（植物学专业论文）粘毛黄芩遗传转化体系的建立及黄酮类化合物的产生.pdf

粘毛黄芩遗传转化体系的建立及黄酮类 化合物的产生 植物学专业硕士研究生王淑芳 指导教师孙敏教授 摘要 粘毛黄芩( s c u t e l l a r i av i s c i d u l ab u n g e ) 是唇形科( l a b i a t a e ) 黄芩属( s c u t e l l a r i a ) 的一种 传统药用植物，其根中含有黄芩苷、汉黄苓素、汉黄芩苷等黄酮类化合物。近年来药理上已 证实黄芩苷有抑菌、降压、镇静、抗癌、抗炎等作用，同时对人类免疫缺失病毒( h ) 逆转 录酶及乙肝病毒( h b v ) 的三种抗原( 表面抗原、e 抗原、核心抗原) 也有显著的抑制作用。随着 黄芩苷新功能的不断开发，在原有巨大市场基础上，其需求还在迅速增长。 目前我国黄芩苷的商品主要来源予野生资源，由于人们超量滥挖，绝大部分地区的粘毛 黄芩濒临灭绝。近年来，山西、山东、河南、四川等省进行人工栽培，但产量较少。另外， 轱毛黄芩生长周期长，需要2 - 5 年才可药用，恢复生产非一时能够见效。因而寻找新的药源 十分必要。 本研究利用改造的工程菌c 5 8 c 1 介导粘毛黄芩遗传转化，诱导毛状根的产生，通过培养 毛状根来获取牯毛黄苓中的主要黄酮类化合物( 黄苓苷) 。主要从以下几个方面进行研究： 离体培养体系的建立、遗传转化体系的建立、优良毛状根系的筛选、毛状根最佳培养条件的 建立。 在建立粘毛黄苓离体培养体系的基础上，将带有p r i a 4 质粒，去除武装( d i s a r m e d ) 的根癌 农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m 咖c i e n s ) c 5 8 c l 菌株。转化粘毛黄芩并对转化条件进行优化。实验结 果表明：利用无菌苗的幼苇、子叶、真叶以及愈伤组织进行遗传转化，幼茎的转化率最高， 为8 8 9 外植体被菌液浸染1 5 m i n ，共培养2 d 转化根诱导率最高，分别达8 4 、8 2 。 粘毛黄芩毛状根经除菌培养基初步筛选后。进一步通过聚合酶链式反应( p o t y r n e r a s ec h a i n r e a c t i o n p c r ) 确定了r o b 、r o l c 在粘毛黄苓毛状根基因组的整合。 液体悬浮培养了8 个精选的单克隆毛状根系，3 6 ( 1 后测定了它们的毛状根产鼙及总黄酮和 黄苓苷的含量，其中毛状根单克隆系h q 4 总黄酮和黄苓苷的含量均最高，总黄酮含量为4 4 5 8 m g f l a s k ，黄苓苷含量为2 2 4 9m g f l a s k 。 不同培养条件及外源激素对液体培养的粘毛黄j 5 = 毛状根生长及其黄酮类化合物生物合成 i 西南大学硕p 学位论文 的研究表明：3 0g l 蔗糖、p h5 8 的1 2 m s 培养基最佳；外源激素n a a 、6 一b a 、2 , 4 d 和 g a 对粘毛黄芩毛状根的生长及黄酮类化合物生物合成有较大影响。添加2 4 d 对粘毛黄芩毛 状根的生长及黄酮类化合物生物合成有很强的抑制作用，而添加适龄浓度n a a 、g a 和6 - b a 则促进粘毛黄苓毛状根的生长及黄酮类化合物生物合成，其中g a 效果最佳。 粘毛黄芩离体培养体系，遗传转化体系的建立和高产黄苓苷毛状根系的获得及其培养条 件的优化，为利用植物次生代谢| t 程技术实现粘毛黄苓黄酮类化合物特别是黄芩苷的大规模 生产奠定了坚实基础，同时也为药用资源可持续发展提供了一条有效途径。 关键词：植物次生代谢工程粘毛黄芩毛状根总黄酮黄芩苷 i l a b s t r a c t e s t a b l i s h m e n to ft r a n s f o r ms y s t e mi n s c u t e l l a r i av i s c i d u l ab u n g ea n di t sf l a v o n o i d s p r o d u c t i o n m a j o r ：b o t a n yg r a d u a t e ：w a n gs h u f a n g t u t o r ：p r o f s u nm i n a b s t r a c t s c u t e l l a r i av i s c i d u l ab u n g ei sav e r yo l da n dw e l l k n o w nd r u gi nt r a d i t i o n a l c h i n e s em e d i c i n e ，w h i c h b e l o n g st o t h eg e n u so fs c u t e l l a r i a ，l a b i a t a e t h e h i g h p h y s i o l o g i c a la c t i v i t yo ft h er o o te x t r a c t si sac o n s e q u e n c eo ft h ep r e s e n c eo fm o s t f l a v o n o i d s ，i n c l u d i n gb a i e a l i n ，w o g o n i n ，w o g o n o s i d e ，e t a 1 o v e rt h el a s t d e c a d e , t h e a n t i m i e r o b i a l ，h y p o t e n s i v e ，s e d a t i v e ，a n t i o x i d a n t ，a n t i t u m o rp r o p e r t i e so fb a i e a l e i nh a v e b e e nf o u n da n dp r o v e db yc l i n i c a lt e s t i n g a tt h es a m et i m eb a i c a l e i nh a sa ni n h i b i t o r y e f f e c to nh u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r n s ( h i v ) a n dh b v t h ep r i c eo fb a i e a l i ni s b e c o m i n gm o l ea n dm o r ee x p e n s i v ew i t ht h ei n c r e a s i n gd e m o n d m e n tf r o mt h e c o n s u m p t i o nm a r k e t s a tp r e s e n tb a i c a l i nr o o t si nw i l dr e s o n r c em a i n l y a sar e s u l to fa b s o l u t e n e s s d i g g i n g ， s c u t e l l a r i av i s c i d u l a b u n g eo f l o t s o fa r e a sw e r ec l o s e t o d e r a c i n a t e s h a n x i ，s b a n d o n g ，h e n a n ，s i c h u a nh a v ep l a n t e da r t i f i c i a l l y , b u tt h eo u t p u tw a s l e s s i na d d i t i o n , g r o w t hc y c l eo fs c u t e l l a r i av i s c i d u l ab u n g ei sl o n g , t h u sc o m e b a c ko f y i e l dc o u n dn o ta c ti m m e d i a t e l y s oi ti sn e c e s s a r i l yt of i n dan e wm e d i c i n er e s o u r c e t h eo b j e c t i v eo ft h i ss t u d yw a st oi n i t i a t es c u t e l l a r i av i s c i d u l ab u n g eh a i r yr o o t c u l t u r eu s i n gt h ed i s a r m e da g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n ss t r a i nc 5 8 c 1a n dy i e l d f l a v o n o i d s t h i ss t u d ys h o w e dt h a ti nv i t r os y s t e m se s t a b l i s h ，t r a n s f o r m e d s y s t e m s e s t a b l i s h ，t h ec h o i c e n e s sh a i r yr o o tl i n e ss e l e c ta n dt h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o no f h a i r y r o o t ss y s t e m se s t a b l i s h b a s e do nt h ee s t a b l i s h m e n to fi nv i t r os y s t e m so fs c u t e l l a r i av i s c i d u l ab u n g e ，a n d m e d i a t e db yt h ed i s a r m e da g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n ss t r a i nc 5 8 c 1w h i c hh a r b o r s n l 西南丈学硕十学位论文 a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e sr ip l a s m i dp r i a 4 h a i r yr o o t sw f f f eo b 诅i n e d 1 1 1 ec o n d i t i o n s o ft r a n s f o r m a t i o nw e r eo p t i m i z e d a m o n gd i f f e r e n tp a r t se x p l a n t s ，s u c h 勰l e a v e s ， c o t y l e d o n s ，s t e m sa n dc a l l u s ，s t e m sh a dt h eh i g h e s ti n d u c e dr a t ea s8 8 9 1 m m e r g e db y b a c t e r i u m a n d1 5m i n u t e sa n dc o c u l t u r e dw i t ha g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e sf o r2d a y sh a d t h eh i g h e s ti n d u c i n gr a t e ( 8 4 ，8 2 ) t h e yw e r es e l e c t e di nt h eh a l f - s t r e n g t hm sm e d i u ma d d e d5 0 0 m e lc e f o t a x i m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) a n a l y s i so fr o l b ，r o l cc o n c e n t r a t i o na n a l y s i sw e r e p e r f o r m e d p c rp r i m a r i l yc o n f i r m e dt h ei n t e g r a t i o no f r o b ，r o c a m o n go ft h ey i e l da n dc o n t e n t so ff l a v o n o i d sa n db a i c a l i no fe i g h th a i r yr o o t l i n e s ，h q 4l i n e sp r e s e n t e dt h es i g n i f i c a n t l yh i g h e rc o n t e n to ff l a v o n o i d s ( 4 4 5 8m g f l a s k ) a n dh i g h e rc o n t e n to f b a i c a l i n ( 2 2 4 9m e , f l a s k ) t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tm e d i u m sa n de x o g e n o u sp h y t o h o r m o n e so nh a i r yr o o t s g r o w t ha n db i o s y n t h e s i so ff l a v o n i d si nt h eh a i r yr o o tc u l t u r e so fs c u t e l l a r i av i s c i d u l a b u n g ew e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt i l a tc o n t a i n e d3 0 9 ls a e r o s e i 2 m sw i t hp h 5 8w a sb e s tm e d i u ma n dt h e2 ，4 _ d ，n a a , 6 一b aa n dg aa l lh a v eo b v i o u se f r e c t so l lt h e g r o w t ho fh a i r yr o o tc u l t u r e sa n dt h eb i o s y n t h e s i so ff l a v o n i d s t h eg r o w t ho fh a i r y r o o t sa n db i o s y n t h e s i so ff l a v o n i d sw e r es t r o n g l yr e s t r a i n e db y2 , 4 一d h o w e v e r ， n a a , g aa n d6 - b ao fa p p r o p r i a t ec o n c e n t r a t i o nw e r ef a v o u r a b l et oh a i r yr o o t sg r o w t h a n df l a v o n i d sp r o d u c t i o na n dt h ee f 话c to f g aw a sp r o m i n e n c e 1 1 1 ee s t a b l i s h m e n to f nv i t r oa n dp l a n tr e g e n e r a t i o n s y s t e m so fs c u t e l l a r i a v i s c i d u l ab u n g e ，t h et r a n s f o r m a t i o ns y s t e mb a s e do ns c u t e l l a r i av i s c i d u l ab u n g e h a i r y r o o t ，t h es e l e c t e dh i g h e r - b a i c a l i n - p r o d u c t i o nh a i r y r o o tl i n ea n de m i n e n t c u l t u r e d - c o n d i t i o n so f h a i r yr o o tg i v ean e w p a t h w a yt or e s o l v et h es h o r t a g eo f b a i c a l i n o f s c u t e l l a r i av i s c i d u l ab u n g e k e yw o r d s ：p l a n ts e c o n d a r ym e t a b o l i ce n g i n e e r i n g s c u t e l l a r i av i s c i d u l ab u n g e h a i r yr o o t f l a v o n o i d sb a i c a l i n 独创性声明 学位论文题目_ 糙垂董茎量篮接丝篮丕鲍建童丞黄盟娄丝佥塑鲍 芒生 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同忐对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者：毛；和葛 签字日期： p - 7 年4 - 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交沦文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：z ；弘絮 签字日期： 砷1 年坤月7 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名：群 签字日期：p 口1j 年辞月砑日 电话： 邮编： 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 植物次生代谢细胞工程 植物次生代谢产物( s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s ) 是指植物体中一大类并非生长发育 所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织和生长发育 的特异性。植物次生代谢物种类繁多，化学结构迥异，主要类别有：含氮化合 物，包括生物碱、非蛋白氨基酸、生氰糖苷等；类萜，包括单萜、倍半萜、色 素苷、柠檬素、葫芦素、强心烯、羟酸内脂、类胡萝卜素等；酚类，包括类黄 酮、醌类等f i 】。次生代谢产物则往往是植物与环境间相互作用的结果【2 j ，它们在整 个生命活动中行使着重要的功能：它们可构成植物防御体系的一部分( 如单宁和 棉酚等抗病虫化合物) ，参与植物的逆境胁迫反应( 如甜菜碱、甘露醇和海藻糖等) 。 我们对棉花抗蚜虫机制的研究结果表明，次生代谢物( 棉酚、单宁和黄酮类等) 及其相关酶基因的时空表达和积累所造成的生化异质性是植物防御虫害的主要机 制之一例( 4 j 。一些次生代谢物( 如花青素等) 使花瓣产生各种色泽、吸引昆虫传粉， 有利于植物繁殖。生长素等次生代谢物可调节植物的生长发育。2 5 的临床药物 都是直接或间接地取自植物的次生代谢物。植物次生代谢物还可用于生产染料、 杀虫剂、食品的调味剂及香料等。 植物次生代谢产物细胞工程是生物工程的重要组成部分，它是利用植物细胞 体系( 培养细胞) ，应用先进的生物技术( 细胞大量培养、次生代谢及其调控、 细胞突变及其筛选等) ，以提供各种次生代谢产物( 医药、香料、试剂、色素、农 药及其它化工产品) 的一门新型的、多学科的科学技术1 5 1 。植物次生代谢产物细胞 工程，是最近的二十年里已迅速发展成为生物工程技术的热点之一，并与基因工 程和快速繁殖技术一起，成为植物生物科技的三大主流。植物次级代谢产物细胞 工程技术的理论基础是植物细胞全能性。而植物细胞全能性的完整含义应该理解 为，在适宜的培养条件下，所有生活的植物细胞都具备形态发育上的全能性及内 在的生理代谢过程的全能性。 利用植物细胞培养技术生产应用于医药、食品、化妆品、农用化学品工业中 的次生代谢物质的研究，在过去的2 0 年里有了突飞猛进的发展【6 l 【7 1 i s 。利用植物细 胞培养生产次生代谢产物与植物栽培相比，有下列优点： ( 1 ) 同样具有次级代谢物生物合成的全能性，但又不受地理、气候等条件的限制。 ( 2 ) 结构疏松，容易分散，易于固相培养和液相培养，不易污染，方便实行工业 化生产，可节省土地，降低成本，缩短生产周期。 ( 3 ) 可通过细胞诱变和单细胞克隆技术，获得能够长期保持生命力和次生代谢物 两南大学硕f | 学位论文 的合成能力的高产细胞株系，大大提高了生产效率。 ( 4 ) 可以在了解次生代谢过程的基础上实施对次生代谢过程的调控，包括对培养 条件的调控、代谢前体的添加及诱导子的采用，因而生产效率更高。因此，开展 旨在提高药用成分的细胞培养及次生代谢调控工作是一项很有应用前景的探索性 研究工作，甚至可以认为这是解决各种濒于灭绝的珍稀名贵药用植物药材资源未 来主要途径。 1 2 毛状根培养在次生代谢产物生产中的应用 毛状根( h a i r y r o o t ) 又称发根，是整体植株或植物某一器官、组织( 包括愈伤 组织) 、单个细胞甚至原生质体受发根农杆菌( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ) 的感染所产 生的一种病理现象( 形成多分枝的、迅速生长的、向地性消失的不定根) ，它起源 于单个细胞1 9 1 。毛状根具有生长迅速、遗传稳定、起源于单细胞( 有利于高效表达 克隆或变异克隆的筛选) 、培养时不需要添加外源激素、拥有亲本植株特征的次生 代谢途径等特点，尤其是它的稳定性和生长迅速是植株次生代谢物工业化生产所 梦寐以求的，也是细胞培养和一般器官培养所不能兼备的，因此毛状根培养技术 被认为是生产植物次生代谢物的一条新途径。毛状根的培养对中草药非常重要， 因为约1 3 的传统中草药是植物的根部，故可用毛状根的培养生产次生代谢产物。 目前利用发根农杆菌已在2 0 0 多种植物上成功诱导出了毛状根，已在长春花、烟 草、紫草、绞股蓝、人参、黄芪、甘草、青蒿等多种植物材料中建立了毛状根的 培养系统。 1 2 1 利用毛状根培养生产次生代谢产物的优点 ( 1 ) 生长迅速 毛状根具有大量的分枝和根毛，生长快速，具有激素自养性，适于大量培养。 如会荞麦( f a g o p y r u mc y m o s u m ) 的毛状根液体培养2 5 d 可增殖1 8 6 1 倍而其细胞培养 物只增殖2 6 7 倍【1 0 1 。 ( 2 ) 合成能力强且稳定 因为外源生长激素能够抑制次生代谢产物的生产，而毛状根中含有的t - d n a 片段上有生长素合成酶基因，所以毛状根表现为激素自养性，有利于产生次生代 谢产物。毛状根的次生代谢物的含量一般比愈伤组织和悬浮培养的细胞高，并且 能够合成某些愈伤组织和悬浮培养细胞不能合成的次生代谢物，例如长春新碱和 长春碱足存在于长春花( c a t h a r a n t h u sr o s e u s ) 中具有抗癌作用的萜类吲哚类生物 碱，通过长春花细胞培养一直未能获得这两种生物碱，但在长春花的毛状根中检 测到了这两种生物碱】；短叶红豆杉的毛状根中紫杉醇的含量是其愈伤组织中的 近8 倍1 1 2 1 ；毛状根中某些次生代谢物的含量甚至可能比原植物还高，例如人参 2 弟1 草义献绿述 ( p a n a x g i n s e n g ) 天然栽培根的人参皂苷含量为1 4 0 3 ( 干重) ，而人参的毛状根在 无外源激素的条件下，人参皂苷的含量可达干重的2 4 8 6 ，比天然栽培根高出近 l 倍”1 。 由于毛状根是由单个细胞分化而来的根组织，属于单个克隆，具有遗传稳定 性，它不仅染色体数目与亲本保持一致，而且合成能力、合成模型及生长速度也 很稳定，这对工业化生产十分重要。例如曼陀罗( d a t u r as t r a m o n i r n ) 毛状根继代5 年以上保持合成托品烷生物碱的稳定性。 ( 3 ) 向培养液释放代谢产物 毛状根可将部分次生代谢产物分泌释放到培养液中，有利于次生代谢产物的 回收提取和工业化生产，例如s h i m o m u r a t l 4 1 等诱导紫草( 枷呷p 硎“肼e r y t h r o r h i z o n ) 产生的毛状根在2 l 气升式反应器中生长迅速，通过与反应器连接的 a m b e r l i t e x a d 2 大孔树脂将分泌到培养液中的紫草色素回收，每天可吸附5 m g 紫 草色素，且可连续生产2 2 0 d 。 1 2 2 影响毛状根生长和次生代谢物合成的因素 以毛状根培养生产次生代谢产物，不但要考虑毛状根的产量，而且还要考虑毛 状根中次生代谢产物的含量。影响毛状根生长和次生代谢产物合成的主要因素有 以下一些： ( 1 ) 光 毛状根培养一般不需要额外的光照，但有些植物的毛状根光照一段时间后开始 变绿，这种毛状根的生长速度和其中次生代谢产物的含量都大幅度提高，可能是 因为一些在原植物叶中表达的产物在绿色毛状根中也得到表达，或是激活了合成 途径中的某些酶，从而促进了次生代谢产物的合成。例如无刺曼陀罗( d a t u r a m e r m 括j a e q ) 毛状根在光照下变绿，其中莨菪烷类生物碱含量大幅度提高；但也有 相反的情况，例如高山火绒草( l e o n t o p o d i u ma t p i n u r ec a s s ) 的毛状根在缺光的条件 下培养能增加挥发油的得率1 1 5 1 。杨世海1 6 1 培养甘草毛状根发现光照对毛状根生长 有抑制作用。 ( 2 ) 培养基种类及组成 不同基本培养基的种类、碳源、氮源、p h 等因素对毛状根的生长和次生代谢 物的含量均有显著影响，例如江洪如【1 7 】的研究表明n i t c h 培养基、s h 培养基对龙 胆( g e n t i a n am a n s h u r i c ak i t a g ) 毛状根的生长优于m s 培养基，而不利于龙胆生长； 蔡国琴【1 8 培养青蒿毛状根时发现，3 的蔗糖有利于毛状根的生长，但从青蒿素含 量上看，2 的蔗糖浓度为最佳浓度，偏酸性环境( p h 6 0 时，毛状根生长受到抑制，毛状根检测不到青蒿素。王冲 两南大学硕十学位论文 之9 j 培养西洋参毛状根发现结果表明s j 1 和b 5 培养基较好，水解乳蛋白可增加毛 状根的鲜重，但降低毛状根中总皂甙的含量。梁朋【2 0 】培养三裂叶野葛毛状根发现 毛状根在含5 、4 、3 和2 蔗糖的m s 培养基中培养1 6 天后的于重增殖倍数 分别为1 1 7 、1 1 9 、1 0 1 和5 9 ；其中尤以3 的蔗糖浓度最有利于毛状根中异黄酮 类化合物及葛根素的积累。杨睿【2 l 】培养雪莲毛状根发现氮源总浓度( 包括n 出+ 和 n 0 3 。) 为3 0 r e t o o l l ：n h 4 + n 0 3 比例为5 ：2 5 ；2 蔗糖和3 葡萄糖组合；p h 5 8 ； 1 8 h d 的光照( 光强为3 5 0 0 1 x ) ；2 4 ；摇床转速为1 0 0 r m i n 有利于毛状根生长及总 黄酮的生物合成。 ( 3 ) 激素 生长素和细胞分裂素常用来调控毛状根的生长和次生代谢产物的合成，但对不 同植物毛状根的作用不同。例如张荫麟【2 2 】发现在含激素的培养基上丹参( s a l v i a m i l t i o r r h i z ab g e ) 毛状根不能正常生长并开始愈伤组织化，但在含激素的培养基上 处理2 - 3 d 后再移到不含激素的m s 培养基上，毛状根大量分枝，生长迅速加快；常 振战 2 3 1 发现0 1 m 班的n a a 处理能促进掌叶大黄僻 倒掰p a l m a t i o nl ) 毛状根的生 长和侧根的产生，但却抑制毛状根中游离蒽醌化合物的合成。周倩耘等1 2 4 1 研究发 现i a a 、m a 、n a a 、2 ，4 d 和6 b a ，5 种生长素在适宜的浓度下均可不同程度地 促进人参毛状根的生长以及皂甙的积累，同时能影响单体皂甙的分布。n a a 和i b a 能显著促进毛状根的生长，其中0 5 0 0m g li b a 能显著促进毛状根生长和总皂甙 的积累。细胞分裂素6 一b a 在较低浓度时虽然对生长无明显的促进作用，但对皂甙 积累有利，同时显著促进单体皂甙r b l 的积累，增大r b l 在总甙中所占的比例。于 荣敏等1 2 5 】研究发现，外源激素2 ，4 一d 、n a a 和6 b a 对何首乌毛状根的生长及蒽醌生 物合成有较大的影响。在m s 培养基中添加2 ，4 d 对何首乌毛状根的生长和蒽醌类化 合物的生物合成有很强的抑制作用，而添加适量浓度n a a 和6 一b a 贝i j 可促进何首乌 毛状根生长以及蒽醌类物质的生物合成。 ( 4 ) 诱导子 张荫麟 2 6 1 在培养丹参毛状根时，以茯苓、风尾菇、紫芝、密环菌4 种真菌发酵 物作为诱导子分别处理毛状根，结果发现真菌诱导子能够促进毛状根中丹参酮的 积累，而且短期内既有明显效果，其中密环菌发酵物效果最好，处理后毛状根中 丹参酮的含量已接近生药水平。于树宏【2 7 】在培养野葛毛状根时，以茉莉酸甲酯作 为诱导子处理毛状根，发现l o 1 0 0m o i l 茉莉酸甲酯( m j ) 口- j 提高野葛毛状根培养 液中葛根素和大豆甙元的水平，促进毛状根内总异黄酮含量的增加。周倩耘【2 8 1 在 培养西洋参毛状根时发现，油菜素内酯( b l ) 单独使用对西洋参毛状根生长有促进 作用，1 0o1 1 1 i e e lb l 显著促进生长。刘蚪”1 等研究发现真菌诱导子不但能影响人 参毛状根总苷的合成量，也能使某些单体皂苷消失或增加，如培养液中黑曲霉多 4 第1 释文献综述 糖诱导子增加到2 0m g l 浓度时，使总苷含量增加到3 6 而单体皂苷中r 勘和r e 未 检出，r 9 2 和r b 。的含量则有明显增加，并可促进人参毛状根的生长。 ( 5 ) 其他 另外，从菊科( a s t e r a c e a e ) 、茄科( s o l a n a c e a e ) 、葫芦科( c u c u r b i t a c e a e ) 3 0 l 的一些种已经转化获得了绿色的毛状根。绿色毛状根可以合成某些只能在植物绿 色器官中产生的化合物【3 1 1 。叶绿体依赖反应是某些次生代谢途径中重要的部分， 这为用根生产化合物提供了新的模式，如用烟草r u b i s c o 大亚基a n 甲基转移酶启 动子和光控调节诱导大豆毛状根p ”。 1 3 药用植物黄芩的研究进展 黄芩为唇形科( l a b i a t a e ) 黄芩属( s c u t e l l a r i a ) 多年生草本植物，始载于神农 本草经 3 3 1 ，列为中品，其干燥根，是我国传统常用中药，其主要的活性成分有 黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等黄酮类化合物，具有清热燥湿、解毒、 止血安胎、抗菌、抗病毒、美白妨晒等作用，主要分布在我国北方各省。是全国 大宗中药材之一，中华人民共和国药典2 0 0 0 年版收载。现由于野生资源锐减， 黄芩已被我国列为三级保护濒危植物【3 4 i 3 卯。 根据2 0 世纪8 0 年代全国中药资源普查统计，黄芩年需要量为7 0 0 万公斤左 右，野生资源蕴藏量约为1 5 2 0 0 万公斤，资源比较丰富。但黄芩商品主要来源于 野生资源，需求量呈现逐年上升的趋势，仅1 9 8 3 年收购采挖量竟达2 1 0 0 万公斤， 大大超过正常的年需要量。9 0 年代，虽无统计数据，但从2 0 世纪9 0 年代初到2 0 世纪9 0 年代末的l o 年间，黄芩一直保持在1 2 1 5 元公斤较高的收购价，可见黄 芩的后备资源不足【3 “。 野生黄芩资源保护不力，特别是主产区缺乏有力保护措施，以致邻近山区和 草原的黄芩多被挖光。黄芩主要生长于石砾质或黏土质山坡、山项草地，丘陵坡 地、草原，也常见于较干旱的荒山坡、土岗以及草原型石砾质山地阳坡，在其中 心分布区常以优势建群种与一些禾草、蒿类或其他杂草共生。在中温带山地草原 常见于海拔6 0 0 1 5 0 0 米向阳山坡或高原草原等处，如燕北山地，坝上高原向东 北至大兴安岭山脉中段一带，包括河北承德地区、内蒙古赤峰北部山地草原和东 部呼伦贝尔、兴安盟境内。大量的野生黄芩的采挖，引起山地植被减少、地表裸 露，蓄水力减弱，水土流失严重，自然环境遭到不同程度的破坏。生态环境破坏 引起的恶性循环，给野生生产带来一定困难【3 刀。传统地道的黄芩老产区，由于过 度采挖，开发时间过长等原因，部分地带的资源已明显减少，黄芩规格质量也开 始下降，大量的野生资源都分布在远处，交通不便，人烟稀少，采挖困难。另外， 野生黄芩生长周期长，需要2 5 年才可药用，恢复生产非一时能够见效。 两南丈学硕p 学位论文 近几年来，临床上对黄芩的需求量越来越大，供需矛盾日益突出，因此有些 学者对黄芩及黄芩代用品的生物特性、化学成分、主要有效成分的药理作用以及 生物技术应用等方面作了较多研究工作，为这些药材的医药价值及其品质评价提 供了科学依据。以下就有关黄芩及其同属药用植物的研究进展作一介绍。 l _ 3 1 药用黄芩的种类 黄芩属植物共有3 0 0 多种，世界广布，我国有1 0 2 种及2 9 个变种。 中药大辞 典收载7 种，这些种主要集中于本属狭叶亚组，其主要特点是：多年生草本；有 圆锥形或圆柱形的根或根茎；根皮棕黄色，断面黄色；粗细不等，直径0 3 2 5 c i i i ； 茎叶全缘或有疏齿；花腋生成顶生总状花序；花萼二唇形，全缘，结果时闭合增 大，上唇背部有一圆形鳞片；花冠二唇形，蓝紫色、白色或黄色，下唇常有各种 色斑，花冠筒背部弯曲或直立；雄蕊4 枚，子房上位；小坚果球形或卵圆形，有瘤 或被毛吲。 据宋万志、裕载勋等的研究 4 0 l ，以下几个种的根做黄芩入药： ( 1 ) 黄芩s c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i sg e o r g i 又名香水水草、黄金茶。多年生草本；根状茎肥厚，粗达2 厘米，伸长。叶具 短柄，披针形至条状披针形，两面无毛或疏被微柔毛，下面密被下陷的腺点。花 序顶生，总状。小坚果卵球形，具瘤，腹面近基部具果脐。分布于北方各省区； 朝鲜，苏联，蒙古，日本也有。生向阳草坡地及休荒地上。根状茎药用，解热消 炎；茎代茶，称芩茶。 ( 2 ) 粘毛黄芩s c u t e l l a r i av i s c i d u l ab u n g e 又名下巴子、腺毛黄芩。多年生直立或上升草本；根状茎直生或斜行，粗达 1 8 厘米，叶近无柄，披针形至条状矩圆形，上面近无毛，下面被或疏或密短柔毛， 两面均有多数黄色腺点。花序顶生，总状。小坚果卵球形。分布于山西北部、内 蒙古、河北北部及山东。生沙砾地、荒地或草坡，海拔7 0 0 1 4 0 0 米。 ( 3 ) 滇黄芩s c u t e l l a r i aa m o e n ac h w r i g i l t 又名西南黄芩。多年生直立草本：根状茎近垂直或斜行，肥厚，径达1 1 厘米 或以上。叶具短柄，矩圆状卵行或矩圆形，两面疏被微柔毛至几无毛。分布于云 南中南部、中部及西北部、四川南部及贵州西北部。生松林下，海拔1 3 0 0 3 0 0 0 米。 ( 4 ) 甘肃黄芩s c u t e l l a r i ar e h d e r i a n ad i e l s 多年生草本；跟状茎斜行，粗0 1 5 1 3 厘米。叶具柄，叶片卵状披针形至卵 形，全缘或下部每侧有2 5 个不规则远离浅牙齿，两面被细柔毛，边缘密被短睫 毛。分布于甘肃、陕西及山西。生多石山地向阳草坡上，海拔1 3 0 0 1 5 0 0 米。 6 第1 苇文献综述 ( 5 ) 丽江黄芩s c u t e l l a r i al i k i a n g e n s i sd i e l s 又名小黄芩。多年生直立草本；根状茎横行或斜行，径0 1 2 1 2 厘米。叶近无 柄，椭圆状卵形或椭圆形，上面被稀疏紧贴小疏柔毛或几无毛，下面密被腺点。 小坚果卵圆形，具瘤，腹面中央具一果脐。产云南西北部。生灌丛、草坡或松林 下，海拔2 5 0 0 3 1 0 0 米。 ( 6 ) 川黄芩s c u t e l l a r i ah y p e r i c i f o l i al e v i 又名魁芩、条芩、子芩。多年生直立或上升草本；根状茎肥厚，粗达2 厘米。 叶具短柄或近无柄；叶片大多为卵形，全缘。花序总状，小坚果卵球形，具瘤， 腹面近基部有一细小果脐。产四川西部。生草坡、高山栎林林缘，海拔2 6 0 0 - - 3 2 0 0 米。 ( 7 ) 大黄芩s c u t e l l a r i at e n a xf e 形s m i t hv a r p a t e n t i p i l o s a ( h - m ) g r 本种根特大。长8 1 0 厘米，直径4 6 厘米，药材外皮已除去，呈淡黄色，中 空，根髓部枯黑部分已除去。此物种为近年才发现。分布于四川金沙江流域及云 南东北部，海拔1 6 0 0 米左右。 近年来，科研工作者对以上几种药材的质量比较做了大量工作，为临床应用提 供了依据。 宋万志、齐美玲、苏薇薇、符洪等3 9 1 1 4 1 1 4 2 1 4 3 1 人认为，粘毛黄芩、甘肃黄芩、 滇黄芩与正品黄芩差异较小，且资源较丰富，可考虑作为正品的代用品使用。从 表1 1 中可看出这4 个种黄芩苷含量差异较小，且都在4 以上。 值得注意的是，不同作者的测定结果有较显著差异。其原因可能与植物生长 条件、生长年限、采收日期和加工、储藏条件有关。 表1 1几种药用黄芩的黄芩苷含量 t a b l e l 1b a c a l i nc o n t e n to f s e v e r a lg e n u so f s c u t e l l a r i a 于留荣【“j 对粘毛黄芩、刘永泓等对甘肃黄荩【4 5 1 和滇黄芩m 1 、董建萍对川黄 芩的黄酮类成分进行了初步研究，结果表明，这些种的黄酮类成分与正品黄芩差 7 两南大学硕卜学位论文 异不大。 1 3 2 药用黄芩的化学成分 黄芩属化学成分研究始于1 8 8 9 年，至今己从该属5 0 多种植物中分离出了多种类 型的化学成分，其中主要是黄酮类化合物，其它成分还有萜类、苯乙醇甙类、甾 醇、氨基酸、生物碱和微量元素等，但种类最多、生物活性最显著的是黄酮类化 合物，其次是二萜类化合物。 ( 1 ) 黄酮类化合物 黄芩属植物普遍含有黄酮类化合物，现已从该属植物中分离并确定结构的黄 酮类化合物有1 5 0 多个，仅从黄芩中就分离出t 6 0 个【4 引 4 9 1 ，这些黄酮类化合物的基 本母核有以下几类：黄酮和黄酮醇类、二氢黄酮和二氢黄酮醇类、查耳酮类、双 黄酮类和较少见的黄酮木脂素类，其中以黄酮类为绝大多数。本属植物中普遍存 在的黄酮类化合物有黄芩苷( b a i c a l i n ) 、黄芩苷元( b a i c a l e i n ) 、汉黄芩苷( w o g o n o s i d e ) 、汉黄芩素( w o g o n i n ) 、千层纸素a ( o r o x y l i na ) 、白杨素( c h r y s i n ) 、芹菜素 ( a p i g e n i n ) 等。 ( 2 ) 二萜类化合物 近年来从黄芩属植物中分离得到的二萜类化合物均是新克罗烷( n e o c l e r o d a n c ) 型二萜。自1 9 8 7 年从半枝莲中分离出黄芩属第一个二萜s c u t e l l o n ea ，至今已从该 属2 0 多种植物中发现了近8 0 个新一克罗烷型二萜【5 0 1 。此类化合物的生物活性主要表 现在它们有很强的昆虫拒食活性，其中有些还对一些植物致病真菌的孢子发芽和 生长有一定的抑制作用。 ( 3 ) 微量元素 近年来，夏元初、周济桂、李蕙明、张志明【5 1 1 【5 2 】1 5 3 1 胛噜人对黄芩微量元素 也进行了较为详细研究，结果见表1 2 。 表1 2 不同地区所产黄芩中的微量元素含量 t a b l e1 - 2t r a c ee l e m e mc o n t e n to f d i f f e r e n ta r e a ss c u t e l l a r i a l _ 3 3 药用黄芩的药理作用 黄芩为常用中药，有清热泻火、解毒、止血、安胎等作用，其有效成分为黄 第1 章文献综述 酮类。目前药理上已经证实黄芩黄酮具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌、 降压、利尿等多种生物活性。此外，作为治疗高血压和爱滋病的辅助药物的前景 也是广阔的。 ( 1 ) 抗癌 黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对癌细胞增殖都有一定的抑制作用。黄芩苷对人 肝癌细胞株的5 0 细胞生长抑制所需浓度为2 0 m g l 【5 5 】黄芩素对人乳腺癌细胞株 m d a m b - 4 3 5 增殖的抑制，其i c s 0 为5 9 9 9 m l