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中山大学硕士学位论文 腰带长体茧蜂多胚发育及整合素p 亚基在其 胚胎增殖中的功能研究 硕士生：王鹏 专业：动物学 导师：胡建副教授 摘要 多胚发育是一种独特的发育模式，一个卵可以分裂产生许多遗传上相同的胚 胎。目前关于多胚发育的研究大多集中在膜翅目昆虫一跳小蜂科的佛州点缘跳小 蜂( c o p i d o s o m af l o r i d a n u m ) 上。然而，只对这一种物种进行多胚发育研究，很难 发现这种奇特的发育方式中保守的发育机制，也很难研究它在进化上是如何出现 的。因此我们研究了膜翅目茧蜂科内另一种多胚发育的昆虫腰带长体茧蜂 ( m a c r o c e n t r u sc i n g u l u m ) 的发育过程。此外，在分子水平上对多胚发育中胚胎的 增殖机制做了一些初步探究，目前国内外对这方面的研究还不深入。 腰带长体茧蜂是一种多胚发育的幼虫内寄生蜂，通常寄生一个或几个卵到 寄主亚洲玉米螟( o s t r i n i af u r n a c a l i s ) 幼虫体内，最终它的一个卵可以产生几 十头蜂。本文主要通过解剖寄主幼虫观察茧蜂的胚胎，并结合胚胎培养和胚胎移 植研究了mc i n g l u l u m 的多胚发育过程，另外也通过扫描电镜观察了一些胚胎的 细致特征。研究发现，腰带长体茧蜂胚胎的发育主要分为卵裂期、胚胎增殖期和 形态发生期。茧蜂的卵细胞进入寄主体内首先发生卵裂，接着卵细胞被分离为多 个初级胚胎细胞，它们单独发育为多个二级桑葚胚。二级桑葚胚又分裂为多个二 级胚胎细胞，每个二级胚胎细胞随后可以进入形态发生阶段从而形成蜂的幼虫。 通过胚胎移植实验发现，二级胚胎细胞具有极强的增殖能力，它可以分化进入形 态发生阶段，也还可以重新形成二级桑葚胚。从发育过程来看，二级桑葚胚分裂 为多个二级胚胎细胞，并且它们每一个可以最终发育为一头蜂幼虫，这是形成多 胚发育的一个重要原因。通过与跳小蜂多胚发育模式的比较，我们发现它们早期 胚胎发育都经过大量胚胎的隔离，因此我们推测胚胎隔离是造成多胚发育产生的 王鹏腰带长体茧蜂多胚发育及整合素p 亚基在其胚胎增殖中的功能研究 主要原因。 整合素是一类跨膜蛋白，它是由a 和p 亚基组成的异二聚体。整合素的功 能非常广泛，它在调控细胞增殖中起重要作用，其中b 亚基的功能更为重要。本 文初步研究了整合素d 亚基在茧蜂胚胎增殖中所起的作用。采用r a c e 方法克 隆了腰带长体茧蜂中整合素1 3 亚基的全长基因，整合素1 3 亚基基因开放阅读框全 长2 5 2 6 b p ，编码8 4 1 个氨基酸；利用荧光定量p c r 检测了整合素d 在各胚胎发 育时期的表达情况，研究发现整合素p 亚基m r n a 在卵细胞、初级胚胎和二级 胚胎中都有转录，在卵细胞中有相对较高的表达，而在初级胚胎和二级胚胎内表 达相对较低并且相近；进一步利用r n a 干扰的方法研究整合素对茧蜂胚胎增殖 的影响，将体外合成整合素1 3 亚基的d s r n a 注射到寄生后的玉米螟体内，发现 最终出蜂数量相对于对照显著降低，表明整合素在调节多胚发育胚胎增殖过程中 起重要的作用。 关键词：腰带长体茧蜂；亚洲玉米螟；多胚发育；胚胎增殖；整合素；r n a 干 扰 中山大学硕士学位论文 s t u d i e so nt h ep o l y e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t a n dt h ef u n c t i o n so fi 墨- i n t e g r i ni ne m b r y o s p r o l i f e r a t i o ni nm a c r o c e n t r u sc i n g u l u m a b s t r a c t n a m e ：w a n gp e n g m a j o r ：z o o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f h uj i a n e r v l s o r o： p o l y e m b r y o n yi sau n i q u em o d eo fd e v e l o p m e n tt h a ti n v o l v e st h ep r o d u c t i o no f m u l t i p l eg e n e t i c a l l yi d e n t i c a le m b r y o sf r o mas i n g l ee g g t od a t e ，t h em a j o r i t yo f r e p o r t sr e g a r d i n gp o l y e m b r y o n i cd e v e l o p m e n to r i g i n a t ef r o mt h es t u d yo fo n e p a r a s i t o i ds p e c i e s ，c o p i d o s o m a f l o r i d a n u m ( h y m e n o p t e r a ：e n c y r t i d a e ) h o w e v e r , i ti s d i f f i c u l tt od i s c r i m i n a t ec o n s e r v e dd e v e l o p m e n t a lp r o c e s s e sf r o ms p e c i e s s p e c i f i c d e v e l o p m e n t a li n n o v a t i o na n dd i f f i c u l tt os t u d yt h ed e v e l o p m e n t a li n n o v a t i o ni n e v o l u t i o ni fo n l yo n es i n g l em o d e lw a sf o c u s e do n t h e r e f o r e ，t h ep o l y e m b r y o n i c d e v e l o p m e n to fm a c r o c e n w u sc i n g u l u m ( h y m e n o p t e r a ：b r a c o n i d a e ) w a ss t u d i e di n t h i st h e s i s f u r t h e r m o r e ，t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo np r o l i f e r a t i o n so fe m b r y o si n p o l y e m b r y o n yh a sn o ty e tb e e ns t u d i e di n t e n s i v e l yu n t i ln o w , s oi tw a se x p l o r e di n t h i st h e s i st o o m c i n g u l u mi sa ne n d o p a r a s i t i cw a s p ，w h i c hu s u a l l yd e p o s i t so n ee g g ( s ) i n t ot h e h e m o c o e lo ft h el a r v ao fo s t r i n i a f u r n a c a l 括a n dg i v e s r i s et od o z e n so fw a s p sf i n a l l y w es t u d i e dt h ee m b r y o n i cd e v e l o p m e n t a ls t a g e sb yd i s s e c t i n gt h ed f u r n a c a l 括a n d c u l t i v a t i n gt h ee m b r y o so ft h ew a s p nv i t r o ，a n dt r a n s p l a n t i n gw a s p se m b r y o si n t o u n p a r a s i t i z e ddf u r n a c a l 妇l a r v a e i na d d i t i o n ，s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) i su s e dt oo b s e r v ed e l i c a t ef e a t u r e so fs o m ee m b r y o s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e d e v e l o p m e n to fmc i n g u l u mw a sc o m p r i s e do ft h r e em a i np h a s e s ：e a r l yc l e a v a g e s ， t h ep r o l i f e r a t i v ep h a s e ，a n dt h em o r p h o g e n e t i cp h a s e t h ee g go fw a s pf i r s t l yf o r m e d p r i m a r ym o u r l ab yc l e a v a g e ，t h e nt h ep r i m a r ye m b r y o n i cc e l l sw a ss e p a r a t e df r o m i i i p r i m a r ym o r u l ab ys p l i to fc h o r i o n e a c hp r i m a r ye m b r y o n i cc e l ld e v e l o p e di n t oo n e s e c o n d a r ym o r u l a ，a n dt h e ns e c o n d a r ye m b r y o n i cc e l l sw e r ef o r m e db ys p l i to ft h e s e c o n d a r ym o r u l a t h e ne a c hs e c o n d a r yc e l lw e n ti n t om o r p h o g e n e s i sa n dd e v e l o p e d i n t oal a r v ao fw a s p r e s u l t sf r o me m b r y ot r a n s p l a n t a t i o ni n d i c a t e dt h a tt h es e c o n d a r y e m b r y o n i cc e l l sc o u l dp r o l i f e r a t ea c t i v e l ya n de i t h e rt oi n i t i a t em o r p h o g e n e s i so rt o p r o d u c em o r es e c o n d a r ym o r u l a i nt e r mo ft h ep o l y e m b r y o n i cd e v e l o p m e n to fw a s p ， t h es e c o n d a r ym o r u l as p l i ti n t om a n ys e c o n d a r ye m b r y o n i cc e i l sa n de a c h c o u l d d e v e l o pi n t oal a r v ao fw a s p ，w h i c hi st h em a i nc a u s et op o l y e m b r y o n yi nw a s p c o m p a r e dw i t hcf l o r i d a n u mi nd e v e l o p m e n t a lp a t t e m ，mc i n g u l u mu n d e r w e n t s e g r e g a t i o n so fe m b r y o sa l s oi ne a r l ye m b r y o n i cd e v e l o p m e n t ，s ow es p e c u l a t e dt h a t t h es e g r e g a t i o n so fe a r l ye m b r y o sl e dt ot h ep o l y e m b r y o n y i n t e g r i n sa r et r a n s m e m b r a n eh e t e r o d i m e r sc o m p o s e do fa a n dps u b u n i t s ，a n dp s u b u n i tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nr e g u l a t i n gc e l lp r o l i f e r a t i o n t h e r e f o r e ，s t u d i e so n t h ef u n c t i o n so f1 3 - i n t e g r i nd u r i n gt h ep r o l i f e r a t i o no fe m b r y o sw e r ep r o c e e d e di nt h i s t h e s i s t h eg e n eo f1 3 - i n t e g r i nw a sc l o n e df r o mmc i n g u l u mb yr a c em e t h o d s ，a n di t s h o w st h a tt h i sg e n eh a sa no r f ( o p e nr e a d i n gf l a m e ) o f2 5 2 6b pe n c o d i n ga n8 4 1 a m i n o - r e s i d u a lp r o t e i n t h ee x p r e s s i o nl e v e lo f1 3 - i n t e g r i nw a ss t u d i e di nd i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a ls t a g e sb yr e a l t i m ep c r r e s u l t si n d i c a t e dt h a t1 3 - i n t e g f i nm r n a s w e r ee x p r e s s e dr e l a t i v e l yh i g h e ri ne g g sa n dr e l a t i v el o w e ra n ds i m i l a ri np r i m a r y e m b r y o n i cc e l l sa n ds e c o n d a r ye m b r y o n i cc e l l s f u r t h e r m o r e ，t h ef u n c t i o n o f p - i n t e g r i ni nr e g u l a t i n gt h ee m b r y o sp r o l i f e r a t i o ni nt h ed e v e l o p m e n to fm c i n g u l u m w a ss t u d i e db yr n ai n t e r f e r e n c e ( r n a i ) t e c h n i q u e t h ed s r n ao f1 3 - i n t e g r i nw a s p r e p a r e d nv i t r o ，a n dt h e n i tw a si n j e c t e di n t ot h eb o d yo fp a r a s i t i z e dh o s tt o u n d e r s t a n di t se f f e c to nt h eq u a n t i t yo fw a s p so f f s p r i n g s r e s u l t si n d i c t e dt h a tt h e q u a n t i t yo fw a s p so f f s p r i n g sw a sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yi nd s r n ai n j e c t e dl a r v a e i n c o n c l u s i o n ，1 3 - i n t e g r i n ss h o u l dp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nr e g u l a t i n gt h ep r o l i f e r a t i o no f e m b r y o si nmc i n g u l u m k e yw o r d s ：m a c r o c e n t r u sc i n g u l u m ，o s t r i n i af u r n a c a l i s ，p o l y e m b r y o n y , e m b r y o s p r o l i f e r a t i o n ，i n t e g r i n ，r n ai n t e r f e r e n c e i v 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成 果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明 确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：粥 日期：劲朋、莎乡 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文 的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制 并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论 文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他 方法保存学位论文。 作者签名：粥 导师签名： 抑之 日期：矽d 乡；7 日期： 加、口f 轧 中山大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 多胚发育研究概况 1 1 1 多胚发育研究历史及现状 多胚发育是指一个卵细胞经过分裂产生许多遗传上相同的胚胎。多胚发育的 现象最早在在植物中被发现，1 8 9 8 年m a r c h a l 在膜翅目昆虫中发现了多胚产生 的现象，因此他把多胚发育的概念首次引入到动物界( i v a n o v a - k a s a s ，1 9 7 2 ) 。在动 物界中，多胚发育可以分为两种：偶然性的多胚发育和专一性的多胚发育。偶然 性的多胚发育是指胚发育中偶然会有多胚产生，它在水螅、环节动物、昆虫、鱼 类、鸟类、哺乳类( 包括人) 等很多物种中都有发现，说明单胚发育中有调节发 育产生多胚的能力( i v a n o v a - k a s a s ，1 9 7 2 ；c r m ge ta 1 ，1 9 9 7 ；g r b i c ，2 0 0 3 ) 。专一性多 胚发育是指胚胎发育中必定产生多胚的发育方式，它主要发生在昆虫、苔藓虫类、 寄生性的扁虫、水螅和哺乳动物的犰狳等物种中( 表1 1 ) 。本论文中讨论的多胚 发育是指动物界中的专一性多胚发育。 下面简要介绍这些物种的多胚发育概况。 ( 1 ) 水螅类 水螅可以通过无性生殖出芽产生许多遗传上相同的个体，因此把水螅类的发 育也称作多胚发育。在c u n i n a p r o b o s c i d e a 水螅中，大的雌性水母体产生的卵可 以受精后发育也可以进行孤雌发育。受精卵发育为g a m m a 幼虫，最后发育为矮 的雄性水母体；没有受精的卵发育为a l p n a 幼虫，它可以经多胚发育( 出芽增殖) 产生b e t a 幼虫，这两种幼虫都可以发育为矮的雌性水母体( b e l l ，1 9 8 2 ；c r a i ge ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。另外一个例子是寄生在淡水鱼的卵中的淡水水螅p o l y p o d i u mh y d r i f o r m e 。 它的卵靠吸收鱼卵内的营养物质发育成一个生殖体，生殖体通过克隆增殖产生几 十个芽，这些芽逐渐长出腔肠体和触手。最终这些芽从生殖体中分裂出来，因此 产生了较多的水螅个体( s l i o b o s k i na n db o s s e r t ，1 9 9 1 ) 。 ( 2 ) 扁虫 一些外寄生和内寄生的扁形虫都可以进行多胚发育。在外寄生的 王鹏腰带长体茧蜂多胚发育及整合素p 亚基在其胚胎增殖中的功能研究 g r y o d a c o d u se l e g a n s 中，一个无卵黄的受精卵在母体子宫内发育。它不均等分裂： 在第一个胚胎内部产生第二个胚胎，第三个胚胎在第二个内部产生，第四个在第 三个内部产生。第二个胚胎在第一个胚胎从母体释放后才完成发育，而释放的胚 胎无需长大便可以长出子代胚胎。用这种方式，一个扁虫可以在3 0 天内产生上 千个子代。一些内寄生的扁形虫在寄主体内完成世代交替，如e c h i n o c o c c u s g r a n u l o s u s ( 细粒棘球绦虫) 中，许多育囊在棘球蚴囊中通过出芽产生，这些育 囊又通过出芽产生成成千上万的绦虫( n o b l ee ta 1 ，1 9 8 9 ；c r a i ge ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 表1 - 1 多胚发育在动物界中的分布( 引自c r a i ge ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 t a b l e 1 - 1d i s t r i b u t i o no fp o l y e m b r y o n yi nt h ea n i m a lk i n g d o m ( f r o mc r a i ge ta 1 ， 1 9 9 7 ) ( 3 ) 根头目甲壳动物 根头目甲壳动物属于藤壶的一个寄生性的目，它有高度可变的生活周期。在 p o x o t h y l a c u s p a n o p a e i 中，注射入寄主体内的寄生体一段时间后可分解为多个细 胞，它们分散到寄主血浆中，它们有些可以发育为中间体，它们之中通常会有一 个发育为大的有性外体，它最终胚胎增殖发育为多个幼体( c r a i ge ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 2 中山大学硕士学位论文 ( 4 ) 圆口苔藓虫 圆口苔藓虫可以形成几个被称为生殖体的生育腔，而其它的苔藓虫每个个体 只能形成一个生育腔。生殖体中的卵细胞受精后，一个或两个初级胚胎经过多次 分裂产生一百多个二级胚胎，二级胚胎继续分裂又继续分裂产生上百个三级胚胎 ( g l e n n e ra n dh o e g ，19 9 5 ；c r a i ge ta 1 ，19 9 7 ) 。 ( 5 ) 棘皮动物 在海星类动物中它们可以通过幼体的克隆进行生殖。它们可以进行两种方式 的无性生殖：一种是通过自组织产生口前叶，口前叶接着产生体腔和肠道：另一 种通过出芽产生，它们在长到囊胚或原肠胚时被释放，接着长成新的个体( j a e c k l e ， 1 9 9 4 ) 。 ( 6 ) 犰狳 犰狳是目前唯一知道在哺乳动物中进行专一性多胚发育的物种。在九带犰狳 中，它通过早期胚胎的两次分裂，从而最终专一性的产生相同的四胞胎( c y r a n o s k i ， 2 0 0 9 ) 。然而，不同的犰狳产生多胚的能力有所不同，如在十二带犰狳中就能产 生八胞胎( c r a ge ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 ( 7 ) 昆虫 多胚发育在昆虫中分布最多，对多胚发育的研究也主要集中在昆虫中。目前 已知的可以进行多胚发育的昆虫分布在膜翅目和捻翅目。在膜翅目昆虫中，主要 发生在跳小蜂科、茧蜂科、广腹细蜂科和螯蜂科中。膜翅目昆虫大多是寄生蜂， 它是目前发现含有多胚发育物种最多的一个目，而其中跳小蜂科的佛州点缘跳小 蜂( c o p i d o s o m af l o r i d a n u m ) 是研究的最为详细和深入的一个物种，实际上它也是 目前多胚发育研究中唯一的一个代表性模型。接下来将对佛州点缘跳小蜂的多胚 发育研究进行详细阐述。 1 1 2 佛州点缘跳小蜂的多胚发育 佛州点缘跳小蜂寄生鳞翅目昆虫粉纹夜蛾( t r i c h o p l u s i an i ) ，它从卵到幼虫都 在在宿主体内渡过，因而它的多胚发育跟宿主的发育进程紧密联系在一起( 如图 1 1 ) 。佛州点缘跳小蜂多胚发育主要分为三个过程： ( 1 ) 早期胚胎发育 佛州点缘跳小蜂的卵呈梨形并有明显的极性，通常认为相对较窄的一段为前 于鹏腰带长体茧蜂多胚发育及_ 蜷合素b 亚基在其胚胎增殖中的功能研究 端，对应的一端为后端。它的外边由一层绒毛膜包围，并在前末端形成一个柄 f g r b i ce t a l ，1 9 9 8 ) 。佛州点缘跳小蜂首先将卵产到粉纹夜蛾的卵内，它的卵随后 随着粉纹夜蛾卵的发育而发育。在寄生2 h 以后，跳小蜂的卵进行第一次卵裂。 第一次卵裂是不完全的卵裂沟向沿卵的前后轴延伸至卵的三分之一的长度，在 后端形成两个大小均等的卵裂球，在前端形成没有分裂的含极核的极体细胞。第 二次卵裂发生在寄生3 h 以后，一个卵裂球均等分裂为两个大小相同的子代卵裂 球，而另外一个分裂为一个太子代卵裂球和一个小了代卵裂球，这个小的卵裂球 是第一次完全的胞质分裂形成的( g r b i ee ta 1 1 9 9 8 ) 。接着这些卵裂球继续进行分 裂，然而在前三次可以认为是同步进行的，在接下来的分裂将不再同步进行( g r b i c e t 以，1 9 9 8 ) 。极体细胞只发生核分裂而不经过胞质分裂，它们不断分裂形成合胞 体并逐渐迁移覆盖分裂的分裂球，这时绒毛膜从胚胎脱落，存寄生2 4 h 后合胞体 形成完全覆盖胚胎的胚外膜。形成的有胚外膜包围的胚胎被称为初级桑旗胚，内 部细胞是接下来所有胚胎的来源。 4 砻 。一。 意茗： 篮一嘞贮瓯西 图1 - 1 佛州点缘跳小蜂与宿主的发育过程旧i 白z h u r o ve a l ，2 0 0 4 ) 。 f i g 1 - 1 t h ed e v e l o p m e n to f c f l o r i d a n u m a n d i t sh o s t ( f r o m z h u r o ve t a l ，2 0 0 4 ) ( 2 ) 胚胎增殖 在寄生后约4 8 1 1 ，初级桑葚胚的胚外膜开始向胚胎内部陷入，它不断地将 细胞分割为许多小的簇，每一簇细胞都是由胚外膜包围，这个阶段的胚胎叫做增 殖桑葚胚。每一簇包含大约2 0 - 3 0 个细胞，这每一簇又称为二级桑葚胚，它们组 中山大学硕士学位论文 合在一起称为多聚桑葚胚( d o n n e l le ta 1 ，2 0 0 4 ；z h u r o ve ta 1 ，2 0 0 7 ) 。从宿主l 龄期 到4 龄期胚胎一直在增殖，到宿主的4 龄末期会形成3 0 0 0 个二级桑葚胚，它们 能独立的发育为幼虫( g o r d o na n ds t r a n d ，2 0 0 9 ) 。研究发现胚胎的这种巨大的增殖 能力跟宿主体内的一些细胞因子和桑葚胚产生的特定因子有关( c o r l e ye ta 1 ， 2 0 0 5 ) 。 在宿主的1 龄到4 龄阶段，大约3 0 6 0 个二级桑葚胚在胚胎增殖阶段形态发 生产生早熟幼虫，而其它大多数的二级桑葚胚会在宿主的5 龄期形态发生发育为 可育幼虫。早熟幼虫的主要功能就是防御种间的竞争者和调节最终蜂幼虫性别 比，它们在宿主5 龄的时候会随着宿主营养的消耗完而死亡( g r b i ce ta 1 ，1 9 9 2 ； h a r v e ye t a l ，2 0 0 0 ；g i r o ne ta 1 ，2 0 0 4 ) 。胚胎发育中早熟幼虫和可育幼虫这两种等 级的出现，跟早期细胞细胞分裂中v a s a 蛋白的分布有关，含有v a s a 的二级桑葚 胚发育为可育幼虫，不含v a s a 的二级桑葚胚发育为早熟幼虫( d o n n e l le ta 1 ，2 0 0 4 ； z h u r o ve ta 1 ，2 0 0 4 ；g o r d o na n ds t r a n d ，2 0 0 9 ) 。 ( 3 ) 形态发生为可育幼虫 桑葚胚在宿主的4 龄初期结束增殖，这时二级桑葚胚开始形态发生。胚胎内 部圆形的胚胎细胞变得伸长并且紧密的连接在一起，它们形成一个没有胚孔囊 胚。接下来胚胎原基沿胚胎前后轴延伸并向内部凹陷，从而形成胚胎的背沟，它 将胚胎未来的的头和尾分开，但这时胚胎卷曲着使头和尾相隔的很近。跳小蜂具 有长胚带类型，随着胚胎发生原肠作用，前端形成头的结构和后端形成尾的结构， 胚胎也开始分节( g r b i ce ta 1 ，1 9 9 6 a ；g r b i c ，2 0 0 3 ) 。最后胚带拉伸，胚胎由卷曲变 得平直，头和尾也明显的被分开。跳小蜂具有长胚带类型，随着胚胎分节的完成， 最终形成完整的幼虫( g r b i ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 1 1 3 佛州点缘跳小蜂多胚发育与其它发育模式的比较 1 1 3 1 多胚发育与单胚发育昆虫的区别 跳小蜂的多胚发育跟其它昆虫的单胚发育有一些明显的不同( g r b i ce ta 1 ， 1 9 9 8 ；g r b i c ，2 0 0 0 ) 。第一，大多数昆虫卵细胞含有大量卵黄，卵细胞在细胞化之 前先形成一个合胞体；而跳小蜂的卵细胞缺乏卵黄，并且在第二次卵裂之后就完 全开始了细胞化( g r b i ee ta 1 ，1 9 9 6 a ) 。第二，大多数昆虫的极体通常会退化而不 参与胚胎发育，而跳小蜂的极体形成桑葚胚的胚外膜，并且它的内陷分割形成了 5 王鹏腰带长体茧蜂多胚发育及整合素p 亚基在其胚胎增殖中的功能研究 许多的二级桑其胚。跳小蜂的胚外膜可能跟胚胎吸收宿主内的营养有关。第三， 跳小蜂的增殖胚阶段在其它昆虫的单胚发育中没有对应阶段。第四，大多数昆虫 胚胎的形态发生是在卵黄表面形成的胎盘上进行，而跳小蜂形成一个紧密的没有 胚孔的囊胚( g r b i ce ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 1 1 3 2 多胚发育与哺乳动物发育的相似性 跳小蜂的多胚发育跟哺乳动物的早期胚胎发育有一些同源性和相似性( g r b i c e ta 1 ，1 9 9 8 ；g r b i c ，2 0 0 0 ) 。第一，跳小蜂第一次卵裂就决定了未来胚胎发育命运， 两个卵裂球发育为未来的所有胚胎组分，极体细胞发育为胚外膜；哺乳动物在囊 胚阶段决定了未来胚胎的发育命运，内细胞团发育为胚胎，滋养层细胞发育为胎 盘。第二，跳小蜂的胚胎外面包有胚外膜，它通常吸附于宿主内的脂肪体和气管 的组织上吸收营养，哺乳动物胚胎外面有滋养层胎盘，它们吸附于子宫内吸收母 体的营养。第三，在胚胎形态发生时它们都经过了胚胎的压缩。第四，哺乳类的 犰狳也能进行专一性的多胚发育 1 1 4 其它昆虫多胚发育研究概况 目前除了佛州点缘跳小蜂外，其它昆虫的多胚发育都研究的较少。捻翅目昆 虫进行多胚发育通常进行胎生，它们通常形成一个羊膜腔，然后在其内部羊膜上 产生较多的生殖带，从而进行多胚发育( i v a n o v a - k a s a s ，1 9 7 2 ) 。膜翅目昆虫中除了 跳小蜂科中的佛州点缘跳小蜂外，目前大多数的报道都集中在2 0 世纪初期，多 是发现了某种昆虫可以进行多胚发育，但具体的发育过程大都了解的很少。广腹 细蜂科中的广腹细蜂通常将卵产入宿主的卵内进行发育，每头宿主可能产生2 1 5 头蜂。广腹细蜂的胚胎也具有胚外膜，并通过它分隔胚胎细胞来完成胚胎的增殖 ( s t r a n da n dg r b i c ，1 9 9 7 ) 。螯蜂科中的鳌峰将卵产入宿主的幼虫体内进行发育，每 头宿主可产生5 0 头蜂( s t r a n da n dg r b i c ，19 9 7 ) 。茧蜂科中对多胚发育也了解的很 少，最早对长体茧蜂中m a c r o c e n t r u sg i f u e n s i s 的多胚发育做过研究，它通过胚胎 的分裂产生较多胚胎从而完成多胚发育，但一些具体过程没有介绍( p a r k e r , 1 9 3 1 ) ，另外在m a c r o c e n t r u sa n c y l i v o r u s 中也发现能进行多胚发育( d a n i e l ，1 9 3 2 ) 。 腰带长体茧蜂的胚胎发育最近得到初步研究，但整个发育过程了解的还不够详 尽，尤其早期的胚胎发育( 胡建，2 0 0 8 ) 。 6 中山大学硕士学位论文 1 2 整合素在细胞增殖过程中的作用 整合素( i n t e g r i n ) 是一种保守的跨膜蛋白，在许多动植物的细胞表面都有表 达。它是类重要的细胞粘连分子，参与细胞与细胞及细胞与基质之间的相互作 用。整合素作为跨膜蛋白，就如同细胞膜上的一座桥梁，通过与细胞内外的蛋白 相互作用介导了细胞由内向外( i n s i d e o u ts i g n a l i n g ) 和由外向内( o u t s i d e i n s i g n a l i n g ) 的信息传导过程( a m a o u te la 1 2 0 0 7 ) 。整合素参与细胞内许多信号反应， 从而调控了许多的生命活动。整合素在细胞增殖过程中起重要调控作用，它主要 通过调控细胞的周期、细胞的分裂及细胞的存活来调节细胞的增殖。 1 2 1 整合素的结构特点 整合素是一种跨膜蛋白，由a 和d 两种亚基通过非共价交联组成异二聚体。 整合素非常保守，在多种物种中都有表达，如哺乳动物、昆虫、鱼类和线虫等。 在人和小鼠的细胞中存在1 8 种a 亚基和8 种1 3 亚基，它们组成2 4 种不同的整合 素如a l d l 、a 2 d l 、a v e 3 等，并行使是不同的功能( h y n e s ，2 0 0 2 ；b a r c z y ke ta 1 ， 2 0 1 0 ) 。在果蝇中，已经发现有5 种a 亚基( a p s l 5 ) 和2 种p 亚基( 1 3 p s ，p v ) ，组成 至少三种整合素( h u m p h r i e se ta 1 ，2 0 0 6 ) 。在配体识别中最重要的结构域为i 结构 域( a 结构域) ，整合素中存在两种i 结构域，一种是0 l i ，存在于人体的8 个a 亚 基中：另一种是b i ，存在于人体的所有b 亚基中。因此，人体中的整合素有的存 在两种i 结构域( 值i 和p i ) ，有的只具有一种i 结构域( j 3 i ) 。a i 和p i 结构域的顶端 都有一个金属离子依赖性粘连位点( m i d a s ) ，它可以与金属离子结合，并导致其 构象的变化，引起整合素结合配体能力的变化( a r n a o u t e ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 整合素的结构分为胞外区、跨膜区和胞内区。以缺少q i 结构域的a v l b 3 为例( 图 1 - 2 a ) ，胞外区0 c v 含有四个结构域：n 端组成螺旋状的7 个b 折叠片，类i g 的t h i g h 结构域，两个大的p 三明治结构域c a l f - 1 和c a l f - 2 ；b 3 亚基含有8 个结构域：从外 到内依次为：p i 结构域( h e a d ) ，类i g 的h y b r i d 结构域，n 端富含半胱氨酸的p s i 结 构域，四个类e g f 结构域，接近细胞膜的f l t d ( t a i l ) 结构域( o h a s b e r ge t a ，2 0 0 5 ； a r n a o u te ta 1 ，2 0 0 7 ；l u oe la 1 ，2 0 0 7 ) 。胞# 1 - 区q hj 3 i 结构域是主要的配体结合位点， 它跟细胞外基质的主要成分纤连蛋白和层粘连蛋白和胶原等结合，还可以同其它 细胞的细胞间粘附分子( i n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l e ，i c a m ) 和e 钙粘素 7 十鹏腰带长体茧蜂多胚笈育及整合素1 3 亚基在其胚胎增殖中的功能研宄 ( e - c a d h e r i n ) 等结合( h u m p h n c se l a l ，2 0 0 6 ) 。跨膜区为单跨膜蛋白，大约有2 4 2 9 氨基酸组成( g i n s b e r ge l a l ，2 0 0 5 ) 。胞内区的区域比胞外区短( 肛除外) ，它们没有 催化活性，只能与l l i | 胞内的蛋白结合米嗣节整合素的状态，包括细胞骨架成分和 激酶如黏着斑激酶( f o c a la d h e s i o nk i n a s e ，f a k ) 、整合素连接激酶( i n t e g r i n l i n k e d k i n a s e ，i l k ) 和g t p a s e 等。与胞内区结合的骨架蛋白有踝蛋白( t a l i n ) 、黏着斑蛋白 ( v i n e u l i n ) 、a 辅肌蛋e q ( a - a c t i n i n ) 、黏着斑蚩白( f i l a m i n ) 等( w i e s n e re ta 1 2 0 0 5 ； a m a o u te t a l ，2 0 0 7 ) 。目前为止发现胞内区域中的b 亚基同细胞的信号蛋白发生 更多的相互作用，从而引起细胞月架的变化或信号传导。 图l - 2 整合素的结构( a ) 和整合素的激活( b ) ( 引自l u oa n ds p f i n g e l2 0 0 6 ) 。 f i g 1 - 2 t h es t r u c t u r eo f i n t e g r i n ( n ) a n da c t i v a t i o no f i n t e g r i n ( b ) ( f r o m l u oa n d s p r i n g e l2 0 0 6 ) 1 2 2 整合素的激活及信号传导 整合素作为跨膜受体介导由细胞内向细胞和细胞外向细胞内的外双向信号 传导，信号的传导首先需要整合素的激活。整合素的激活是指整合素由低亲和状 中山大学硕士学位论文 态转变为高亲和状态，整合素的构像也随之改变( 如图1 - 2 b ) 。低亲和状态时， 整合素的a 、p 亚基的跨膜区相互交联，跨膜区较长，由2 9 个氨基酸组成，并且0 【 跨膜区末端的精氨酸( a r g ，r ) 与p 跨膜区末端的天冬氨酸( a s p ，d ) 形成盐桥；整合素 被激活时，整合素的仅、p 亚基的跨膜区相互分离，跨膜区变短，由2 4 2 5 个氨基 酸组成，其它4 5 氨基酸暴露到胞质中，盐桥也被打断( g i n s b e r ge ta l ，2 0 0 5 ) 。在 整合素激活的过程中，胞外区的构象发生较大变化，由类似于双腿的弯曲构象变 为伸展构象( l u oe ta 1 ，2 0 0 7 ；r o c c oe l 讲，2 0 0 8 ) 。整合素的激活可由胞外信号激 活：整合素与细胞外基质或其他配体结合后，引起整合素的聚簇，整合素构像改 变，使盐桥也随之断开，整合素被激活；整合素也可由胞内信号激活：细胞内的 t a l i n 被活化后与整合素的胞质中的p 亚基末端结合，造成c 与p 跨膜区分离，盐桥 断开，整合素被激活( g i n s b e r ge ta 1 ，2 0 0 5 ；l u oa n ds p r i n g e r , 2 0 0 6 ) 。实际上这两个 方向信号并不是孤立的，而是紧密连合在一起的。整合素激活后增加配体结合力， 从而产生胞内到胞外的信号通路。相反，配体结合又能引起胞外向胞内的信号传 导( s h a t t i le ta 1 ，2 0 10 ) 。 激活的整合素通常首先激活与体内的相连的两类多功能的激酶：f a k 和i l k ， 它们再激活其下游分子，从而调控细胞的活动。粘着斑激酶是细胞质中的非受体 酪氨酸蛋白激酶，它磷酸化后能够跟许多蛋白结合女i s r c 激酶家族、g t p a s e 家族 等。f a k 活化后与s r c 相互激活，f a k s r c 活化后可以激活r a s ，接着r a s 激活下游 m a p k 级联反应，从而调控细胞的增殖和分化。f a k s r c 还可以激活r a c ，再依 次激活下游p a l ( 和j n k ，它们磷酸化核内的转录因子如：e - j u n 、a t f 2 、e l k 1 和p 5 3 等，从而调节细胞凋亡等相关基因的表达( g i a n c o t t ia n dr u o s l a h t i ，1 9 9 9 ； p a r s o n s ，2 0 0 3 ) 。f a k 还可以通过p i p 3 k a k t 通路，然后激活n f r , b 、p 3 8