（有机化学专业论文）异硫氰酸荧光素溶菌酶的制备及其对溶菌酶晶体生长影响的预研究.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：代连想 黜引译略 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：代盘花 签字同期：2 0 晦年年月l z 日 导师签字：玉海打争 l 签字日期：2 0 0 ，年弘月循 山末师范大学硕士学位论文 摘要 在以研究蛋白质这些生物大分子为主要目标时，在基础科学方面是研究蛋白 质大分子晶体生长的过程，认识大分子晶体生长的物理化学，如何获得高质量的 蛋白质晶体。研究蛋白质晶体的生长对生命科学和微重力科学具有重要的意义， 因此蛋白质晶体生长过程越来越受到重视。在本文中主要介绍了研究蛋白质晶体 生长的意义及目前研究蛋白质晶体生长的进展，即主要采用的研究手段和内容 介绍了采用共聚焦显微镜来研究蛋白质晶体生长的意义：嫁接荧光指示剂在研究 蛋白质晶体生长的意义和进展，并且简要介绍了蛋白质晶体生长的物理化学过程 和主要的培养方法。 我们研究蛋白质经常采用荧光方法，这种方法主要利用了研究的样品具有荧 光这一特性。但蛋白质本身所具有的内源荧光一般无法直接应用于蛋白质晶体生 长研究中，这是因为蛋白质在结晶过程中浓度非常高，而荧光技术却要求荧光探 针的浓度尽可能的低，以保持在线性反映区域内，所以在研究蛋白质晶体生长时 需要引入外源性荧光物质来解决这一问题。我们用异硫氰酸荧光素作为探针标记 了溶菌酶，测定了溶菌酶标记物的紫外可见吸收光谱和荧光光谱，摸索了其晶 体的生长条件。实验结果表明，在标记过程中异硫氰酸荧光素没有影响溶菌酶的 生化性质，标记后的溶菌酶可用于激光扫描共聚焦显微镜以便进行后续研究。 同时我们以不同浓度的异硫氰酸荧光素标记的蛋白质作为杂质，研究其对不 同浓度蛋白质晶体生长的影响。通过实验我们发现，加入0 0 9 异硫氰酸荧光素 就可以抑制溶菌酶晶体f 1 1 0 晶面的生长速度为8 5 左右。在其他浓度的溶菌酶 也可得到相同的结论。这说明当杂质存在时，由于抑制了晶核的出现，使晶体尺 山东师范大学硕士学位论文 寸变大，即当晶核数目多时，晶体尺寸较小，而晶核数日少时，能得到较大尺寸 的晶体，并且随着杂质浓度的增加，对蛋白质晶核抑制会加大。 然后在文章中又对激光扫描共聚焦显微镜和普通光学显微镜进行了比较，其 分辨率高，同时具有可对样品进行非侵入性无损伤断层扫描以及对样品形貌进行 三维成建等特点，因此可作为研究晶体生长强有利的工具；并且介绍了激光扫描 共聚焦显微镜在定量测量晶体的个数，重组三维图像以获得晶体生长的过程信息 以及测定晶体生长台阶动态变化等方面的应用；还对激光扫描共聚焦显微镜在晶 体生长研究的其它方面应用前景和异硫氰酸荧光素标记的蛋白质其他方面研究 作了展望。 关键词：蛋白质晶体生长、溶菌酶蛋白质、异硫氰酸荧光素一蛋白质、激光扫 描共聚焦显微镜、 4 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h es t u d yo ft h em a c r o m o l e c u l e s ，t h eb a s i ck n o w l e d g et h a tw ew a n tt ok n o wi s t h ep r o c e s so ft h ep r o t e i ng r o w t h ，t h ep h y s i c a lc h e m i s t r yo ft h ep m t e i ng r o w t ha n d h o wt or e c e i v et h eg o o dq u a l i t yp r o t e i nc r y s t a l t h es t u d yo ft h ep r o c e s so ft h ep r o t e i nc r y s t a lg r o w t hi s i n c r e a s i n g l yp a i d a t t e n t i o nt ob e c a u s et h ep r o t e i nc r y s t a lg r o w t hh a sp l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nt h el i f e s c i e n c e sa n dt h em i c m g r a v i t ys c i e n c e s i nt h ep a p e r , w ei n t r o d u c e dt h es i g n i f i c a n c e f o rt h ep r o t e i nc r y s t a lg r o w t ha n dt h eu s e f u lt o o l sa n dt h em e t h o d sf o rt h es t u d y i n g v a r i o u sa s p e c t so fp r o t e i nc r y s t a lg r o w t h ，s u c ha ss t a t i ca n dd y n a m i cl i g h r i n g s c a t t e r i n g ，a t o m i cf o r c em i c r o s c o p ya n dt h el a s e rc o n f o c a lm i c r o s c o p ya n ds oo n m e a n w h i l ew es i m p l yi n t r o d u c e ds o m em e t h o d so f p r o t e i nc r y s t a l l i z a t i o n i ti sw e l lk n o w nt h a tt h ef l u o r e s c e n c ei so n eo ft h em o s tv e r s a t i l ea n dp o w e r f u l t o o lf o rt h es t u d y i n go fm a e m m o l e c u l e s ，w h i l em o s tp r o t e i n sa r ei n t r i n s i c a l l y f l u o r e s c e n t ，w o r k i n ga tc r y s t a l l i z a t i o nc o n c e n t r a t i o n sr e q u i r e st h eu s eo fc o v a l e n t l y p r e p a r e dd e r i v a t i v e sa d d e da st r a c e r s t h i sa p p r o a c hr e q u i r e sd e r i v a t i v e st h a td on o t m a r k e d l ya f f e c tt h ec r y s t a lp a c k i n g w eh a v ep r e p a r e df l u o r e s c e n td e r i v a t i v e so f l y s o z y m e f l u o r e s c e i n 一5 一l s o t h i o c y a n a l t e ( f i t c ) w a su s e da sap r o b et ol a b e lt h e l y s o z y m e t h ea b s o r p t i o nf l u o r e s c e n c es p e c t r ao ft h el a b e l e dl y s o z y m ei n d i c a t et h a t f i t ch a sl i t t l ee f f e c to nt h eb i o l o g i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fl y s o z y m e s o t h ef i t cd e r i v a t i v e so fl y s o z y m ec a nb eu s e di nr e s e a r c ho f p r o t e i nc r y s t a lg r o w t hb y t h el a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y 5 u j 尔帅犯天芋蜘士学位论文 t h e n ，t oi n v e s t i g a t et h ei m p u r i t ye f f e c t so ff i t c - l y s o z y m eo nt h el y s o z y m e c r y s t a l l i z a t i o n ，f i t c - l y s o z y m ei n t h ed i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nw a sa d d e dt ot h e l y s o z y m ec r y s t a l l i z a t i o ns o l u t i o n sb e f o r et h ec r y s t a l l i z a t i o ns t a r t e d w ef o u n dt h a tt h e a d d i t i o no ft h el o wc o n c e n t r a t i o n ( o 0 2m g m 1 ) o ff i t c l y s o z y m ec o m p l e t e l y s u p p r e s s e dt h e n u c l e a t i o no fl y s o z y m ec r y s t a l s t h e s er e s u l t ss h o wt h a tt h en u c l e a t i o n s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n gi m p u r i t yc o n c e n t r a t i o nf o rm o s ti n i t i a l c o n c e n t r a t i o no fl y s o z y m ea n dt h ei n h i b i t i o no ft h ei n t e r m o l e c u l a rb o n d i n gp l a y sa l l i m p o r t a n tr o l ei nt h ee f f e c t so fi m p u r i t yp r o t e i n t h i sc o n c l u s i o ni sc o n s i s t e n tw i t ha k i n e t i c a l l yc o n t r o l l e dp r o c e s so f i m p u r i t yi n c o r p o r a t i o n i na d d i t i o n ，w ei n t r o d u c e dt h eh i 【g hr e s o l u t i o nc o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y i sap o w e r f u lf o rt h eo b s e r v i n ga n da n a l y s i so fp r o t e i ng r o w t h ，b e c a u s ei tw i l ln o t d a m a g eo rd i s t u r bt h ec r y s t a ls u r f a c ea n dr e c o n s t r u c t3 di m a g e i tc a nb eu s e dt o m e a s u r et h en u m b e ro f c r y s t a l ，r e c o n s t r u c t3 di m a g et oa c q u i r et h ei n f o r m a t i o no f t h e “s t e p ”o nt h es u r f a c eo f t h ec r y s t a li nt h ep r o c e s so f t h ep r o t e i nc r y s t a lg r o w t h w eh a s a l s oe x p e c t e di nt h eo t h e ru s e so fl a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p ya n df i t c - l y s o z y m ei n t h ep r o t e i nc r y s t a lg r o w t h k e y w o r d s ：p r o t e i nc r y s t a lg r o w t h , l y s o z y m e ，f l u o r e s c e i n 5 l s o t h i o c y a n a l t e - p m t e i n ， 6 c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y 山东师范大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 研究蛋白质晶体生长的意义 随着破译生命密码的人类基因组计划进入尾声，一个以蛋白质和药物基因学 为研究重点的后基因组时代已经拉开了序幕，对科学家提出了更为严峻的挑战。 经过l o 年多研究，科学家们已经拥有了一张接近完整的人类基因组谱图，蛋白 质将是他们今后的重点研究方向之一。 哈佛大学科学家麦克贝斯说，人类基因组谱图并没有告诉我们所有基因的 “身份”以及它们所编码的蛋白质，人类体内真正发挥作用的是蛋白质。当研究 蛋白质这些生物大分子生物技术时，在基础科学方面是研究蛋白质大分子的晶体 生长的过程，认识大分子晶体生长的物理化学，在应用方面是研究如何生长出高 质量的晶体。基础研究是高效率和高质量获得晶体的根基，生长高质量蛋白质晶 体，通过x 衍射获得蛋白质分子的精细结构，可以揭示其生物学功能( 正常生 理作用、致病机制、药效或副作用) 与分子结构的关系，因而对分子药物设计具 有直接的作用，使得生命科学研究能实现其最终目标，能研制出治疗包括癌症和 爱滋病等在内的多种疾病的药物。例如，科学家们已经鉴别出了将健康细胞转化 为癌细胞的蛋白质、或者防止细胞癌变的蛋白质，利用这些发现将有可能开发出 在血样中检测有关蛋白质的技术，以及帮助诊断早期癌症，并最终研制出控制癌 变的药物的“开关”。 山东师范大学硕士学位论文 1 2 蛋白质在微重力条件下生长的前景 要了解蛋白质的结构，就必须有高质量的蛋白质晶体。蛋白质晶体生长是一 种非平衡态过程，涉及到传热、传质和固液界面的物质交换，其动量和质量的 输运是非均匀且各向异性的，是通过宏观对流和细观扩散实现的，因此重力是影 响这一过程的重要因素。我们知道在地面上，由于重力的条件，液相中不可避免 地存在着强烈的重力驱动力对流，即通常所说的热对流，热对流对晶体生长是极 为不利的。特殊的太空环境，为生长高质量的蛋白质晶体开辟了新路。空间的微 重力环境成为培养高质量蛋白质晶体的理想之地。这种环境下的蛋白质晶体生 长，也成为最有希望的空间生物技术。自2 0 世纪8 0 年代初期，欧美及日本等发 达国家相继开展了空间蛋白质晶体生长的研究，并投入了越来越多的人力和物 力。利用返回式卫星、航天飞机、和平号空间站等空间飞行器，进行了上百次空 间蛋白质结晶实验，微重力条件下的蛋白质晶体生长研究取得重要进展，发展了 一些空间结晶技术，生长出一些质量较高的蛋白质晶体，在研究机理上的认识也 有所深化。虽然空间生物实验的成功率有待提高，但是科学家们仍然认为，这是 一种最有希望的空间技术，将为人类了解蛋白质、设计新型药物带来巨大的前景。 太空的实验结果表明在空间生长的晶体通常要比在地面上生长的晶体大，这 样研究者们就可以使用很多方法进行检测，包括x 一射线衍射，电子显微镜和原 子力显微镜等来进行蛋白质、病毒和核酸的三维结构的成像，而这些结构可以帮 助研究者们探索和寻找更为有效的药物和治疗方法，同时也可以对动植物的基本 生长过程有更深入的了解。不过，在空间生长的蛋白质有一部分比地面生长的蛋 白质在质量上没有更多的改进，原因不清。此外，统计结果还表明，在空间能够 生长出比地面质量高的蛋白质晶体的概率为2 0 至3 0 ，也就是说空间实验的成 山东师范大学硕士学位论文 功率仍然是较低的，所以研究重力条件下的蛋白质晶体生长，进而研究微重力效 应这课题还有很大的发展空间，是目前较为重要的，也较为热门的一项研究课 题。 目前，我国在这一领域也进行了大量的研究。2 0 0 2 年3 月2 5 日在酒泉卫星 发射中心发射的“神舟三号”上，进行的蛋白质晶体生长实验，采用的是我国研 制的第二代空间蛋白质结晶装置。这神装置能容纳6 0 个蛋白质结晶样品。这次 空间之旅，共有来自国内外8 个研究单位的1 6 种蛋白质搭乘。特别值得一提的 是，在这些蛋白质中，有不少是利用我国的生物资源制备得到的。其中，除个别 模型蛋白质用于检验实验装置和研究方法外，大部分实验对象的目标是为了改善 晶体质量，以便能够测得较精确的蛋白质结构信息。日前，通过试验，随“神舟 三号”飞天的蛋白质结晶样品出晶率高达7 0 以上，并获得了至少4 种质量较 好的蛋白质晶体，同时，着重研究方法技术的结晶实验也取得较满意的结果。此 外，通过对某些蛋白质晶体质量的初步检测，发现至少有两种蛋白质晶体的衍射 能力已超过发表的数据。初步分析表明，微重力可能对不同蛋白质结晶系统产生 不同效果，当然，这还有待于对实验结果进行全面和深入的研究。 1 3 目前蛋白质晶体研究的进展 在研究蛋白质生物大分子时，其结构和功能是科研工作中的一个重头戏。但 是面对成千上万的未知生物大分子结构，如何测得其精细的三维结构，如何得到 适于x 射线研究的晶体，是许多科研工作者头痛的事情。因为生物大分子本身 的特殊性，不像小分子那样，容易结晶。尽管生物大分子晶体生长有了很长的历 史，但是到目前为止，大多数实验室进行生物大分子晶体生长时，仍然主要采取 山东师范大学硕士学位论文 尝试法，很难有一个具有指导意义的晶体生长，特别是对于一个新的蛋白质来说， 进行不断的尝试是主要的方法，而且有些蛋白质晶体即使能在一定的条件下长出 微晶体来，但是要想长出足够尺寸的晶体并非易事。总之，面对生物大分子晶体 生长的种种特征，很显然，生物大分子到底是如何进行生长，在生长过程中会出 现什么样的生长情况，包括生长方式，缺陷种类等等，这就要求对晶体生长的过 程要有一个全过程动态的研究。目前对蛋白质晶体生长主要采用光散射1 】和原子 力显微镜1 纠等仪器，还有刚刚发展起来的激光共聚焦显微镜1 3 1 等。 1 3 1 光散射对蛋白质晶体生长的应用 光散射分为静态光散射( s t a t i cl i g h ts c a t t i n g ，s l c ) 和动态光散射( d ”锄i c l i g h ts c a t t i n g ) 两种，它们主要是通过测量一定浓度的蛋白质溶液散射的光强来反 映蛋白质晶体生长的情况。在1 9 7 6 年b r o w n 对动态光散射理论和实验做了完整 的描述1 4 1 ，1 9 8 7 年k r a t o c h v i l 对静态光散射做了描述筘1 。通过测量光散射强度， 获得一些蛋白质的状态参数，如平均分子量m w , 蛋白质的第二维里系数b ：和旋 转半径r g 等，通过这些参数描述就能蛋白质晶体的生长情况。最近，用光散射 来研究蛋白质晶体生长主要有以下两个方面：( 1 ) 蛋白质成核以前的研究，如， 蛋白质聚合体的状态6 。9 】、蛋白质和蛋白质的相互作用和蛋白质溶解行为( 就是 在什么浓度下容易结晶) 1 0 - 1 5 1 ；( 2 ) 对成核和成核以后的研究分析，如蛋白质成 核的临近尺寸大小决定和蛋白质颗粒在溶液中的分布情况等 1 6 - 2 3 。光散射方法已 经成为研究蛋白质结晶的成熟、有效的方法，为如何优化蛋白质晶体的质量提供 了可靠的依据。 1 0 山东师范大学硕士学位论文 1 3 2 原子力显微镜在蛋白质晶体生长的应用 扫描探针显微镜( s c a n n i n gp r o b em i c r o s c o p e ，s p a ) 是一系列使用微探针进 行纳米级微观水平双察物质表面的新型显微镜的统称，其中就包括原子力显微 镜。自从1 9 8 6 年b i n n i n g 等人首次使用原子力显微镜( a f m ) 在溶液中得到固 体材料表面的高分辨率的图像以来2 4 1 ，a f m 这一技术得到了广泛的应用。随后， 在1 9 9 2 年d u r b i n 等人首次在母液存在下对溶菌酶晶体表面台阶生长情况进行 了报道【2 5 1 ，从而使得a f m 开始进入到了蛋白质晶体的研究领域，为研究蛋白质 晶体生长机理提供了又一重要的工具。利用原子力显微镜不仅可得到单张图片， 还可以在有母液存在下得到一系列的图片，并由此来描述在蛋白质晶体生长过程 中在晶体表面所发生的一系列的连续的变化。由于原子力显微镜能用于实时原位 地对样品进行观察，同时具有高精度，可达到n l b 级的高分辨率，因此能得到许 多有关生物大分子晶体表面的微观参数，为解释许多微观的现象提供了宝贵的资 料。 在过去二十年中，世界上分别有几个实验室使用a f m 进行有关晶体生长的 实验工作，他们是m a l k i n 等人在实验室进行t h a t u n a t i n 结晶研究1 2 6 ；单斜的 c a n a v a l i n 晶体生长是由l a n d 等人报道的2 7 】：a p o f e f f i t i n 是由k v e k i l o v 等人进行 研究的【2 8 i ，在k o m a t s u 和l i 等人的实验室里进行了l y s o z y m e 晶体的研究2 9 1 。另 外，在m e p h e r s o n 的实验室里作了很多有关蛋白质晶体生长的a f m 研究，包括 生物大分子晶体生长中的杂质影响、生长缺陷结构问题及控制晶体生长的机理的 有关问题，对于分子量较大的病毒还可以直接看到单个分子的排列和尺寸大小等 等，并取得了很大的进展。| 3 0 - 3 4 1 下图为用a f m 扫描的不同蛋白质晶体表面的各 种螺旋位错。 i l 山东师范大学硕士学位论文 a d b e 图1 ，1 不同晶体表面的各种螺旋位错 1 3 3 激光扫描共聚焦显微镜在蛋白质晶体生长的应用 c f 激光扫描共聚焦显微镜( l s c m ) 是近十几年来才发展起来的图像分析仪器 其性能较普通光学显微镜是一个质的飞跃，是电子显微镜的一个补充。它是在荧 光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外或可见光激发荧光探针，利 用计算机进行图像处理，从而得到晶体组织内部的微细荧光图像以及晶体生长的 形态变化。 p m u h l i g 等在2 0 0 1 年首次用l s c m 对胰岛素( d e s t h r 3 0 ) 晶体的早期生 长阶段进行了观察。2 0 0 3 年他们又用l s c m 对型号为g l a r g i n e 的胰岛素进行 了实验3 ，从分别从测量晶体的个数，重组三维图像以获得晶体生长的过程信息 和通过对晶体生长台阶动态变化的测定进一步阐明了晶体的动力学特征。2 0 0 4 年日本的g e ns a z a k i 等人又用l s c m 和差分干涉对比显微镜( d i m ) 联合来观察 山东师范大学硕士学位论文 溶菌酶晶体 儿0 晶面二维成核的生长情况咖。因为l s c m 与a f m 比较起来有以下 优点：可以在不同的观察方向上对不同深度层次的样品进行非侵入性无损伤断层 扫描，不会对晶样造成物理和化学特性的破坏，所以可能成为研究晶体生长有利 的工具。但是受分辨率等因素影响，要用l s c m 来观察晶体，必须经过改装或与 其它光学仪器联合使用以便提高l s c m 的分辨率。关于l s c m 在蛋白质晶体生长的 应用，具体内容见本文的第四章。 1 3 4 嫁接荧光指示剂在蛋白质晶体生长中的应用 荧光技术通常研究蛋白质和分子之间常用的工具，只是偶尔用在研究晶体生 长过程中，2 0 0 1 年j o h np 等人成功地用荧光黄( 1 u c i f e ry e l l o w ) 标记了鸡蛋蛋 白溶菌酶。”。我们知道，蛋白质本身所具有的内源荧光一般无法直接应用于蛋白 质晶体生长研究中，这是因为蛋白质在结晶过程中的浓度非常高，而荧光技术却 要求荧光探针的浓度尽可能的低，以保持在线性反映区域内，所以在研究蛋白质 晶体生长时需要引入外源性荧光物质来解决这一问题。嫁接了荧光指示剂的蛋白 质可以用来研究蛋自质晶体的成核和生长。例如通过测定共振能量的传播，可以 测出标记的两个指针的距离，在成核中可以研究荧光猝灭和蛋白质的各向异性等 问题。还可以用标记的蛋白质来作为杂质看其影响蛋白质生长等情况。其中本文 第三章和第四章详细论述了荧光标记蛋白质的方法和其作为杂质对蛋白质生长 情况有何影响。 山东师范大学硕士学位论文 第二章蛋白质晶体的生长 2 1 蛋白质晶体生长的方法 蛋白质结晶通常是将蛋白质溶解于含有沉淀剂的溶液中，并且溶液里需要有 一定的p h 值的缓冲试剂。2 3 。在某些情况下，还需要加入一些其他物质，比如抗 菌剂等等。蛋白质结晶时通常是将上述溶液通过一定的方法形成过饱和，形成过 饱和的方法一般是：改变沉淀剂的浓度、晶体结晶的温度和缓冲溶液的p h 值。 目前，大多数蛋白质结晶是基于改变沉淀剂的浓度来形成过饱和。改变沉淀剂的 浓度可以有四种方法：( i ) 气相扩散方法；( 2 ) 液一液扩散法；( 3 ) 渗析法( 4 ) 批量法。在很多文献中可以看到采用上述四种方法结晶蛋白质”“ 其中，最常用的气相扩散方法，批量法、平衡渗析法和晶种嫁接或重复接种 法等。 1 ) 气相扩散方法 气相扩散法，尤其是悬滴法是蛋白质晶体生长中最常用的一种方法。它第一 次出现是在结晶t r n a 实验中“。随后，越来越多人采用此方法来生长蛋白质晶 体。 我们可以采用下图( 图2 i ) 来表示气相扩散的原理。在小液滴中( 一般小 液滴体积为2u l 或更少) 含有要结晶的生物大分子以及缓冲溶液、沉淀剂和其 他添加剂，在蓄积液中有比小液滴中更高浓度的沉淀剂。小液滴和蓄积液之间的 平衡过程是通过水或有机溶剂的扩散来完成的。直到最后，在两者中蒸气压相等， 此过程才结束。如果发生了水从小液滴往蓄积液转移，那么小液滴的体积会发生 变化，导致液滴中各物质的浓度发生了变化，而对于蒸气压比水高的物质，就会 山东师范大学硕士学位论文 有水从蓄积液往小液滴转移的情况。这两种情况对于悬滴法和坐滴法、三明治滴 法都相同。 ( a ) h a n g i n gd r o p( b ) s i t t i n gd r o p( c ) s a n d w i c hd r o p 图2 1 气相扩散方法培养蛋白质晶体图。其中，( a ) 悬滴法( b ) 坐滴法( c ) 三明治法 气相扩散方法最常采用的三种沉淀剂分别是盐，如n a c l 和( n h 。) ：s o 。；有机 溶剂，如乙醇和丙酮；还有各种分子量的聚乙烯乙二醇( p e g ) 。在盐和p e g 体系 中，水从蛋白质转移到了沉淀剂溶液中，而在有机溶剂中，有机溶剂从沉淀剂中 转移到了蛋白质溶液中，有机溶剂的使用是很有限的，因为有机溶剂可能导致蛋 白质的变性“。 2 ) 批量法 批量法是将要结晶的生物大分子和沉淀剂混合在一起，并使溶液中的生物大 分子立即达到过饱和状态，如图2 2 。对于悬滴法或坐滴法而言，蓄积液的作用 和气相扩散法中有所不同，它不再起到浓缩悬滴或坐滴溶液的作用，而仅仅起到 维持一个恒定的蒸气压的作用。因为结晶过程是从过饱和开始进行的，形成的核 子一般较大。用批量法很少得到大的晶体，因为蛋白质浓度离亚稳定区很近。 p r o t e i n1 棚 p r i p t t a n t1 州 图2 2 批量法培养晶体 1 5 山东师范大学硕士学位论文 3 ) 平衡透析法 利用半透膜允许小分子透过而不允许大分子透过的性质，来调节蛋白质溶液 的离子强度或p h 值，使蛋白质溶液慢慢地接近饱和。这种方法的优点是：通过 有控制的扩散，改变结晶的条件，从而慢慢地到达晶核形成点。晶体的生长也是 可以不断的调节，已经产生的沉淀或微晶可通过外部条件的改变重新溶解。这种 方法可以在低离子强度条件下应用传统的盐析方法结晶，它既适用于大批量的结 晶，也适用于微量的结晶。图2 3 为平衡透析法培养晶体示意图，蛋白质母液内 的条件通过半透膜与外部溶液平衡透析而改变。 图2 3 透析法培养晶体示意图 4 ) 晶种接种或重复接种 当某种蛋白质在应用各种微量结晶试验后，仅能得到小晶体而得不到足够大 的适应于分析用的晶体时，就可以尝试采用接种或重复接种的方法来培养晶体。 这种方法是把已得到的小晶体经选择清洗后接入到新配置的结晶母液中，作为晶 体生长的晶核，然后采用上面介绍的任何一种晶体培养的方法继续设法使晶种长 大为适用于分析用的大晶体。 晶种的来源：( 1 ) 由微量法得到小晶体( 0 0 1 0 1 m m ) ，或者由其他方法得 到的更小的微晶；( 2 ) 蔟生的针状的或片状的晶体，经过精心分离、切断、挑选 山东师范大学硬士学位论文 的单晶片段。晶体的选择，最好在偏光显微镜下进行，这样容易选取外行归整、 无裂纹、又不是孪生的小晶体或晶体片段为晶种。 晶种的转移：选好的晶体，在接种前需要在一定的浓度的沉淀剂缓冲溶液中 清洗，去搏品种表厩附着的晶体碎片和变性的蛋白，使晶体表面新鲜。沉淀剂浓 度一般略高于原晶体生长时候的浓度，以免在清洗过程中溶解。经多次清洗后的 晶种，借助于玻璃毛细吸管或用l o o p ，小心地转移到新配置的晶体生长母液中。 在转移过程中一定要保证晶种的完整，同时要注意尽可能地减少把清洗晶种的溶 液带入新鲜母液里，防止改变母液的浓度。母液中蛋白质和沉淀剂浓度应根据原 晶体生长时候的条件，经试验决定。一般蛋白质浓度略略低于原晶种生长时候的 浓度，而沉淀剂浓度略高于原晶种生长时候的浓度。这样既保证晶种移入后不溶 解，又有利于晶种的生长。 晶种的生长：已转移到母液中的晶种，可采用前面介绍的任何一种方法来促 使晶种继续生长增大，如果一次接种后，尚不能达到足够大，可将该晶体再做品 种，并按上述步骤再清洗，转移生长，如还达不到要求，可再重复，直至获得符 合要求的单晶为止“。 2 2 蛋白质晶体生长的过程 从溶液中生长出晶体，正如象水变成冰一样，是一个相变的过程。从系统组 分可预见的行为来看，这是一个不连续的过程。当两个相之间的能垒被克服以后， 这种相变化就会发生，并且相的变化导致一个能量上讲更为有利的状态( 如图 2 4 ) 。对于生物大分子晶体来说，相变过程由于蛋白质在溶液里的排列时处于较 为不利的能量状态下的排列而致使其能量上不适，当进入故态时变会使这些得到 1 7 山东师范大学硕士学位论文 改善，这时就会发生蛋白质溶液的相变。 图表2 4 晶体生长过程的能垒图 生物大分子使用三个主要的方法来完成这个相变的过程：1 扰动正常的大分 予与溶液间的关系，包括水分子和水中的离子。2 扰动溶剂结构使大分子外溶剂 壳破坏，从而促进相变过程。3 提高单个大分子间的相互作用的数目和强度，包 括与水和离子的作用。然而，大分子从无序到有序的过程是如何进行的呢? 在饱和非平衡态时，大分子会结合以形成簇团和粗糙的球型聚集体，每个球 都可以用其半径来描述。我们可以用光散射或原予力显微镜来得到它。从直观上 讲这是合理的。溶液中的大分子不断形成潜在的核并从核上重新回到溶液里去。 如果在某个时间点上，这个核的尺寸达到一个临界值时( r e ) ，就会发生如图2 4 所示的过程。这时它聚集新的分子会比旧的分子离去的快，这样晶核就产生了。 过饱和度越高，分子被聚集而不是失去的可能性就越高。其中r c 与过饱和度有 定的函数关系。 核的特点及其形成过程可能有很多路径，而这些我们目前尚不是很清楚。一 个溶解的聚集体必须克服一定的活化能或者说能垒。能垒的高度与过饱和度有一 山东师范大学硕士学位论文 定的函数关系，同样也与结晶系统的其他特殊性质有一定关系。对于临界核从一 开始是有序的，还是在重构过程中变得有序，也不是很清楚；或者是由小的亚尺 寸簇团构成，或者是由严格上讲的单体或寡聚体组成，同样也不清楚。 2 3 蛋白质晶体生长中的物理化学 2 3 1 过饱和 饱和溶液在液相和固相之间存在着热动力学平衡，因为在晶体和溶液之间化 学势是相同的，即有： 其中，虬是标准化学势，y 是活化系数，c 。是物质i 的浓度，饱和溶液中溶质的 浓度用溶解度c 。来定义。 当溶液中溶质的化学势大于晶体的化学势时，就到达了过饱和。通过改变影 响化学势的各种条件( 包括温度、蛋白质浓度、活性系数、盐浓度、压力等等) 就能达到改变溶质化学势的目的。过饱和度是晶体结晶的驱动力，它可以定义为 溶液和晶体之间的化学势的差异，通常用c c 。和c c 。c 。来描述，其中，c 是蛋 白质浓度。应该指出的是，要达到同样的过饱和度，可以采用不同的方法，如改 变蛋白质的浓度，升高或降低温度等。一般而言，蛋白质结晶时过饱和度在2 1 0 之间，这个值远远超过了一般的小分子结晶时的过饱和度的数值。 过饱和过程和p h ，离子强度，液体的电介质常数，温度和蛋白质浓度有关系。 上述因素对过饱和过程的影响，在文献“”中已经有所描述，在蛋白质成核时，过 饱和的程度要大于在蛋白质晶体生长时的过饱和程度。因此，对于过饱和的过程 需要精确的控制。 山东师范大学硕士学位论文 在蛋白质晶体生长过程中经常会发现“生长停止”的现象“，主要表现为当 蛋白质晶体生长到一定的尺寸后不再生长。但是将蛋白质晶体切开，在切开后的 晶体上又开始继续生长，直至一定的尺寸，这种现象很可能与蛋白质表面的杂质 有关系，杂质会影响对流。 2 3 2 成核 新相的成核起源于能量的振荡，而这种能量的振荡是出于过饱和引起的平均 自由能的增大。在大量的溶液中成核时，成核是均一的，而在固体颗粒( 如灰尘、 实验设备的玻璃器壁等) 上成核是不均一的。 结晶并不一定在所有的过饱和溶液中都会产生。为了产生一个新的相，体系 要克服一定的势垒，这个势垒称为晶核活化自由能q 如果过饱和度太低，能 量振荡的幅度就不足以达到可以超过势垒的程度。我们可以把过饱和分为两个部 分，不稳定区和亚稳定区。在稳定区( 不饱和) ，晶体不会生长出来；在亚稳区， 会有晶体的生长，但不会有晶核的生长，在不稳定区，晶体可以自发生长( 如图 2 5 ) 。 山东师范大学硕士学位论文 图2 5 晶体溶解度曲线图 对于我们熟悉的沉淀而言，会产生两种沉淀类型：( a ) 有很小的晶体组成的 类似晶体的沉淀物。在这种情况下，沉淀曲线位于不稳定区。晶体的动力学曲线 的特征是晶体出现的时间延迟非常短。( b ) 由于非特异性的范德华吸引力引起的 胶状沉淀物或无定型沉淀。这是新相，而不是晶体。在这种情况下，沉淀曲线穿 过晶体相。 根据小分子结晶理论“，可得出半径为r 的核，其ag ，由两部分组成 a g ，= - k t ( 4nr 3 vi n1 3 ) + 4 yr 3 。其中，v 是晶体内分子的体积，b 是过饱 和度，k 是玻尔兹曼常数，y 是核子和溶液之间的界面自由能。g 。是体积和表 面能的函数，体积函数是负的，而表面函数为正的，表面函数对应于产生一个新 的晶体表面单元所必须提供的能量；体积函数则正比于过饱和度，描述了从体系 自由能降低而产生的能量获得。g 。随y 的增大而增大，在y 达到一定的值时( 此 2 l 山东师范大学硕士学位论文 时称为临界的粒子大小y 。) g 。数值最大，然后随着y 的增大而下降。这表明 核子达到了临界尺寸y 。时是最稳定的。g 。随着过饱和降低雨降低，随着晶体 溶液的界面自由能增大而增大。因此，高的过饱和会导致能量瓶颈，而不易产生 新相，易于成核。存在的外部颗粒降低了界面自由能，增大了成核的频率。这样 当不均一的成核时，低过饱和是适宜的。 对于小分子晶体生长，成核速率可以用下列式子表达：j 。= b 。e x p ( 一 6 , k t ) 。其中，动力学系数b ；是溶解度和动力学参数的积，这表明了溶解度越大， 成核越快。确实，当溶液中有许多自由分子时，它们更容易发生碰撞并连接在一 起。在这种情况下，在相对慢的过饱和速率时成核就发生了。当分子溶解度较低， 成核就会在高过饱和时出现，并且时间延迟较长。此时，晶体就会大量出现。因 此，溶解度高能促进成核。为了更容易成核，可以通过( a ) 将体系尽可能位于 不稳定区； ( b ) 尽可能选择使蛋白质溶解度更高的条件。 2 3 3 过饱和和成核的动力学 成核速率不仅依赖于过饱和度，也依赖于达到成核的途径。生长晶体时，平 衡动力学依靠实验安排和实验方法的选择( 气相扩散，渗析等) ，蛋白质溶液平 衡速率影响过饱和动力学，因此也就影响了结晶过程，降低了平衡速率会导致更 少和更大的晶体出现。这是由于当平衡进行时，过饱和逐渐发展，一旦体系到达 不稳定区核子就会产生。假定成核在不稳定区和亚稳定区之间的边界线上发生 那么生成小的晶体聚集就会导致整个过饱和的降低，因而体系就被进一步驱使进 入不稳定区而产生更多的核子。在这场已存在的晶体的继续生长和生长的核子之 间类似于“拔河”的战役中，目的只有一个，那就是尽可能快地降低体系的自由 能。这样，一旦有少量的晶体出现，如果平衡速率相对于晶体生长速率要快的话， 山东师范大学硕士学位论文 体系将保持在亚稳定区，阻止核子的继续生长。为了控制过饱和动力学，我们必 须知道蛋白质的溶解度，也需要了解平衡动力学。 目前，一些工作已经对气象扩散生长蛋白质的主要参数的影响进行了研究 “。这些参数有悬滴的体积，悬滴的稀释度，温度等等。研究表明，悬滴的体积 变化是时间的参数，它可以用下式来描述： v v o = 6 + ( 卜6 ) e x p ( 一t t ) v 。是起始滴体积，6 是滴的稀释度，它是悬滴中沉淀剂浓度与蓄积中沉淀剂浓度 的比值。t 是时间常数，t = n v 。5 p 。其中，p 0 是纯水的蒸汽压，n 与沉淀剂有关。 表2 1 中给出了r i 和e 的一些值。要注意的是，这仅仅是个半经验的公式， 这个公式可让我们计算出过饱和随时间变化的情况。( 参考文献“8 1 ) 。 表2 1 估计悬滴中水蒸发动力所用时间常数t 参数值 沉淀剂n ( 小时) ( n h 。) ：s o 。1 6m 3 2 1 5 8 0 8 l o 0 6 p e g6 0 0 02 0 ( w v ) 1 4 9 2 80 8 1 0 0 6 m p d2 0 ( v v )4 6 9 - 4 - 7 70 8 1 0 0 6 2 4 结晶与溶解度图的关系 虽然测量出每个生物大分子的溶解度图或相图是不太可能的，但是，理解溶 解度图和达到过饱和结晶所需采用的方法这二者之间的关系是非常重要的。 2 4 1 气相扩散法 在气相扩散法中，一种很常见的情况是，蓄积液中沉淀剂浓度是悬滴中沉 淀剂浓度的二倍。从图2 6 中可看出，蛋白质从不饱和的a 点( 浓度为c p ) 开始 山东师范大学硕士学位论文 逐渐增大浓度，最终达到过饱和的b 点( 浓度为2 c ，) 。对于图( a ) 的情况，最 终实验结果得不到蛋白质晶体，而如图( b ) 的情况却不同，可以生长出晶体。因 为在图( a ) 中得不到晶体，b 点将一直位于亚稳定区，而当有晶体出现时，溶液 中蛋白质的浓度会由b 点向c 点变化( c 点位于溶解度曲线上) 。 ( a ) p h a s ed i a g r a m f o rv a p o u rd i f f u s i o ne x p e r i m e n t ，n oc r y s t a l s ( b ) p h a s ed i a g r a m f o rv a p o u rd i f f u s i o ne x p e r i m e n t ，c r y s t a l sg r o w i n g 图2 6 气相扩散法培养晶体相图，( a ) 没有晶体生成的情况，( b ) 有晶体生成 山东师范大学硕士学位论文 2 4 。2 批量法 在一个密闭的批量法体系中，如图2 4 中所示，有三种情况会出现o 一是 如果蛋白质溶液是不饱和的( 如图中的a 点) ，就不可能出现晶体( 除非有另外 的参数，如温度等发生变化) 。二是，在过饱和区中位于溶解度曲线和沉淀曲线 之间的区域( 图中b 点) ，箭头表示了结晶时蛋白质浓度的变化情况。三是，在 图中c 点，蛋白质会立即沉淀下来，因为过饱和度太高了。在某些情况下，蛋白 质会从生成的这些沉淀上接着长出晶