（微生物学专业论文）红树林环境中新型漆酶基因的克隆酶学特性及分子定向改造研究.pdf

中山大学博十学位论文 红树林环境中新型漆酶基因的克隆，酶学特性及分子 定向改造研究 专业：微生物学 博士生：叶茂 指导教师：刘玉焕教授 摘要 漆酶( 1 a c c a s e ，e c1 1 0 3 2 ) 是一类含铜的多酚氧化酶，其作用底物非常广泛， 包括酚类、芳胺类、羧酸类、甾体激素和生物色素等。漆酶不仅在木质素的降解 和制浆造纸中有重要的应用前景，而且在废水处理、生物漂白、环境污染物降解、 土壤修复、生物监测、食品加工和有机合成等方面也具有潜在的应用价值。 目前，自然环境中绝大部分的微生物不易获得分离和培养，这极大限制了人 们对微生物资源的有效利用。宏基因组学方法避开了传统的微生物分离培养方 法，直接从环境样品中提取总基因组d n a ，通过构建和筛选宏基因组文库来获 得新的功能基因或生物活性物质。宏基因组文库包括了可培养的和未培养的微生 物遗传信息，因此增加了获得新的功能基因和生物活性物质的机会。 在论文中，我们从红树林环境样品中提取总基因组，构建了一个的宏基因组 文库，并从中筛选获得一个新的漆酶基因。采用大肠杆菌表达系统对该基因进行 高效表达，并研究其重组蛋白的酶学性质和在降解环境污染物方面的应用，此外， 为了进一步提高该漆酶的酶活性及对环境污染物的降解能力，利用易错p c r 技 术对该基因进行分子改造。主要研究结果如下： 构建了近海红树林环境样品的宏基因组文库，通过功能筛选方法，成功筛选 出一个其表达产物具有漆酶活性的新基因，命名为l a c 5 9 1 。该基因序列全长1 5 0 0 b p ，编码5 0 0 个氨基酸残基，推测其分子量为5 7 4k d a 。通过蛋白序列分析发现， 漆酶l a c 5 9 1 含有4 个作为铜离子结合位点的组氨酸保守区域。同源性比对结果 表明，该基因与细菌漆酶有中等程度的同源性，最高的是与嗜碱芽孢杆菌( b a c i l l u s 摘要 h a l o d u r a n sc 1 2 5 ) 的漆酶为5 2 。该基因已经提交到g e n b a n k ，登录号为 g q 4 6 8 3 1 3 。 将筛选出的漆酶基因l a c 5 9 1 连接到p e t - 3 2 a ( + ) 表达载体上，并转入表达菌株 e s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 中，使用终浓度为1 0m mi p t g 及0 2 5m mc u s 0 4 ， 在3 0 诱导8h ，目的蛋白表达量达到最高，为3 8 0m g l ，是已知漆酶基因中 的最高表达量。重组漆酶蛋白对多种常见底物的比酶活分别为1 2 7 3u m g ( 2 ， 6 - d m p ) 、5 4 3u m g ( 0 【萘酚) 、7 3 5u m g ( 邻苯二酚) 、1 0 2u m g ( 愈创木酚) 、0 5 1 u m g ( 丁香醛连氮) ，以及0 1 5u m g ( a b t s ) 。s d s - p a g e 电泳结果表明，纯化后 的重组蛋白的分子量约为7 5k d a ( 其中1 8k d a 为表达载体上的融合蛋白标签分 子量) ，结合n a t i v e p a g e 分析结果，推断该漆酶为单亚基蛋白。酶学性质研究 显示，纯化后漆酶对多种研究底物的最适反应p h 值分别为8 0 ( 2 ，6 - d m p ) ，8 2 ( a - 萘酚) ，9 0 ( 邻苯二酚) ，7 5 ( 愈创木酚) ，8 o ( 丁香醛连氮) 以及7 4 ( a b t s ) ；在p h 7 0 1 0 0 范围内仍能保留大于8 0 的酶活( 以愈创木酚为底物) ，表明该酶为碱性 漆酶：此外，该酶的最适反应温度为5 5 ，且在5 0 以下温度处理3 0m i n 能 保留7 0 以上的酶活性( 以愈创木酚为底物) 。不同的金属离子对漆酶活性有不同 程度的影响，在1m m 低浓度条件下，c a 2 + 和f e 2 + 使酶活性分别提高到1 5 0 和 1 4 0 ，m n 2 + 、m 9 2 + 、c 0 2 + 、n a + 和k + 对酶活性影响不明显，n i + 、z n 2 + 和a 1 3 + 则 使酶活性降低至7 7 、5 5 和6 8 ；而在1 0 0m m 高浓度下，c a 2 + 使酶活性提高 2 倍，m 9 2 + 、n a + 和k + 使酶活性分别提高到1 2 5 、1 2 0 和11 0 ，m n 2 + 使酶活 性降低至7 0 ，c 0 2 + 、z n 2 + 、f e 2 + 、n i + 和a 1 3 + 则使漆酶完全失活。1m me d t a 能完全抑制重组漆酶l a c 5 9 1 的酶活性；1m m 的尿素和咪唑对酶活性的影响不 明显，但1 0 0m m 的尿素和咪唑则分别抑制酶活性至2 0 和4 6 ；1m m 的s d s 抑制酶活性至4 2 ，1 0 0m m 的s d s 则使漆酶完全失活。此外，该酶的动力学参 数。显示，2 ，6 - d m p 为该酶的最适反应底物，其余底物依次为邻苯二酚、a 萘酚、愈创木酚、丁香醛连氮和a b t s 。 在研究重组漆酶l a c 5 9 1 对环境污染物的降解时发现，在金属离子c a 2 + 和小 分子介体a b t s ( 或h b t ) 存在的情况下，重组漆酶l a c 5 9 1 处理染料1 4h 后，其 降解率分别为1 1 ( 碱性蓝3 ) 、2 5 ( 亚甲基蓝) 、5 7 ( 溴酚蓝) 、6 0 ( 结晶紫) 、 3 7 ( 亮蓝r ) 和1 0 ( 酸性紫7 ) ；而对靛红染料，漆酶处理6 0m i n 其降解率即可 达到1 0 0 。此外，在小分子介体a b t s ( 或h b t ) 存在的情况下，l a c 5 9 1 处理碱 t i 中山大学博十学位论文 木质素1 4h 后，其降解率可达1 1 。结果表明，该漆酶在降解环境污染物中具 有一定的应用前景。 由于我们所筛选出的漆酶l a c 5 9 1 存在比酶活性较低，因此我们进一步采用 定向进化技术对该基因进行分子改造。通过三轮易错p c r 方法构建了随机突变 文库，以愈创木酚底物酶活力为筛选指标，最终获得酶活性提高的突变酶 ( l a c 3 t 9 3 ) 。经氨基酸序列比对，发现突变酶共有4 个氨基酸发生了替换，突变 点分别是e 3 1 6 v 、f 6 2 l 、v 5 5 a 和n 4 0 s 。与野生型漆酶相比较，突变酶的酶活 性分别提高了4 1 倍( 4 1 0u m g ，以愈创木酚为底物) ，和4 8 倍( 6 1 2 2u r n g ，以 2 ，6 - d m p 为底物) 。突变酶的最适反应温度提高了5 ，达到6 0 ，其最适反 应p h 值从7 5 提高到8 0 ( 以愈创木酚为底物) ，但突变酶的温度和p h 稳定性未 见明显改善。此外，在相同条件下，突变酶l a c 3 t 9 3 对碱性蓝3 、亚甲基蓝、溴 酚蓝和结晶紫等染料的降解率分别提高至2 6 、5 5 、7 9 和8 3 ；并且对靛红 染料完全降解所需时间由6 0m i n 缩短到4 0m i r a 突变酶l a c 3 t 9 3 对碱木质素的 降解率也由11 提高到1 5 。3 。上述结果表明，在提高漆酶活力和环境污染物降 解能力方面，易错p c r 的定向进化技术是一种行之有效的方法。 通过这些研究的结果表明，利用宏基因组学技术获得的漆酶不仅表达量高、 热稳定性较好，以及在碱性环境中具有较高的酶活性，而且对部分染料和碱木质 素具有较好的降解效果，为进一步研究近海红树林环境中微生物的其它重要功能 基因提供了借鉴作用，具有重要的理论意义和应用前景。 关键词：宏基因组文库，漆酶，酶学特性，降解，定向进化 i i i a b s t r a c t an o v e lm a n g r o v e d e r i v e dl a c c a s e g e n ec l o n i n g ， e n z y m a t i cp r o p e r t i e sa n d m o l e c u l a rd i r e c t e d e v o l u t i o n m a j o r ：m i c r o b i o l o g y c a n d i d a t e ：y em a o s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rl i uy u h u a n a bs t r a c t l a c c a s e s ( b e n z e n e d i o l ：o x y g e no x i d o r e d u c t a s e s ，e c1 10 3 2 ) a r em u l t i c o p p e r o x i d a s e s l a c c a s ei sa b l et oo x i d i z eaw i d ev a r i e t yo fs u b s t r a t e s ，i n c l u d i n gp h e n o l s ， a r y l a m i n e s ，c a r b o x y l i ca c i d s ，s t e r o i dh o r m o n e s ，b i o c h r o m e s ，a n ds oo n l a c c a s eh a s a p p l i c a t i o n so f b i o d e g r a d a t i o no fl i g n i na n dp u l pa n dp a p e ri n d u s t r y ，b u ta l s op o t e n t i a l a p p l i e dv a l u eo fw a s t e w a t e rt r e a t m e n t ，e n z y m eb l e a c h i n g ，e n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t d e g r a d a t i o n ，s o i lb i o r e m e d i a t i o n , b i o l o g i c a lm o n i t o r i n g ，f o o dp r o c e s s i n ga n do r g a n i c s y n t h e s i s m i c r o b i a ld i v e r s i t yc o n s t i t u t e sl a r g e l yu n e x p l o r e de n z y m e st h a tc a nb ee x p l o i t e d i n b i o c a t a l y t i cp r o c e s s e s d u et om o s tm i c r o b e si nt h ee n v i r o n m e n tc a nn o tb e c u l t i v a t e du s i n gc o n v e n t i o n a lm e t h o d s ，t h eo n l ym e a n so fa c c e s s i n gt h er e s o u r c e so f t h em i c r o b i a lw o r l di st oh a r v e s tg e n e t i cr e s o u r c e si ns o c a l l e dm e t a g e n o m i cl i b r a r i e s t h em e t a g e n o m i ca p p r o a c h , d i r e c te x t r a c t i n go fd n a 丘o me n v i r o n m e n t a ls a m p l e s a n ds t r u c t u r i n ga n ds c r e e n i n gm e t a g e n o m i cl i b r a r i e s ，a v oi d st r a d i t i o n a lm i c r o b i a l i s o l a t e da n dc u l t u r e dm e t h o d st oo b t a i nn e wf u n c t i o n a lg e n e sa n db i o a c t i v a t o r s m e t a g e n o m i c l i b r a r i e si n c l u d ec u l t u r a b l ea n du n c u l t u r e a b l em i c r o b i a l g e n e t i c i n f o r m a t i o n s ，s ot h a ti ti n c r e a s e st h eo p p o r t u n i t yt oo b t a i nn e wf u n c t i o n a lg e n e sa n d b i o a c t i v a t o r s i nt h i s s t u d y ，w ee x t r a c t e dd n af r o mm a n g r o v es o i la n ds t r u c t u r e d a m e t a g e n o m i c sl i b r a r y an e wl a c c a s eg e n ew a so b t a i n e d t h el a c c a s eg e n ew a s i n d u c e dh i g h - l e v e le x p r e s s i o ni ne s c h e r i c h i ac o l i ，a n dt h ee n z y m a t i cp r o p e r t i e sa n d t h ee n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t sd e g r a d a t i o no fl a c c a s ew e r es t u d i e d m o r e o v e r , t h e i v 中山大学博士学位论文 e n z y m ep r o t e i nw a sr e f o r m e db yd i r e c t e de v o l u t i o nt e c h n o l o g y t h em a i nf i n d i n g s w e r ea sf o l l o w s ： w eh a v ec o n s t r u c t e dam e t a g e n o m i c sl i b r a r yf r o mm a n g r o v es o i l ，a n di s o l a t e da n e wl a c c a s eg e n ef r o mi tb yf u n c t i o n a ls c r e e n i n g t h i sl a c c a s eg e n ew a sd e s i g n a t e d l a c 5 9 1 ，w h i c he n c o d e d5 0 0 a m i n oa c i dp e p t i d e sw i t ht h ef u l ll e n g t ho f15 0 0 b p i t s p r e d i c t e dm o l e c u l a rm a s si s5 7 4k d a ab l a s ts e a r c hi nt h ed a t a b a s e so fn c b i r e v e a l e dt h a tt h el a c c a s el a c 5 91h a dt h ef o u rc o p p e r i n gd o m a i n s c o m p a r i n gt h e d e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e sw i t ho t h e rl a c c a s es e q u e n c e sf i o mv a r i o u so r g a n i s m s o u r c e ss h o w e dt h a tam e d i u mh o m o l o g yw i t hb a c t e r i u ml a c c a s e sa n dt h eh i g h e s t h o m o l o g yo ft h ea m i n oa c i ds e q u e n c e sw a s5 2 b e t w e e nt h el a c c a s eo fb a c u l l u s h a l o d u r a n sc - 12 5a n dl a c 5 91 t h en u c l e o t i d es e q u e n c ed a t ar e p o r t e dh e r eh a v eb e e n d e p o s i t e di nt h e n u c l e o t i d es e q u e n c ed a t a b a s e su n d e ra c c e s s i o nn u m b e r ( g q 4 6 8 31 3 ) t h en e wl a c c a s eg e n el a c 5 9 1w a sa m p l i f i e dv i ap c i la n dt h e nw a sl i g a t e di n t o e x p r e s s i o n v e c t o rp e t 一3 2 “+ ) ，a n dt r a n s f o r m e di n t oec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t h e t r a n s f o r m a n t sw a si n c u b a t e da t3 0o cf o rm o r et h a n8hw i t h1 0m mi p t ga n do 2 5 m mc u s 0 4o ft h ef i n a lc o n c e n t r a t i o na d d e dt oi n d u c et a r g e tp r o t e i ne x p r e s s i o n t h e h i g h e s te x p r e s s i o nl e v e lo f l a c 5 9 1w a sa b o u t3 8 0m g l ，w h i c hw a sh i g h e s te x p r e s s i o n l e v e lo fl a c c a s eg e n er e p o r t e d a n dr e c o m b i n a n te n z y m ed i s p l a y e dd i f f e r e n ts p e c i f i c a c t i v i t yt os e v e r a lc l a s s i c a ls u b s t r a t e sa sf o l l o w s ：12 7 3u m g ( 2 ，6 - d m p ) ，5 4 3u m g ( c 【- n a p h t h 0 1 ) ，7 3 5u m g ( c a t e c h 0 1 ) ，1 0 2u m g ( g u a i a c 0 1 ) ，o 51u m g ( s g z ) ，a n d 0 15u m g ( a b t s ) t h em o l e c u l a rm a s so fr e c o m b i n a n tl a c 5 91 p u r i f i e dw a s7 5 4 k d ab ys d s p a g ea n a l y s i s ( i n c l u d i n ga i ln t e r m i n a lf u s i o no f15 6a m i n oa c i d s ， a b o u t18k d a ) c o m b i n i n gw i t ht h er e s u ko fn a t i v e - p a g ea n a l y s i s ，t h er e c o m b i n a n t l a c 5 91w a st h o u g h tau n i m e r l a c 5 91s h o w e da na l k a l i n ep ho p t i m u mf o ra l lt e s t e d s u b s t r a t e ss u c ha sg u a i a c o l ( p h7 5 ) ，a b t s ( p h 7 4 ) ，2 ，6 - d m p ( p h 8 0 ) ，s g z ( p h 8 0 ) ， n - n a p h t h o l ( p h 8 2 ) ，a n dc a t e c h o l ( p h 9 o ) m o r e o v e r ，t h ee n z y m ew a sf o u n dt ob e s t a b l ei nt h ep hr a n g eo f7 0 - 10 0 ( t o w a r dg u a i a c 0 1 ) i tc o n f i r m e dt h a tl a c 5 91w a sa l l a l k a l i n el a c c a s e w i t hg u a i a c o la sas u b s t r a t e t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ef o rt h ee n z y m e w a s5 5o c ，a n dt h ee n z y m ew a ss t a b l e ( 7 0 f o r3 0m i n ) u n d e r5 0o c ( t o w a r d g u a i a c 0 1 ) t h ee f f e c to fd i f f e r e n tm e t a li o n so nt h el a c 5 9 1a c t i v i t yw a si n v e s t i g a t e d w h e na d d e da tl o wc o n c e n t r a t i o n s ( 1m m ) ，c a 2 + a n df e 2 + i n c r e a s e dt h ee n z y m a t i c a c t i v i t yt o15 0 a n d14 0 ，w h i l em n 2 + ，m 9 2 + ，c 0 2 + ，n a + ，a n dk + s l i g h t l yd e c r e a s e d t h ee n z y m a t i ca c t i v i t ya n dn i + ，z n 2 + a n da 1 3 + d e c r e a s e dt h ee n z y m a t i ca c t i v i t yt o7 7 ， 55 a n d6 8 w h e na d d e da th i g hc o n c e n t r a t i o n ( 10 0m m ) ，c a 2 + e n h a n c e dt h e v a b s t r a c t e n z y m ea c t i v i t ym a r k e d l y , a n dt h ee n z y m ea c t i v i t yr e a c h e du pt o2 - 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n a p h t h o l g u a i a c o l s g z a b t sa c c o r d i n gt ot h e i r k k m v a l u e m o r e o v e r ，t h ed e g r a d a t i o no fr e c o m b i n a n tl a c 5 9 1t oe n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t s w a sa l s oi n v e s t i g a t e d w i t ha d d t i o no fc a + a n dh b t ( o ra b t s ) ，l a c 5 91c o u l d d e c o l o u r i z eb a s i cb l u e3 ( 2 5 ) ，m e t h y l e n eb l u e ( 11 ) ，b r o m o p h e n o lb l u e ( 5 7 ) ， c r y s t a lv i o l e t ( 6 0 ) ，r b b r ( 3 7 ) a n da c i dv i o l e t7 ( 1 0 ) t h el a c c a s el a c 5 9 1 d e g r a d a t e di n d i g oc a r m i n et o 10 0 w i t h6 0m i n m o r e o v e r ，w i t hh b t ( o ra b t s ) a d d e d l a c 5 91e n h a n c e di t sd e g r a d a t i o nr a t et ol i g n i n - a l k a l iu pt o1 1 w i t h14h t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a tl a c 5 91 h a dp o t e n t i a la p p l i e dv a l u eo fd e g r a d a t i n g e n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t s t b e c a u s ee n z y m a t i ca c t i v i t yo ft h el a c c a s el a c 5 91w a sl o w e r , l a c 5 9 1g e n ew a s r e f o r m e db yd i r e c t e de v o l u t i o nt e c h n o l o g y r a n d o mm u t a t i o n sw e r ei n t r o d u c e d t h r o u g ht h r e er o u n do fe r r o r p r o n ep c r ，a n dm u t a n t sw e r es c r e e n e db ya s s a y i n gt h e i r a c t i v i t i e st o w a r d st h ep h e n o l i cs u b s t r a t eg u a i a c 0 1 a m o n gt h e m , am u t a n t ( 3 t 9 3 ) w i t h t h eh i g h e s ta c t i v i t ys h o w e df o u rm u t a t i o n s ( n 4 0 s ，v 5 5 a , f 6 2 l ，a n de 316 v ) ， c o m p a r e dw i t ht h ew i l dt y p e ，t h es p e c i f i ca c t i v i t yo ft h em u t a n te n z y m ei n c r e a s e dt o 4f o l d ( 4 1 0u m g ，t o w a r dg u a i a c 0 1 ) o r4 8f o l d ( 6 1 2 2u r a g ，t o w a r d2 ，6 - d m p ) o f t h a to ft h ew i l dt y p e m o r e o v e r ，t h em u t a n t s3 t 9 3s h o w e dm a x i m u ma c t i v i t ya t6 0 。c ， h i g h t e rt h a nt h a to fw i l dt y p et o5 。c ，a n dt h ep hv a l u ef o ro p t i m a la c t i v i t yw a s i n c r e a s e dt o8 0f r o m7 5 ( t o w a r dg u a i a c 0 1 ) b u ta l lt h r e em u t a n t ss h o w e ds i m i l a r t e m p e r a t u r ea n dp hp r o f i l e st o t h a to ft h ew i l dt y p e i na d d i t i o n , t h ed e g r a d a t i o n a b i l i t yo fl a c 5 9 1a n di t sm u t a n te n z y m ef o rs e v e r a li n d u s t r i a ld y e sw a si n v e s t i g a t e d ， a n dt h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h ea c t i v i t yo fm u t a n te n z y m el a c 3 t 9 3t o w a r d sb a s i c b l u e3 ，m e t h y l e n eb l u e ，b r o m o p h r n o lb l u ea n dc r y s t a lv i o l e tw a si n c r e a s e dt o2 6 ， 中山大学博士学位论文 5 5 ，7 9 a n d8 3 ，a n dl a c 3 t 9 3a l s oc l e a r l yd i s p l a y e dh i g h e rd e c o l o r i z a t i o nr a t e t o w a r di n d i g oc a r n m i n e ( 10 0 d e c o l o r i z a t i o nr a t ea f t e r4 0m i n ) ，c o m p a r i n gw i t ht h a t o fw i l dt y p e ( 10 0 d e c o l o r i z a t i o nr a t ea f t e r6 0m i n ) a l s o ，m u t a n te n z y m el a c 3 t 9 3 e n h a n c e di t sd e g r a d a t i n gl i g n i n - a l k a l iw a si n c r e a s e dt o1 5 3 f r o m1 1 t h er e s u l t s s h o wt h a te r r o r p r o n ep c ro fd i r e c t e de v o l u t i o nt e c h n o l o g yi sa ne f f e c t i v em e t h o dt o i n c r e a s ee n z y m a t i ca c t i v i t ya n dd e g r a d a t i o na b i l i t yt oi n d u s t r i a lp o l l u t a n t s i ns u m m a r y , t h en o v e ll a c c a s ew a sf o u n di n m e t a g e n o m i c sl i b r a r y l a c 5 9 1 e x h i b i t sn o v e le n z y m a t i cc h a r a c t e r i s t i c si n c l u d i n gh i g h l ys ol u b l ee x p r e s s i o ni nec o l i g o o dt h e r m a ls t a b i l i t ya n dh i g ha l k a l i n ep ho p t i m u m , a n dt h el a c c a s eh a dt h ea b i l i t y o fd e g r a d a t i n gi n d u s t r i a ld y e sa n dl i g n i n ，w h i c hi sh i g h l ya d v a n t a g e o u sf o ri n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n s m o r e o v e r , i ti sa l s oi m p o r t a n ti nb e i n gau s e f u lr e f e r e n c ef o re x p l o r a t i o n o fo t h e ri m p o r t a n tf u n c t i o n a lg e n e sf r o mm a n g r o v em i c r o b e s k e yw o r d s ：m e t a g e n o m i cl i b r a r y ，l a c c a s e ，c h a r a c t e r i s t i c so fe n z y m e ，d e g r a d a t i o n , d i r e c t e de v o l u t i o n i 中山大学博士学位论文 a b t s a m p b p 2 6 d m p d n a e d t a h h b t i p t g k t k m kd a l b m m l o d p c r p h 印m s s d s s g z 1 r i s u p l v 缩略词 2 ，2 - a z i n o b i s - ( 3 - e t h y l b e n z t h i a z o l i n e 一 6 - s u l p h o n i ca c i d ) a m p i c i l l i n b a s ep a i r 2 ，6 - d i m e t h y l p h e n o l d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d h o u r h y d r o x y b e n z o t r i a z o l e i s o p r o p h y lt h i o - p - d - g a l a c t o s i d e c a t a l y t i cr a t ec o n s t a n t m i c h a e l i s m e n t e ne q u i l i b r i u m k i l o d a l t o n l a u r i ab r o t hm e d i u m n o i l m i l l i l i t e r o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o t e n t i a lo fh y d r o g e n r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e s e c o n d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s y r i n g a l d z i n e u n i t m i c r o l i t e r v o l t 1 4 3 2 ，2 连氮基双( 3 乙基苯并 二氢噻唑啉6 磺酸) 二铵盐 氨苄青霉素 碱基对 2 ，6 二甲基苯酚 脱氧核糖核酸 乙二胺四乙酸 小时 羟基苯并三唑 异丙基硫代一p d 一半乳糖苷 催化速率常数 米氏常数 千道尔顿 l a u r i a 肉汤培养基 摩尔升 毫升 光密度 聚合酶链式反应 酸碱度 转| 食钠 秒 十二烷基磺酸钠 丁香醛连氮 三羟甲基氨基甲烷 单位 微升 伏特 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容 外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品 成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以 明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：叶找 日期：g 沙( d 年名月印日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论 文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复 制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位 论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其 他方法保存学位论文。 篱篙警蒡焉篙氏言篓葛砗鹣麓日期劬o 年6 月厂。日 日期：力。f 砗6 月c 日 中山大学博士学位论文 1 1 漆酶 第1 章前言 漆酶( 1 a c c a s e ，e c1 1 0 。3 2 ) 是一类含铜的多酚氧化酶，与抗坏血酸氧化酶和 哺乳动物血浆铜蓝蛋白同源，都属于蓝色多铜氧化酶家族( b a l d r i a n2 0 0 6 ； m o r o z o v ae ta 1 2 0 0 7 ) 。漆酶是最简单的多铜氧化酶。 1 1 1 漆酶的来源 漆酶最早发现于日本紫胶漆树( r h u sv e r m e r f e r a ) 的分泌物p ( y o s h i d a1 8 8 3 ) 。 随后人们发现漆酶广泛存在于自然界中，分布于多种植物( h u t t e r m a n ne ta 1 2 0 0 1 ； 丛汉卿