（微生物学专业论文）白藜芦醇的酵母菌发酵生产及减肥机制研究.pdf

山东大学硕士毕业论文 摘要 白藜芦醇存在于多种植物中，其中中药虎杖和葡萄中的含量尤为丰富，是一种 天然的小分子多酚类化合物。现有白藜芦醇的提纯合成法主要是天然植物提取法和 化学合成法，都由相对局限性，因此本论文对首株重组酵母菌产白藜芦醇的发酵条 件进行讨论，旨在为开发微生物发酵生产白藜芦醇的新方法打下理论基础，同时对 白藜芦醇的减肥效果和机理做了初步研究。 首先对可用于发酵生产白藜芦醇的s a c c h a r o m y c e s c e r e 订s k z ef y 2 3 重组菌株的 发酵条件进行了研究。本章先建立h p l c 检测白藜芦醇的方法，接着检测菌株f y 2 3 在原培养条件下白藜芦醇的产量，最后研究了一些重要因素对发酵的影响，以期得 到生产白藜芦醇的较优条件。结果表明：培养基选用y p d 培养基，其中碳源选用 1 4 的葡萄糖、氮源利用蛋白胨当种龄为3 6 h ，接种量为6 ，培养基的初始p h 值为5 0 ，培养温度为3 0 1 2 ，摇床速度为2 0 0t p m m i n ，整个发酵过程的时间为7 2 h 时，获得白藜芦醇的产量最高，可达1 9 1 3u g l 接着讨论自藜芦醇的减肥效果。首先采用高脂饲料建立肥胖小鼠模型，同时， 通过给水口服方式用白藜芦醇对饮食诱导的肥胖鼠进行干预。经过1 8 周喂养后，对 给药组与高脂肪对照组进行体重、脂肪含量、血清总胆固醇和低密度脂蛋白、全视 野内脂肪数目等指标的比较，观察白藜芦酵的减肥作用。结果发现：白藜芦醇可使 肥胖小鼠的体重减轻约5 克左右，脂肪含量减少5 克左右，全视野内脂肪小型细胞 数目增加、脂肪细胞直径变小；降低肥胖小鼠血清血清总胆固醇和低密度脂蛋白水 平，与此同时发现自藜芦醇干预后的小鼠对胰岛素敏感性增强。因此证明白藜芦醇 对高脂食物诱导肥胖有一定的抑制作用。 最后部分讨论白藜芦醇减肥可能的机制。在能量摄入和能量消耗两方面进行了 减肥效果的讨论。首先排除减肥作用是由于抑制食欲而引发的可能性；进一步通过 检测体温的变化，发现给药后的小鼠产热增加，即证明白藜芦醇的减肥作用是在不 影响能量摄入的同时通过增加能量消耗而达到的；继而通过检测脂肪组织中产能细 胞器线粒体面积的增加、生热相关蛋白表达的增多进一步讨论了白藜芦醇减肥作用 t 山东大学硕士毕业论文 的分子机制。由实验结果推测：白藜芦醇可能是通过促进脂肪组织q = s i m 、p g c - 1 、 u c p l 蛋白表达，提高小鼠产热，加快能量消耗，提高代谢率从而达到减肥的效果。 关键词：白藜芦醇；重组酵母菌；食物诱导肥胖模型；减肥 口 山东大学硕士毕业论文 a b s t r a c t a sap l a n tm i c r o c o m p o n e m , r e s v e r a l z o li sap o l y p h e n o l i cc o m p o u n dp r o d u c e db y s e v e r a ls p e c i e sa n df o u n de s p e c i a n yi nh uz h a n ga n dg r a p ea n dt h e r e f o r ec a bb ep r e s e n t i nh u m a nd i e to rb e v e r a g e ( r e dw i n e f o ri n s t a n c e ) t h e r e 矾t w om e t h o d st op r o d u c e r e s v e r a t r o l ，n a t u r a lp l a n te x l x a c ta n dc h e m i c a ls y n t h e s i s h o w e v e r , t h e ya l lh a v e s o l t i c d i s a d v a n t a g e s s oo u rs t u d yc o n c e n t r a t e do ns t u d y i n gt h ef e r m e n t a t i o n n & f i e n so f r e c o m b i n a n ty e a s tw h i c hc a np r o d u c er e s v e r a t r 0 1 m e a n w h i l ei t sa n t i - o b e s i t ye f f e c ta n d p r e l i m i n a r ym e c h a n i s mw e f es t u d i e d f i r s t l y , t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f $ a c c h a r o r a y c e s c e r e v i s i a ef y 2 3w h i c h 啪 p r o d u c er e s v e r a t r o lw a so p t i m i z e d t od e t e c tt h er e s v e r a t r o l , h p l cm e t h o d w a s s e tu p t h e nt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ed e s i g n e d 硒f o l l o w s ：c u l t u r em e d i u i m y p d m e d i u m , w h i c hc o n t a i n s1 4 g l u c u s e 硒c a r b o m cs o u r c e v v h j l et h ec u l t i v a t i o n c o n d i d o n s _ 一s e e d a g e3 6 h , c u l t i v a t i o np h 5 0 ，3 0 c ，2 0 0r p t w m i n 7 2 h t h ec o n t e n to f r e s v e r a t r o lr e a c h e d1 9 1 3 u g l t od e t e c tt h ea n f i - o b e s i t ye f f e c to fr e s v e r a t r o l ，t h ed i e t i n d u c e do b e s i t y ( d l o ) m i c e m o d e lw a se s t a b l i s h e db yh i 曲f a tf o o d t h e nr e s v e r a t r o lw a sa d m i n i s t r a t e do r a l l yi n w a t e r a f t e r1 8w e e k s 。t h eb o d yw e i g h t , f a tc o n t e n t , s e r u mc h o l e s t e r o la n dl d l ，n u m b e r o ff a tc e l l sp e ru n i tv i s u a lf i e l dw e s e l e c t e dt oo b s e r v et h ea n t i o b e s i t ye f f e c to fd i o m i c e r e s u l t s ：r e s v e r a t r o lc o u l dl o w e rt h eb o d yw e i g h ta n df a tc o n t e n ta b o u t5g r a m , d e c r e a s et h ed i a m e t e ro ff a tc e l l ，l o w e rt h el e v e lo fs e r u mc h o l e s t e r o la n dl d l ，w b i l et h e i n s u l i ns e n s i t i v i t yw a si m p r o v e dal o t c o n c l u s i o n ：r e s v e r a t r o lh a sa n t i - o b e s i t ye f f e c ti n d i e t - i n d u c e do b e s i t y f i n a l l y , t h ep r e l i m i n a r ym e c h a n i s mw a sd i s c u s s e d e n e r g yb a l a n c ee x i s t sw h e n e n e r g yi n t a k ea n de x p e n d i t u r ea l es t e a d y t h a ti st os a y , f a ta c c u m u l a t i o ni sb e c a u s eo f e n e r g yi m b a l a n c e s oi nt h ee x p e r i m e n t se n e r g yi n t a k ew h i c he q u a l st od i e t a r ye n e r g y i n t a k ea n de n e r g ye x p e n d i t u r eo rt h e r m o g e n e s i sw e r ed e t e c t e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e r e s v e r a t r o ls t i m u l a t e dt h e r m o g e n e s i sw i t h o u ta f f e c t i n ge n e r g yi n t a k e i nt h ef u r t h e rs t u d y ，t h em i t o c h o n d r i aw a sd e t e c t e du n d e re l e c t r i c - m i c r o s c o p e ， m e a n w h i l e g r o u p so fo b l i g a t o r ye n e r g yr e l a t e dp r o t e i ns u c ha sp g c - 1 、u c p lw e r e r - ， l 山东大学硕士毕业论文 o b s e r v e d r e s u l t ss h o wt h a tr e s v e r a t r o ls t i m u l a t e dt h em i t o c h o n d r i af o r m a t i o n a n d i n c r e a s e dt h ep g c - 1 ，u c p le x p r e s s i o na tp r o t e i nl e v e l s ow eg e tt h ec o n c l u s i o n ： r e s v e r a t r o lh a st h ea n t i - o b e s i t ye f f e c tm a yt h r o u g hi n c r e a s i n gt h ee n e r g ye x p e n d i t u r e k e yw o r d s ：r e s v e r a t r o l ，r e c o m b i n a n ts a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e , d i e t - i n d u c e d o b e s i t ym i c e , o b e s i t y - i v - 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的 研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声 明的法律贵任由本人承担。 论文作者签名：日期：2 “6 j ，玛 。关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：独基导师签名：氇 遣日期：迹：1 7 ， 山东大学硕士毕业论文 1 白藜芦醇 第一章前言 白黎芦醇( r e s v e r a l r o l 。r v ) ，。化学名称为芪三酚( 3 ，4 ，5 ，一三羟基芪) ， 分子式c 1 4 h 1 2 0 3 ，分子量2 2 8 2 5 ，如图1 1 所示。 h o h o t r a n s c e s v e r a t r o l ( a c a v em o l e c u 埘 c 曲e s v e m t r o l ( n o na c t i v em o l e c u l e ) 图1 1 反式、顺式白藜芦醇的结构式 1 9 4 0 年首次从毛叶藜芦的根部分离得到的白藜芦醇甙1 1 】，其后发现白藜芦醇 广泛存在于种子植物中闭，目前已知有7 0 多种植物中含有白藜芦醇，其中在葡 萄、花生，桑椹以及中药虎帐中含量特别丰富。它是一种活性非黄酮类多酚化合 物，呈白色针状晶体，难溶于水，能溶于乙醇、乙酸乙酯，丙酮等极性强的溶剂 中；以游离态( 顺式、反式) 和糖苷结合态( 顺式、反式) 两种形式存在，反 式白藜芦醇在光照条件下容易变成顺式白藜芦醇。1 9 9 2 年在商业葡萄酒中首次 发现白藜芦醇。同一年科学界也确认了葡萄酒中存在着白藜芦醇i 习。1 9 9 5 年，日 本山犁大学科研人员进一步研究了葡萄酒中的白藜芦醇，确认该成分多存在于葡 萄果皮上，并以反式结构占主导地位。通过浸渍与发酵( 酒精发酵和苹果酸一 乳酸发酵) 进入酒中。白藜芦醇带有的葡萄糖配糖体称作云杉新甙，是中药“虎 杖根”的主要成份，云杉新甙在肠道内分离后成为白藜芦醇。红葡萄酒中自藜芦 醇含量平均为1m g l ，白葡萄酒中则约为o 2m g l 。 山东大学硕士毕业论文 2 白藜芦醇的研究现状 2 1 白藜芦醇的提取与合成 2 1 1 天然植物中提取 白藜芦醇作为植物体的一种次生代谢产物，在干燥虎杖根茎中的含量可达 1 4m g g ，在新鲜葡萄皮中的含量达到5 0 1 0 0u g ，g ，花生中也含有白藜芦醇， 其含量大致为2 5 7u g gm 。目前主要以含量相对较高的虎杖和葡萄皮为原料， 采用有机溶剂提取，高效液相色谱、硅胶柱层析或大孔吸附树脂吸附分离的方法 来提纯白藜芦醇。另外，逆流色谱是一种不用固态支撑体或载体的液液分配色谱 技术，在分离提纯虎杖中的白藜芦醇得到了较好效果。 白藜芦醇已经在1 2 科3 l 属7 2 种植物中被发现，因此植物提取法的优点在 于原材料来源广泛，但工艺流程复杂且提取纯度很难提高，此外对我国庞大的人 口数来说，可以从植物中提取的白藜芦醇还是很少的，今后应该在发挥资源优势 的同时，开发生产白藜芦醇的新工艺，提供更多富含白藜芦醇的天然植物。据报 道，洪江华光生物有限责任公司与湖南农业大学天然产物研究中心合作，共同研 制开发了一种新工艺。该工艺首次采用微生物发酵酶解技术，使一次性提取粗品 含量比传统工艺提高了1 倍，而且缩短了生产周期。目前，已有从虎杖中分离提 取得到2 0 9 9 纯度的产品。为开发新的生产工艺奠定了基础1 6 】。 2 1 2 化学合成 由于白藜芦醇在天然植物中的含量较低，且受到原料数量的限制，制约了其 产业化规模及其在医药、功能食品上的推广应用。因此化学合成法为生产白藜芦 醇提供了新思路。然而白藜芦醇化学合成十分困难，步骤复杂，且需要较高成本， 得率也不高。目前国内对这一方法研究还较少。据报道，李晓光等1 7 】以3 ，5 一二甲 氧基苯甲醛和对甲氧基苄基溴( 可由对甲氧基苯甲醛为原料制得) 进行w i t t i n g 反应、顺反异构化和去保护基三步反应，并分离提纯，制得9 8 白藜芦醇。 ， 山东大学硕士毕业论文 2 1 3 利用植物组织细胞培养技术生产白藜芦醇 随着现代生物技术的飞速发展，国内西北大学生命科学学院首先论证了植物 组织培养生产白藜芦醇新方法在理论上的可行性；白藜芦醇的产量是直接提取的 1 5 3 倍，生产不受季节的限制，可以人为的影响或控制植物组织的生长周期 上海纳贝生物公司利用植物细胞大规模培养技术将植物细胞在生物反应器中进 行培养来生产白藜芦醇，也最终实现产业化生产白葫芦醇。该技术以高产植物细 胞株筛选为重点，以植物细胞在生物反应器中大规模培养为核心，具有生产成本 低、产品品质好、不破坏自然资源等优势，为白藜芦醇产业化提供了新途型”。 z1 4 基因工程改造菌株产白藜芦醇 目前，国内的许多厂家在生产白藜芦醇，生产方法主要是利用天然植物提取 法和化学合成法，但只有为数不多的厂家能生产含量高达9 8 以上的高含量产 品，在国内市场上9 9 含量的高纯度的白藜芦醇的售价在3 2 0 0 0 元k g 左右，国 际市场上售价更高，因此亟待开发生产白藜芦醇的新方法唧。据报道，洪江华光 生物有限责任公司与湖南农业大学天然产物研究中心合作，共同研制开发了一种 新工艺。该工艺首次采用微生物发酵酶解技术，使一次性提取粗品含量比传统工 艺提高了1 倍，而且缩短了生产周期。目前，已有从虎杖中分离提取得到2 0 9 9 纯度的产品。为开发新的生产工艺奠定了基础嘲。 国外目前也有开发微生物发酵生产白藜芦醇的相关研究。为提高白葡萄酒和 红葡萄酒中自藜芦醇的含量，因此s p r e t o r i u s 教授研究组研究通过改造酿酒酵 母，得到世界上首株发酵可产生白藜芦醇的酿酒酵母菌r e c o m b i n a n t s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ef y 2 3 ，旨在与葡萄酒共同发酵中产生白藜芦醇，以此 提高白藜芦醇的产量。该重组酵母菌生产白藜芦醇的原理是通过苯丙氨酸代谢途 径( p h e n y l p r o p a n o i dp a t h w a y ) ，如图1 2 所示。合成白藜芦醇需要两个底物，即 丙二酰辅酶a ( m a l o n y l - c o a ) 和香豆酸辅酶a ( p - c o u m a r o y l - c o a ) 。其中丙二酰辅 酶a 是酵母菌已经有的，且参与脂肪酸的生物合成；香豆酸辅酶a 在酵母菌种并 不能合成，因此为了合成白藜芦醇，转入编码辅酶a 连接酶的基因4 c l 2 1 6 和白 山东大学硕士毕业论文 藜芦醇合成酶基因v s t l ，使重组酵母菌可以产生香豆酸辅酶a 和白藜芦醇。 土。phenyla。一lanine 上轴c州innmamx灿ate 3 ma。坦：!竺全、：、上=e 2 2 白藜芦醇的检测方法 目前，白藜芦醇的分析方法主要有高效液相色谱( r p l c ) 、毛细管电泳 ( h p c e ) 、薄层扫描( 1 r i c ) 和气相色谱一质谱联用( g c m s ) 等埘。 i - i p l c 是中药制剂质量评价中常用的分析方法，也是目前企业及科研单位精 确定量白藜芦醇最主要的方法【1 3 1 。h p l c 以其高效、高速、微量和低消耗等优 点在分析领域中占有重要的应用和发展前景。近期发展起来的非水毛细管电泳法 ， 山东大学硕士毕业论文 ( n a c e ) 突破了普通毛细管电泳法被分析物应有一定亲水性的要求限制，拓宽了 毛细管电泳的分析领域。在对二苯乙烯类化合物的含量测定研究中，t l c 法是 较早应用的分析方法。有研究应用薄层扫描法和薄层层析一紫外分光光度法测定 白藜芦醇，所得结果基本一致，证实了薄层扫描法测定该化合物的准确性和可行 性。气一质联用( c , c - m s ) 分析的方法对葡萄酒中白藜芦醇的含量测定。此法进样 量小，能很好的分离白藜芦醇及其顺反异构体。另外，还有报道用二级管阵列检 测结合反相梯度高效液相色谱法进行测定；灵敏度较高，张宏芳等还建立了二次 微分简易示波伏法测定葡萄酒中自藜芦醇含量的分析方法1 6 】。 2 3 药理作用 自1 9 4 0 年首次发现该成分以来，1 9 6 3 年n o n o m u r a 等提出白藜芦醇是某些 天然药物治疗炎症、心脏疾病，调节脂类等代谢等的有效成分。1 9 7 6 年l a n g c a k e 和p r y c e 等发现在葡萄叶片中存在白藜芦醇，其合成在遭受紫外照射、机械伤害 及真菌感染时急剧增加，能抵抗葡萄病原菌的侵染，被称为植物抗菌素，此后自 藜芦醇开始受到葡萄育种学家和植物病理学家的重视。其药理作用逐渐受到医药 界的重视，迄今为止的研究表明，白藜芦醇具有抗肿瘤、抗氧化、抗心血管疾病、 抗细菌、抗炎、抑制血小板凝集、调节免疫、化学预防等作用【1 4 】已经成为科 学家们高度重视的天然活性成分，且有很大的药物价值和市场前景。目前对白藜 芦醇的研究主要集中在以下几个方面： 2 3 1 降低心血管疾病发病率 研究表明饮用红葡萄酒，有利于保护心血管【嘲，适度饮红葡萄酒者较不喝 酒者患冠心病的死亡率低i 阍。有个很著名的“法国奇迹”( f r e n c hp a r a d o x ) 的说 法，即法国人的饮食中高脂肪、高蛋白、高能量，但心血管疾病的发病率却要 比预期的发病率低4 0 。流行病学家研究认为这可能与法国人适度饮用红葡萄 酒有关，而红葡萄酒中可能的有效成分就是白藜芦酵。主要表现为对脂类代谢 和血小板凝集的影响，从而预防冠心病、动脉粥样硬化等疾病。北京中医药大 山东大学硕士毕业论文 学多例中老年脑力劳动者，每天坚持睡前饮用红葡萄酒1 小杯，结果发现睡眠 质量提高了，冠心病也得到了控制n 7 1 2 3 2 抗肿瘤、抗诱变作用 j o h n p e z z u t o 教授证明白藜芦醇能有效抑制与癌症各过程相关的细胞活动， 也就是说，在癌症发生的起始、增进和扩展三个主要阶段，白藜芦醇都有防癌 活性，并对癌症发生的三个阶段全部抑制嗍。白藜芦醇已经成为研究人员最感 兴趣的抗肿瘤药物之一。白藜芦醇可以抑制很多肿瘤细胞，其中包括淋巴癌、 骨癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌，前列腺癌、脑瘤、子宫肌瘤、肝癌、 肺癌、富颈癌、黑素瘤等。且可以作用于肿瘤形成的每一个步骤，包括i n i t i a t i o n ， p r o m o t i o n 和p r o g r e s s i o n 。目前认为可能是通过抑制自由基的形成，抑制 c y c l o o x y g e n a s e 、h y d r o p e r o x i d a s e 和细胞色素p 4 5 0 的活性，抑制细胞增殖，诱 导细胞休眠、凋亡或分化，而实现抑制肿瘤的。 2 3 3 对脂代澍的影响 传统中药虎杖的主要有效成分为白藜芦醇甙，用于治疗皮炎、脚癣、脓肿 等疾病。八十年代，在研究从虎杖中分离得到的白藜芦醇的脂类代谢的影响时 发现，脂肪肝和高血脂的兔子服用白藜芦醇能抑制甘油三酯和总胆固醇在肝脏 的沉积。静脉注射白藜芦醇的小鼠，其肝脏由软脂酸形成的脂肪大大减少”， 同时白藜芦醇还具有增加血液中高密度脂蛋白( h d l ) 的比例、阻止低密度脂蛋 白( l d l ) 的氧化等作用 2 0 l 。 2 3 4 抗氧化作用 近年来发现，白藜芦醇在1 3 u g m l 时，能明显抑制大鼠红细胞的自氧化溶 血和由h 2 0 2 引起的氧化溶血；对小鼠心、肝、脑、肾的体内外过氧化脂质的产 生有明显抑制作用2 ”。此外对多种活性氧具有清除作用，减少氧自由基产生的 可能性，同时也是各种自由基有效的清除剂，包括羟基自由基、超氧阴离子、 金属或者酶诱导产生的自由基以及细胞自身的自由型2 羽。 山东大学硕士毕业论文 2 3 5 抑菌作用 j e a n d e r t 和s b a g h i 等的研究表明，葡萄受到葡萄霜霉菌侵染后，离坏死 果实较近且没有受到侵染的部位，白藜芦醇的含量很高，能有效地抑制坏死区 的扩展。另外还可以抑制h e f i c o b a c t e rp y l o r i 。白藜芦醇最初作为一种葡萄类植 物在受到真菌赶热闹、紫外线照射等不利条件作用时产生的植物抗菌剂而为人 所认识。p o n t 等侧认为自藜芦醇抗灰茵的活性与其电子特性、分子体积及亲脂 性大小有关，它可能破坏灰菌细胞膜并干扰电子传递系统的蛋白质。 2 - 3 6 抗血小板凝集血 小板凝聚由多种刺激因子引起，其中一个机制是花生四烯酸代谢主要产物血 栓烷引起血小板凝聚，白藜芦醇能调节花生四烯酸代谢产物的形成矧，从而对腺 嘌呤核苷二磷酸( a d p ) 、凝血酶和胶原引起的血小板凝聚有抑制作用。 2 3 7 保护线粒体 通过缺氧一再给氧的大鼠模型，研究大鼠的脑组织中分离线粒体，发现白藜 芦醇通过浓度依赖方式完全阻滞细胞色素c 的释放，在浓度1 n m o l 时可以显著 降低氧化物阴离子的生成。缺氧：再给氧所造成的线粒体保护膜破坏在白藜芦醇 0 1 微摩尔的浓度受到大约7 0 的保护。在n a d h 和细胞色素c 的存在下，一 个低的半数有效浓度1 8 3 4 p m 的白藜芦醇可以阻滞线粒体的耗氧量。白藜芦醇 保护线粒体作用的三大机制：抗氧化性质、e o m p l e x l i i 的作用和细胞膜稳定作 用。 2 3 8 抑制脂肪细胞的形成 白藜芦醇如上所述有降血脂的功能，可以降低血清中胆固醇及甘油三酯的含 量。最近有报道发现自藜芦醇通过激活s i r t l 可以抑制前体脂肪细胞的分化，减 少脂质的积累【4 2 1 。该研究发现，白藜芦酵作为s i r t l 的激动剂可以促进其蛋白量 表达在细胞中的增加，而s i r t l 的增加抑制了脂肪细胞的分化。结果显示，s i r t l 对脂肪细胞的抑制作用可能使通过p p a r 一? 实现的。而p p a r 一? 以往研究表明是 山东大学硕士毕业论文 治疗二型糖尿病的作用靶点【4 3 】，且其作为作用于外周脂肪细胞的调节因子可以调 节体脂的积累。 3 肥胖及其研究现状 3 1 肥胖 肥胖是体内脂肪堆积过多和( 或) 分布异常的一种状态。1 9 9 7 年，世界卫生组 织( w i - z o ) 将肥胖明确宣布为一种疾病。按照w h o 的定义。肥胖症作为一种全身 内分泌代谢疾病，不但影响体态和活动，而且与高脂血症、动脉粥样硬化、冠心病、 糖尿病、癌症、痛风、脂肪肝、内分泌失调、肺泡低换气综合征、胆囊炎等密切 相关，以及抵抗力低下而易感染，故有损健康和有碍延寿1 2 5 ) 。 通过计算患者的体质指数( b m i ) 可诊断是否肥胖，如表1 1 所示。人的体 重公斤数除以身高的平方数即体质指数( b m i ) 。用公式表示：b m i ( 体质指数) - 体重( k g ) 身高2 ( m 2 ) 表l 1 成人b m i 指数分类标准 目前肥胖的发病率正在逐年增加，据统计全球目前有3 亿人患肥胖症，1 3 亿 人超重。美国肥胖人口在过去的2 0 年中急剧增加。1 9 8 5 年时，仅有几个州有肥 胖人群；2 0 0 3 年，1 5 个州的比例为1 5 1 9 ，3 1 个州达到2 0 - 2 4 ，另外还有四 个州的比例超过2 5 。2 0 0 4 年“中国居民营养与健康现状”统计表明，中国超重 山东大学硕士毕业论文 人口超过2 亿，患肥胖症人口超过6 千万，成人超重率达2 2 8 ，肥胖率为7 1 。与1 9 9 2 年相比，成人超重率上升3 9 ，肥胖率上升9 7 。专家预测，在未 来十年，中国肥肥胖人群将会超过2 亿，肥胖已成为中国面临的一个严重的公共 健康问题。 世界卫生组织宣布肥胖已成为全球最大且迅速增加的流行性慢性疾病。不但 肥胖本身对健康有损害，更为严重的是增加了相关疾病的发病率。肥胖相关疾病 或伴发病常见者包括：i i 型糖尿病和( 或) 糖耐量减低、冠心病、高胰岛素血症，血 脂异常和高血压、骨关节病、高尿酸血症、痛风、胆囊疾病( 胆结石、胆囊炎) 、 呼吸困难、睡眠呼吸暂停、下背部疼痛、扁平足、生殖激素异常生殖功能降低、 多囊肿巢综合征等。肥胖还增加发生其他健康问题的危险性，诸如癌肿( 绝经后 乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌) 以及与母亲肥胖相关的胎儿缺陷等。以上相关疾 病的发生率随体质指数的增加而上升。国际医学界呼吁：肥胖是温和杀手，慢慢 使人出现糖代谢紊乱、脂质代谢紊乱、心血管紊乱、脂肪肝紊乱等功能障碍，直 至生命死亡。 3 2 肥胖的研究现状 3 2 。1 肥胖的发病机制研究 一般来说，当机体经常处于正的能量平衡状态，使能量的获得大于消耗时促 进发胖。体内有许多调节机制促进进食与产热，进而调节体脂量，使人们保持正 常体重。当这些调节机制异常时，能量平衡状态被打破，导致肥胖发生。经过研 究有近2 0 0 个肥胖相关基因被发现。这些机制主要包括以下几个方面：主要作 用于下丘脑的生物因子：神经内分泌递质神经肽y ( n p y ) 、阿片促黑激素皮质 素原( p o m c ) 、黑色素细胞刺激素( a - m s h ) 、a g r p 、增食因子( o r e x i n ) 、5 羟色胺、肠道分泌的脑肠肽，脂肪细胞分泌的瘦素等；交感神经、下丘脑一垂体一 肾上腺轴等反馈机制均能调节机体能量平衡。主要作用于外周脂肪细胞的调节 因子有：肿瘤坏死因子a 、解偶联蛋白( u c p ) 、还可通过激活或抑制脂肪细胞 上的b 3 肾上腺素受体和过氧化物酶增殖物激活受体g a m m a ( p p a r 一? ) 及其转录 一 山东大学预f 。毕业论文 骨骼肌、脾，胸腺等多种组织中表达，对人体代谢率有重要影响，激素敏感脂肪 酶( h s l ) 和u c p 2 表达的增多，可是使白色脂肪中的脂肪运动增强，减少脂肪 的堆积；u c p 3 在骨骼肌细胞中含量很高，u c p 3m r n a 水平的升高可是大鼠的 静息代谢率增加。u c p i 的产热和耗能靠交感神经调节。u c p 3 基因有一个过氧 化物酶增殖物激活受体y ( p p a r - y ) 的反应单位p p r e ，与激活的过氧化物酶增殖 物激活受体y ( p p a r - y ) 结合可调节其基因的转录。甲状腺素、糖皮质激素、游 离脂肪酸、艮一肾上腺素受体激动剂、热休克蛋白、瘦素和饥饿都可促进u c p s m r n a 在组织中表达。在寒冷刺激下，体重正常的鼠体内血中游离脂肪酸上 升，u c p s 表达增多；而发生瘦素抵抗的d b d b 肥胖鼠无此现象，提示u c p s 功能 与白色脂肪组织的脂解作用有关。 ( 3 ) 过氧化物酶增殖物激活受体y ( p p a r - 一) p p a r 是细胞核内f 体激素受体，可被过氧化物酶增殖剂( p p l 激活。同其它 核内受体一样，p p a r 也是配体激活转录因子，体内多种脂肪酸及其代谢产物可激 活p p a r 。活化的p p a r 通过与位于某些基因上游的特异d n a 反应元件( p p r e ) 结合，调控基因表达。p p r e 基因存在于u c p 家族、脂肪辅酶a 氧化酶等基因中。 p p a r 有3 个亚型a 、6 、t ，分别在不同组织表达。在人类p p a r c t 主要与肝内腊 类代谢及免疫反应有关。p p a r - y 主要在脂肪及免疫系统表达，与脂肪平衡、诱导 多种组织细胞脂肪细胞分化及胰岛素有关。p p a r - 7 有2 种异构体p p a r - - 7 1 及 p p a r - 7 2 ，其6 p p p a r - y 2 高浓度表达于脂肪组织1 3 0 1 ，与肥胖关系密切。p p a r - t 2 的第11 5 位氨基酸发生改变，导致p p a r 吖持续激活，加速脂肪细胞分化，患者表现 为严重肥胖，但不伴有高胰岛素血症。人骨骼肌中的p p a r - 7 表达主要受胰岛素所 控制，在伴有高胰岛素血症肥胖或2 型糖尿病患者中表达上调，p p a r - t m r n a 水 平与b m i 及空腹胰岛素浓度呈正相关。g a t a - 2 和o a t a 3 存在于白色脂肪组 织，可调节p p a r - 7 2 启动基因，并抑制前脂肪细胞转化为脂肪细胞口1 1 。 ( 4 ) p p a r - 丫转录共激活因子( p g c - i ) 许多生物功能的实现与转录因子有关。目静p g c 1 作为一个共转录因子家 族，在肥胖、糖尿病、心肌炎等疾病中调节代谢及保持糖、脂和能量平衡的作用 山东大学硕卜毕业论文 是一个研究热点。这些研究也为发展新的疾病治疗手段提供了新的靶点。p g c 1 是p p a r - t 的共转录激活因子，在细胞整体循环代谢中起到信号调节作用。其中 最主要的是调节线粒体代谢和保持糖、脂和能量代谢的平衡。p g c 1 有两个亚基： a 和1 3 。其中p g c - l a 是在褐色脂肪中发现与p p a r 有相互作用。p g c 1 可与许 多不同的转录因子相互作用，从而在不同的组织中发挥不同的作用。p g c 1 可以 通过配体结合方式与核受体家族成员结合，如与p p a r - y 结合可以促进u c p i 的产 生。此岁f p g c l 还可以与核外受体家族结合执行功能，如与s r e b p 结合促进脂肪 和脂蛋白的生成、与f o x 0 1 结合增加糖异生p 2 1 。 最近报道有关于p g c 1 a 缺失的小鼠其线粒体相关基因表达减少。褐色脂肪 中p g c l 是褐色脂肪细胞分化必不可少的分子，是控制适应性产热相关蛋白产 生的分子开关，它可以促进能量摄入，线粒体脂肪酸氧化、u c p i 诱导的能量产 生p ”。同时发现冷环境可以促进p g c 1 的表达，而当p g c 1 缺失时，小鼠对冷 的耐受能力急剧下降，这可能是由于损伤了线粒体中脂肪酸氧化和电子转运的功 能，同时伴随u c p i 表达量的减少，同样的结果在人体内也有发现0 4 1 。此外， p g c l 过量表达不仅可以诱导u c p i 表达量的增加而且能促进白色脂肪向褐色 脂肪的分化1 3 ”6 】。另夕b r o d g e r 教授发现s i r t l 和p g c 1 有相互作用：饥饿时的营 养信号可激活肝脏 s i n l 蛋白，此时s i r t l 使p g c 1 去乙酰化后与其相互作用达 到调节糖异生作用，而不影响p g c 1 对线粒体的作用【翊。 ( 5 ) 葡萄糖转运子- 4 ( g l u t - 4 ) g l u t - 4 对胰岛素敏感。可将胞外葡萄糖转运至胞内，介导葡萄糖的吸收过 程。这一过程受p k b 调节。d b d b 鼠p k b 酶活性降低，阻断葡萄糖转运，抑制葡 萄糖利用，导致胰岛素抵抗。 【6 】脂酶 在胰腺和胃肠中有胎酶可将食物中的脂肪分解为小分子以利于吸收。抑制脂 酶可减少脂类物质的吸收，降低血中t g 和l d l ，动员内源性脂肪，起到减肥作用，而 且不会产生难以忍受的不良反应或成瘾性，但可能会影响脂类维生素的吸收。 山东大学硕士毕业论文 3 2 2 肥胖的治疗及减肥药的开发现状 由于肥胖症发病率的迅猛增长及其对人们健康的严重威胁，对肥胖症的治疗 引起越来越多研究者的注意。据不完全统计，全球用于减肥治疗的各种费用已高 达数千亿美元；美国每年花在肥胖防治与研究上的费用占医疗总支出的2 5 左右。减肥方法层出不穷，目前肥胖的治疗主要包括三方面内容，即行为治疗、 药物治疗及手术治疗，其中行为治疗的长期耐受性差，而手术治疗则较难于被广 泛的接受。因此，药物在肥胖症的治疗中占有越来越重要的地位。中国营养协会 推荐的最为科学的减肥方案是“低脂饮食+ 适当运动+ 安全有效的药物”。 目前开发的减肥药物分为三大类：抑制食欲的药物、增加能量消耗的药物和 抑制肠道消化吸收的药物。减肥西药的研究中集中在：肾上腺素能药物，该药物 直接作用于中枢神经系统( c n s ) ，起到抑制食欲减少摄食的作用；5 羟色胺受 体激动剂，这类药物作用于c n s 的5 一羟色胺受体，增加饱腹感而起到抑制食欲 的作用；单胺再摄取抑制剂，西部曲明是该类药物的代表，它能减少摄食，增加 产熟；脂酶抑制剂，奥利司他是该类药物的代表，它能抑制胰腺利胃肠中的羧基 脂酶及磷脂酶a 2 活性，从而抑制肠道对脂肪的吸收，降低体内脂肪储存而减轻 体重【3 8 】。 新开发的减肥药品种类繁多，不仅反映了人们治疗肥胖的强烈要求，更加引 起了国家对减肥药市场的关注。市场销售的减肥药物由于引发了很多副作用且治 疗效果差，因而引起了人们对减肥药物和保健品专业性的质疑。问题的症结集中 在缺少对药物疗效和安全性的研究。因此，1 9 9 2 年w e i n t r a u b 报道通过建立多种 基于遗传性肥胖建立的肥胖动物模型可以验证部分药物的治疗作用，由此改变了 人们的怀疑，也使得可以长期使用的减肥药物和保健品的研究、开发迅速增加【聊。 美国国会举行关于滥用减肥药的听证会，而且对减肥药物的使用逐渐形成了越来 越严格的规定。目前被美国食品及药物管理局( f d a ) 批准的具有较好疗效性和 安全性的减肥药仅有两种，一种是西布曲明，另一种是奥利司他。但且治疗周期 长，且都有不良反应。因此，亟待在此基础上开发更加安全有效的减肥药物和保 健品。 对减肥药的开发现主要集中在干扰c n s 的正常通路，因而极易引起副作用。 山东大学硕士毕业论文 因此，目前正致力于寻找新的减肥作用靶点，即直接作用于脂肪细胞因子。如b ，一 肾上腺素受体( 3 3 - a r ) 激动剂的研究c l 3 1 6 2 4 在肥胖和糖尿病的动物模型显示 有抗肥胖、糖尿病，改善胰岛素抵抗作用 4 0 j ，鉴于此p 3 - a r 激动剂的研究开发也 是减肥药筛选的新思路，开发了a d 9 6 7 7 、c p 3 3 1 、6 7 9 等二十余种药物，它 们对b ，a r 具有高度选择性，在动物模型中效果肯定。另外，多酚类物质减肥作 用的研究也小有成果，现已经开发出减肥保健品茶多酚( e g c g ) 研究发现， 长期服用茶多酚( 4g d ) 不仅可以减少体内脂肪的积累，而且对促进肝脏中脂质 的代谢都有促进作用。但其缺点是作用时间长【4 ”。因此，现在仍然缺少一种有 效的可供长期使用的减肥药物，开发有效的减肥药物是亟待解决的问题。减肥药 的市场需求量大，开发减肥药物具有广阔的市场前景。 4 论文的研究意义和主要内容 4 1 研究意义 随着白藜芦醇研究的进一步深入，由于其确切的保健作用及纯天然的来源途 径，符合人们对保健产品的新要求，市场需求在逐步扩大，尤其是在国内，有关 白藜芦醇产品开发的前景将十分广阔。然而其价格却居高不下，国外市场以s i g m a 公司为例，价格为6 0 0 0 元克；国内提取天然白藜芦醇生产厂家甚多，但只有为 数不多的厂家能生产含量高达9 8 以上的高含量产品，在国内市场上9 9 含量 的高纯度的白藜芦醇的售价在3 2 0 0 0 元k g 左右。因此开发微生物发酵生产白藜 芦醇的方法，对于提高产量、降低成本有重大意义，将在药品、食品和保健品等 领域为人类提高生活质量作贡献。 白藜芦醇的以往的研究集中于降低心血管疾病发病率、抗肿瘤、抗氧化等方 面的研究，关于减肥效果的研究在国内外尚属首次。由于它是一种天然植物中含 有的物质，因此安全性高。如果有减肥效果，将是极其瞩目的一种安全可靠的减 肥制品，有广阔的市场前景。 山东大学硕士毕业论文 4 2 主要研究内容 白藜芦醇存在于多种植物中，其中中药虎杖和葡萄中的含量尤为丰富，是一 种天然的小分子多酚类化合物。现有白藜芦醇的提纯合成法主要是天然植物提取 法和化学合成法，都由相对局限性，因此本论文对首株重组酵母菌产白藜芦醇的 发酵条件进行讨论，旨在为开发微生物发酵生产白藜芦醇的新方法打下理论基 础，同时对白藜芦醇的减肥效果和机理做了初步研究。 本文主要分为三部分： 第一部分，研究微生物发酵生产白藜芦醇，对获得的可用于发酵生产白藜芦 醇的s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ef y 2 3 重组菌株的发酵条件进行了研究。本章首先 建立h p l c 检测白藜芦醇的方法，接着检测菌株f y 2 3 在原培养条件下白藜芦醇 的产量，最后研究了一些重要因素对发酵的影响，以期得到生产白藜芦醇的较优 条件。结果表明：培养基选用y p d 培养基，其中碳源选用1 4 的葡萄糖、氮 源利用蛋白胨。当种龄为3 6 h ，接种量为6 ，培养基的初始p h 值为5 0 ，培养 温度为3 0 c ，摇床速度为2 0 0r p m m i n ，整个发酵过程的时间为7 2 h 时，获得白 藜芦醇的产量最高，可达1 9 1 3u g l 。 第二部分，为了研究自藜芦醇的减肥效果，首先利用高脂食物诱导肥胖小鼠， 建立肥胖模型。通过给水口服方式用白藜芦醇对肥胖鼠进行干预。经过1 8 周喂 养后，对给药组与高脂肪对照组进行外形，体重、生理生化等指标的比较，验证 自藜芦醇的减肥效果。 第三部分，讨论了白藜芦醇减肥可能的机制。首先验证自藜芦醇干预后的小 鼠体重减轻的部位为脂肪组织，之后在能量摄入和能量消耗两方面进行了减肥效 果的讨论。