（微生物学专业论文）大肠杆菌操纵子改造及其应用初步研究.pdf

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4 一羟基丁酸共聚物；聚( p - 羟 基丁酸酯) a b s t r a c t e x p r e s s i 。nr e g i l l a t i o n 。fm 锄“c p a t h w a y si s o n e0 ft h em 。s ti m p 删1 s s ：o ： m 五。l i ce n g i n e e 血g i np r o k a r y o t e s ，g e n e s a r ea 玎孤g e da s 叩e r o n g e n e sm v 0 1 v e d i nr e l a t e dp a t l l w a yo rb i 。l 。g i c a lf u n c t i o n a ip r o c e s s e s a r ec 0 r e g l l l a t e di n a n 。譬翼篓 a 眦s c 孟t i 。n a lu n i ta n da r ee x p r e s s e d 弱p o l y c i s t r o n i cm r n 八mc 锄0 1 饥，t h e 0 p c r o ni st h ec o m m 。nm e c h a n i s m s h o wb a c t e r i a lr e g u l a t eg e n ee x p r e s s i o nd e p e n m g ：e n v 袖e n t a lc o n d i t i 。n s a n di t sp r o m o t e r ，w h i c hi i 瓶眦s 饷m 嘶p t l o np ：e ? r e g u l a t c st h e 懈c 州o n 。f 。p e r o n s 。t h e n a t u r e 。f p r o m o t e r p l a y s 呻。? ：! ：! ： 二l a t i n gg e n ee x p r e s s i o n s 眦呲0 f0 p e r o n 觚d 龀觚椭f 咖n 巾k p r o m o t e r si no p e r o nw e r e s t u d i e d t oc o n 咖tap r o m o t e ra c t i v i t ye v a l u a t i o ns y s t e m t h e l o wc o p y p 咖讨衅- 竺 w a se m p l o y e dt 0c l o 血gap r o m o t e r 1 e s s 咖a n d l a c ze x p r e s s i n g 。p e r o n a n 置t h e r e i sap r 二o t e f - c l 。血gr e g i o nu p s t r e a m t h eg f pa n dl a c ze x p r e s s i n g o p e r o mb i ：0 n 竺 c e 孟p r o m 彻幽m i sr e 舀。i l ，t h c p r o m o t e ra c t i v i t y c 雒b ee 咄e db y ：e e x p r e s s 二l e v e l0 f 孕e e n 岫s c e n c e p r o t e i na r i a - g a l a c t o 蛆执e h “湖鼍芝 p 二m o t e ra c t i v i t y c a nb ee a s i l y e v a l u a t e db y m o 血0 血g 舢螂c e n c e 鼍e 。 二a l a c t o s i d a s ea c t 沁i t y t h i sp r o m c r a c t i v i t ye v a l 删i o ns y s t c mc 锄b e 1 1 s e da sa b ：c = l e c u l a rt o 。l 。fs 呻i n gp r o m o t e r s b ye m p l y i n g m i ss y s t e m ，所ep r o m 弩8 。冀 s p c 御。s ，n l p d ，k a t ea n d 恤c 。r er e g i o n 。f t r cp r o m o t e rw e r es m d i e d a c c o r 竺g ! ：；s s i 矗l c v e l 。fg r e e nn u 。r e s c e n c ep r o t e i na n d 伊g 妇懈1 慨e 芝仉? ，竺 a c t i v i 00 fj f i ca n dk a t ep r o 蝴a r e r e l a t i v e l yl o wc 伽叩a r e dt 0s p c r p 。s a 1 1 dn l p u p r o m o t e r s 哪t h e t i co p e r o nw a sa l s 。e m p l 。y e a t os t u d yt h ei m p a c t 。fm u l t i p l ep 舢o t e r sm 狮毒r o n 孤dp r o m o t e r1 。c a t e s b 咖e e ng e n e s f i v e c o p i e s 缸价p r o m 锨竺 赠二w e f e 吣s i s e d a n dc l o n e dt 0m ep r o m o t e r - c l 砷gr e 百o no f 恤p ? m 竺 ：淼o ns y s t e m t h ea c t i v 埘。fm u l t i p l e - t r cp r o m 。t e r i s2 4 7 - f o l ds t r o n g e rn l a n 也e a c t i v i 钟0 f 仃cp r o m 。t e r b 。t hs p ca n d 仃cp r o m o t e r w e r ec 1 。n e dt 0t h ep r o m 譬e r c l 砌毒r e 西。nn e x tt 。e a e ho t h e r m a c t i v i t y0 ft h es p c 舭p r o m 锨远舳n g e rm ? e i t h e rp r o m 。t e fa l o n e i ts u g g e s t st h ep o s s i b l ea p p l i c a t i o n o fm u l t i p l ep r o m o 螂m i n c r e a s i n gt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f g e n e si nm e t a b 。l i ce n g i n e e r i n g i ，埘 、) l ，i mu n r e l a t e dc a r b o ns o u r c e s ，c a t 2g e n ef r o mc l o s t r i d i u mk l u y v e r i ，g a b df r o m e s c h r i c h i ac o l i ，g b dg e n ef r o mr a l s t o n i ae u t r o p h aa n dy i h ug e n e g e n ef r o m e s c h r i c h i ac o l iw e r ee x p r e s s e d 勰s y n t h e t i co p e r o n t h es u c c i n a t e p r o d u c i n gs t r a i n e x p r e s s i n gt h es y n t h e t i co p e r o nw a su s e dt op r o d u c ep ( 3 h b - c o - 4 h b ) p ( 3 h b c o 一 4 h b ) w a sd e t e c t e d k e yw o r d s ： o p e r o nlp r o m o t e r ；m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ；p ( 3 h b - c o - 4 h b ) ；p h b i v 山东大学硕士学位论文 本论文的缩写词表 a b b r e v i a t i o n 3 - h b 3 羟基丁酸( 3 - h y d r o x y b u t y r a t e ) 4 - h b 4 羟基丁酸( 4 - h y d r o x y b u t y r a t e ) a g e 琼脂糖凝胶电泳( a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) a m p氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ) b p碱基对( b a s ep a i t ) c a t 24 羟基丁酸辅酶a 转移酶( 4 一h y d r o x y b u t y r a t ec o e n z y m ea t r a n s f e r a s e ) d a 道尔顿( d a l t o n ) d n t p sd a t p ，d c t p ，d g t p ，d 订p 四种碱基的等比例混合物 e d t a 乙二胺四乙酸( e t h y l e n d i a m i n et e t r a a c e t a t e ) g a b d n a d p + 一d e p e n d e n ts u c c i n a t es e m i a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e g b d n a d 依赖型4 - 羟基丁酸脱氢酶n a d d e p e n d e n t4 h y d r o x y b u t y r a t ed e h y d r o g e n a s e o c 摄氏度孕a dc e l s i u s h 小时( h o u r s ) i p t g 异丙基硫代p d 一半乳糖苷( i s o p r o p y l - p - d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ) k m 卡那霉素( k a n a m y c i n ) k b p千碱基对( k i l o b a s e p a i r s ) l 公升( l i t e r ) l b 细菌全营养培养基l u r i a b e r t a n i m m 米( m e t e r , m i l l i ，lx 10 3 ) m c s 多克隆位点( m u l t i p l ec l o n i n gs i t e ) m i n 分钟( m i n u t e ) m o l ( m )摩尔( 6 ，0 2 3x1 0 2 3 ) nn a n o ( 1x1 0 9 ) n v l j l 东大学硕七学位论文 p h a c a b p h a 操纵子 p ( 3 h b c o - 4 h b )聚3 - 羟基丁酸，4 - 羟基丁酸酯( p o l y ( 3 - h y d r o x y b u t y r a t e c o _ 4 h y d r o x y b u t y r a t e ) ) p h b 聚p 羟基丁酸 p a g e 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) p c r 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 转m i n 转速( r o t a t i o np e rm i n u t e ) r n a 核糖核酸( r i b o n u c l e i ca c i d ) s 秒( s e c o n d ) t 温度( t e m p e r a t u r e ) ， u v 紫外( u l t r a v i o l e t ) v 伏特( v a l i n e ，v o l o v 体积比( v o l u m ep e rt o t a lv o l u m e ) y i h un a d 依赖型4 - 羟基丁酸脱氢酶( n a d ( h ) 一d e p e n d e n t4 一 h y d r o x y b u t y r a t ed e h y d r o g e n a s e ) 建， j 山东大学硕士学位论文 皇皇i i i i i i i i i 宣葺i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 置i i i i i i i i i i i i i i i i 第一章绪论 1 1 代谢工程 1 1 1 代谢工程简介 代谢工程( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) 也称途径工程( p a t h w a ye n g i n e e r i n g ) ，是根据 己知细胞代谢网络知识对细胞代谢途径进行合理设计，并利用分子生物学手段， 如d n a 重组技术等对细胞代谢途径以及代谢途径调控进行改造以积累目的产 物的应用学科 1 ，2 】。代谢工程与传统的生物育种不同是代谢工程带有更强明确 的目的性来改造细胞内某些代谢途径或代谢调控机制，即有目的的对细胞代谢 网络进行整体上的改造【3 。例如，利用细胞中已有的代谢途径或改造细胞内已 有的代谢途径，通过表达异源基因编码的酶分子，将细胞内原有代谢物经过新 的代谢途径积累目的产物。通过在大肠杆菌内的表达来源于r a l s t o n i ae u t r o p h a 的p h b 代谢途径，重组的大肠杆菌以葡萄糖为底物，利用葡萄糖在大肠杆菌内 代谢生成的中间产物乙酰辅酶为直接前体，经过p h a c a b 操纵子表达的p h b 代 谢途径作用下积累p h b 。目前，重组大肠杆菌积累p h b 可以达到细胞干重的 9 0 以上 4 】。同时，根据对代谢网络的分析，还可以通过改变细胞内代谢物流 量分布来实现目的产物的大量积累。例如，在大肠杆菌内通过异源表达来自铜 绿假单胞菌( p a e r u g i n o s a ) p h a 聚合酶基因p h a c l 或p h a c 2 ，可以利用伊脂肪 酸氧化途径中的中间产物3 - 羟基脂酰基辅酶a ( 3 - h y d r o x y a c y lc o e n z y m ea ( a c y l c o a ) ) 为底物在大肠杆菌内积累p h a ，其中长链p h a 组分可占细胞干重的 3 5 】。而聚合物中长链p h a 组分的重要影响因素是其前体物的积累，3 一羟基 脂酰基辅酶a 是伊脂肪酸氧化途径的中间产物 6 】，会进一步发生转辅酶a 反应 以完成伊脂肪酸氧化途径。为在细胞内大量积累长链p h a 组分的直接前体物3 羟基脂酰基辅酶a ，通过添加伊脂肪酸氧化途径的抑制剂，抑制脂肪酸氧化途 径中最后一步的反应，可将大肠杆菌内长链单体组份提高到细胞干重的 6 0 7 】。 然而细胞的代谢是一个严谨控制，多分子互相影响错综复杂的网络 2 】。约 1 0 0 0 多个催化代谢反应的酶分子，及其他维持细胞正常生物学功能的分子共同 转运细胞系统。代谢工程中引入外源基因的表达要尽量减小对于宿主细胞的干 1 l | j 东大学硕+ 学位论文 i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 宣i i i i i i i i 宣i i i i i i i i i i i i i i i i 萱i i i 置i i i i i i 扰，以最小的拷贝数，最小的表达量来达到最佳的效果。代谢途径中，一个酶 的催化产物即为代谢途径中另一个酶的催化底物，中间产物的积累不仅造成了 底物的浪费，还有可能对细胞产生毒害作用。协调的代谢流量意味着一个酶的 产物完全被另一个酶代谢，实现代谢流量的平衡。因此，代谢工程中，实现代 谢流量的调控即要求代谢工程中代谢途径的精确调控 8 。 1 1 2 代谢工程发展一精确调控 在代谢工程发展的2 0 多年里，随着越来越多的微生物全基因组测序的完 成，以及对微生物代谢网络更全面系统的认识，代谢工程的改造范围已经发展到 涉及到跨越种属的多基因的联合协同表达及调控。通过对细胞代谢网络的认 识，代谢工程已经可以组合不同来源的多种酶分子来构建自然界不存在的新的 代谢途径，从而实现天然复杂产物在单个细胞内实现生物转化，同时可以省略 化学合成中间产物及其衍生物的合成及纯化工作【9 】。在利用微生物发酵生产蛋 白药物或蛋白多肽的过程中，只需要单独的过量表达单个基因以提高蛋白药物 的表达量。而代谢工程恰恰相反，在代谢工程中，代谢途径中前一个酶分子的 反应产物即后一个酶分子催化的底物，任何中间产物的积累都会给细胞造成负 担或者是毒性从而导致终产物产量的减少。同时，目的基因的过量表达反而会 消耗细胞中可用于生成目的代谢产物的代谢物和能量。因此，在代谢途径改造 过程中，编码催化代谢途径中关键酶的基因并不需要简单的大量表达，而是必须 将代谢途径中每个酶的表达量限制在一定范围内。实现多基因的联合协同表达。 例如：在利用大肠杆菌内生产p h b 的过程中，通过过量表达p h b 合成操纵子 p h a c a b 可以在大肠杆菌内积累高达8 0 以上的p h b 4 】，然而，过量的表达 p h b 合成操纵子p h a c a b 不仅战用了细胞大量的能量和合成m r n a 的资源，同 时还分流细胞中大量的乙酰辅酶a 和还原力，即在大量p h b 的同时，却抑制 了菌体的生长速率。虽然增大了p h b 占细胞干重的比例，却没有提高葡萄糖到 p i - i b 的转化率 1 0 】。相对于整个代谢途径的表达量，p h a b 编码的脱氢酶是p h b 代谢途径中的限速步骤，因此，相对础口c ，p h a a 基因增加p h a b 基因的表达量 将有助于在不影响细胞生长速率的前提下提高p u b 的积累量【1 0 1 。尽管目前已 有很多成熟的控制基因表达的系统，例如l a c 启动子系统等，但是能达到代谢工 2 山东大学硕士学位论文 程要求的多基因、多水平的精确调控的系统还很少。为了实现代谢途径水平和 细胞生物质的积累之间的精确平衡，代谢工程的持续发展要求具有更精细的代 谢工程生物元件来实现代谢途径的协调表达【l l 】。目前快速发展的合成生物学 为代谢工程中这些问题的解决提供了新的思路和工具。 1 2 合成生物学 合成生物学( s y n t h e t i cb i o l o g y ) 是近几年来新兴的一门学科，其定义是随着发 展的时间不断演变和改进的 1 2 。合成生物学的两大主要内容是：1 人工设计 和构建自然界本身不存在的标准的生物学元件或改造自然界存在的生物学元件 ( 例如，酶分子，启动子，核糖开关等) 。并且这些生物学元件有明显的模块 化性质，每一个生物学元件都有详细的生物学性质描述，可以与其他的生物学 元件组成更大的生物学装置( d e v i c e ) 1 3 】；2 利用这些标准的合成生物学元件构 建非天然的生物学系统，例如，基因环路，代谢途径甚至细胞删而相比于传统 的分子生物学和细胞生物学，合成生物学更强调对已有的生物学元件或系统进 行人工的设计和改造得到新的标准的合成生物学核心元件( c o r ec o m p o n e n t s ) ， 且以分子生物学经典知识背景，结合生物信息学，系统生物学来利用这些生物 学元件构建非自然的生物系统。合成生物学的元件可以是任意一个分子生物学 的分子，例如，启动子在分子生物学上是转录的起始位点，在合成生物学上即 可作为起始d n a 转录r n a 的生物学元件，且合成生物学更强调通过人工改造构 建出一系列具有不同的启动强度，具有不同的调控性质的启动子以适应发展多 样生物学装置的需要。在这些标准化的生物学元件在合成生物学领域，可以像 物理学元件组装成更大规模的集成电路一样，组装成具有特定生物学功能的生 物学装置。例如，酰基高丝氨酸内酯( n a c y lh o m o s e r i n el a c t o n e s ，a h l s ) 多 种革兰氏阴性菌产生的一种群体感应信号分子，这种信号分子首次在海洋费氏 弧菌( v i b r i o f i s 幽硼中发现 1 4 】。酰基高丝氨酸内酯i 主t l u x i 蛋白催化产生并分泌 到胞外，胞外酰基高丝氨酸内酯的浓度与菌体量在正比，当信号分子达到一定 浓度之后，l u x r 蛋白可以与酰基高丝氨酸内酯形成l u x r - a h l s 复合物，复合物 可以与r n a 聚合酶相互作用并调节下游目标基因的表达。l u x r 通过对反应细胞 3 山东大学硕士学位论文 浓度的信号分子酰基高丝氨酸内酯的识别可以调控下游基因的表达时机及强 度。不同来源的l u x r 分子并不具体序列上的保守性，而且可以识别不同长度的 酰基高丝氨酸内酯。因此，通过设计和改造l u x r 分子可以构建识别不同信号分 子以及对不同信号分子有不同响应度的a h l 依赖型转录因子。c o l l i n s 等人通过 对v i b r i o f i s c h e r i 来源的l u x r 蛋白进行随机突变，筛选到可以识别辛基高丝氨酸 内酯的l u x r 分子，并获得八个对不同浓度辛基高丝氨酸内酯响应的l u x r 突变体 【1 5 】。得用这些人工合成的生物学元件可以改变细胞的群体感应特性。 从上面的例子可以看出，合成生物学的理念就是像工程学那样通过设计和改 造己知的生物学元件，依照生物学规律构建具有新功能的生物系统。合成生物 学已经发展成为综合了分子生物学、细胞生物学、系统生物学和生物信息学等 多门学科的综合学科。另外，合成生物学的特点之一就是标准化和简便性，合 成生物学工作者可以利用标准化的元件和装置设计，实现更大规模的生物工程学 改造。即利用标准化的生物学元件，可以简便地实现大规模的生物学途径的构建， 达到生物合成的目的。利用合成生物学构建的具有详细生物学特征的生物学元 件来构建代谢途径具有好的可预测性，可以简化代谢工程的过程，提高代谢工程 改造的效率，同时为构建更复杂的生物学系统提供技术支持。合成生物学研究的 各种生物学元件包括：合成的或经过改造的启动子( s y n t h e t i co rm o d i f i e d p r o m o t e r s ) ，核糖开关( r i b o s w i t c h e s ) ，基因间序列( t u n a b l ei n t e r g e n i cr e g i o n s ) ，翻 译调控元件( t r a n s l a t i o nm o d u l a t o r s ) ，核糖结合位点( r b si n t e r n a lr i b o s o m ee n t r y s e q u e n c e s ) ，上游开放阅读框( u p s t r e a mo p e nr e a d i n gf r a m e s ) ，m r n a 分子的二级 结构( o p t i m i z e dm r n as e c o n d a r ys t r u c t u r e s ) ，r n a 沉默( r n as i l e n c i n g ) 等都是 代谢工程中可供选择的精确调控的基础分子生物学元件 1 3 1 。 1 3 操纵子 1 3 1 操纵子的概念 操纵子是功能相关基因及其调控基因或启动子组成的基因簇，通常被同时转 录形成一个转录单位，其转录产物是多顺反子。操纵子是原核生物基因分布的 基本形式，也是原核生物基因转录调控的基本形式。操纵子结构可以通过调控 4 山东大学硕士学位论文 基因或启动子的调控作用使下游结构基因的表达得到统一的调控。操纵子在转 录水平受到转录时机以及转录强度两个水平受到调控。实现转录水平调控的分 子机制有，特异性的转录因子( s p e c i f i c i t yf a c t o r s ) ，如细菌中的0 8 因子；抑制子 ( r e p r e s s o r s ) ，如l a c l ；g e n e r a lt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s 转录因子；转录激活因子 ( a c t i v a t o r s ) ；增强子( e n h a n c e r s ) 等。o s 因子可以增加r n a 聚合酶对其识别的压 力条件下启动子的亲和力，同时降低r n a 聚合酶与持家基因启动子的结合强 度，从而对不同基因进行转录调控。抑制子通过与d n a 链的非编码区结合，其 形成的空间结构阻碍r n a 聚合酶与启动子区域的结合，从而抑制基因的转录作 用及表达。增强子通常位于启动子的上游较远区域，增强子可以增强r n a 聚合 酶与特定启动子的结合强度，从而增强基因的转录水平。转录激活因子 ( a c t i v a t o r s ) 通过与r n a 聚合酶的相互作用或改变d n a 分子的结构从而改变 r n a 聚合酶与启动子的结合强度，进而调控基因的转录水平。这些转录水平的 调控分子都是操纵子的组成部分，可以调控操纵子中全部基因的表达调控。 最早研究的操纵子是乳糖操纵子 1 6 】。乳糖操纵子表达与乳糖代谢的相关基 因及其调控序列。乳糖操纵子由三个结构基因l a c z ，l a c ll a c a ，l a c 启动子和 操纵基因l a c i 组成。l a c z 基因编码伊半乳糖苷酶，可以催化乳糖的半乳糖苷键 水解反应，而产生半乳糖和葡萄糖；l a c y 基因编码半乳糖苷渗透酶，是一个跨 膜的转运系统，负责从胞外转运半乳糖苷运入到细胞中；l a c a 基因编码半乳糖 苷转酰酶催化伊半乳糖苷的转乙酰基反应；a c 编码舭阻遏物( 1 a c r e p r e s s o r ) ，a c 有自己的启动子可以独立转录。 黧 d n a 气 - 中- - 咔曩h i t n a 田 ：妾：乏p r o t e i n 声- 4 d a l a c t o s l d a s ct r a n s a c e t y l a s e p e r m e a s e 图1 3 i 乳糖操控子模型 5 山东大学硕士学位论文 当胞内乳糖水平很低时，细胞不需要乳糖操纵子中三个基因的表达，此时 a c 阻遏物与操纵基因结合，阻遏l a c 启动子的转录起始，胞内乳糖相关酶含量 较少。当无葡萄糖的胞内加入大量乳糖时，细胞需要表达乳糖操纵子降解乳糖 为细胞提高能源物质，此时，乳糖可与l a c 阻遏蛋白形成复合物，改变阻遏物构 型，从而不能与操纵基因o l a c 结合，从而解除这种阻遏作用，诱导乳糖操纵子 的转录。 1 3 2 大肠杆菌基因组内操纵子信息的相关工具 大肠杆菌的基因组结构已经研究的非常详尽，有很多生物信息学的数据库提 供大肠杆菌基因内操纵子的结构。r e g u l o nd b ( h t t p ：r e g u l o n d b c c g u n a l l l r e x ) 是 大肠杆菌转录调控和操作子数据库，可以提供有文献记载的所有操纵子的结构 及其调控因子，并提供详尽的原始文献 1 7 】。b i o c y c ( h t t p ：b i o c y c o r g ) 数据库中 的g e n o m eb r o w s e 和g e n o m eo v e r v i e w 等工具也提供详细的大肠杆菌操纵子信 息( 如下图) 。g e n o m eb r o w s e 中可以搜索任一基因或操纵子，显示结果包括操 纵子在基因组上的位置，操纵子结构，与其作用的转录调控因子，启动子序列 等详细信息 1 8 】。 e s c _ 一er f 寸| 8c 0 | k - 1 2s u b s t r ，m g l 6 5 sc h r o m o s o m e ：1 弱舯0 s t a r t 姊j ：广一埘沏i ：厨斧一ig f - n - m ：厂一百；葡；i i l 继导黼罗f 勰游蜘禚黧篡瓣舞撼 艇垒篮u 丑笙! 羔皇二上壁韭丝上丝嚣墟麓 ；嚣篙”对9 f l o 豫w 1 $ n e r e t e c l。粼篙燮篁监墨怎篇篇搿篆鬻盥垃地箜盥墼髓簟譬对辊呲e n 油船t 恕w 查】f 0 0 b ，e ，咖n 铀，口湘y 也2 o ，嗽0 “一0 图1 3 2b i o e y e 数据库g e n o m eb r o w s e 工具 6 山东大学硕十学位论文 g e n o m eo v e r v i e w 可以从全基因组水平上研究大肠杆菌的操纵子分布情况。 燃嬖熊嚣- 一伽l r , n a 。c r ：黛慧薰潞徽搂然蕊黧溉徽燃一一一 伪r 日_ m o _ 嘲： l 缸! ! 蜓：，! o ? o 蟹- 唧：塑 。! 臻! ，紫嗍“! ! 一。；1 。1 1 8 7 ：! 鹭兰耋j l 垡 ! 一地“。! 椿l 黔跪噱骁! 骢o o 鎏：材 ：，1 j “_ b ! 帆”? 叫“删垒o ：p “。“! ：妫，4 e ： - 一一世，l ：卫“! ”# “，。”“出二+ 4 。“h 2 “# i p ) j 7 ； t ，i i 叶 ”，二n ，l ， l + ，”t 秘”p 。，0 2 4 o 二o j 5 ，q 4：p ，：t ? ! ，e ，o ： o p 特! ! ! 删一：鲤廿怂拈 “t ! ! 骢蚶o 罂! 蚺：o 鼍 b 8 - l ? i t ：二口t ! 学 t ：吧! 鲢2。! - ：擘二二= p 。：。! 辣翟二二- ，世? ! ! 。、? ：o 型删鞲? 吐! 8 ： ! 一t 0 2 ：2 ：吁：! ：* j 。! 一掣“一：7 。+ ! ! 吁o e 墅“= ：燃! 酚馨! ，竹：4 ：毒普些。 7 9 】l ：i 竖。“。一川“j4 ：2 一“4 5 ：。 。 靶j ：l ，”。：o ：2 ”f 。! “2 p ”r ”o + ! f t n j ：e ! 竹e t ”o - 一+ 姥p 怂：2 o ，墟o + “”：，! p 盛! 坫怂燃t ! ! ：l 、毫2 “ i ：j j l 嫩一：e 。啦廿塑訾 i 搿t - 犍! 一2 ：! 剥：! ：譬：t ：缱，世能f 鲥。! ：p ! 笛! ：七- ! p l ，：、7 l ：o ：? ： 吁| ，”绻：? 一：缝些0 ! o 杼些! 二二垡! 。j 壁“o 二：盐：i 世! 一k t 譬! j 靶缱! 曼嬲世二l 一 ：r3 b 7 i -。! i ”塑脚j 缝 ! “t 吖。t l t _ t 埔妒-：川# o 州垂! ! 。 l ，7 ；t 4 ：# ，h 女 “t ”_ + ：”# 二。一!- 。：州 1 $ 0 j c 4 ：擘t - ” - ， 。旺! ，f 。：。! ! ，能e6 o ：e ” + + f l - 7 神：。：p p 2 ：2 m 二e 。! j ：! ：0e 电! ，q 一8 ，名缨p ! ! “：o ：! 盼世鲤= 廿! 。! 一：馏：“! “。味! j ：f l p ；，蚴： 。：型甚i o - 一t ：蛆! 盥! ! ! ，：2 p 一j ：棼；警”j ：j - - 丝，! ! 一：4 一! ：! 鲶e ! 一：! - ：p 一! ：! e l ，w l - ，4 。掣：一! m ! z ! $ ! 。t 静。“t 一! i ”翟一一。型! p “蟑耪! t 三苎p ! 一! 驰：坠o ! 孵 ：，# ：q ，h 一+ ”t ”，i ”：川“# ，o 嚣、“f t “+ ! 壁 4 ：r ：7 5 l t t ：箸塑；t 。2 一 ，。t ：f 。n t t ! 掣n 。 2 + ，。” z ：，o ，l 二： ；j 一” - 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