（微生物学专业论文）明串珠菌的筛选及其生理代谢特性研究.pdf

摘要 明串珠菌是一类进行异型乳酸发酵的革兰氏阳性细菌，可以代谢柠檬酸形成风 味成分双乙酰，在乳制品、食品防腐和医药行业有重要用途，是乳品加工中占有重 要地位的发酵剂菌种之一。本文从不同来源的基质中分离、筛选明串珠菌。研究 其代谢和生理特性，旨在提供新的适应于商业性发酵剂规模化生产的优良菌株和资 源为开发新的发酵乳产品和满足人们的消费需求提供技术支持。 采用h p 、l u s m 和l m m 三种选择性培养基，从来源不同的基质材料中分离到 4 5 株疑似明串珠菌：经万古霉素抗性试验、柠檬酸代谢试验和葡聚糖生成试验，获 得柠檬酸代谢和葡聚糖生成均为阳性的菌株6 株，柠檬酸代谢阳性菌株6 株，能够 将蔗糖转化为葡聚糖的菌株8 株。经过革兰氏染色、细胞形态学特征观察、3 7 a c 下 生长试验、r , h4 8 生长试验、6 5 和3 n a c i 生长试验、过氧化氢酶试验、水解精 氨酸试验、从葡萄糖产酸产气试验、水解七叶灵试验以及碳水化合物发酵试验，并 以肠膜明串珠菌肠膜亚种6 0 5 5 作为鉴定试验模式菌株，对所获得的2 0 株疑似菌株 分别进行生理和生化特征测试，参照伯杰细菌鉴定手册( 第八版) 确定2 0 株参 选菌株均属于明串珠菌属，其中1 0 株被鉴定为肠膜明串珠菌肠膜亚种，4 株被鉴定 为肠膜明串珠菌右旋葡聚糖亚种、l 株被鉴定为肠膜明串珠菌乳脂亚种、1 株被鉴定 为乳明串珠菌、4 株被鉴定为假肠膜明串珠菌。 基于柠檬酸代谢试验以及双乙酰产量初步测定结果，确定了柠檬酸代谢能力较 强的3 个菌株，即肠膜明串珠菌肠膜亚种d m l - 2 、肠膜明串珠菌右旋葡聚糖亚种 w z 4 - 3 和假肠膜明串珠菌w z 9 2 作为进一步的研究菌株。 以模式菌株肠膜明串珠菌6 0 5 5 作为对照，研究了葡萄糖、蔗糖和乳糖等碳源对 菌株d m l 2 、w z 4 3 和w z - 9 - 2 细胞生长和发酵活性的影响。结果表明，蔗糖和葡 萄糖均可促进菌株6 0 5 5 、d m l - 2 和w z 9 2 良好生长，且效果相近，而菌株w z 4 3 的最佳碳源是蔗糖。 研究了蛋白胨、胰蛋白胨和胰酶水解酪蛋白等氮源对菌株6 0 5 5 、d m l 2 、w z 4 3 和w z - 9 - 2 的生长和发酵活性的影响。结果表明，三种氮源在刺激明串珠菌的生长 和酸化活性方面并没有显著的差别。都可以作为氮源使用。 研究了柠檬酸对菌株6 0 5 5 、d m l 2 ，w z 4 3 和w z 9 2 的细胞生长和发酵活性 的影响。结果表明，添加柠檬酸均不同程度的降低了四菌株的酸化活力；在刺激细 胞生长方面，除明显刺激w z 4 - 3 的细胞增长之外，对其它3 个菌株并无明显效果。 研究了m n 2 + 和m 9 2 + 的不同添加方式对菌株6 0 5 5 、d m l 2 、w z 4 - 3 和w z - 9 2 的细胞生长和发酵活性的影响。结果表明，m n 2 + 对4 株菌的细胞生长和发酵活性均 有促进效果，而m 9 2 + 并无明显效果。 研究了2 1 。c 、2 5 0 c 和3 2 0 c 等不同培养温度对菌株6 0 5 5 、d m 一2 ，w z 4 - 3 和 w z 9 2 的细胞生长和发酵活性的影响。结果表明，前两株菌适合于在3 2 。c 下生 长后两株菌则更适合于在2 5 。c 下生长。 通过酶促反应测定，分剐确定了菌株6 0 5 5 、d m l 2 、w z 4 3 和w z 一9 2 的双乙 酰还原酶和乳酸脱氯酶的活力及其在p h4 6 - - 6 6 的范围内随p h 值的变化情况。结 果表明，菌株6 0 5 5 的双乙酰还原酶活力随p h 值呈v 型变化，在p h5 4 左右时的 活力达到最低，为o 2 9 0 2 6 3 u ：其乳酸脱氨酶活力随讲- i 降低，从0 1 8 8 7 3 i u 减弱到 o 0 8 3 4 1 2 u 。菌株d m l 2 的双乙酰还原酶和乳酸脱氢酶活力均随p h 值降低而减弱， 在口h6 6 - - 4 6 的范围内，双乙酰还原酶活力从0 2 9 1 u 降至0 1 9 5 u ，乳酸脱氢酶活力 从0 1 7 3 u 降至0 0 6 2 u 。菌株w z 4 - 3 的双乙酰还原酶和乳酸脱氨酶活力均随p h 值 星“八”型变化，双乙酰还原酶在p h5 4 处活力最高为o 2 31 u ：乳酸脱氢酶活力在 p h 5 8 处活力最高，为0 1 6 5 u 。菌株w z - 9 2 的双乙酰还原酶活性随p h 值降低而逐 渐增强，在d h6 6 - - 4 6 的范围内其活力从o 0 5 9 u 升高至o 1 4 9 u ：乳酸脱氢酶活性则 随毋i 值降低而减弱，其酶活力从0 2 7 8 u 降至o 1 1 4 u 。 采用o n p g 比色法测定了菌株6 0 5 5 、d m l 2 、w z 4 3 和w z 9 2 在p r t7 0 条件 下的b 一半乳糖苷酶活力，结果表明，它们的乳糖酶活力分别是6 7 6 x 1 0 - 3 u 、 8 4 1 】0 - 3 u 、2 8 8 1 0 - 3 u 和9 3 4 x 1 0 _ 2 u 。 采用通气蒸馏及比色法研究了肠膜明串珠菌肠膜亚种d m l - 2 和右旋葡聚糖亚种 w z 4 3 在不同发酵条件下的双乙酰生成及其利用柠檬酸的情况。结果表明，在接种 之前向乳中添加0 1 5 的柠檬酸，可使菌株d m l - 2 的双乙酰产量从1 5 7 1 i _ t g m l 提 高至2 t s 6 i _ , g m l 。使菌株w z 4 3 的双乙酰产量从1 , 4 3 7 1 x g m l 提高至1 9 1 7 1 t g m l 。 在此基础上，采用6 0 r m i n 的转速摇床培养，可分别使菌株d m l - 2 和w z 4 3 的双乙 酰产量进一步提高到2 4 3 9 1 x g m l 和2 3 5 4 i _ t g m l 。与2 5 c 的培养温度相比，采用 3 2 。c 培养可使菌株d m l - 2 和w e 4 - 3 的双乙酰产量分别从1 8 5 8 g m l 和 1 8 2 4 i t g m l 提高至2 1 2 7 l _ t g m l 和2 8 0 9 i t g m l ，双乙酰产量分别提高了 0 0 2 6 9 h g m l 和0 9 8 5 弘g m l 。 研究了肠膜明串珠菌右旋葡聚糖亚种w z 4 3 的萄体细胞在p h4 1 6 6 范围内的 双乙酰生成能力和柠檬酸代谢活性。结果表明，在p h4 6 5 5 之间。菌株w z 4 。3 细 胞的双乙酰生成能力和柠檬酸代谢活性均比较高，尤其是在d h5 1 5 5 之间，双乙 酰生成能力和柠檬酸代谢活性同时达到最高值；而在p h4 1 4 5 和p h5 6 。6 6 的范 围内，细胞生成双乙酰和代谢柠檬酸的活力相对较低。 关键词：明串珠菌菌株；柠檬酸代谢；x g e , 酰；葡聚糖：双乙酰还原酶；乳酸脱氢 酶；生理特性 s t u d i e so nt h es c r e e n i n g p h y s i o l o g i c a la n dm e t a b o l i c p r o p e r t i e s o fl e u c o n o s t o cs t a i n su s e d i nd a i r yi n d u s t r y g a n l i l i f i e l di nm a s t e rd e g r e e ：a p p l i e dm i c r o b i o l o g y ( s c h o o lo f f o o ds c i e n c e t e c h n o l o g y , h e b e ia 鲫c u l t u r a lu n i v e r s i t y ) s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rd r z h a n g b o l i n a b s t r a c t l e u c o n o s t o cs p p a r cg r a m - p o s i t i v ea n dh e r e t o f e r m e n t a t i v el a c t i ca c i db a c t e r i af o u n di nr a w f o o d s t u f f s ，d a i r yp r o d u c t sa n dv e g e t a b l ef e r m e n t a t i o n s t h em i c r o o r g a n i s m sa r ea b l et o c o n v e r t c i t r i ca c i df r o mm e d i ai n t od i a c e t y l ，o n ei m p o r t a n tc o m p o u n dc o n t r i b u t i n gt ot h ea r o m ao fd a i r y p r o d u c t sl i k eb u t t e r , c h e e s e s o fb u t t e r m i l k m o r e o v e r , l e u c o n o s t o cs t r a i n sh a v ef o u n dc o m m e r c i a l a p p l i c a t i o n sa so n eo f t h em o s ti m p o r t a n ts t a r t e rc u l t u r e si nd a i r ya n dv e g e t a b l ep r o c e s s i n g f o o d p r e s e r v a t i o na n d e v e nm e d i c a li n d u s t r y t h eo b j e c t i v e so f t h ep r e s e n ts t u d yw e r e ：( 1 ) t oi s o l a t ea n d s c r e e nl e u c o f l o s t o cs t r a i n sf r o mv a r i o u ss o u r c e si i k er a wm i l k sa n df e r m e n t e ds a u e r k r a u t s ；( 2 ) t o i n v e s t i g a t et h e i rp h y s i o l o g i c a la n dc i t r a t e m e t a b o l i z i n gp r o p e r t i e su n d e r c o n t r o l l e dc o n d i t i o n s ；( 3 ) t oo b t a i nn e w l e u e o n o s t o cs t r a i n sa v a i l a b l e f o r t h ec o m m e r c i a l p r e p a r a t i o no f s t a r t e r s u s e d i n d a 时 p r o d u c t s t h ef o l l o w i n ga r cm a i n r e s u l t s t h et h t e es e l e c t i v em e d i al i p , l u s ma n dl m m w e r cu s e dt oi s o l a t e4 5s t r a i n so f l e u c o n o a t o c s p p f r o mr a wc o wm i i k , g o a tm i l ka n df e r m e n t e dv e g e t a b l e so b t a i n e df o r mi n n e rm o n g o l i aa n d b a o d i n g c i t y o fh e b e ip r o v i n c eb a s e do n v a n c o m y c i n - r e s i s t a n t , c i t r a t e - f e r m e n t i n g a n d d e x t r a n - p r o d u c i n g f r o ms s c c h d l r o s e a m o n g4 5i s o l a t e s , 2 0i s o l a 耗sw e r ei d e n t i f i e da sl a n c o m x s t o c s p e c i e sb a s e do ot h em o r p h o l o g i c a l ，g r a m - s t l i n i n $ p h y s i o l o g ya n dc a r b o h y d r a t ef e r m e n t a t i o n s w i t hr e f e r e n c e t o t h e t y p es t r a i n i , p l o n o s t o c m e s e n t e r i o d i e ss u b s p m e s e n t e r i o d i e s6 0 5 5 o u t o f 2 0 l e u c o n o s t o c s p e c i e s , 1 0 s t r a i n sw e i d e n t i f i e da sl e u c o n o s t o cm e s e n t e r i o d i e s s u b s p m e s e n t e r i o d i e s 。4s l r a i n sa sl e u c o n o s t o cm e s e n t e r i o d i e s s u b s p d e x t r a n i c u m , 1 s t r a i na s l e u c o n o s t o cm e s e n t e r i o d i e ss u b s p c r e m o r i ! , 1s t r a i na s 伽o n o s t o cl a c t i c ，a n d4s l r a i n sa s l e u c o n o s t o c p r a r m e s e n t e r i o d t e s lm e s e n t e r i o d i e ss u b s p m e s e n t e r i o d i e sd m l - 2 工m e s e n t e r i o d i e ss u b s p d e x t r a m i c u mw z 4 3 a n dl p r a r m e s e n t e r i o d i e sw z - 9 - 2 ，a l o n gw i t h 厶m e a e n t e r i o d i e ss u b s p m e s e n t e r i o d i e s6 0 5 5 ，w e r e t e s t e df o rf o r t h e rs t u d i e sa c c o r d i n gt ot h e i rc i t r a t e - m e t a b o l i z i n ga n dt h ea m o u n to f f o r m e d d i a c e t y l c o m p a r e d t os t r a i n6 0 5 5u s e da st h ec o n t r o l ，t h ee f f e c t so f g l u c o s e ，s a c c h a r o s ea n dl a c t o s eo n t h ec e l lg r o w t ha n d a c i d i f y i n ga b i l i t yo f s t r a i n sd m l 2 ，w z 4 - 3a n dw z 一9 2w e r ec a r r i e do u t t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tg l u c o s ea n ds a c c h a r o s es t i m u l a t e dt h eg r o w t ha n da c i d i l y i n ga c t i v i t yo fs t r a i n s 6 0 5 5 ，d m l 2a n dw z - 9 - 2v e r yw e l l ，w h e r e a ss a c 圮h a r o s ew a st h eo p t i m a ls u g a rs u p p o r t i n gt h ec e l l g r o w t ho f s t r a i nw z 4 - 3 p e p t o n e ，t r y p t o n ea n dc a s e i n h y d r o l y s a t ew e r eu t i l i z e dw e l la sn i t r o g e ns o u r c e sb yt h es u 蚵n s 6 0 5 5 d m i 2 w z 4 3a n dw z - 9 - 2 t h ec e l lg r o w t ha n da c i d i f y i n ga c t i v i t yo f4s t r a i n ss t u d i e d s h e w e dt h a tn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sw e r ef o u n da m o n g t h eu t i l i z a t i o uo f3n i t r o g e nr e s o u r c e s u s e da sg r o w t h - p r o m o t i n gf a c t o r s i n c l u s i o no f c i t r a t ei n t om r sm e d i ai n c u b a t e d a t3 7 。c ，t os o m ee x t e n t , r e d u c e dt h ea c i d i f y i n g a c t i v i t yo f l e u c o n o s t o cs t r a i n s6 0 5 5 。d m l - 2 ，w z 4 - 3a n dw 二9 - 2 m o r e o v e r a d d i t i o no f 0 1 5 c i t r i ca c i dt om r sm e d i ah a dn o tg i v eac l e a rs t i m u l a t i o nt ot h ec e l lg r o w t ho f6 0 5 5 ，d m l - 2a n d w z 9 - 2e x c e 口ts t r a i nw z 4 - 3 t h ee f f e c t so f m e t n ii r o n sl i k em n 2 + ，m 矿+ o rm n 2 + p l u sm 矿+ o n t h ec e l lg r o w t ha n da c i d i f y i n g a b i l i t vo fl e u e o n o s t o cs t r a i n sd m l - 2 ，w z 4 - 3a n dw z 一9 - 2w e m c a r r i e do u t n 峙r e s u l t si n d i c a t e d t h a tm n ”i m p r o v e dc l e a r l yt h eg r o w t ha n da c i d 耐i n ga c t i v i t yo f4s t r b i n st e s t e d ，w h e r e a s 埘+ p r o d u c e d n o c l e a rs t i m u l a t i o n t o t h eg r o w t h a n d a c t i v 时o f l e u c o n o s t o c s t r a i n s f o u rs t r a i n so f l c u e o n o s t a ct a s t e dg r e wa tuw i d et e m p e r a t u r er a n g ef r o m2 1 。ct o3 2 。c c e l l g r o w t h a n da c i d i f y i n ga c t i v i t ys h o w e dt h a ts t r a i n s6 0 5 5a n dd m l - 2g r e wv e r yw e l la t3 2 。c s t r a i n s w z 4 - 3a n dw z 9 2h a dt h el a r g e s tg r o w t ha n da c i d i f y i n ga c t i v i t ya t2 5 0 c i tw a sc l e a rt h a tt h e o p t i m a lc e l lg r o w t ha n da c t i v i t yw e r es t r a i n - d e p e n d e n t t h ea c t i v i t i e so fd i a c e t y lr e d u c t e s ea n dl a c t i cd e h y d r o g e n a s e ( l d h ) o ft h es t r a i n s6 1 5 5 ， d m l - 2 w z 4 - 3a n dw z - 9 - 2w 晰i n v e s t i g a t e db a s e do nt h ec h a n g e so ft h et w oe n z y m e si np h f r o m4 6t o6 6 i tw a ss nt h a tt h ed i a c e t y lr e d u c t e s eo f s t r a i n6 0 5 5s h o w e dac h a n g ei nt h es h a p e o f v ”f i e f i r s t l yd e c l i n i n g , t h e nr e a c h i n g t h el o w e s t , a n df i n a l l yr i s i n g ) a sp hi n c r e a s e d w h e np h w a s5 5 t h el e v e lo f d i a c e t y lr e d u c l t a s ef r o ms t r a i n6 0 5 5a c h i e v e dt h em i n i m u mh a v i n g0 ，2 9 0 1 2 i t s l d ha c t i v 研d e c r e a s e df r o m0 1 8 8 ut o0 0 8 3uw h e np hw a sr a i s e d l e v e l so fd i 蝴时l r e d u c t s s ea n dl d hf r o mm a i nd m i 2d 蜊列i l a l l yw i t hj l i 口凇i np h w h e np h c h a n g e d b e t w e e n6 6a n d4 6 t h ee n z y m e sa c t i v i t yo fs t r a i nd m l - 2d e c l i n e df r o m0 2 9 1 ut o0 1 9 5 1 1i n d i a e e t y lr e d u e t n s eo rf r o m0 1 7 3 ut oo 0 6 2 ui nl d h d a t a f r o mt h ep r e s e n ts t u d ys h o w e dt h a tt h e a c t i v i t i e so fd i a c e t y lr e d u c t e s ea n dl d ho fs t r a i n sw z 4 3v a r i e dj nt h es h a p eo f ”a sp h r o s e f r o m 4 6 t o6 6 t h e a c t i v i t y o f i t s d i a t y lr e d u e t a s e h a d a m a x i m a lv a l u e o f 0 2 3 1 ua t p h 4 8 ：a n d i 协l d hr e a c h e dm a x i m u mw i t h0 1 6 5a tp h5 8 t h ed i a c c t y lr e d u c t a s eo f s t r a i nw z - 9 - 2i n 甜吼s e d s l o w l yb e t w e e no 0 5 9 ua n d0 1 4 9 ua sp h d e c l i n e df r o m6 6t o4 6 i t sl d h a c t i v i t ys h o w e da d e c l i n ef r o m0 2 7 8 ut o0 11 4 1 3w h e np hv a r i e db e t w e e n6 6a n d4 6 t h ec o l o r i m e t r i ee s t i m a t i o no fo n p gw a su s e dt od e t e r m i n ei b - - g a l a c t o s i d a s ea c t i v ho ft h e f o u rl e u o o n o s t o es t r a i n s6 0 5 5 ，d m l 一2 ，w z 4 - 3a n dw z - 9 - 2 t h el e v e l so f1 3 - g a l a e t n s i d n s ew a s 6 8 x 1 0 一u f o rs t r a i n 6 0 5 5 ，8 4 x 1 0 一u f o r s t r a i n d m l - 2 ，2 9 x 1 0 - 3 u f o rs t r a i n w z 4 3a n d 9 3 x l0 2 u f o rs t r a i n w z - 9 - 2 ，r e s p e c t i v e l y i t w a sc l e a rt h a tt h el e v e l so f 脚l a c t o s i d a s cf o r m e db y l e u c o n o s t o cd e p e n d e du p o ns t r a i n su s e d s t e a m - d i s t i l l a t i o n - s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o dw a su s e dt o d e a lw i t hc i t r a t eu t i l i z a t i o na n d s u b s e q u e n td i a c e t y lf o r m a t i o nb yt h el e u c o n o s l o cs t r a i n sd m i 2a n dw z 4 3u n d e rd i f f e r e n t 向r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta d d i t i o no f0 1 5 c i t r i ca c i dt om i l kb e f o r e i n o c u l a t i o ni n c r e a s e dt h el e v e lo fd i a c e t y lf r o m1 5 7 1 “s m lt o2 1 8 6 t g m lp r o d u c e db ys t r a i n d m l 2o rf r o m 1 4 3 7 p g m l t o 1 9 1 7 p g m lp r o d u c e db y s t r a i nw z 4 - 3 m o r e o v e r , s h a k e c u l t i v a t i o nw i t h6 0r p m m i na l l o w e ds t r a i n sd m l 一2a n dw z 4 - 3t of o r mm o r ed i a c e t yt h a l l t h ei n c l u s i o no fc i t r a t et om i l kd i di n d i v i d u a l l y t h ef o r m a t i o no fd i a c e t y lw a si n c r e a s e d t 0 2 4 3 9 p g m lb ys t r a i nd m i 一2a n d2 3 5 4 p g m lb y s t r a i nw z 4 - 3 r e s p e c t i v e l y i nc o m p a r i s o nw i t h t h et e m p e r a t u r eo f 2 5 。c t h ec u l t i v a t i o nt e m p e r a t u r eo f 3 2 。ca l l o w e ds w a i n sd m l - 2a n dw z 4 3t o p r o d u c ed i a c e t y lf r o m1 8 5 8 1 t g m l o r1 8 2 4 1 t g m lt o2 1 2 7 p g m lo f2 8 0 9 p g m l r e s p e c t i v e l y t t i ea m o u n to f d i a c e t y lf o r m e db y t h et w ol e u c o n o s t o es t r a i n sw a si n c r e a s e db y0 0 2 6 9 “g m la n d o 9 8 5 l l g m l r e s p e c t i v e l y ap hr a l l 始f r o m4 1t o6 6 p r o d u c e dd i f i e r e n ti n f l u e n c e so nt h ec i t r a t ef e r m e n t a t i o na n d d i a c e t y lf o r m a t i o no f s t r a i nw z 4 - 3 w h e np h v a r i e db e t w e e n4 6a n d5 5 t h ec e l l so f s t r a i nw z 4 3 h a dh i g h e ra b i l i t i 船t of e r m e n tc i t r a t ea n dp r o d u c ed i a e e t y l i tw a sn o t e dt h a tt h ea c t i v i t i e so f c i t r a t e - u t i l i z i n ga n dt h e nd i a e e t y l f o r m i n gb yt h es t r a i nr e a c h e dt h em a x i m u m a tp ho f5 i - 5 5 e i t h e r i n t h e p hr a n g e o f 4 1 - - 4 5o r o f5 6 - - 6 6 t h ec e l lo f s t r a i n w z 4 - 3s h o w e da w e a k a c t i v i t y i n b o t hc i t r a t e f e r m e n t i n ga n d d i a c e t y l p r o d u c i n g k e y w o r d s ：l e u c o n o s t o cs t r a i n s ；c i t r a t em e t a b o l i s m ；d i a e e t y lf o r m a t i o n ；d e x t r a n ；d i a c e t y l r e d u c t a s e ；l a c t i cd e h y d r o g e n a s e ( l d 脚；p h y s i o l o g i c a lp r o p e r t i e s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑韭盘些盘堂或其他教育机构的学 位或证书面使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：高扔司 签字日期：卫口步 年月土日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑i 垦盔些盘茎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑韭盎些盘茔可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：螽狰1 翻 签字日期：矽哕年歹月f 日 铆签孝殇 签字日期：芦岁 材7 够_ 年7 月纠日 学位论文作者毕业后去向：磁苏伪钐听疹五、 工作单位：北痦群弗大谚 电话：6 归一办影铅笋 通讯地址：际和海霭乏四褊年尊潞墨黟蠕端溲大曾邮编：，。移 乡强蝌落步技水、薯鳓 明串珠菌的筛选及其生理代谢特性研究 1 引言 尽管近年来中国乳业市场呈现出快速增长的喜人趋势，然而我国乳制品市场上仍然暴露出 产品同质化程度高、品种结构相对单调等诸多不适应市场需求的现象。除资本原因外，许多乳品 加工企业因缺乏后续的产品研发能力，导致市场竞争力下降。因此，如何对未来乳品市场定位， 确定乳制品新品种研发的方向，显然是高等院校和乳品企业的科研人员极为关注的问题。 发酵乳制品由于其良好的风味和口感、丰富的营养成分和显著的促健康功效而深受广大消费 者喜爱，而且一直是整个乳品市场的主导产品，如干酪、酸奶、黄油等等大宗乳制品。近年来， 发酵乳的研究与开发进一步向健康或功能性方向发展。然而，无论这些产品的结构怎样变化或发 展，制作发酵乳制品的一个关键技术是发酵剂的选择和确定，这类产品的风味、类型、功能性和 质量在报大程度上与发酵剂的菌株组成和种类有关。因此，开发选育新的多样化的乳制品发酵剂 菌株特别是与发酵乳密切相关的乳酸菌菌种，显然对于开发和产生新型发酵乳制品是非常必要 的。 在乳品加工中，明串珠菌是占有重要地位的发酵剂菌种之一。它能够代谢生成c 0 2 和多种风味化台物，并且具有潜在的益生效果，常用被于发酵乳、黄油以及干酪的发酵生产。将 明串珠菌其作为发酵荆菌种或非发酵剂乳酸菌( n s l a b ) 应用到发酵乳制品当中，将会在很大程 度上提高产品的感观质量或功能型性效果。然而目前国内尚没有明串珠菌参与发酵的乳制品闷 世，因此选育具有优良性状昀明串璩菌菌种将会在很大程度上促进国内发酵乳制品种类的多样 化同时提高产品的感观质量和功能效果。 1 1 明串珠菌的分类 明串球菌( l e a c o n o s t o c ) 存在的生态环境较为宽泛，但主要存在于植物的表蕊及根部。尽管 鲜乳及某些乳制品当中也存在相当数量的明串珠菌，但其原生环境仍然为植物材料，主要来源于 牧场或加工环境中新鲜或发酵的植物材料1 1 1 明串珠菌是一类不产生孢子，g + c 含量低于5 0 的革兰氏阳性细菌，可以在厌氧或有氧条 件下生长通常表现为过氧化氢酶阴性，不水解耪氨酸，其细胞大小为0 5 - 0 7 x 0 7 一1 2 p s n 。在自 然生长环境中，明串珠菌细胞呈对或短链状排列：在某些竞争性生长的环境中，细胞排列成较长 的链。明串珠菌大多数菌株的最适生长温度在2 0 3 0 0 c 之间，异型乳酸发酵，可以进行柠檬酸代 谢。 由于其生理特性，明串珠菌在很大程度上与异型代谢的乳酸杆菌非常接近。但是由于明串 珠菌的形态学特征，以及从葡萄糖代谢完全产生肼乳酸的特性，又使其明显区别于异型代谢的乳 酸抨菌。目前，除形态学( 革兰氏染色) 、糖发酵、生长等指标用于种的鉴定外，基于进化关系， 人们应用分子生物学证据( 包括1 6 s r r n a 序列、2 3 s r r n a 序列和r p o c 基因。r p o c 是一种编码 依赖d n a 的r n a 聚合酶b 亚单位的基因) 将原明串珠菌属的种或亚种重新划分到三个属，即明 串珠菌属( l e u c o n o s t o c ) 、魏氏菌属( f e i s a e l l a ) 和酒球菌属( o e n o c o c c u s ) 。 新的明串球菌属由肠膜明串珠菌和其它7 个种组成包括lg e l i d u m ( 冷明串球菌) 、三 河北农业大学硕士学位论文 c c l r n o s m ( 肉明串珠菌) 、f a l l o x ( 欺诈明串珠菌) 、lc i t r a u m ( 嘈柠檬酸明串珠菌) 、la r g e n t i n u m ( 阿根廷明串珠菌) 、p s e u d o m e s e n t e r o i d e s ( 假肠膜明串珠菌) 和1 a c t i s ( 乳酸明串珠菌) 。其 中肠膜明串珠茵又包括三个亚种：肠骥明串珠苗肠膜亚种( 三m e s e n t e r o i d e ss u b s p m e s e n t e r o i d e $ ) 、 肠膜明串珠菌右旋葡聚糖亚种( lm e s e n t e r o i d e ss u b s p d e x t r a n i c m n ) 和肠膜明串珠菌乳腊亚种( 厶 m e s e n t e r o i d e ss u b s p c r e m o r i s ) 魏氏苗属( w e i s s e l l a ) 由原来明串珠菌属的类肠膜明串珠菌( 厶p a r a m c s e n t e r o i d e s ，现在重 新定名为w e i s s e l l ap a r a m e s e n t e r o i d e s ，类肠膜魏斯氏菌) 以及原乳杆菌的几个种l a c t o b a c i l l u s c o n f l l s e s ( 现在定名为w e i s s e l l ac o n f m s 。混淆魏斯氏菌) 、l t o b a c i l l u s v i r i d e s c e n s ( w e i s s e l l a v i r i d e s c e n s ，绿色燕斯氏菌) 、w e i s s e l l a k a n d l e r t ( 坎氏魏斯氏菌) 、w e i s s e l l a m i n o r ( 微小魏斯氏菌) 和w e i s s e l l a h e l l e n i c a ( 希腊魏斯氏菌) 等种构成 洒球菌属现在仅有一个种：酒类酒球菌( o e n o c o c c u s o e n i ) 。 1 2 明串珠菌的分离鉴定 1 2 1 菌株筛选 由于材料来源不同，明串珠茁筛选时需要选用不同的选择性培养基。n i c k e l s 和h 盛赋眦 ( 1 9 6 4 ) 采用添加了乳清和不溶性柠糠酸钙的培养基对来源于乳中的明串珠菌进行筛选他们证 实，如果向其中添加一定量的氯化三苯基四氮睦能够使明串珠菌的菌落更为鲜明闫。1 9 7 8 年。 p e a r c e 和h a l l i g a n 建议使用h p 培养基对乳中的明串球菌进行筛选例1 9 8 8 年，v e b a s k i 等人使用 l m m 培养基从植物材料当中筛选肠膜明串珠菌肠