（微生物学专业论文）平菇菌体蛋白饲料菌种筛选研究.pdf

中文摘要一i 英文摘要。i i i l 引言1 1 1 菌体蛋白饲料1 1 1 1 生产菌体蛋白的微生物及不同微生物生产出菌体蛋白的优缺点1 1 1 2 对菌体蛋白饲料的营养性评价一2 1 1 3 菌体蛋白饲料的优点和缺点2 1 1 4 菌体蛋白饲料的安全性。3 1 1 5 国内外菌体蛋白生产的发展3 1 2 利用秸秆做饲料的优势5 1 2 1 作物秸秆的营养。5 1 2 2 利用秸秆制作菌体蛋白饲料时对秸秆的处理方法5 1 3 应用白腐真菌生产菌体蛋白的优势6 1 4 利用畜禽粪便做饲料的可行性7 1 4 1 富禽粪便的营养分析。8 1 4 2 畜禽粪便作为饲料应用8 1 4 3 畜禽粪便应用做饲料的方法9 1 5 应用固体发酵的可行性1 0 1 6 利用白腐真菌接种堆肥化后的基质的作用机制1 0 1 7 原生质技术在培育食用菌新品种上的应用1l 1 8 本研究的目的和意义1 l 1 9 本试验的技术路线1 2 2 材料与方法1 4 2 1 供试材料1 4 2 1 1 供试菌种1 4 2 1 2 供试培养基1 4 2 1 - 3 供试试剂1 4 2 2 试验方法1 5 2 2 1 对2 8 种异源菌种的初筛15 2 2 2 对1 7 种异源侧耳的模糊综合评价1 5 2 2 3 单核菌丝的制各l6 2 2 4 单核菌丝的杂交1 7 2 2 5 平菇菌种在不同碳源上的长势优化1 7 2 2 6 制作菌体蛋白饲料的培养基质配方的优化1 8 2 2 7 利用不同菌株生产菌体蛋白饲料的指标综合分析1 9 3 结果与分析2 2 8 一 帆7 一 一 录! ： 东北农业大学理学硕士学位论文 3 1 对2 8 种菌种的拮抗试验2 2 3 2 利用模糊概率法进行分析2 4 3 2 1 干重。2 4 3 2 2 粗蛋白含量2 4 3 2 3 漆酶活性2 5 3 2 4 日均生长量2 5 3 2 5 评价对象集的确定。j 。2 6 3 2 6 利用模糊综合法分析2 7 3 3 原生质制备条件的优化2 9 3 3 1 酶解温度2 9 3 3 2 溶壁酶浓度3 0 3 3 3 酶解时间3 0 3 3 4 平菇菌种的培养天数3l 3 3 5 正交试验的方差分析3 l 3 3 6 验证实验3 3 3 4 原生质体的制备3 4 3 5 单核菌丝的判定3 4 3 6 单核菌丝的杂交3 5 3 6 1 双核菌丝的判定3 5 3 6 2 拮抗试验的结果3 6 3 6 3 出菇的验证试验3 7 3 7 基质配方的优化3 7 3 7 1 菌丝在三种料上的长势观察3 7 3 7 2 腐熟度的表观评价3 8 3 7 3 完全试验的结果3 8 3 8 不同平菇菌种生产菌体蛋白饲料的指标4 l 3 8 1 粗蛋白含量4 1 3 8 2 漆酶活性4 l 3 8 3 纤维素酶活4 2 3 8 4 日均生长量。4 2 3 8 5 对1 8 种异源平菇的模糊综合评定。4 3 4 讨论4 7 4 1 利用模糊综合分析法的探索4 7 4 2 原生质体制备条件的优化4 7 4 3 原生质体的制备4 8 4 4 单单杂交的结果- 4 8 4 5 基质配方的优化4 9 5 结论5 0 l i 目录 致谢5l 参考文献。5 2 攻读硕士学位期间发表的学术论文。5 6 i i i c o n t e n t s c o n t e n t s c h i n e s ea b s t r a c t i e n g l i s ha b s t r a c t i i i 1i n t r o d u c t i o n 一l 1 1o s t r e a t u sp r o t e i nf e e d l 1 1 1m i c r o o r g a n i s m sf o ro s t r e a t u sp r o t e i np r o d u c t i o na n dt h e i ra d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g el 1 1 2n u t r i t i o n a la s s e s s m e n to fo s t r e a t u sp r o t e i nf e e d 2 1 1 3a d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so f o s t r e a t u sp r o t e i nf e e d 2 1 1 4s a f e t yo fo s t r e a t u sp r o t e i nf e e d 3 1 1 5 d o m e s t i ca n da b r o a dt h ed e v e l o p m e n to f s i n g l ec e l lp r o t e i np r o d u c t i o n 3 1 2a d v a n t a g e so fu s i n gs t r a wa sf e e d 5 1 2 1c r o pn u t r i t i o n 5 1 3 2u s eo fs t r a wt op r o d u c es i n g l ec e l lp r o t e i nf e e dw h e ns t r a wa p p r o a c h 。5 1 3a d v a n t a g e so fu s i n gw h i t e - r o tf u n g it op r o d u c t s i n g l e - c e l lp r o t e i n 一6 1 4u s eo f a n i m a lm a n u r ea sf e e dt h ef e a s i b i l i t y 7 1 4 1a n a l y s i so fl i v e s t o c km a n u r en u t r i e n t 8 1 4 2a p p l i c a t i o no f a n i m a lm a n u r ea sf e e d 8 1 4 3a p p l i c a t i o no f a n i m a lm a n u r ea sf e e dm e a n s 9 1 5f e a s i b i l i t yo f a p p l i c a t i n gs o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n 1 0 1 6u s eo f w h i t e - r o tf u n g ia f t e ri n o c u l a t i o nc o m p o s t i n gs u b s t r a t em e c h a n i s m 1 0 1 7p r o t o p l a s tt e c h n o l o g yi nc u l t i v a t i n gn e wv a r i e t i e so f m u s h r o o m 1 l 1 8p u r p o s eo f t h es t u d ya n ds i g n i f i c a n c e ll 1 9o v e r a l ld e s i g no f t h ee x p e r i m e n t 1 2 2m a t e r i a i sa n dm e t h o d s 1 4 2 1m a t e r i a l s 1 4 2 1 1s t r a i n sf o rt h et e s t 1 4 2 1 2s u b s t r a t ef o r t h e t e s t 1 4 2 1 3r e a g e n t so f t e s t 1 4 2 2m e t h o d s 11 ； 2 2 1s c r e e n i n go f h e t e r o l o g o u s2 8s t r a i n s 1 5 2 2 2f u z z yc o m p r e h e n s i v ee v a l u a t i o no fp l e u r o t u so f17k i n d so fd i f f e r e n ts o u r c e s 。15 2 2 3p r e p a r a t i o no f s i n g l e - c o r eh y p h a e 1 6 2 2 4m o n o k a r y o nh y b r i d i z a t i o n 1 7 2 2 5t h eo p t i m i z a t i o no f 尸e u r x ) t u ss t r a i n sg r o w t hi nd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e s 1 7 2 2 6o p t i m i z a t i o no f m e d i u mt op r o d u c to f o s t r e a t u sp r o t e i nf e e df o r m u l a t i o n 1 8 v l 东北农业大学理学硕士学位论文 2 2 7p r o d u c t i o no fo s t r e a t u sp r o t e i nu s i n gd i f f e r e n ts t r a i n so fac o m p r e h e n s i v ea n a l y s i so ft h e n u t r i t i o n a lv a l u eo f f e e d 1 9 3r e s u l t sa n da n a l y s i s 2 2 3 1r e s u l t so f a n t a g o n i s t i ct e s to f 2 8s t r a i n s 2 2 3 2r e s u l t so f t h ea n a l y s i so fp r o b a b i l i t ym e t h o du s i n gt h ef u z z y 2 4 3 2 11 p 恬i g h t 一2 4 3 2 ：! c r u d ep r o t e i nc o n t e n t 2 4 3 2 3l a c c a s ea c t i v i t y 2 5 3 2 4g r o w t ho f a v e r a g ed a i l yv o l u m e 2 5 3 2 5e v a l u a t i o no f t h ed e t e r m i n a t i o no f o b j e c ts e t 2 6 ：；2 6u s i n gf u z z yc o m p r e h e n s i y ea n a l y s i s 2 7 3 3o p t i m i z a t i o no fp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n sp r o t o p l a s m 2 9 3 3 1t e m p e r a t u r eo fh y d r o l y s i s 2 9 3 ：；2c o n c e n t r a t i o no f l y w a l l z y m e 3 0 3 3 3t i m eo f e n z y m o l y s i s 3 0 3 3 4c u l t i v a t i o no f p l e u r o t u so s t r e a t u ss t r a i n 3 1 3 3 5a n a l y s i so fv a r i a n c eo r t h o g o n a lt e s t 31 3 3 6v e r i f i c a t i o ne x p e r i m e n t 3 3 3 4p r e p a r a t i o no fp r o t o p l a s t 3 4 3 5f o u n d i t i o no f t h es i n g l e c o r em y c e l i m 3 4 3 6r e s u l t so f s i n g l e h y b r i d i z a t i o n 3 5 3 6 1f o u n d i t i o no f d u a l c o r em y c e l i a l 3 5 3 6 2r e s u l t so f a n t a g o n i s t i ct e s t 3 6 3 6 3f r u i t i n gv e r i f i c a t i o nt e s t 3 7 3 7m a t r i xf o r m u l m i o no p t i m i z a t i o n 3 7 3 7 1o b s e r v a t i o no fg r o w t ho fh y p h a ea tt h r e ek i n d so fm a t e r i a l 3 7 3 7 2e v a l u a t i o no f a p p a r e n tm a t u r i t y 3 8 3 7 3r e s u l t so f c o m p l e t et e s t 3 8 3 8a s s e s s e dt h en u t r i t i o n a lv a l u eo f d i f f e r e n tm u s h r o o ms t r a i n so f o s t r e a t u sp r o t e i nf e ：e d 一4 1 3 。8 1c o n t e n t i o no f c r u d ep r o t e i n 4 1 3 8 2l a c c a s ea c t i v i t y 4 1 3 8 3c e l l u l a s ea c t i v i t y 4 2 3 8 4g r o w t ho f a v e r a g ed a i l yv o l u m e 4 2 3 8 5f u z z yc o m p r e h e n s i v ee v a l u a t i o no fl8k i n d so f d i f f e r e n ts o u r c e so s t r e a t u s 4 3 4d i s c u s s i o n s 4 7 4 1e x p l o r eo fu s eo ff u z z yc o m p r e h e n s i v ea n a l y s i sm e t h o d 4 7 4 2o p t i m i z a t i o no f p r o t o p l a s t 4 7 4 3p r e p a r a t i o no f p r o t o p l a s t s - 4 8 v i l l 1 c o n t e n t s 4 4r e s u l t so f s i n g l e h y b r i d i z a t i o n 4 8 4 5o p t i m i z a t i o nm a t r i xf o r m u l a t i o n 。4 9 5c o n c l u s i o n s 。5 0 a c k n o w l e d g e m e n t 一51 r e f e r e n c e s 5 2 a r t i c l ep u b l i s h e dd u r i n gt h ed e g r e eo fm a s t e r 5 6 v i i j j 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获 ( 洼；麴遗查甚丝霞塞犍别童盟的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日期：知勿年月9 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 日期：劫年办近日 导师签名坪够考醐：彩形月o r-r-rt：il 摘要 摘要 我国是农业大国，农业和畜牧业的产值占我国的国民生产总值很大的比率，自从我国加 入世贸组织后，各行各业得到了高速的发展，在畜牧业的发展上也暴露了我国是饲料资源短 缺的国家。早在1 9 世纪的早期，国外就已经大力开发新的饲料能源和原材料，寻求蛋白饲料 的代替品和新型的蛋白饲料的开发更是重中之重。本试验通过菌化发酵后的粪秸秆料，制作 粗蛋白含量较高的饲料，不但改善了秸秆的适口性，而且一定程度上也改善了由畜禽粪便所 造成严重的环境污染的现状。 本试验首先通过拈抗试验对搜集来的2 8 种菌种进行初筛，得出1 7 种异源菌种；利用模糊 综合分析法对1 7 种异源菌种的干重、长速、粗蛋白含量和漆酶活性进行分析，选出杂交的亲 本；通过单核菌丝杂交的方法进行菌种的杂交，得出平菇杂交菌株a 0 7 1 3 ：然后将a 0 7 1 3 接到 优化的基质中，将杂交菌株的营养指标和1 7 种异源菌种进行综合分析，从而确定出制作菌体 蛋白饲料的优良的品种和适合的基质配方。 试验结果如下： 1 ) 用拮抗法从搜集来的2 8 株菌种中初步筛选出1 7 株异源菌种，然后利用模糊综合分析 法初步研究了1 7 种菌株的优劣；更合理更客观的从菌丝体的干重、菌丝日均长速、粗蛋白含 量、长势几个因素上分析出菌种的优劣。 2 ) 从营养合理、长速较快的角度选出两株异源菌株进行杂交，利用正交试验得出菌龄为 5 天的平菇，其原生质在2 8 下，用1 5 的溶壁酶进行处理3 小时释放的量最大，可以达到 3 6 x 1 07 个m l ，而后利用原生质技术中的单单杂交方法对两种异源菌株进行了杂交，经过菌 丝的镜检；a 0 7 1 3 与亲本的拮抗试验：a 0 7 1 3 的出菇试验基本可以判断出融合成功。 3 ) 利用杂交出来的菌株a 0 7 1 3 的进行培养基质的优化，通过对不同碳源、氮源、石膏 添加量的分析，利用添加氮源的种类和百分含量与石膏量的三个水平的添加量进行完全试验， 可以得出平菇菌种在适量的添加鸡粪和牛粪时都可以生长，由于氮源的加入在鸡粪添加6 时的长势明显高于对照，但是当湿度为6 5 ，鸡粪添加量高于1 2 时菌丝长势缓慢。不能够 长满培养料。在添加牛粪的培养基质中在湿度为6 5 ，添加量为1 5 时从蛋白含量、生长速 度、漆酶活性、菌丝浓密显示出了优势，可以判断为合理配方。 4 ) 用1 8 种不同的平菇菌株处理基质，得出在综合的评定上a 0 7 1 3 杂交菌株表现效果最好， 但是粗蛋白含量黑平王最高，纤维素酶活性为澳黑最高。 关键词发酵；菌体蛋白；平菇；玉米秸秆；鸡粪 a b s t r a c t s t u d yo ns c r e e n i n gs t a i n sf o rm a k i n g p l e u r o t u s o s t r e a t u sp r o t e i nf e e d a b s t r a c t c h i n ai sa b i ga g r i c u l t u r a lc o u n t r y , a g r i c u l t u r ea n da n i m a lh u s b a n d r yo u t p u tv a l u ea c c o u n t sf o r m u c ho fc h i n a sg r o s sn a t i o n a lp r o d u c tr a t i o ，s i n c ec h i n a sa c c e s s i o nt ot h ew t o , a l lw a l k so fl i f e h a v eb e e nr a p i dd e v e l o p m e n t s ，a n dw i t ht h ed e v e l o p m e n to fa n i m a lh u s b a n d r yh a sa l s oe x p o s e d o u rc o u n t r yi st h en a t i o n as h o r to ff e e dr e s o u r c e s a s e a r l ya st h e19 t hc e n t u r yn e we n e r g ya n dr a w m a t e r i a lf e e dh a db e e nd e v e l o p e dv i g o r o u s l yo v e r s e a s ，a n ds e a k i n gs u b s t i t u t ef o rp r o t e i nf e e da n d d e v e l o p i n gn e wp r o t e i nf e e db et h et h et o pp r i o r i t y t h e r e b yt h ec r u d ep r o t e i nc o n t e n to fs t r a wa n d t h ep a l a t a b i l i t yo fs t r a ww i l lb ei m p r o v e d m o r e o v e r , m a n u r ei su s i n gt om a k em a t r i x ，s ot h e p o l l u t i o nc a u s e db ya n i m a lm a n u r em a y b ei m p r o v e dt os o m ee x t e n t f i r s to fa l l ，t h i sp i l o tt e s ts c r e e n e do u t17h e t e r o l o g o u ss t r a i n sf r o mt h ec o l l e c t e d2 8s t a i n s a n dt h e nu s i n gf u z z yc o m p r e h e n s i v ea n a l y t i c a lm e t h o dc o m p a r e dt h e mb yt h ed r yw e i g h t , d a yl o n g f a s t , c r u d ep r o t e i nc o n t e n t , g r o w i n gt oo b t a i nt h eo b j e c to fh y b r i dp a r e n t s b ym o n o c y t es t r a i n s h y b r i d i z a t i o nm e t h o dd e r i v e dh y b r i ds t r a i no fa 0 7 1 3 t h e np l a n t i n ga 0 7 1 3i no p t i m a lm a t r i x ，a n d m a k i n gc o m p r e h e n s i v ea n a l y s i si nt h en u t r i t i o ni n d i c a t o r so fh y b r i ds t r a i n sa n d17h e t e r o l o g o u s s t r a i n st od e t e r m i n et h eg o o ds p e c i e sa n df i t i n gm a t r i xf o rs t a i n sp r o t e i nf e e dp r o d u c t i o n t h er e s u l t so fe x p e r i m e n t ： 1 ) f i r s tt os c r e e nt h ec o l l e c t e d2 8h y p h a sa n di n i t i a l l ys c r e e n i n go u t17h e t e r o l o g o u ss t r a i n s f o rt e s t t oe n s u r et h eh e t e r o l o g o u s ，a n dt h e nu s i n gf u z z yc o m p r e h e n s i v ea n a l y t i c a lm e t h o d p r e l i m i n a r i l ys t u d yt h es u p e r i o ra n di n f e r i o ro f17h y p h a e s ，m o r er e a s o n a b l ea n dm o r eo b j e c t i v e a n a l y z e dt h e2 8h y p h a sf r o mt h ed r yw e i g h t , d a yl o n gf a s t ，c r u d ep r o t e i nc o n t e n ta n dg r o w i n g 2 ) b yt i m eo fe n z y m et r e a t m e n t , e n z y m et r e a t m e n tt e m p e r a t u r ea n de n z y m ec o n c e n t r a t i o n c h o o s e dt w oh e t e r o l o g o u ss t r a i n s h y b r i dt h i st w ok i n d sh e t e r o l o g o u sh y p h a e s ，a r e rm i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n ，w ef o u n da g eo f5d a y s ，t h e i rp r o t o p l a s t sa t2 8 ，u s i n g1 5 l y w a l l z y m e ，i n3h o u r s t op r o c e s s ，w ec a ng o tr e l e a s eo f3 6 x1 07 m l ，a n dt h e np r o t e s ta n dt h ea n t a g o n i s mt e s tb e t w e e n d i f f e r e n ts t r a i n s t h o u g hm i c r o s c o p et e s t ；a n t a g o n i s t i ct e s tw i t hp a r e n t s ；f r u i t i n go fs t r a i na 0 713 ，c a n b a s i c a l l yd e t e r m i n et h es u c c e s so fi n t e g r a t i o n 3 ) t h r o u g ht h e d i f f e r e n tc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e so p t i m i z a t i n gt h em e d i u mf o rs t r a i n s a 0 7 1 3 ，a n a l y s i s i n gt h ea m o u n to fg y f s u ma d d e d o nt h r e el e v e l sf u l lt e s tu s i n gt h et y p ea n d p e r c e n t a g eo fa d d e dn i t r o g e na n dg y p s u mc o n t e n ts h o w e dt h a tm u s h r o o ms t r a i n sc a ng r o wi nt h e r i g h ta m o u n to fc h i c k e nm a n u r ea n dc o wd u n ga d d e d d u et ot h ec h i c k e nm a n u r et oa d dn i t r o g e n 6 t h eh y p h ai sg r o w i n gs i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h ec o m p a r i s o n 。b u tw h e nt h eh u m i d i t yi s6 5 ， c h i c k e nm a n u r ea b o v e12 ，h y p h ag r o w i n gv e r ys l o w l y , d on o tt h r i v e ，n o tb ec o v e r e di nt r a i n i n g m a t e r i a l s a d dc o wd u n gi nt h em a t r i xa tt h eh u m i d i t yo f6 5 ，i t sa d d i n g15 s h o w e da l l i i i a d v a n t a g ef r o mt h ep r o t e i nc o n t e n t ，g r o w t hr a t e ，l a c c a s ea c t i v i t y , h y p h a et h i c kc a l lb e j u d g e d 邪a r e a s o n a b l ef o r m u l a 4 ) i nc o m p r e h e n s i v ea s s e s s m e n to ft h ep e r f o r m a n c et h ea 0 713h y b r i ds t r a i ni st h eb e s ta m o n g 18d i f f e r e n ts t r a i n s ，b u tt h eh e ip i n g w a n gh i g h e s ti nt h ec r u d e p r o t e i nc o n t e n t ，a n da oh e ih 船m e t o pc e l l u l a s ea c t i v i t y k e y w o r d sf e r m e n t a t i o n ；o s t r e a t u sp r o t e i n ；p l e u r o t u so s t r e a t u s ；c o r ns t a l k s ；c h i c k e nm a n u r e i v c a n d i d a t e ：s u nl e i s p e c i a l i t y ：m i c r o b i o l o g y s u p e r v i o r ：p r o f x ux i u h o n g 引言 1 引言 1 1 菌体蛋白饲料 蛋白质是生命的基本物质，在一切生命过程中起着决定性的作用。蛋白质有植物蛋白、 动物蛋白和菌体蛋白( 郭正初，1 9 9 8 ) 。所谓菌体蛋白，又称微生物蛋白，一般是指酵母、 非病源性细菌、微型菌、真菌等单细胞生物体内所含的蛋白质，是由各种氨基酸组成的复合 物，其中蛋白质含量为4