（微生物学专业论文）新型克隆载体和融合表达载体的构建.pdf

摘要 摘要 1 9 7 3 年，第一条具有生物学功能的细菌质粒构建成功标志着d n a 重组和分 子克隆的开始。经过近4 0 年的发展，基因重组技术已经是研究生物的最基本的 技术操作了。尽管分子克隆是生物技术基本技术操作，却是后续实验的基础，没 有高效的克隆效率是很难进行下面的实验的。目前实验室常用的克隆载体如p u c 系列和p b l u e s c n p t 系列，所采用的筛选克隆的方法为蓝自斑筛选。然而由于种 种原因，蓝白斑筛选并不能完全反应克隆的情形，即白斑有时并非重组克隆，有 时需要筛选许多菌落才能得到正确的重组克隆，而这在需要克隆效率的构建文库 实验中尤为不利。而我们以p b l u e s c f i p tk s ( ) 质粒为骨架，通过o v e r l a p p c r 技 术构建的全新载体，利用r p s l ( d b o s o m a jp r o t e i ns m a l ls u b u n i t ) 作为负筛选标记， 其重组效率高达到9 6 1 0 0 ，因此可以作为通用的克隆载体使用。 随着蛋白质组学的发展，越来越多的科学家对一些有特殊功能的蛋白质感兴 趣。这些蛋白产物，不论是作为生化分析研究还是对其治疗或结构分析，必有三 个共同点：可表达性、可溶性和可纯化。尽管蛋白表达不再是限制其发展的步骤， 而蛋白纯化方法经过二十多年的发展也取得了突破性的进展，但是表达纯化出具 有可溶性的蛋白质依然是该领域所面临的主要问题。通过加融合标签来提高目的 蛋白的表达量和可溶性依然是最方便并广泛采用的技术。但是不同的融合标签对 蛋白所提高的效果是不同的，因此需要选择合适的标签很重要。融合标签有可能 对靶蛋白的结构或活性有一定的潜在影响，这时就需要将融合标签从融合蛋白上 面切除。烟草蚀纹病毒蛋白酶具有酶切位点特异性和广泛的温度适应性，所以经 常使用它将融合标签与目的蛋白切开。我们以p e t - 3 0 a 质粒为骨架，并加上五种 不同的融合蛋白基因，构建的一系列的表达载体以满足蛋白表达的需要，并在融 合标签的下游末端加入n 蛋白酶专一性的酶切位点，这样就可以很容易的将 融合标签与目的蛋白分离纯化。我们合成了t e v 酶的基因并构建到表达载体上 进行表达。然而表达的t e v 酶有个严重问题即出现不可溶性组份而降低其酶切效 果。所以我们将它的序列中的三个氨基酸替换并加上多聚精氨酸尾，并在其基因 的前端加融合标签，观察其酶的表达量和它的稳定性及活性。 关键词：克隆载体融合表达载体t e v 酶纯化 n a b s t r a c t c o n s t r u c t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fn e wc l o n i n gv e c t o ra n d f u s i o ne x p r e s s i o nv e c t o r s a b s t r a c t i n19 7 3 ，t h ec o n s t r u c t i o no ft h ef i r s tb i o l o g i c a l l yf i m c t i o n a lb a c t e r i a lp l a s m i d s i g n a l e dt h eb e g i n n i n go fm o l e c u l a rc l o n i n ga n dr e c o m b i n a n td n at e c h n o l o g y a f t e r n e a r l y4 0y e a r so fd e v e l o p m e n t , r e c o m b i n a n td n at e c h n o l o g yh a sb e c o m et h e f o u n d a t i o no f b i o l o g i c a lr e s e a r c h 。 臻醢e f f i c i e n td n ac l o n i n gi sc r u c i a lt of o l l o 酶4 n gs t u d i e s p u ca n dp b l u e s e r i p t s e r i a lv e c t o r sa r em o s to f t e nu s e dc l o n i n gv e c t o r s ，t h ed e s i r e dc l o n e sa 】潆 d i f f e r e n t i a t e df r o me m p t yv e c t o r s 谢也b l u e w h i t es c r e e n i n g 。t h ed i s a d v a n t a g eo f b l u e w h i t ev i s u a l i z a t i o ni sn o ts or e l i a b l ew h i c hm e a n sap o r t i o no fo rs o m e t i m e s m o s tw h i t ec o l o n i e sa r en o tr e c o m b i n a n t t h el o wr e c o m b i n a t i o n e f f i c i e n c ym a yb ea s e v e r e p r o b l e m i n c l o n i n g e x p e r i m e n t st h a th i 盛r e c o m b i n a t i o ne f f i c i e n c yi sn e e d e d ，s u c ha sm i n i - g e n o m i c l i b r a r yp r e p a r a t i o na n dc l o n i n go fal o wa b u n d a n c eg e n ef r o mag e n o m e 。t oo b t a i na c l o n i n gv e c t o r w i t hh i g hr e c o m b i n a t i o ne f f i c i e n c y , an e wc l o n i n gv e c t o rw a s c o n s t r u c t e di nt h i ss t u d y n ev e c t o rp l s 9 7 5w a sc o n s t r u c t e db yf u s i o nt h er p s l ( r i b o s o m a lp r o t e i ns m a l ls u b u n i t ) g e n ew i mam u l t i p l ec l o n i n gs i t e s ( m c s ) r e g i o n t h r o u g ho v e r - l a pe x t e n s i o np c r c l o n i n go f1 - 3k ba n d4 - 7k bo ft h eg e n o m i cd n a f r a g m e n t sf r o mt h er a p a m y c i np r o d u c i n gs t r a i ns h o w st h a tt h ec l o n i n ge f f i c i e n c yi sa s 越曲a s9 6 1 0 0 , s u g g e s t i n gt h a tp l s 9 7 5c a l lb eu s e dag e n e r a lc l o n i n gv e c t o r , w h i c hi se s p e c i a l l yu s e f i f lf o rt h ec l o n i n ge x p e r i m e n t sd e m a n d i n gh i g hc l o n i n g e f f i c i e n c y w i t ht h ea d v e n to fp r o t e o m i c s ，m o r ea n dm o r es c i e n t i s t sa r ei n t e r e s t e di nt h e p r o t e i nf u n c t i o nc h a r a c t e r i z a t i o n p r o d u c t i o no fp r o t e i n , w h e t h e rf o rb i o c h e m i c a l a n a l y s i s ，t h e r a p e u t i c so rs t r u c t u r a ls t u d i e s ，r e q u i r e st h es u c c e s so ft h r e ei n d i v i d u a l f a c t o r s ：e x p r e s s i o n ，s o l u b i l i 段a n dp u r i f i c a t i o n 。 a l t h o u g hp r o t e i ne x p r e s s i o ni sn ol o n g e rc o n s i d e r e dam a j o rl i m i t i n gs t e pa n d p r o t e i np u r i f i c a t i o nt e c h n i q u e sh a v eb e e ni m p r o v e dd r a m a t i c a l l yi nt h ep a s td e c a d e s ， 燃 m ep r o b l e mo fp r o d u c i n gs o l u b l ep r o t e i n sf o rh a sc o n t i n u e dt ob ea m a j o rb 砌e n e c k h n p 】例i 1 1 9t h ey i e l da n ds o l u b i l i t yo ft a r g e tp r o t e i n sb yt h eu s eo ff u s i o nt a g s i sa c o n v e n i e n ta n dw i d e l yu s e dt e c h n o l o g y f u s i o nt a g sr e p r e s e n t sa ne f f i c i e n ts t r a t e g yi no b t a i n i n gh i g r l l ys o l u b l ep r o t e i n s a s f u s i o nt a g sh a v et h ep o t e n t i a lt oi n t e r f e r ew i t hs t r u c t u r e o ra c t i v i t yo fp a s s e n g e r p r o t e i i l ，r e m o v et h et a gi s n e c e s s a r yi ns o m ec o n d i t i o n s t h es t r i n g e n ts e q u e n c e s p e c i f i c i t ya n da c t i v i t yo v e ra b r o a dt e m p e r a t u r er a n g eo ft h et o b a c c oe t c hv i m s ( t z v ) p r o t e a s eh a sb e e np r o v e dt ob eu s e f u lo f t h i s p u r p o s e w i t he s c h e r c h i ac o l ie x p r e s s i o np l a s m i dp e t 3 0 aa sab a c k b o n e ，w ec o n s t r u c t e da s e t i e so fe x p r e s s i o nv e c t o r sw i t hm u l t i p l ef u s i o nt a g s t e vr e c o g n i t i o n s l t ew a s e n g i n e e r e dt o f a c i l i t a t et h ec l e a v a g eo ft a g s m a n yc o m p a n i e sh a v ep r o d u c t v p r o t e a s eb u tt h ep r i c ei st o o1 1 i 曲w es y n t h e t i s et h ed n a s e q u e n c ea n dc o n s t r a c ti t i n t o0 1 1 1 e x p r e s s i o nv e c t o rt oe x p r e s s t oi m p r o v et h es o l u b i l i t yo ft e v t h r e et e v m 1 】t a t i o i l sw e r em a d ea n di t sc l e a v a g ea b i l i t i e sw e r ee v a l u a t e d k e y w o r d s ：c l o n i n gv e c t o r ；f u s i o n e x p r e s s i o n v e c t o r ；t e vp r o t e a s e ；p r o t e m p u r i f i c a t i o n i v 名词缩写 一_ 一 名词缩写 a m p a p s b p b s a d n a d n t p e b e d t a g s t 6 x h i s p t g k a n l b 田p 融 o d p a g e p c r r p m s d s s 仃 s i m o t e 恸 t e t t e v t i 乜 x g 2 l l a m p i c i l l i n a m m o n i u mp e r s s u l f a t e b a s ep a i r b o v i n es e r u ma l b u m i n d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d d e o x y r i b o n u e l e o f i d et r i p h o s p h a t e e 衄d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n o t r t r a a c e t i ca c i d g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e 6 h i s t i d i n e i s o p r o p y l p d - 1 - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k a n a m y c i n l u r i a - b e r t a l l i m a l t o s e - b i n d i n gp r o t e i n n i t r i l o t r i a c e t i ca c i d o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r o u n d sp e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s t r e p t o m y c i n s m a l lu b i q u i t i n r e l a t e dm o d i f i e r , n ，n n n 一t e t r a m e t h y l e t h y l e n d i a m i n e t e t r a c y c l i n e t o b a c c oe t c hv i r u s t r i s o a y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 5 b r o m o 4 c h l o r o 一3 一i n d o l y l - p d g a l a c t o s i d e 氨苄青霉素 过硫酸铵 碱基对 牛血清白蛋白 脱氧核糖核酸 脱氧核苷三磷酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 谷胱甘肽巯基转移酶 六聚组氨酸 异丙基p d 硫代半乳糖 苷 卡那霉素 麦芽糖结合蛋白 次氨基三乙酸 光密度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 每分钟转速 十二烷基硫酸钠 链霉素 小分子泛素样修饰蛋白 n , n , n 。，n 。四甲基乙二胺 四环素 烟草蚀纹病毒 三羟甲基氨基甲烷 5 溴4 氯3 吲哚- p d - 半 乳糖苷 惴8iiii-38 帅2 舢7iiii 唧y 综述 第一章综述 基因工程( g e n e t i ce n g i n e e r i n g ) 或称d n a 重组，指针对不同生物的基因，根 据人们的意愿在体外进行切割、拼接，并重新转入生物体内，生产出人们期望的 产物，或创造出具有新遗传特征的生物类型。 限制性内切酶和基因载体这两方面的基础理论研究为基因工程技术的产生 奠定了坚定基础。1 9 7 2 年，美国斯坦福大学的e b e r g 1 j 博士领导的研究小组，在 体外将猿猴病毒s v 4 0 的d n a 和九噬菌体的d n a 用e c o r i 酶切，然后用t 4 连 接酶将两种消化片段拼接起来，筛选到含有s v 4 0 和z , d n a 的杂种d n a 分子， 并因此获得了1 9 8 0 年的诺贝尔化学奖。1 9 7 3 年，斯坦福大学的s c o h e n l 2 1 等用 e c o r i 酶切不同抗性基因的两种质粒，用t 4 连接酶将它们连接并转入大肠杆菌 ( e s c h e r i c h i l ac o l i ，ec o l i ) 中，从而获得同时含有两种抗性基因的重组子。该 实验的成功，标志着基因工程正式登上历史的舞台。 基因工程的出现是2 0 世纪生物科学的划时代意义的巨大事件，标志着人们可 以根据自己的意愿进行基因操作设计和创建出新的基因、蛋白甚至物种，以满足 人们的要求。例如蛋白质工程，也有人称之为第二代基因工程。蛋白质工程主要 通过基因工程技术了解蛋白质的d n a 编码序列，蛋白质分离纯化，蛋白质的序 列分析和结构功能分析，蛋白质结晶和蛋白质的力学分析，计算机辅助设计突变 区，对蛋白质的d n a 进行突变改造等诸多过程，这些为蛋白质结构和功能的研 究开辟新的途径。 基因工程主要包含四个步骤：一是获得满足人们需求的d n a 片段，被为“目 的基因”；二是将目的基因与载体连接成重组d n a ；三是把重组d n a 转入宿主 细胞；四是把含有重组子质粒的细胞中挑选出来。基因工程之所以能够在体外将 不同来源的d n a 重新组合构成新的d n a ，并在宿主细胞扩增和表达，主要依赖 于包括载体、工具酶和受体细胞等一系列重要的克隆工具的使用。 1 1 基因工程载体 基因克隆技术的一个重要环节是载体的设计和使用。目的基因片段一般较难 进入不同种属的细胞，即便能进入受体细胞中，也不能进行复制增殖，它必须与 具有自我复制能力的d n a 分子共价结合后才能复制增殖，我们把这种具有在细 胞内进行自我复制的d n a 分子称为载体( v e c t o r ) 。一般按功能可将载体分为两 大类：克隆载体和表达载体。克隆载体主要用于克隆和扩增外源d n a 片段，表 达载体则用于获得外源基因的表达产物( 转录和翻译的产物) 。 载体由诸多不同的元件组成，如复制区、启动子和抗性基因等，它们可分别 取自细菌质粒、噬菌体d n a 或病毒d n a 等。根据基本组成元件的来源，可以 将载体分为质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、黏粒载体和人工染色体载体等 类型。 尽管不同载体在大小、结构、性能等方面具有较大差异，但作为载体它们都 具备以下一些共同的基本特点： 具备自主复制能力，以保证重组d n a 可以在宿主细胞内扩增；具备较小的 相对分子质量，易于操作，并有足够的容纳目的基因的容量；在非必需区的 d n a 区段有较多的单- - i 艮 $ i 性酶切位点，便于目的基因的克隆；含一个或多 个筛选标记如对抗生素的抗性、营养缺陷型或表型显色反应等；具有遗传稳定 性；具有安全性，d n a 载体没有致病性，不易扩散，以免造成危害； 1 1 1 基因工程中常用克隆载体 目前可以满足基因克隆的的载体都是人工构建的，而且现在市场上也有种类 繁多生物商品化的载体可供选择。但是每类载体都有它独特的结构与性质，适用 于不同的研究目的。 l 细菌质粒载体 质粒( p l a s m i d ) 是指在细菌染色体之外的具有自主复制能力的环状双链d n a ， 广泛存在于细菌、放线菌和真菌细胞中。绝大多数质粒是超螺旋结构的d n a ， 分子量范围很大，小的约有2 3k b ，最大可达数百k b 。每个质粒都含有d n a 复 制起始位点序列，使其在宿主细胞内独立自主进行复制，并在细胞分裂时稳定地 分配到子代细胞，同时它们又必须依赖于宿主细胞基因编码的聚合酶等蛋白进行 复制和转录。 通常质粒d n a 在宿主细胞内，既不杀死细胞对宿主的代谢活动也没有影响。 一般情况下，宿主细胞即使失去质粒也能生存，但质粒如果离开宿主细胞就无法 复制。质粒的存在常常会赋予宿主细胞一些新的有利于细菌的生存的遗传性状， 如对某些抗生素或重金属的抗性等。因而可根据宿主菌的表型来筛选和鉴定重组 质粒是否存在于宿主细胞中。但是应当注意的是，质粒具有不相容性【3 】，即在没 2 ，；受 综述 有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的质粒，不能长期稳定地共存于同一个 宿主细胞中，只有亲缘关系比较远的质粒可以共存于同一宿主细胞中。我们将质 粒d n a 中能够自主复制并维持正常拷贝数的一段最小的核酸序列单位称为质粒 复制子n 3 ( r e p l i c o n ) 。质粒在细菌中的拷贝数是指在正常的生长条件下，每个细 菌细胞或染色体所对应的平均质粒数，不同质粒在细胞中的拷贝数也各不相同。 一般而言，质粒的拷贝数与其分子量成反比关系，分子量越大，拷贝数越低，分 子量小的拷贝数高。拷贝数与其复制子的种类也有密切的关系。质粒在复制子的 调控下，拷贝数还可随细菌培养条件的变化在一个比较狭窄的范围内波动。我们 根据质粒的复制是否受宿主菌的控制可将其分件严紧型和松弛型两种。严紧型指 的是质粒d n a 复制的启动，是受宿主细胞不稳定的复制起始蛋白控制的，它的 复制必须在一定的细胞生长周期内与宿主细菌染色体复制同步，染色体不复制时 质粒也不复制，即质粒复制通常是在严紧控制下进行的。严紧型质粒在细胞中是 以低拷贝数形式存在的，一般每个细胞只有1 - - - 2 个同样的质粒。松弛型指的是 质粒d n a 复制的启动，是由质粒编码合成的功能蛋白调节的，与在宿主细胞周 期开始时合成的不稳定复制起始蛋白无关。在整个细胞生长周期中质粒均可复 制，即质粒复制是在松弛控制下进行的。一般情况下松弛型质粒在宿主细胞中是 以高拷贝数形式存在的，每个细胞有大约含1 0 - 2 0 0 个质粒，基因工程所用的克 隆载体质粒一般都是具有高拷贝的松弛型质粒。 最早作为克隆载体如p s c l 0 1 、c o l e l 和p c r l 等的质粒仅含一个选择性标 记。第一个经改造的认为比较完整的质粒载体是p b r 3 1 3 ，属松弛型复制，同时 引入了两个选择标记即抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因( t e t r 和a m p r ) 和一 些有用的限制性酶切位点。但因其分子量过大而且有一半以上基因在功能上是非 必需的，所以未能广泛的应用。随后构建成功的p b r 3 2 2 i s , 6 】不仅去掉了大部分非 必需序列，同时还保留p b r 3 1 3 原来所有优良特性。 i p b r 3 2 2 载体质粒 大肠杆菌质粒p b r 3 2 2 是基因工程中最常用和最具有代表性的质粒，其主要 特点可归纳如下：具有较小分子量，仅4 3 6 3k b ：含有一个复制起始点( o f f ) ， 复制子为c o l e l ，属松弛复制型；含有抗四环素基因( t e t r ) 和抗氨苄青霉素基 因( a m p r ) ，其中b a m _ h i 等9 个单一酶切位点位于t e t r 基因内，p s f l 等3 个单 一酶切位点位于a m p 基因内，因而利于插入目的基因同时便于筛选出重组子。 i i p u c 载体质粒 p u c 7 1 质粒也是一种较常见的载体质粒，它是以p b r 3 2 2 质粒为骨架，加入 含有多克隆位点( m u l t i p l ec l o n i n g s i t e s ，m c s ) 的l a c z7 基因，从而发展成具有 双功能检测特性的新型质粒载体系列。典型的p u c 系列的质粒载体主要包括： 来自p b r 3 2 2 质粒的复制起始点；氨苄青霉素抗性基因( a m p ) ，但该基因 不再含有原来的限制性酶切位点；大肠杆菌b 半乳糖苷酶基因( l a c z ) 的启动 子及其编码甜肽链d n a 序列，此结构特称为a c z7 基因；l a c z7 基因5 7 端含有m c s 区段，但它并不破坏该基因的功能。与p b r 3 2 2 质粒载体比较，p u c 质粒载体有许多方面的优越性如：o p u c 质粒载体的分子量更小而且拷贝数更 高；可直接从茵落颜色挑选出重组子即蓝白斑筛选法。其原理是载体含有的 三口c z 讲段可以和菌株l a c z 基因c 端互补而得到功能性的p 一半乳糖苷酶，p 半 乳糖苷酶可被培养基中添加的i p t g 所诱导，催化分解生色底物x g a l ，所得菌 落为蓝色。当插入目的基因后，l a c z a 舶读码框被破坏，这样就不能和宿主菌中 l a c z 基因c 一端互补，l a c z 基因失活，不能表达功能性的b 半乳糖苷酶。此时， i p t g 和x g a l 不起作用，所得菌株为白色。 i i i p g e m 和p s p 载体质粒 p g e m 一3 z 和p s p 载体都是由p u c 系列质粒载体衍生而来。p g e m 3 z 几乎与 p u c l 8 8 】相同，但其含有两种启动子即：噬茵体t 7 的r n a 聚合酶启动子和噬菌 体s p 6 的r n a 聚合酶启动子。p s p 系列载体则用的是噬菌体s p 6 的r n a 聚合 酶启动子，它们都有一段来自m 1 3 噬菌体的m c s 序列，用于克隆外源d n a 片 段，在其上游与之相邻的是噬菌体的r n a 聚合酶启动子。 穿梭载体质粒 为了方便基因工程工作，人们先后构建了一系列不同类型的穿梭质粒 ( s h u t t l ep l a s m i d ) 。它具有两种细胞的复制起点，因而可在两种不同的寄主细胞 中存活和复制，并可以携带着外源d n a 序列在不同物种的细胞之间往返。常 见的有大肠杆菌枯草芽孢杆菌【9 】穿梭质粒载体以及大肠杆菌酿酒酵母穿梭质 粒载体【l o 】等。大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体大多是由这两种杆菌的质粒 融合构建而成的。大肠杆菌酿酒酵母穿梭质粒载体含有两种分别来自大肠杆菌 4 综述 和酿酒酵母的复制起点和筛选标记，另外还有m c s 区。该质粒载体在研究目 的基因表达活性及其他调节功能方面非常有用。除了在细菌体系中发展的穿梭 质粒外，在动物体系中也发展出类似的穿梭质粒载体，最早是由大肠杆菌质粒 载体和牛乳头瘤病毒【1 l 】构建而成。曾经用这个穿梭载体克隆人的p 一干扰素基因 【1 2 】，先在大肠杆菌中操作，然后转染到多种不同的动物细胞系，结果均表 达出相似水平的干扰素。 2 九噬菌体克隆载体 九噬菌体载体是基因工程中一类很有价值的克隆载体，具有很多优点： 背景清楚，对其分子遗传学背景研究的较为透彻；大容量，一般质粒 载体最多能容纳1 0k b 左右外源d n a 片段，而九噬菌体载体却能容纳大约2 3 k b 的外源d n a 片段；高效性，其感染宿主细胞的效率几乎达到1 0 0 ， 而质粒d n a 的转化效率只有0 1 。九噬菌体d n a 分子很大、结构复杂、 限制性酶有很多切点而且这些切点多位于必需基因中等一系列的原因使得 野生型九噬菌体d n a 不适合做克隆载体。为利于使用，需要对其进行一系 列的改造。首先删除非必需基因，使基因组变小，有利于大的d n a 片段的 克隆；其次是删除基因上多余的限制性酶切位点。一般将九噬菌体载体分为 两类，即插入型载体和取代型载体。虽然九噬菌体载体极为有用，但是由于 九噬菌体头部组装时容纳d n a 的量是固定的，以此插入的外源d n a 的长度 必须控制在使重组d n a 的总长度为野生型九噬菌体d n a 长度的7 5 1 0 5 ，否则不能进行正常包装。 3 柯斯质粒载体 柯斯质粒( c o s m i d ) 即黏粒，是一类由九噬菌体黏性末端和质粒复制予 构建而成的杂种质粒载体。它是为克隆和增殖真核基因组d n a 的大区段而 设计的，是组建真核生物基因文库以及从多种生物中分离基因的有效手段。 柯斯质粒载体的优点是：具有噬菌体的高效感染力，进入宿主细胞后不 形成子代噬茵体仅以质粒形式存在；具有质粒d n a 的复制方式，重组 d n a 注入宿主细胞后，两个c o s 位点连接形成环状d n a 分子，如同质粒一 样进行复制；具有克隆大片段外源d n a 的能力，这是柯斯质粒最大的优 点。柯斯质粒本身一般只有5 7k b 左右，而它克隆外源d n a 片段的极限 值高达4 5k b ，远远超过质粒和九噬菌体载体的容量。 4m 1 3 噬菌体载体 m 1 3 是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组是环状s s d n a ，大小为6 4 0 7b p 。 m 1 3 克隆载体主要是在野生型m 1 3 基因的i g 区插入p 半乳糖苷酶选择性标 记和m c s 。该载体的优点主要是：可以有效克隆双链d n a 分子中的每一条 链。因此可用于制备测序用的单链d n a 模板、特异的单链d n a 探针，定 点诱变等等。 5 噬菌粒载体 噬菌粒载体( p h a s m i d ) 是由丝状噬菌体和质粒d n a 融合而成，因而 具有两者的优点。这类载体具有来自m 1 3 或f l 噬菌体的复制起点和来自质 粒的复制起点、选择性标记及一个m c s 。较常见的噬菌粒载体主要有 p u c l l 8 、p u c l l 9 和p b l u e s c r i p t 噬菌粒载体。 p u c l l 8 及p u c l l 9 噬菌粒载体与上文所述的p u c 克隆载体相比，主要 优点在于：分子小，载体分子仅3k b ，利于操作和分离；容量大，容 量较m 1 3 噬菌体载体大，最大可克隆1 0k b 的外源d n a 片段；可用于制 备单链或双链d n a ，克隆和表达外源基因。 p b l u e s c r i p t 噬菌粒载体是一类从p u c 载体衍生而来的载体，一般称 p b l u e s c r i p ts k ( + 一) 。在m c s 的两侧，含有t 3 和t 7 噬菌体的启动子，用 以定向地指导插入在m c s 的外源基因的转录。另外除具有m 1 3 或f 1 噬茵 体复制起点外，还同时具有一个来自c o l e l 质粒的复制起点，因而 p b l u e s c r i p t 载体根据有无辅助噬菌体共感染，可按不同的形式进行复制，进 而合成出单链或双链的d n a 。p b l u e s c r i p t 噬菌粒载体除了用做普通的克隆 载体外，还可用于制备具有d n a 探针、用于筛选基因组文库或c d n a 克隆 进行基因组结构的s o u t h e r n 分析以及基因表达的n o r t h e r n 检测。我们所构 建的具有新型筛选标记的载体就是从p b l u e s c r i p ts k ( 一) 衍生而来的。 6 人工染色体 人工染色体一般包括两种，即酵母人工染色体( y e a s ta r t i f i c i a l c h r o m o s o m e ，y a c ) 和细菌人工染色体( b a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ， b a c ) 。人工染色体的最大的优点就是能容纳多达1 0 0 0k b 的外源d n a 片段。 6 综述 y a c 系统的容量大，已经被广泛应用于d n a 文库的构建和基因簇研究，但 也有严重的缺陷如易发生重组、缺乏稳定性以及制备工艺繁琐等。b a c 由 大肠杆菌单拷贝f 质粒衍生而成，可用于克隆基因组大片段d n a 及作为构 建基因组文库的载体。b a c 载体不但可携带大的外源d n a 片段，而且遗传 稳定性也比y a c 好。另外b a c 载体的低拷贝数还可避免产生嵌合体，减 少外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。 除以上所述的克隆载体外，还有一些关于真核生物病毒载体。例如哺 乳动物病毒载体、昆虫病毒载体及植物病毒载体等等，就不再一一赘述。 1 1 2 基因表达载体 以上所涉及的主要是克隆载体，而研究与生产中常常需要获得目的基 因的表达产物，这就需要选择使用表达载体。表达载体除具有克隆载体所 具备的性质外，还具备以下特点：强启动子，具有r n a 聚合酶所识别的 强启动子利于目的基因的高效表达；可诱导调控。为避免外源基因的过 表达对宿主细胞生长、繁殖的抑制效应，通常使用具有诱导调控功能的启 动子如温度控制型启动子或诱导物如i p t g 、i a a 等加以诱导调控。这样可 将宿主细胞的生长与外源基因的表达分开，即在细胞对数生长末期启动外 源基因的表达，；强终止子。表达载体具有强终止子，以便在r n a 聚合 酶只转录外源基因而不转录其他无关的基因，即防止“通读”现象；翻 译起始信号。翻译的起始信号包括起始密码子a u g 和s d 序列，这是翻译 所必需的基本元件： 表达载体很多，根据宿主菌的不同分原核表达载体和真核表达载体。前 者可以在原核系统中表达，后者在真核系统中表达。大肠杆菌表达体系因 其遗传背景清楚、操作简单、便于大规模发酵培养等优点，常常作为高效 表达研究的首选体系。较常用的大肠杆菌表达载体有p b v 2 2 0 系列载体和 p e t 系列载体。 ip b v 2 2 0 表达载体 p b v 2 2 0 载体是国内使用较多的表达载体，其以下元件组成：来源于 p u c 8 多克隆位点；核糖体r r n b 基因终止信号；九噬菌体t i t s 8 5 7 抑制 子基因及p r 启动子； p r c 2 3 的p l 启动子及s d 序列。此载体的主要优点： 7 综述 c l t s 8 5 7 抑制子基因和p l 启动子同在一个载体上，可转化任何菌株，以便 筛选出蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易降解；s d 序列紧跟 在多克隆位点，便于插入带起始a t g 的外源基因，表达非融合蛋白；强 的转录终止信号可防止出现“通读 现象，有利于质粒一宿主系统的稳定； 整个质粒仅为3 6 6k b ，有利于增加其拷贝数及容量，可以插入大片段外源 基因；p r 和p l 启动子串联，可增强启动作用；该载体表达系统为温度 诱导型，产物以包涵体形式存在，可占大肠杆菌总蛋白的2 0 3 0 ，均一 性好而且不易降解； i ip e t 系列载体 p e t ( p l a s m i df o re x p r e s s i o nb yt 7r n ap o l y m e r a s e ) 系统是目前应用最 为广泛的表达载体。该载体使用t 7 噬菌体启动子，该启动子不能被大肠杆 菌r n a 聚合酶识别，但它能被t 7r n a 聚合酶所识别，因而可在整合有t 7 r n a 聚合酶基因的大肠杆菌菌株b l 2 1 ( d e 3 ) 中表达。外源基因的表达由 i p t g 诱导调控，充分诱导时几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱 导表达仅几个小时，目的蛋白通常可以占细胞总蛋白的5 0 以上。尽管该 系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来消弱蛋白表达。 降低表达水平可以提高某些目的蛋白的可溶性部分的产量。另外，p e t 载 体系列还有带有6 h i s 标签，使表达产物能很方便地使用金属螯合物分离 材料进行分离，一步即可达到高纯度、高收率。 大肠杆菌表达体系也有其缺陷，例如：大肠杆菌的分泌能力不足，真 核蛋白质常形成不溶性的包涵体，表达产物需要经变性复性才恢复活性。 另外表达的蛋白质不能糖基化，蛋白质的n 端多余一个甲硫氨酸残基等。 为克服上述缺点，人们又陆续开发出枯草芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达 系统及酵母表达系统等等。 1 2 融合蛋白标签 蛋白质工程一直是生物技术研究的一个重要的方面。在科学研究中，获 得大量纯化的、可溶性的、有生物活性的蛋白质是蛋白质理化性质与功能研究的 基础。然而受到资源有限、成本昂贵等因素的影响，天然的蛋白质无法满足实际 需要。随着蛋白质工程和基因工程技术的发展，蛋白质的异源表达技术也日趋成 熟。尽管某些异源表达的蛋白质在理化性质和生物学活性上已接近于天然蛋白 质。但是据有关报道称在大肠杆菌中成功表达的蛋白质中，只有1 3 - - 。2 3 的 蛋白质具有可溶性，大多数蛋白质特别是一些具有重要生物活性的蛋白如蛋白激 酶、磷酸化酶、细胞膜相关蛋白等都是以不可溶、无生物活性包涵体形式存在。 虽然可采用强变性剂溶解包涵体并在体外复性得到有活性的蛋白，但存在步骤繁 琐、复性效率低( 只有原来的2 0 ) 等诸多问题。通过改变宿主菌、优化培养条 件、改变培养基成分及使用偏爱密码子等来提高蛋白的可溶性，但是这些方法并 不通用。如何实现高通量、可溶性并具有生物活性的异源表达产物一直是众多研 究者孜孜不断追求的问题。 融合标签( f u s i o nt a g ) 技术是2 0 世纪末兴起的一种基于报告基因的重 组d n a 技术，主要是在靶蛋白编码基因的3 端或5 端融合某种标签蛋白的 编码基因，通过合适的宿主菌来表达杂合蛋白质【13 1 。融合标签不仅可提高 蛋白的可溶性表达，还有利于蛋白的分离纯化，同时也为探索蛋白的功能、 分布等生物学信息提供了有力的手段。 1 2 1 融合标签表达的优点及特点 融合标签技术最早被用来在原核宿主细胞( 主要是大肠杆菌) 中表达真 核蛋白，如胰岛素、生长抑制素等。随着技术的发展，融合标签技术【1 4 】已 被广泛用于细菌、酵母、昆虫、哺乳动物等表达系统中。与传统技术相比， 融合标签技术有以下优点：有利于外源真核基因的高效表达，外源基因 二级结构有时可能会干扰核糖体与其结合位点的接触进而影响其表达。但 如果其结合位点处的基因序列完全是宿主细胞自身的话，这种情况就有可 能避免。避免重组蛋白的降解，外源蛋白特别是那些分子量较小的蛋白， 易被宿主细胞内的蛋白酶所降解。如果外源与宿主的一个蛋白融合在一起， 从而保护外源蛋白不被降解；重组蛋白表达形式可控性，外源基因在大 肠杆菌中有包涵体表达和可溶性表达两种形式，各有优缺点。包涵体表达 的蛋白产量高不易降解。而且使目的蛋白以无活性的包涵体形式存在是表 达对宿主细胞有毒害作用的蛋白质的最佳形式。缺点是包涵体内的蛋白需 要变性、复性等恢复其活性，因而程序较复杂，且活性较低。可溶性表达 虽然可以获得正确折叠的有生物活性的重组蛋白，但产量低、易降解，并 9 综述 且可溶性表达不能用于生产对宿主有毒的重组蛋白。 1 2 2 融合标签的分类 随着技术的发展，越来越多的融合标签不断涌现，但是它们却有着诸多 共同点：纯化方便，通常采用一步纯化即可较高纯度的融合蛋白；融 合标签便于切除，融合标签的加入有可能对目的蛋白的三维结构和生物活 性产生影响，需要将其切除；适用于大量不同蛋白质的表达；一般来说， 对于特定的目标蛋白很难决定采用哪种标签，有时需要连用多种融合标签。 根据融合标签在分离纯化中的作用的不同，一般分为增溶标签和纯化标 签两种，但有些融合标签兼具两方面的功能。 1 增溶标签 d s b a d s b a ( d i s u l f i d eb o n df o r m a t i o np r o t e i na ，d s b a ) 是一个分子量为2 1 1k d a 的单体蛋白【1 5 】，存在于大肠杆菌周质腔内，可催化二硫键的形成保证了新生多 肽可及时正确的折叠。研究发现，d s b a 具有提高外源蛋白在大肠杆菌中的可溶 性【1 6 1 刀表达的能力，而且多种蛋白也已在其的帮助下实现了高通量的可溶性表 达。将d s b a 的突变体【1 6 1 d s b a m 哦作为n 端融合标签与i f g 结合蛋白3 ( i g f b p 3 ) 、 人鼻病毒3 c 蛋白酶和绿色荧光蛋白( g f p ) 等基因进行融合表达，发现其可溶 性都大大增加，每个蛋白在3 7 0 c 条件下