（有机化学专业论文）含氨基功能基三23二溴丙基异氰脲酸酯半抗原的合成.pdf

， i i i iiii lli ii i i iui iiil 19 0 7 3 0 7 s y n t h e s i so fh a p t e n sf o rt r i s ( 2 , 3 - d i b r o m o p r o p y l ) i s o c y a n u r a t e c o n t a i n i n ga m i n of u n c t i o ng r o u p b y p a nc h e n g ju n b e ( n o r t h e a s tf o r e s t r yu n i v e r s i t y ) 2 0 0 8 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e e o f m a s t e ro fs c i e n c e l n o r g a n i cc h e m i s t r y i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o ra nd e l i e m a y ，2 0 1 1 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何 其它个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法 律后果由本人承担。 作者签名：；零房覃 日期：z 。，年占月ze l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编 本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名： 乏蒡讲辱 导师签名：嬲 ，r l 7 日期：二d ，年石月2e l e l 期：纱，年g 月2 日 硕士学位论文 摘要 持久性有机污染物( p o p s ) 是一类具有毒性、难降解、且能在生物体内蓄积并 通过生物链进行长距离迁移的所有有机化合物的总称。p o p s 的存在严重威胁人类 的生存繁衍和可持续发展。近年来，研究表明人工抗原不仅可以在医学上用来治 疗疾病，同时还可以用来检测农药残留物。将半抗原分子通过直接或者间接的方 式与载体蛋白质( 大分子) 耦合得到的抗原分子可以诱导动物细胞产生针对该半抗 原分子的特异性抗体。基于该原理，一种新的分析检测方法免疫检测方法近年来 得到了快速的发展。与传统的分析检测方法( 例如，色谱方法) 相比，该方法可以 在短时间内对大量样品进行快速、灵敏的检测。 - - ( 2 ，3 - 二溴丙基) 异氰脲酸酯( t r i s ( 2 ，3 d i b r o m o p r o p y l ) i s o c y a n u r a t e ，以下简称 t b c ) 是一种六溴杂环阻燃添加剂，该物质不易降解，热稳定，且能够在生态系统 中长期聚集，损害人体的身体健康，污染生态环境，具有持续性有机污染物的性 质。 t b c 属于有机小分子，本身不具备免疫特性，也不能诱导动物细胞产生抗体， 因此，在t b c 的免疫检测研究中，设计与合成能够与载体蛋白质结合的t b c 半 抗原分子显得尤为关键。为了探讨半抗原的分子结构与抗体质量的关系，最终优 化出最佳的分子结构，本论文做了如下两个方面研究： ( 1 ) 采用分子内的重排反应得到中间体化合物3 ，并且优化了反应的条件，使 得其产率提高到6 9 ，接着采用w i l l i a m c n s o n 成醚反应，亲核取代反应，溴化反 应，还原反应等较高产率的合成了4 种含有芳香氨基的半抗原分子，引入氨基官 能团是因为载体蛋白质含有羧基官能团，半抗原上的氨基可以与羧基通过肽键结 合成半抗原分子，合成不同长度连接臂的半抗原分子可以探讨连接臂的长度对抗 原和抗体性能的影响。 ( 2 ) 采用g a b r i e l 反应合成了不含苯环的脂肪胺半抗原分子。由于苯环分子的 存在改变了母体分子的化学结构，会影响最终抗体的灵敏性，因此为了研究苯环 结构对最终抗体分子灵敏性的影响，本论文还设计与合成了一系列不含苯环的脂 肪胺半抗原分子。 关键词：半抗原；三( 2 ，3 一二溴丙基) 异氰脲酸酯；t b c ；合成 h 含氨基功能基三( 2 , 3 - - - 溴丙基) 异氰脲酸酯半抗原的合成 a b s t r a c t p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ( p o p s ) i sak i n do ft o x i co r g a n i cc o m p o u n d sw h i c h c a ne x i s ti nt h ee n v i r o n m e n tf o ral o n gt i m ea n dt r a n s p o r tal o n gd i s t a n c ei nt h e e n v i r o n m e n t t h ee x i s t e n c eo ft h e s ec o m p o u n d sp o s e sa d v e r s ee f f e c tt oh u m a n b e i n g s a n de c o s y s t e m r e c e n ta d v a n c e si nt h er e s e a r c ho fa r t i f i c i a la n t i g e nh a v es h o w nt h a t a r t i f i c i a la n t i g e n sc a nb eav a l u a b l ea p p r o a c hf o rt h et r e a t m e n to fs o m ed i s e a s e sa s w e l la st h ed e t e c t i o no fp e s t i c i d er e s i d u e s b yc o u p l i n gh a p t e n st oa na p p r o p r i a t e d c a r r i e r ，a r t i f i c i a la n t i g e nc a ni n d u c ea n i m a l st op r o d u c eh a p t e n - s p e c i f i ca n t i b o d y b a s e do nt h i sp r i n c i p l ean e wa n a l y t i c a lm e t h o d ，i m m u n o l o g i c a la n a l y s i sh a sb e e n r e c e n t l yd e v e l o p e d c o m p a r e dt ot h ec o n v e n t i o n a la n a l y t i c a lt e c h n o l o g i e s ，s u c ha s c h r o m a t o g r a p h i cm e t h o d s ，t h i sm e t h o do f f e r sa na l t e r n a t i v ew i t hh i g hs p e c i f i c i t y s e n s i t i v i t yf o rt h ea n a l y s i so fal a r g en u m b e ro fs a m p l e si na s h o r tt i m e t r i s ( 2 , 3 - d i b r o m o p r o p y l ) i s o c y a n u r a t e ( t b c ) i sah e t e r o c y c l i ch e x a b r o m i n a t e d a d d i t i v ef l a m er e t a r d a n tt h a tp o s s e s st h et y p i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fp e r s i s t e n to r g a n i c p o l l u t a n t s ( p o p s ) ，w h i c hi sr e s i s t a n tt op h o t o d e g r a d a t i o n ，d u r a b l e ，a n dt h e r m a l l y s t a b l ea n dh a sa d v e r s ee f f e c tt ot h ee c o s y s t e m sa n dh u m a nh e a l t h t b ci sas m a l lo r g a n i cc o m p o u n dw h i c hi s n o n i m m u n o g e n i c h e n c e ，i ti s n e c e s s a r yt od e s i g na p p r o p r i a t ec h e m i c a ls t r u c t u r e st h a tc a nb ec o v a l e n t l yc o u p l e dt o ac a r r i e rp r o t e i n i no r d e rt of i n dt h eh a p t e ns t r u c t u r e sa n da c t i v i t yr e l a t i o n s h i po ft h e f i n a la n t i b o d y , w ea r ec o m m i t t e dt ot h ef o l l o w i n gt w or e s e a r c h e s ： f i r s t l y ，i n t e r m e d i a t ec o m p o u n d3w a ss y n t h e s i z e dv i ai n t r a - r e a r r a n g e m e n t r e a c t i o na n dt h ey i l e dw a so p t i m i z e dt o6 9 ，t h e nt h ef i r s ts e r i e so fh a p t e n sw i t h a r o m a t i cf u n c t i o ng r o u pf o rt b ch a v eb e e ns u c c e s s f u l l yo b t a i n e dv i aw i l l i a m e n s o n e t h e r r e a c t i o n ，n u c l e o p h i l i cs u b s t i t u t i o nr e a c t i o n ，b r o m i n a t i o n ，g a b r i e lr e a c t i o n ， r e d u c t i v er e a c t i o n t h er e a s o nf o ri n t r o d u c i n ga m i n et ot h es t r u c t u r ei st h a ti tc o u l d r e a c tw i t hc a r b o x y l i cg r o u po ft h ep r o t e i nc a r r i e rt of o r mp e p t i d eb o n d w ed e s i g n e d f o u rh a p t e n sf o rt b cw i t hd i f f e r e n tl e n g t ho fa l k y lc h a i n si no r d e rt of i n dh o wt h e l e n g t ho fs p a c e ra r m si n f l u e n c et h ec o n j u g a t i o no fg e n e r a t i n ga n t i g e n sa n dt h ef i n a l p r o d u c t i o no fa n t i b o d y s e c o n d l y , t h eo t h e rs e r i e sh a p t e n sw i t ha l i p h a t i cf u n c t i o ng r o u pf o rt b ch a v e b e e ns u c c e s s f u l l yo b t a i n e dv i ag a b r i e lr e a c t i o n t h e s es e r i e sh a p t e n sa r ea l lw i t h o u t a r o m a t i cr i n g s a sw ea l lk n o w , w h e nt h ea r o m a t i cr i n gw a si n t r o d u c e dt ot h et a r g e t i l l c o m p o u n d s ，i tw i l lc h a n g et h eo r i g i n a ls t r u c t u r e sw h i c hm a ya f f e c tt h es p e c i f i c i t yo f t h ef i n a la n t i b o d y i nt h i sc a s e ，w ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e dt h i ss e r i e sc o m p o u n d s w i t h o u ta r o m a t i cr i n gt of i n dt ow h a te x t e n tt h eb e n z e n er i n g a f f e c tt h ef i n a l s p e c i f i c i t y k e yw o r d s ：h a p t e n ；t r i s ( 2 ，3 - d i b r o m o p r o p y l ) i s o c y a n u r a t e ；t b c ；s y n t h e s i s i v 含氨基功能基三( 2 ，3 一二溴丙基) 异氰脲酸酯半抗原的合成 目录 学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t i l l 第1 章绪论1 1 1p o p s 研究现状1 1 1 1p o p s 的基本特征l 1 1 2 典型的p o p s 1 1 1 3 新型持续性有机污染物( p o p s ) l 1 1 4p o p s 的仪器检测分析方法3 1 1 5p o p s 的免疫检测分析方法3 1 2p o p s 半抗原分子的设计与合成5 1 2 1 衍生化合成半抗原分子6 。 1 2 2 选择类似物合成半抗原分子7 1 2 3 全合成半抗原分子1 1 1 3 影响半抗原分子质量的因素1 4 1 3 1 分子偶联点的选择1 4 1 3 2 连接臂的选择1 4 1 4 半抗原分子与载体蛋白质的偶联方法1 5 1 5 课题引入及研究内容1 6 第2 章- - ( 2 ，3 二溴丙基) 异氰脲酸酯芳香胺半抗原的合成1 8 2 1 化合物的合成路线设计1 8 2 1 1 中间体化合物4 的合成设计1 8 2 1 2t b c 芳香胺半抗原分子的合成路线设计1 8 2 1 3 含芳香胺h a p t e nl d 的合成路线设计1 9 2 2 结果与讨论2 0 2 2 1c l a i s e n 重排反应的合成研究2 0 2 2 2w i l l i a m e n s o n 成醚反应研究2 3 2 2 2 化合物谱图分析2 5 2 3 实验部分3 4 v 硕士学位论文 2 3 1 仪器和试剂3 4 2 3 2 实验步骤3 4 2 4 本章小结4 0 第3 章- - - ( 2 ，3 二溴丙基) 异氰脲酸酯脂肪胺半抗原的合成4 l 3 1t b c 脂肪胺半抗原的合成路线设计4 1 3 2 结果与讨论4 2 3 2 1g a b r i e l 反应的合成研究。4 2 3 2 2 化合物谱图分析4 5 3 3 实验部分4 9 3 3 1 仪器和试剂4 9 3 3 2 实验步骤5 0 3 3 本章小结5 4 结论5 5 参考文献5 6 附录a 化合物一览表6 3 附录b 化合物谱图6 5 致 射8 4 硕士学位论文 1 1p o p s 研究现状 第1 章绪论 持久性有机污染物( p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ，以下简称p o p s ) 是指具有毒 性、难降解、难挥发、能够在生态环境中长距离迁移并沉积，并对人类和生态系 统造成危害的有机污染物的总称。目前，除了已经被列为p o p s 的物质之外，新 型污染物( e m e r g i n gc h e m i c a l s ) 也日益受到人们的关注u 曲j 。 1 1 1p o p s 的基本特征 p o p s 具有持久( 在环境中滞留时间长，降解速度缓慢) 、长期蓄积、难挥发以 及毒性高四个显着的特性，对人体和生态环境造成严重的危害【7 母】。p o p s 物质对 生态和环境的污染，其严重性和复杂性远超过气体、重金属等物质对环境体系的 损害，许多p o p s 对生物体的健康具有致畸、致癌、致突变性，同时对生物内分泌 系统具有一定的干扰作用，直接威胁野生动物或人类的生存和繁衍，影响人体生 殖行为，可能对子孙后代造成影响【1 0 , 1 1 】。因此引起了世界各国政府、学术界、工 业界以及公众的广泛重视和关注，全球1 2 0 多个国家于2 0 0 1 年5 月在瑞典召开 部长级会议签署并于2 0 0 4 年5 月1 7 日正式生效的关于持久性有机污染物的 斯德哥尔摩公约使p o p s 成为一个重要的全球性环境问题。我国作为首批签约 国，2 0 0 7 年4 月国务院批准了中国履行( 关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩 公约) 国家实施计划，从此我国开始进行持续性有机物的研究l l 2 。 1 1 2 典型的p o p s 有机氯农药，主要包括含氯烃类、碳环或杂环化合物，常用的有机氯杀虫剂 是( 1 ) 滴滴涕( d d t ) 及其同系物；( 2 ) 六六六( h c h ) ；( 3 ) 环戊二烯类及其衍生化合 物；( 4 ) 毒杀芬及其衍生物，由于有机氯农药对生态环境造成了非常严重的影响， 我国政府已经停止在农药中使用有机氯杀虫剂。( 5 ) 二嗯英类物质，是1 7 种多氯 代二苯并对二嗯英和多氯代二苯并呋喃及1 2 种具有二嗯英毒性的多氯联苯类物 质。( 6 ) 全氟辛烷磺酸( p f o s ) 和全氟辛烷酸( p f o a ) 属于全氟有机化合物( p f c s ) ， 该类化合物具疏水、疏油的特殊性质使得其被广泛应用于工业和日用消费品中， 该类化合物具有很高的毒性以及难以降解的性质，2 0 0 9 年5 月，p f o s 在斯德哥 尔摩会议上被列入持久性有机污染物名单i lz 。 1 1 3 新型持续性有机污染物( p o p s ) 随着对持续性有机污染物( p o p s ) 研究的深入，很多具有p o p s 类似性质的有 含氨基功能基三( 2 ，3 一二溴丙基) 异氰脲酸酯半抗原的合成 机污染物，对人体和生态环境均具有潜在的威胁，许多新物质已经相继列入p o p s 名单【1 3 】。 1 1 3 1 溴代阻燃剂 溴代阻燃剂( b r o m i n a t e df l a m er e t a r d a n t s ，b f r s ) 由于阻燃效果好，是目前应 用最为广泛的阻燃剂之一，多溴联苯醚( p o l y b r o m i n a t e dd i p h e n y le t h e r s ，p b d e s ) 属于溴代阻燃剂这一大类中的一种，目前被广泛应用于建材行业，纺织工业，电 子器件领域，化工行业等，该类物质具有良好的脂溶性，阻燃效果不错，该物质 属于添加型阻燃剂，很容易释放到环境中，该类物质中的5 溴和8 溴产品已经被 列入 关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约【1 4 j 。 四溴双酚a ( t c t r a b r o m o b i s p h e n o l a ，t b b p a ) 作为一种反应型阻燃剂，是目前 使用范围最大的反应型阻燃剂，由于该物质具有与人体甲状腺激素类似的结构而 被认为有可能会干扰人体正常内分泌和新陈代谢，从而影响人的身体健康【1 5 】。目 前我国关于t b b p a 的监测和研究还处于起步阶段，相关报道较少1 1 6 j 。 六溴环十二烷( h c x a b r o m o c y c l o d o d c c a n e ，h b c d ) 是目前使用范围仅次于 t b b p a 的添加型阻燃剂，由于h b c d 在各地的环境中纷纷被检查出来，因此该 污染物引起了人们广泛的关注【15 1 。 近年来，很多新型的b f r s 在世界各地纷纷被检测出来，例如s t a p l e t o n 等在 美国一些地区发现了两种b f r s ，2 - e t h y l h e x y l 2 ，3 ，4 ，5 t e t r a - b r o m o b e n z o a t e ( t b b ) 和 b i s - ( 2 e t h y l h c x y l ) t e t r a b r o m o p h a l a t e ( t b p h ) 1 6 】。j i a n g 等人在我国首次发现了 t r i s ( 2 ，3 一d i b r o m o p r o p y l ) i s o c y a n u r a t e ( t b c ) ，该物质具有p o p s 的特性，对人体健康 和生态环境造成潜在的危险【17 1 ，同时该物质也是本论文的主要研究内容和检测对 象。 1 1 3 2 新多氯联苯和共平面多溴氯联苯 多氯联苯( p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ，p c b s ) 是传统的p o p s 物质，该物质已经 在全世界很多国家和地区被禁止使用多年，近年来，h u 等检测出p c b s 的同系物 p c b 1 1 【1 引。 1 1 3 3 氮化正构烷烃 氯化正构烷烃( p o l y c h l o r i n a t e d 刀a l k a n c s ，p c a s ) 属于石蜡烃的氯化衍生物，同 时也被称为氯化石蜡( c h l o r i n a t e dp a r a f f i n s ，c p s ) 。该类物质因为具有电绝缘性好、 阻燃性能好、挥发性低等优点，目前在各国的橡胶、地板、电缆和塑料中得到广 泛应用。由于c p s 具有p o p s 的特性并在世界范围得到广泛的应用，目前已经有 一系列关于c p s 毒理研究的报道。但是关于c p s 的分析方法学、毒理学等研究还 有很大的不足，该研究的许多问题正在等待解决f 1 4 】。 硕士学位论文 1 1 4p o p s 的仪器检测分析方法 关于p o p s 的仪器检测，传统的方法有气相色谱法( g c ) ，高效液相色谱 ( h p l c ) ，超临界流体色谱( s f c ) ，气相色谱质谱联用( o c m s ) ，液相色谱质谱联 用( l c m s ) ，毛细管电泳( c e ) 等。一般而言，仪器检测的方法可以保证数据的准 确性和精确度，但是这些传统的检测方法同时也存在如下的缺点与不足：( 1 ) 需要 经过复杂的样品前处理过程，流程比较繁琐；( 2 ) 要求有精密的分离检测仪器、良 好的实验环境和训练有素的操作人员；虽然这些缺点限制了仪器分析方法在p o p s 检测中的应用，但是在p o p s 的速测技术中，仪器分析方法依然扮演着非常重要 的角色。 气相色谱法( g c ) 具有灵敏度高、选择性好、分离效果好等优点，适用于对能 够气化、热不分解的物质进行检测，因此具有非常广泛的应用价值。高效液相色 谱( h p l c ) 适用于对热不稳定、分子量大、极性强的p o p s 残留物检测，气相色谱 质谱联用( g c m s ) ，液相色谱质谱联用( l c m s ) 结合了色谱和质谱的优势，用色 谱法分离物质，用质谱检测各组分的含量，使得色谱质谱联用技术成为目前最重 要的检测手段之一【1 9 , 2 0 j 。 液相色谱法( h p l c ) 是2 0 世纪6 0 年代发展起来的分离、分析技术，适用于沸 点高、难挥发，热不稳定的有机化合物。由于高效液相色谱法具有检测效率高、 灵敏度好、速度快等优点，是目前进行有机污染物检测的一类重要方法【2 1 1 。 液相气相色谱质谱联用技术是当代最为重要的分析和分离手段之一。色谱 仪具有很高的分离效率，但是对未知物的定性困难。质谱仪不能分离混合物，但 是能够定性未知物。两种仪器有效的结合，取长补短，使混合物的分离和未知物 坚定能够同步进行。目前在有机残留物的分析中，应用最早的是气相色谱质谱联 用仪( o c m s ) ，发展相对成熟，但是，g c m s 的缺陷是样品需要预先汽化，而只 有不到2 0 的样品可以不经过预先处理而直接汽化得到比较满意的效果，因此大 大限制了g c m s 的应用。由于液相色谱可以分离极性的，难挥发和热不稳定的 有机化合物，是的l c m s 具有更加广泛的应用前景i 2 2 。 1 1 5p o p s 的免疫检测分析方法 为了克服仪器分析方法的缺点，人们开始寻求成本低廉且简便快速的检测技 术，以便能在实验室或者环境中及时准确地进行有机污染物的监测。近年来，国 内外相关学者对免疫检测的方法进行了大量的研究并取得了很大进展，由于免疫 检测技术具有简便、快速、灵敏等诸多优点，已经发展成为最有发展潜力和应用 价值的痕量分析方法之一。到目前为止，已经开发了拟除虫菊酯【2 3 1 、磺胺类药物 【2 4 1 、澡毒素2 5 】等多种物质的免疫检测方法，同时已经成功开发了氯霉素、有机磷 农药、盐酸克仑特罗的试剂盒【2 6 1 。 含氨基功能基三( 2 ，3 一二溴丙基) 异氰脲酸酯半抗原的合成 免疫分析方法( i m m u n o a s s a y ，i a s ) 是基于有机分子抗原与抗体之间的特异 性，可逆性结合反应的一种新型分析技术，目前广泛应用于医学上对微量物质的 检测，环境检测中对有机污染物，重金属等的检测，与常规理化分析技术相比。该 技术具有取样量少、仪器化程度低、特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量 大、分析成本低等优点【2 7 ，2 引。常规的仪器测定技术( 如h p l c 或g c ) 需要繁琐 的待测样品预处理( 样本提取、纯化、浓缩等) 过程，样品的预处理要占用整个分 析过程的绝大部分工作量。而免疫分析方法( i a s ) 样品预处理要求非常简单，一般 仅需提取即可，这在一定程度上简化了分析操作，因此，样本前处理步骤最大程 度上体现了i a s 的优越性。近年来，美国化学会已经将免疫检测的分析方法与气 相色谱、液相色谱列为目前农药残留物检测( 绝大部分的农药残留物均为p o p s ) 的 三大支柱技术1 2 9 1 。 免疫分析方法( 抗原抗体反应) ，其最大的特点是具有高灵敏性、高选择性， 一般而言，抗原和抗体的亲和常数可达1 0 9 ，由于免疫反应不仅仅可以在生物体 内发生，在自然环境中也可以进行，由于分析测试手段的不断改进与发展，目前 对于放射性物质、荧光素等都可以极其微量的检测到，结合目前的检测手段和免 疫技术，可以建立一系列的免疫检测技术。 1 9 6 7 年，c e n t e n o 等制备了杀虫剂马拉硫磷的抗血清，然后通过抗原抗体的 凝聚实验，该研究证明了抗血清与马拉硫磷之间可以发生抗原抗体的反应，遗憾 的是，该研究并未应用于检测领域【3 0 】。直到1 9 7 1 年，e r c e g o v i c h 等在研究中指 出，免疫检测技术将会发展成为众多农药检测手段中非常重要检测手段之一【3 1 1 ， 此外，s e r n b e r g e r 等针对农药狄氏剂、艾氏剂、苯菌灵、百草枯等免疫检测方法。 特别是1 9 8 1 年，e r c e g o v i c h 等制备了对硫磷的荧光免疫检测分析方法，其检测下 限可达0 1 i _ t g k g 3 2 l 。自从免疫检测的分析方法被广泛应用于有机残留物的检测以 来，该技术得到了飞速发展，按照标记物或检测体系来划分，免疫分析方法可以 分为酶联免疫测定法( e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ，e l i s a ) 、荧光免疫法 ( f l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a y ，f i a ) 、放射免疫测定法( r a d i o i m m u n o a s s a y ，r i a ) 、免 疫传感器法( i m m u n o s e n s o r ) 等【3 引，目前最常用的分析方法为酶联免疫测定法 ( e l i s a ) 。酶联免疫测定法( e l i s a ) 是目前最为常见的免疫检测方法，该方法的原 理是将抗体或者抗原负载到某种固相载体( 酶) ，而且保留免疫活性，该方法既保 留了抗体的免疫活性，又使得酶的活性得到了保留。因为催化效率很高的酶存在 于检测体系之中，可以放大该反应的效果，使得该检测方法具有很高的灵敏度。 e l i s a 的方法目前在农药残留物的监测中起到了非常重要的作用，有望成为继气 相色谱和液相色谱之后的另一个具有广泛前景的分析检测方法【3 4 】。 硕士学位论文 加咖一一- 一- 一 一p o l y s t y 陀m ， p l a t e a n t i g e n c o a t e dp l a t ee n z y m et r a c e r 图1 1 两种常用的e l i s a 检测模型( h r p h o r s er a d i s hp e r o x i d a s e ，h t - h a p t e nt r a c e r , h c - c o a t i n g h a p t e n ，a a n a l y t e ，a n da b a n t i b o d y ) 1 3 引。 1 2p o p s 半抗原分子的设计与合成 半抗原的定义：半抗原是指与待测有机化合物结构类似、含有活性功能基团 ( 如：氨基、羧基、醛基等) ，与载体蛋白质的偶联物( 抗原) 能够诱导动物细胞产生 特异性免疫抗体的一类小分子有机化合物的总称【3 5 。 多数p o p s 属于小分子物质，一般分子量小于1 0 0 0d a ，由于缺乏t 细胞表位 而无法直接诱导动物机体的b 细胞产生特异性抗体，当p o p s 与大分子物质，如 载体蛋白质偶联后得到抗原，可借助蛋白质大分子的t 细胞表位间接诱导动物细 胞的增殖及分化，产生针对该p o p s 抗原的特异性抗体【4 j 。如果p o p s 分子本身分 子结构具有活性官能团( 如氨基、羧基等) ，则与蛋白质的偶联反应可直接进行， 反之则必须对p o p s 分子进行衍生化修饰，合成出带有能够与载体蛋白质反应的 活性官能团的半抗原，这一步被称之为p o p s 半抗原的设计与合成p j 。 抗体的特异选择性是影响最终免疫检测分析质量的关键因素，而半抗原分子 的结构直接决定了动物细胞诱导产生的抗体选择性，因而p o p s 半抗原分子的设 计与合成是免疫分析检测方法中至关重要的因素，半抗原分子结构的好坏将影响 最终能否制备出高质量的特异性抗体，从而决定是否能够建立待测分子的免疫检 测方法。半抗原分子活性官能团引入位点的选择、活性官能团的种类、半抗原分 子连接臂的长短、半抗原分子是否含有芳香基团、半抗原分子与载体分子的偶联 配比等【4 5 】都影响到能否制备出具有高选择性的抗体。在p o p s 半抗原的设计与合 成中，由于某些p o p s 分子结构非常复杂，直接在分子结构中引入活性官能团非 含氨基功能摹三( 2 ，3 一二溴丙基) 异氰脲酸酯半抗原的合成 常困难，非常有必要对该类p o p s 的半抗原分子进行全合成，合成该类半抗原分 子往往合成步骤较长、产物分离纯化困难，有时甚至无法拿到高质量的半抗原分 子1 6 j 。因此，从上世纪8 0 年代以来，国内外不同领域的学者( 如有机合成化学， 分析化学，免疫学，材料科学等) 对于半抗原分子的合成进行了积极的探索，大致 可以分为如下几种合成方法：( 1 ) 衍生化合成半抗原分子；( 2 ) 选择类似物合成半抗 原分子；( 3 ) 半抗原分子的全合成。 半抗原的设计原则上要求应尽量使合成的半抗原分子能刺激动物机体产生选 择性免疫应答，从而产生具有预期活性的抗体。因此，在设计半抗原分子时应该 尽量保证半抗原分子的特征结构能最大限度地被免疫活性细胞所识别，并保证合 成出的半抗原分子应具备与待测物分子类似的分子结构与立体化学特性【7 1 。此外， p o p s 的自身结构应有一定的复杂性，如具有分支结构、苯环或杂环结构等，否则 很难产生具有特异功能的抗体或产生的抗体效价较低。研究人员指出，如果半抗 原分子具有芳香基团则制备抗体的成功率为1 3 ，反之成功率仅为1 1 l 【3 5 】。 1 2 1 衍生化合成半抗原分子 根据待测p o p s 的分子结构，选择适当的分子偶联点，通过连接臂引出活性 功能基团的方法称为衍生化合成半抗原分子。由于不同的偶联点会导致分子的极 性、构型、电子云分布及空间结构不同，从而会使免疫系统识别的抗原决定簇也 不同。如果待测p o p s 分子有多个可供选择的偶联位点，可尝试利用多个位点分 别合成多种半抗原，并通过进一步实验筛选出较理想的半抗原。如果p o p s 分子 含有活性基团，可直接与载体蛋白质连接，但大多数p o p s 属于有机小分子，没 有现成的活性基团，需要作适当的衍生修饰，使p o p s 分子产生活性基团，即在 p o p s 分子末端引入c o o h 、n h 2 、s h 、o h 、c h o 等活性基团后再与偶联剂 连接。原则上，偶联点应尽量远离母体分子的特征结构，这样可以减小载体蛋白 对待测p o p s 分子特征结构的覆盖与屏蔽作用，以便被免疫系统较好地识别，且 活性基团的存在应该对p o p s 分子半抗原的电子分布没有影响。 s a l a m o n e 等1 3 6 j 直接从四氯二酚的酚羟基出发，在n a o h 做碱的条件下直接与 过量的溴乙酸发生w i l l i a m e s o n 成醚反应，合成出含有羧基功能基团的四氯二酚 半抗原分子，该半抗原分子保留了四氯二酚的化学结构和特征结构。 c i c i o h o h l 町。警 qp - 彳 o h 图1 2 四氯二酚的半抗原合成路线示意图 近年来，环境中存在的多环芳烃类有机化合物( p a h s ) 对人体和生态环境均造 成非常严重的危害，大多数的多环芳烃类化合物会增加动物体和人类患癌症等重 硕士学位论文 大疾病概率。美国环境保护协会( e p a ) j y 0 出了废水中的1 6 种多环芳烃，土壤和粉 尘里2 4 种多环芳烃，其中苯并芘的致癌危害最大。l i 等p 7 1 用萘，葸，芴，菲， 芘，荧葸，苯并芘为起始原料，选择合适的位点进行衍生，合成了一系列p a h s 半抗原分子，他们使用这些不同种类的p a h s 半抗原分子进行e l i s a 单克隆抗体 ( m a b s ) 的交叉反应实验，对苯并芘用e l i s a 的检测与气相检测实验相比较和对 照，发现e l i s a 有着更高的检测灵敏度，更低的检测下限。 g 了叩 n a p - 2 a h 国c h 2 c h z c h 2 c 0 2 h p y r 1 c 习g 渊州吣洲搬h f l a - 3 a c h 2 ) 2 c o z h c h 2 ) 2 c 0 2 h 图1 3 多环芳烃类有机化合物( p a h s ) 的半抗原分子 c h o i 等【1 5 1 在合成杀螨菊酯半抗原分子时，选择杀螨菊酯分子中的s h 作为偶 联位点，与丁二酸酐发生反应，合成出含有羧基功能基的半抗原分子。该方法的 优点是，步骤简单，合成出的半抗原分子保留了待测分子的全部化学结构和立体 结构，因而有望进一步制备出具有特异选择性的杀螨菊酯抗体。 h ，s n qh ，s n 0 h o n 峨 o h n 吼 p 0 s n qr s n 上_ h ai m i d a c l o p r i dh a p t e nn n 0 2 ba c e t a m i p d d h a p t e n 忖n 0 2 图1 4 杀螨菊酯的半抗原分子合成路线图 i 2 2 选择类似物合成半抗原分子 一般而言，在p o p s 的研究和开发过程中，会有大量的前驱化合物或类似中 含氨基功能基三( 2 ，3 一二溴丙基) 异氰脲酸酯半抗原的合成 间物被合成出来，这些化合物均可作为潜在的半抗原分子合成原料。当待测p o p s 的分子结构难以直接衍生出活性基团，而又可以找到该待测物分子结构类似的含 有反应活性基团的有机化合物或者中间体时，则可以考虑利用该分子结构合成出 目标待测物的半抗原分子，这种方法称之为选择类似物进行合成p o p s 半抗原分 子。该方法的好处是合成步骤少，抗原在动物细胞中免疫得到的抗血清效价较高， 近年来在p o p s 残留物的检测中得到了广泛的应用。 m i y a m o t o 等【”】在合成哒螨灵半抗原分子时，发现哒螨灵的分子结构中很难 直接衍生出带有活性功能基团的半抗原分子，半琥珀酸胆固醇的分子结构保留了 哒螨灵的全部分子结构，并且带有活性基团羟基，与丁二酸酐反应，可以非常顺 利的合成出含有羧基功能基的半抗原分子。使用该方法的第一个好处是半琥珀酸 胆固醇属于商用试剂，可以很容易购买到，第二个好处是半琥珀酸胆固醇本身带 有的羟基可以引出不同结构的