷资源的浪费， 一方面饲料中的磷得不到有效利用，另一方面则需加入大量无机磷以满足动物对 磷的需求，提高了生产成本1 2 l ；2 扃磷粪便对环境的污染，饲料中8 5 的植酸磷 被动物直接排出体外，使周围的土壤和水受到严重污染。此外植酸还是抗营养因 子，它在动物肠道内与二价金属离子如z n ”f e ”c a 2 c u “等以及蛋白质螫合 成相应的不溶复合物，使得单胃动物不能有效利用营养物质，从而降低了禽畜的 生产效益【3 1 。 植酸酶是催化植酸及其盐类的一类酶的总称，它对提高单胃动物对饲料中磷 的利用率，减少磷对环境的污染有着重要的意义。植酸酶作为一种单胃动物的饲 料添加剂，其饲喂效果已在世界范围内得到了确证。 1 植酸及植酸盐的分布、结构、理化性质和作用 1 1 植酸及植酸盐的分布 植酸又称肌醇六磷酸，作为几乎所有种子中磷酸盐和肌醇的主要存在形式， 广泛存在于植物组织和相应的粮食产品中。在小麦稻谷和大麦等种子中，植酸 集中存在于谷粒的糊粉层与外壳，玉米则集中存在于胚芽，豆类籽实中的植酸分 布于整个种子的蛋白质络合物中。在谷物加工副产品和油产饼粕中植酸的含量相 对较高，而谷物和豆类籽实中含量则相对较低。表1 - 1 是饲料中的植酸磷含量分 布【4 1 8 表卜l 饲料中的植酸磷含量分布 总磷 植酸磷植酸磷占总磷的， 来源 ( g ，k g 干物质) ( g k g 干物质) 百分数( ) 1 2 植酸的结构 植酸的分子式为c 乩 o p o ( 0 h ) ： 。，分子量为6 6 0 8 ，化学名称是环己六醇一1 2 3 4 、5 6 - 六磷酸二氢酯，六个磷酸基团具有强大的络合能力，多与二价 的阳离子结合在一起，形成化学性质稳定的络合物，其作用与e d t a 类似，但比 其适应范围更加广泛【5 1 。植酸是维生素b 族的种肌醇六磷酸酯，其确切的结构 式已经被确定为船式，其结构示意图如图i - i 所示 o i h o h i o = p 一0 hh 0 一p = o ii a h 0 = b h o 一 ：0 i o h f i g 卜1s t r u c t u r eo fp a ( a 、b ca r et h ec a t a l y t i cs i t e so f6 - p h y t a s e 、3 - p h y t a s e a n dt h en o v e la l k a l e s c e n tp h y t a s e ) 9 山东大学硕士学位论文 图1 中的a ，b 、c 分别是肌醇六磷酸6 一磷酸水解酶、肌醇六磷酸3 一磷酸 水解酶和非特异性的正磷酸盐单酯磷酸水解酶的作用位点1 6 i ， 1 3 植酸的理化性质 植酸是一种淡黄色或淡褐色的粘稠液体，呈强酸性，易溶于水、9 5 7 , 醇和 丙酮，几乎不溶于苯、氯仿和醚。其本身毒性很小，具有很强的螯合能力，与e d t a 接近，可以与金属阳离子如m g ”、c a s * 、m n 、f e 、z n ”整合形成稳定的不溶性复 合物。植酸在植物体中一般以各种盐的形式存在用。下图是植酸在不同条件下形 成的络合物的分子结构图： 植酸 o 一口刍 f ：b 宁h c 太? h o = f oo 一甲= 。 ho o 一占= o ( b ) 植酸一期离子 6 h 一0 _ + ( c ) 植酸一蛋白质 ( d ) 植酸一阳离子一蛋白质 图l - 2 植酸以及不同的植酸络合物 9 一z n p 一0 m 1 o i c = 0 c h 3 l p r o t e i n 1 4 植酸的作用 1 4 1 植酸的负面作用 第一、单胃动物常用植物性饲料，其中三分之二的总磷与肌醇结合成植酸， 进而形成稳定的植酸盐复合物，阻碍了其对磷的吸收利用1 8 i 。由此会引起单胃动 物生长缓慢或停滞，出现骨病，禽类产蛋率低，体重下降等问题。目前解决这 1 0 山东大学硕士学位论文 问题的方法是在饲料中添加无机磷，然而尽管添加的无机磷满足了畜禽对磷的需 求，但植酸磷仍滞留在粪便中未被消化吸收而以植酸盐的形式排出体外。磷被吸f 附于土壤表面，会与土壤中的钙铝铜等元素形成不溶性复合物而保留在土壤 中，一方面会引起土壤板结而影响种植业的发展，另一方面积聚在土壤中的磷最 终因积聚过多而随地表径流的冲刷溢出到江河湖海，与氮一起造成水体的富营养 化，导致水体缺氧，鱼类等水生动物窒息死亡，水体腐败变质，进而影响到人类 赖以生存的生态环境。 第二、降低矿物元素的利用率【9 1 植酸的强络合能力使之与锌、锰、钙、铜、 镁、铁等阳离子形成难溶性的络合物，从而降低了动物对这些矿物质元素的利用 率。在消化道p h 条件下，几种矿物元素与植酸的络合能力依次为锌、铜、镍、 钴、锰、钙。植酸与锌结合成十分稳定的植酸锌盐，从而降低其生物学利用率。 植酸与钙也可以形成难溶性的植酸钙，从而导致钙的利用率下降，而钙是动物日 粮中必需的常量矿物元素，其利用率下降会导致畜禽出现钙缺乏症，所以植酸对 钙的抗营养作用一直是畜禽营养研究的重要内容 第三、对蛋白质消化利用的影响【l o l 。一般而言，在酸性条件下蛋白质带有 正电荷，植酸分子上带有负电荷的基团可以与蛋白质发生反应，生成植酸蛋白质 二元复合物或以金属阳离子为桥生成植酸一金属阳离子一蛋白质三元复合物。这 些复合物的形成不仅降低了蛋白质的生物效价，还影响了蛋白质的功能特性。此 外，植酸及其不完全水解产物还可以抑制蛋白酶( 如胃蛋白酶、胰蛋白酶) 的活 性，影响机体的正常代谢抑制的程度与肌醇一2 一磷酸盐和植酸盐的浓度有关， 并显示出抑制作用与磷酸基团的数目有关。研究表明，植酸盐及其肌醇磷酸酯对 多种不同来源的淀粉酶、磷酸酶有抑制作用，抑制的程度与肌醇磷酸酯脱磷酸基 团的程度、肌醇磷酸酯的浓度、p h 和酶源有关。m 9 2 + 可以提高磷酸酶的活性，但 过量的植酸盐可以降低这种作用。 最后，对淀粉、脂肪利用的影响【l l l 。因为植酸及不完全水解产物可以抑制淀 粉酶、脂肪酶的活性，所以饲料中的植酸会降低动物对淀粉、脂肪的消化率。如 猪脂肪酶与0 3 7 的植酸钠在p h 8 0 和6 5 时，温育0 5 小时后酶活性抑制率为 1 4 5 和1 2 。 以上这些研究表明植物中的植酸及其植酸盐对动物和人的消化吸收有不利 山东大学硕士学位论文 影响，不但对体内许多酶有抑制作用，而且对各种二价离子和蛋白质等营养成分 的吸收利用具有广泛的抑制作用，因而又被称为抗营养因子。 ， 1 4 2 植酸的正面作用 植酸在某些领域内又有积极的一面，据报道植酸及其盐类可作为一种发酵促 进剂而对某些微生物的代谢具有促进效应，可以缩短发酵时问，还可提高米曲酶 产糖化酶的能力。如植酸钠在黑曲霉柠檬酸发酵过程中有明显的促进作用n 2 1 。 植酸在食品工业中也有广泛的用途，植酸是纯天然的食品添加剂，可以用 作油脂抗氧化剂、稳定剂、螯合剂、护色剂、发酵辅助剂、调节剂及缓冲剂等。 同时，植酸在化工上已被广泛的应用，如医药、化妆品中。另外，动物和微生物 中的植酸酶在特定条件下( p h ，温度等) 将植酸分解为肌醇和无机磷酸。无机磷酸 是动物生长的必要元素，肌醇是微生物和人类细胞生长和内环境稳定的基本因子 之一。对治疗糖尿病、神经炎均有重要作用。在植物中，肌醇是尿酸和细胞壁多糖 或者戊糖残基的前体物质；i p 5 能调节鸟类、爬行动物和两栖动物红细胞中血红 蛋白与氧结合的亲和力。i p 3 与i p 4 联合作用可以有效调节细胞内的钙离子水平。 因此，对此丰富资源应该加以开发研究，使之得到更好的应用“。 2 产植酸酶的物种及植酸酶的分类 2 1 产植酸酶的物种 植酸酶广泛存在于自然界中，植物、微生物、动物和人均可产生植酸酶，其 中微生物所产植酸酶最为重要。在不同植物中植酸酶的活性差异很大，黑麦、小 麦、大麦和小麦麸中植酸酶活性较高，而燕麦、玉米、大豆饼和花生饼中植酸酶 活性很低。植物植酸酶有两种，一种是6 一植酸酶( e c - 3 1 3 2 6 ) ，另一种是3 一植酸 酶( e c 一3 1 3 8 ) 。微生物中的细菌( 大肠杆菌、枯草杆菌等) 、酵母菌和霉菌都可 产生植酸酶，特别是霉菌中的曲霉属( 如黑曲霉、无花果曲霉等) 一直被认为是微 生物植酸酶主要产生菌而被大量研究。大多数微生物产生的植酸酶主要是3 一植 酸酶( e c 一3 1 3 8 ) 。哺乳动物的小肠及脊椎动物红血球 1 4 1 5 1 中含有植酸酶，但含 量很少且活性很低，但牛等反刍动物的瘤胃中植酸酶活性较高，这可能是瘤胃微 生物产生植酸酶的缘故。 山东大学硕士学位论文 2 2 植酸酶的分类 现已知道的植酸酶包括碱性植酸酶和组氨酸酸性磷酸酶( h a p ) 。对不同崔 酸酶的氨基酸序列进行系统发生分析，结果明确的揭示了这两大类植酸酶与依照 生化和催化特性分类得到的植酸酶种类很相符。 h a p 家族的一个主要特征含有r h g x r x p 保守功能域。h a p 类可以进一步 划分为三个不同的类型( p h y a - p h y c ) ，其依据为氨基酸序列的同源性和生化特 性，比如最适p h 、植酸盐水解的位置特异性 组i ，p h y a ，包括由4 6 5 - 4 7 6 个氨基酸组成的酶以及一些种属的胞外h a p ， 这些种属有a s p n i g e r ( v a nh a r f i n g s v e l d te ta 1 1 9 9 3 ) a s p n i g e r ( a w a m o r 0 ( p i d d i n g t o ne ta 1 1 9 9 3 ) ，a s p 舡m g a t u s ( p a s a m o n t e se ta 1 1 9 9 7 o ) ，a s p t e r m s ( m i t c h e l le ta 1 1 9 9 7 ) ，e m e r i c e l l an i d u l a n s ( p a s a m o n t e se ta 1 1 9 9 7 a i , m y c e l i o p h t h o r a t h e r m o p h i l a ( m i t c h e l le ta 1 1 9 9 0 , t a l a r o m y c e st h e r m o p h i l u s ( p a s a m o n t e se t a 1 1 9 9 7 a ) 。这些植酸酶有两个最适p h 值p h ( 2 5 ，5 5 ) ，最适温度在5 5 - - 6 0 。c ( u l l a h 1 9 8 8 ；w y s s e ta 1 1 9 9 9 a ) 。 未糖基化的植酸酶分子量预计为4 8 - 5 0 k d a 。然而，通过s d sp a g e 检测，糖 基化的植酸酶表观分子量在6 2 1 2 8 k d a ，而采用分析型超速离心机测量则为 6 4 - 1 3 7 k d a ( w y s se ta 1 1 9 9 9 b ) ，这类酶对许多含磷复合物表现活性，包括植酸盐 和其他的磷酸酯( w y s se ta 1 1 9 9 9 ) 。由于它们偏好于在d 一3 位上水解植酸盐，产生 d m y o - i n o s i t o l 一( 1 ，2 ，4 ，5 ，6 ) 一p e n t a k i s p h o s p h a t e ，p h y a 封| 分为一种3 - 植酸酶( c o s g r o v e 1 9 8 0 ；g r e i n e re ta 1 1 9 9 7 ；w y s se ta 1 1 9 9 9 a ) 。 组i i ，p h y b ，包括一些胞外h a p s ，它们来源于a s p n i g e r0 e t h r l i c he ta 1 1 9 9 3 ) ， s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ( b , j w ae ta 1 1 9 8 4 ) 和s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e ( e l l i o t te ta 1 1 9 8 6 ) 。这类酶由4 5 3 4 7 9 个氨基酸组成，其分子量4 8 5 0 k d a ，糖基化 后的表观分子量通过s d s p a g e 检测为6 5 k d a ，通过分析型超速离心机测量大约 为2 7 0k d a ( k o s t r e w ae t a l 1 9 9 9 ) 。a s p n i g e r p h y b 的晶体结构明确显示该酶为四聚 体结构( k o s t r e w a e ta 1 1 9 9 9 ) 。这些植酸酶都有一个最适p h2 5 ，在p h5 o 或者更 高p h 下没有酶活。最适作用温度在5 5 6 0 。c 之间。p h y b 的底物特异性也较低 巾l l a ha n dc u m m i n s1 9 8 7 ；w y s se ta 1 1 9 9 9 a ) 。 组i i i ，p h y c ，包括源自ec o i i 的酸性植酸酶( d o s s aa n db o q u e t1 9 8 5 ；d o s s ae t 1 3 山东大学硕士学位论文 a 1 1 9 9 0 ) ，l y s o s o m a l ( p o h l m a n ne ta 1 1 9 8 8 ；g e i e re ta 1 1 9 9 1 ) 以及来自老鼠和人体 的p r o s t a t i ca c i dp h o s p h a t a s e s ( v a ne t t e ne ta 1 1 9 9 1 ) 这类植酸酶是由3 5 4 - 4 3 9 个 氨基酸组成的胞内蛋白质，分子量为4 2 - 4 5 k d a ，这些单亚基酶是非糖基化酶( w y s s e ta 1 1 9 9 9 b ) 。p h y c 的最适p h 为5 0 - 6 0 ，最适反应温度在4 0 6 0 c 之间。 表l - 3 是不同来源来源植酸酶特征常数的比较 1 7 】 一 表l - 3 不同来源植酸酶特征常数比较 3 植酸酶的功能 一、使饲料中有机磷得到有效的利用，降低饲料成本。植酸酶加入饲料中， 分解植物中的植酸释放无机磷，提高了植物有机磷的利用率n 踟。目前每公斤饲 料中，植酸酶的最适添加量为3 5 0 1 2 0 0 u 之间，另外有报道指出在猪饲料中， 植酸酶的添加量在3 5 0 5 0 0 u 即可，再高己无意义，并且发现采取湿喂只需2 5 0 u 即可。 二、减少环境磷污染采用植酸酶替代无机磷可以使畜禽粪便中的磷含 量减少2 5 6 5 ，减少数量的多少根据植酸酶添加量及替代无机磷量而异。 三、改善畜禽生长性能1 9 1 。大量实验表明，在肉鸡饲料中添加植酸酶可以 有明显的增重效应，并改善饲料利用率，减少料肉比；对蛋鸡可减少死亡率，增 1 4 山东大学硕士学位论文 加产蛋率，降低饲料成本，鸡也有增重效应；也可使猪的料肉比减少。 四、在磷含量较低的动物饲料中添加植酸酶后，不仅促进了植酸磷的生物种 用率，而且增加了钙、镁、锰、铜、锌、铁以及氮的生物利用率，并且促进了动 物矿质营养的平衡，特别是钙、磷平衡和铜、锌平衡 r 帕1 五、促进了动物对蛋白质、氨基酸和碳水化合物的消化吸收“。植酸酶分 解体内的植酸盐后，消除了植酸盐对体内许多种酶的抑制作用，使动物的消化能 力提高，从而使动物的吸收能力也得到了加强。 4 植酸酶基因的分子生物学特征 到目前为止。共有百余个植酸酶编码基因得到了分离克隆。几乎所有分离到的 植酸酶基因都申请了专利。最先分离出的植酸酶基因是a s p e r g i l u s 疗c u u m n r r l 3 1 3 5 的p h y a 基因“1 来源于a s p e r g i l l u s ，i c u u mn r r l 3 1 3 5 的p h y a 结构 基因全长1 5 0 6 b p ，其中+ 4 6 + 1 4 7 的1 0 2 b p 的核苷酸序列是一典型的真菌内含子 序列，其上有真菌内含子的特征保守序列：d o n o r 序列一g t a t g c 、l a r i a t 序列一 g c t g a c 及a c c e p t o r 序列一c a g 。它的基因编码4 6 7 个氨基酸，根据信号肽序列 的结构规则推断，n 端的1 9 个氨基酸为信号肽，信号肤的切割位点在+ 1 9 位的 g l y 之后。来源于a s p e r g i l l u sf i c u u mn r r l 3 1 3 5 的植酸酶是一种糖基化蛋白， 在p h y a 编码的氨基酸序列上，发现了1 0 个潜在的n 糖基化位点( a s n - x s e t t h r ，x 为任意氨基酸) 。从氨基酸推断出的理论分子量约为5 1 4 k d a ，糖基 化后的表观分子量在8 5 k d a 左右。氨基酸序列上存在组氨酸酸性磷酸酶的活性位 点保守序列( a c t i v es i t es e q u e n c e ) = c q v t f a q v l s 婴坠e ) 堕d s k g k ，它位于氨基 r o l l 酸序列的+ 5 2 + 7 4 ，可归为组氨酸酸性磷酸酶这一家族“。a s p e r g i l u s f i c u u m n r r l 3 1 3 5 的p h y a 基因中g + c 含量达到6 8 3 ，这是丝状真菌中高表达蛋白编码 r q o l 序列所具有的特征之一“。 来源于丝状真菌，尤其是曲霉的p h y a 基因无论在核苷酸来源、编码的氨基 酸序列等基因结构上，还是在基因产物的酶学特征上均有较高的相似性，例如它 们的编码基因长度相当，核苷酸同源性较高，编码的氨基酸个数都在4 6 0 4 8 0 之间，氨基酸序列上也有较高同源性，均具有活性位点保守序列r h g x r x p ( x 为 山东大学硕士学位论文 可变氨基酸) ，在氨基酸序列上有数量不等的潜在糖基化位点，翻译后的蛋白都 需进行糖基化修饰后才具有正常的生物学活性【2 。 ， p h y b 基因与p h y a 相比，虽然也属于组氨酸酸性磷酸酶家族，有活性位点保 守序列r h g x r x p ，但核苷酸序列及编码的氨基酸序列同源性较低，实际上它的最 适底物不是植酸盐，它仅是具有植酸酶活性的酸性磷酸酶“。 来源于细菌的植酸酶是另一类植酸酶，它的编码基因较短，编码蛋白的分子 量也较小，它的核苷酸序列及编码的氨基酸序列与p h y a 和p h y b 及已报道的磷酸 酶基因没有同源性，它也没有普遍存在于p h y a 和p h y b 编码蛋白上的活性位点保 守序列r i i g x r x p ，这说明它不属于组氨酸酸性磷酸酶家族。对这一类植酸酶的研 究仅在近年来才开始涉及，1 9 9 8 年k e r o v u o 等才首次从b a c i l l u ss u b t i l i s 中 分离出其完整的编码基因2 引。来源于b a c j - j 坩s u b t i l i s 的植酸酶基因p h y c 长1 1 5 2 ，编码3 8 3 个氨基酸，其中n 端的2 6 个氨基酸是信号肽序列。生物学活 性依赖钙离子的存在。 目前唯一报道的植物来源的植酸酶基因是m a u g e n s e t 等于1 9 9 8 年从萌发的玉 米种子中分离的，成熟酶由两个相同的亚基组成，亚基的结构基因( c d n a ) 全长 i1 6 7 b p ，编码3 8 7 个氨基酸，理论分子量为4 1 k d a 它与微生物来源的植酸酶没有 氨基酸序列同源性，但存在一个包含活性位点保守序列r h g x r x p 的3 3 个氨基酸的 同源区，与来源于a s p e r g i l l u sf i c u u mn r r l 3 1 3 5 的啪4 和脚脚相比，这一段氨 基酸序列的同源性分别达到4 8 和5 1 。丝状真菌来源的p h y a 基因编码的植酸酶， 其r h g x r x p 序列一般位于n 端，如a s p e r g i l u sf i c u u mn r r l 3 1 3 5 的p h y a 中它的位 置在+ 8 1 + 8 7 ，而玉米植酸酶中，r h g x r x p 序列位置较靠后，在+ 2 0 4 + 2 l o 的区 域上“ 5 植酸酶的高级结构 对植酸酶的高级结构研究较多的是来源于a s p e r g y l l u sf i c u u mn r r l 3 1 3 5 的 p h y a 编码的植酸酶p h y a ，k o s t r e w a 等 2 6 】利用x 衍射分析了它的晶体结构。p h y a 的高级结构中有5 对二硫键：c y s 8c y s l 7 、c y s4 8c y s3 9 1 、c y s1 9 2c y s4 4 2 ，c y s 2 4 1c y s2 9 5 、c y s4 1 3c y s4 2 1 。用盐酸胍变性处理后，植酸酶活性丧失，说明二 硫键在植酸酶的折叠上扮演着重要的作用。p h y a 的晶体结构可分为两部分：一个 1 6 山东大学硕士学位论文 大的a 9 结构域和一个较小的n 结构域，c i 1 3 结构域的中心是一个由6 片组 成的口折叠片。结构中共有1 4 个a 螺旋，对应的氨基酸序列的位置分别为：8 + 8 2 ；， + 8 8 + 9 5 ；+ 1 0 7 + 1 2 3 ：+ 1 4 1 + 1 5 9 ；1 9 3 + 1 9 7 ：2 0 0 + 2 1 0 ：2 1 3 + 2 2 3 ：2 3 1 + 2 4 6 ： 2 5 7 + 2 6 1 ：2 6 4 + 2 8 1 ；2 9 0 + 3 0 5 ：3 3 4 + 3 4 5 ；4 2 3 “2 9 ：4 3 9 + 4 4 3 。1 3 折叠片中的 6 个片相对应的氨基酸序列的位置分别为：4 8 + 8 2 ；1 3 4 + 1 3 8 ：1 7 3 + 1 7 7 ；3 3 2 + 3 3 7 ： 3 8 3 + 3 9 1 ；3 9 8 + 4 0 3 。在两个结构域的内表面有一很深的凹套，凹套中有酶催化 活性的必需氨基酸a 略5 8 和h i s 5 9 ，它们是植酸酶活性位点保守序列 r h g x r x p 中的前两个氨基酸，在以前的研究中利用化学修饰的方法就已证实 r h g x r x p 序列中的a r g s 8 直接涉及其酶活性，a r 9 5 8 在其晶体结构中的位置也与 它的作用相吻合p h y a 的晶体结构与鼠的低分子量酸性磷酸酶的晶体结构有很 高的结构相似性，说明它属于组氨酸酸性磷酸酶家族。 表1 4 已分离克隆到的植酸酶基因： 表l _ 4 已分离克隆到的植酸酶基因 来源 编码基因。篙鬻理繁他鼢p h 最适 r h c a 氨基酸序列 温度，r p 同源性， 6 真菌植酸酶基因的分子生物学研究 1 7 山东大学硕士学位论文 6 1 真菌植酸酶基因的分子生物学特征 经序列分析表明，真菌植酸酶基因存在一个开放阅读框( o r f ) ，长度刿 1 4 k b i 5 k b ，两个外显子被一个公认的真菌内含子隔开，其长度约为1 0 2 b p ， r q 1 各报道略有不同“但所有的内含子均含有相同的基元序列( 或称真菌的内含 子特征保守序列) ：供体序列( d o n o r ) 一t r n g c ，套索序列( l a r i a t ) - - r c t r a c ， 受体序列( a c c e p t o r ) - - y a g 。 转录起始密码子均为a t g ( m e t ) 。在不同菌株的植酸酶基因序列的上游，大 多数同时含有t a t a 框( t a t a b o x ) 和c a a t ( c a a t b o x ) 框，有的仅含有其中1 个或1 个也没有。这种富含a t 而缺乏g c 的保守序列结构，有利于d n a 双链的解开和r n a 聚合酶的挤入，有助于转录的正确起始。密码子中的g + c 含量较高，均高于5 0 9 6 ； 密码子第三位碱基的g + c 含量接近或超过7 0 。在密码子第三位碱基上高频使用g 和c 碱基是曲霉中高效表达蛋白编码序列所具有的特征之一“。不同菌株来源的 结构基因长度及核苷酸组成有所不同，但同种菌株的同源性可高达9 0 以上，而 不同种菌株的同源性仅为4 8 6 6 不等 6 2 真菌植酸酶基因o r f 编码的多肽，信号肽及其糖基化位点 真菌植酸酶基因的序列分析及提取的纯酶氨基酸序列分析表明，经剪接后的 ( 去除内含子) 的序列编码了含有信号肽的成熟肽。不同菌株来源的这种成熟肽， 其多肽长度及氨基酸组成有所不同。大多数真菌植酸酶基因编码的成熟肽为4 6 7 个氨基酸的多肽，也有4 6 3 、4 6 5 、4 6 6 和4 8 7 个氨基酸的报道4 “。有人认为还 可编码植酸酶的1 4 个氨基酸的内源性肽片段，u l l a h 等认为还可编码长度为1 4 r 帖1 和2 9 个氨基酸的内源性肽片段“ 现已证实，植酸酶的活性位点序列( a c t i v es i t e ss e q u e n c e ) 是：r h g x r x p ( x 为可变氨基酸) ，它是微生物来源的植酸酶活性位点中最保守的序列。根据 v o nh e i j i n g 的信号肽序列结构规则可以推断出真菌植酸酶基因编码的成熟肽的 分泌性信号肽的切割位点及长度。现有报道的植酸酶信号肽长度大多数为1 9 个氨基酸，也有1 8 、2 2 、2 3 、2 6 和2 8 个氨基酸的报道。由于植酸酶是一种糖基 化蛋白，因此翻译出的植酸酶蛋白还需糖基化等一系列的加工才能成为有功能的 成熟酶y a n g m i n gh a n 等通过对黑曲霉p h y a 基因在p i c h ap a s t o r f s 、 1 8 山东大学硕士学位论文 sc e r e v i s i a e 中的表达，证实了糖基化对表达的p h y a 的生物合成和热稳定性至 关重要”“在不同的植酸酶基因编码的氨基酸序列上，均发现潜在的n 一糖基化 位点( s n - x s e r t h r ，x 为任意氨基酸) ，但个数不同，有7 个、9 个和1 0 个的 r 口n 1 报道“。 7 植酸酶耐热性的研究进展 酶的失活因素很多，其中温度是造成酶失活的重要因素，如何提高酶的耐热 性问题一直都是一个亟待解决的课题。植酸酶在温度较高的情况下酶活损失很 大，是商品化生产植酸酶面临的最主要的问题。鉴于植酸酶对提高禽畜业生产效 益和降低植酸磷对环境的污染有着重要意义，许多的科研单位都对此作了大量的 工作，以期能解决植酸酶的耐热性问题。 目前，人们从不同的方面对植酸梅的耐热性进行了许多富有成效的研究，使 植酸酶已经可以用于商品化的生产。 7 1 传统方法提高植酸酶的耐热性 7 1 1 筛选产耐热植酸酶的菌株 从自然环境中筛选优良菌株是一种传统的途径。1 9 9 7 年p a s a m o n t e s 等从 a s p e t g i l u sf u m i g a t u s 中分离到一种常温植酸酶具有极好的热稳定性，在 1 0 0 下处理2 0 m i n ，酶活性丧失不到1 0 ，但由于它的最适p h 值为6 5 _ - 7 5 ， 不适合在单胃动物肠胃中的酸性环境起作用1 3 3 1 。从嗜温微生物m y c e l i o p h t h o r a t h e r m o p h i a ，a s p e r g i l l u s t e r r u s 等中分离到的高温植酸酶其最适温度在7 0 8 0 c ， 虽然具有很好的耐热性，但在3 7 ( 2 的酶活很低，不能作为商品用酶 2 1 。香港大学 的 l y ea j ，s mf k 等从且s u b t i l i s1 6 8 和b 1 i c h e n i o r m i s 中发现两种新型热稳定 性的植酸酶，即使在c a 2 + 浓度很低，p h 中性的条件下，9 5 ( 2 保温1 0 分钟后仍能 恢复8 0 的初始酶活刚。u n i v e r s i t yo fl i m e r i c k 的c a s e ya 和w a l s hg 从 a s p e r g i l l u sn i g e ra t c c9 1 4 2 分离得到的植酸酶在8 0 c 比两种商品化植酸酶有更 高的热稳定性，这种植酸酶酶活能被c a 2 + 所抑制【蛳。以上这些植酸酶尽管在p h 或者其他方面还不适合于商品化生产，但是已经具备了很高的热稳定性。利用分 子生物学方面或者传统的诱变技术对其改造，应该可以得到较好的商品化用酶。 7 1 2 添加保护剂以提高植酸酶的耐热性 多羟基化合物可以通过氢键与酶蛋白表面分子相联接，也可以通过氢键有 1 9 山东大学硕士学位论文 效的与外部水分子相连接，使酶蛋白分子稳定段学辉等比较了三种不同类型的 植酸酶制剂，发现添加海藻酸钠、无机盐和多羟基化合物颗粒化的植酸酶具有剪 高的热稳定性，在9 5 高温下处理2 0m i n ，酶活基本能保持在8 0 以上，比液 体酶和普通固体化处理的植酸酶制剂提高了5 0 1 3 6 l 。台湾学者将高粱糖浆废弃液 和淀粉的混合物添加到植酸酶溶液中，在8 0 处理1 0 m i n ，仍有6 7 的酶活，而 未加保护剂的酶在此温度下完全失活，这是一种非常经济的方法i 。此外人们 发现添加无机盐对植酸酶有保护作用。y a n gm u nc h o i 从b a e l l u ss pk h u - 1 0 菌株分离到的植酸酶在加入一定量的c a 2 + ，6 0 保温1 0 m i n ，相对酶活为9 8 ，而 未加c a 2 + 的相对酶活几乎为零【3 8 1 ，段学辉等在对甲醇酵母植酸酶热稳定性的研究 中发现加入1 0 m o l c a c l ：，能明显提高植酸酶的热稳定性，8 0 保温1 5 m i n ，其保 留酶活可达原液的7 7 8 3 7 1 荷兰的g i s t 公司发现m g s 0 ：和z n s 0 2 可以明显提 高植酸酶的耐热性l 矧而欧洲的b a s f 公司和n o v 0 公司发明了制备包被型的含 酶颗粒，经9 0 高温处理3 0 s ，酶活残留率达9 3 ，而未包被的酶仅有2 0 。 7 2 分子生物学方法对植酸酶进行分子改造 在自然环境中很难获得一种热稳定性强的工业化用酶，利用分子生物学方法 对现有的优良菌株进行基因工程方面的改造，是获得热稳定性突变株的便捷途 径。 7 2 1 植酸酶分子进行蛋白质修饰，特别是糖基化修饰 蛋白质在完成翻译后最主要的修饰是糖基化修饰。试验表明，糖基化修饰 对于植酸酶耐热性的提高是有作用的。h a r ty a n m i n g 等把a i g e rp h y a 基因在毕 赤酵母中表达，得到的新植酸酶比天然植酸酶分子量大，最适温度比原来提高了2 。经过去糖基化，该植酸酶的热稳定性降低了4 。这表明，糖基化程度对植 酸酶的热稳定性