（微生物学专业论文）利用放线菌生产链霉亲和素和普伐他汀的研究.pdf

摘要 摘要 放线菌是一类具有重要经济价值和广泛应用前途的微生物。本课题从各地 采集的1 1 1 个土样中，分离得到9 2 0 株放线菌，建立了放线菌资源库。从此库中 筛选得到了高产链霉亲和素的放线菌z g 0 4 2 9 和可以转化美伐他汀生产普伐他 汀的放线菌z 3 1 4 。利用形态观察、培养特征、生理生化鉴定以及1 6 sr r n a 序 列分析，首先对z g 0 4 2 9 和z 3 1 4 进行了初步的分类鉴定，结果表明z g 0 4 2 9 菌 株为链霉菌属中的淡紫灰链霉菌，z 3 1 4 菌株为黄质产色链霉菌。 通过单因素考察、正交实验设计等方法，本课题对z g 0 4 2 9 菌株分泌链霉亲 和素培养条件进行优化，使z g 0 4 2 9 菌株分泌链霉亲和素产量达至l j 2 0 1 m g l ，比 初始条件下的产量提高了近6 0 倍。此外，本课题建立了硫铵沉淀、s e p h a d e xg 一5 0 和s e p h a d e xg 2 0 0 层析三步分离法，对发酵液中的链霉亲和素进行了纯化，链霉 亲和素的回收率为7 6 9 ，经s d s p a g e 和免疫印迹分析，纯化产物的分子量为 6 1k d a ，纯度为9 7 0 3 ，并具有良好的生物学活性。基因同源性的分析结果表 明：该链霉亲和素基因全长为4 7 7b p ，编码1 5 9 个氨基酸，与阿维丁链霉菌链霉 亲和素基因序列和氨基酸序列的同源性分别为9 3 1 和9 4 3 。利用此序列构建 原核表达载体p e t - 2 1 a ( + ) s a ，在大肠杆菌b l 2 1 中成功表达出了具有良好生物素 结合活性的链霉亲和素蛋白。 利用正交设计试验在摇瓶水平对z 31 4 菌株转化生产普伐他汀的培养条件进 行优化，得到美伐他汀的转化率为4 4 6 7 ，普伐他汀生成量为1 4 3m g m l 。以 摇瓶发酵条件为基础，在1 0l 小型发酵罐上对链霉菌z 3 1 4 进行了转化实验，结 果与摇瓶水平相当，美伐他汀转化率为4 9 4 5 ，普伐他汀平均生成量为1 5 8 m g m l 。进而采用中空纤维素柱过滤、大孔树脂吸附和半制备h p l c 纯化发酵 液中的普伐他汀，得到普伐他汀回收率为4 5 0 6 ，纯度为9 9 0 2 。纯化产物 利用质谱鉴定分子量为4 2 4 5 4 ，与普伐他汀标准品相同。 本课题筛选到的放线菌z g 0 4 2 9 和z 3 1 4 具有较高的链霉亲和素和普伐他汀 产量，且产物分离纯化方法简单易行，成本低廉，为进一步大规模发酵生产链 霉亲和素和普伐他汀奠定了基础。 关键词：放线菌链霉亲和素普伐他汀分类鉴定分离纯化 a b a s t m c t a b s t r a c t a c t i n o m y c e t ei s ak i n d o fm i c r o o r g a n i s mw i t hs i g n i f i c a n te c o n o m i ca n d a p p l i c a b l ev a l u e 11 ，1s p e c i e so fs o i ls a m p l e sw e r eg a t h e r e da 1 1o v e rt h ec o t m t r y , 9 2 0 s t r a i n so fa c t i n o m y c e t ef r o mw h i c hw e r ec u l t i v a t e da b u n d a n t l ya f t e rs c r e e n e da n d u s e dt oe s t a b l i s ht h er e s o u r c el i b r a r y s t r a i nz g 0 4 2 9w i n ll l i g hy i e l do fs t r e p t a v i d i n a n ds t r a i nz 314w i t ht h ec a p a b i l i t yo fc o n v e r t i n gc o m p a c t i nt op r a v a s t a t i nw e r e s e l e c t e df r o mt h i sl i b r a r y s t r a i nz g 0 4 2 9a n ds t r a i nz 314w e r ei d e n t i f i e db y m o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a l ，c h e m o t a x o n o m i c c h a r a c t e r i s t i c sa n d16 sr r n a a n a l y s i s t h er e s u l t ss h o w e da sf o l l o w s ：s t r a i nz g 0 4 2 9b e l o n g st ot h eg e n u s s t r e p t o m y c e sa n dw a si d e n t i f i e da st h es p e c i e so fs t r e p t o m y c e sl a v e n d u l a ；s t r a i nz 314 b e l o n g st ot h eg e n u ss t r e p t o m y c e sa n dw a si d e n t i f i e da st h es p e c i e so fs t r e p t o m y c e s x a n t h o c h r o m o g e n e t h ec u l t u r ec o n d i t i o no fz g 0 4 2 9w a so p t i m i z e db ym e a n so fs i n g l ef a c t o r d e t e c t i o n sa n do r t h o g o n a lt e s t a n a l y s i s t h eh i g h e s ty i e l do fs t r e p t a v i d i ni nt h e o p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o nr e a c h e da sm u c ha s2 01m g lw h i c hw a s6 0t i m e sm o r e t h a ni nt h e p r i m a r yc o n d i t i o n w i t ht h ee f f e c t i v e t h r e e s t e ps y s t e m ， a m m o n i u m - s u l f a t ed e p o s i t i o n ，s e p h a d e xg 一5 0a n ds e p h a d e xg 一2 0 0g e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y , s t r e p t a v i d i nw a sp u r i f i e df r o mt h ec u l t u r es u p e m a t a n tw i t ha r e c o v e r yo f7 6 9 a n dap u r i t yo f9 7 0 3 t h em o l e c u l a rw e i g h ta n db i o a c t i v i t yo f t h ep u r i f i e dp r o d u c tw e r ef u r t h e rc o n f i r m e db ys d s p a g ea n dw e s t e r nb l o t s t r e p t a v i d i ng e n eh o m o l o g ya n a l y s i ss h o w e d ：z g 0 4 2 9s t r e p t a v i d i ng e n ei s4 7 7b p a n d15 9a m i n oa c i d sw e r ec o d e db yi t ；i t sg e n es e q u e n c ea n da m i n oa c i d sh o m o l o g y w i t hs t r e p t o m y c e sa v i d i n i iw e r e9 3 1 a n d9 4 3 s e p a r a t e l y w i t ht h i ss t r e p t a v i d i n g e n e ，e x p r e s s i o nv e c t o rp e t 一21a ( + ) 一s aw a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e da n db i o a c t i v e p r o d u c tw a se x p r e s s e db ye c o l ib l 2 1 t h ec u l t u r ec o n d i t i o no fz 314w a so p t i m i z e db ym e a n so fo r t h o g o n a lt e s t a n a l y s i si nt h es h a k i n gf l a s k s t h ec o n v e r s i o nr a t ew a s4 4 6 7 a n dt h ey i e l do f p r a v a s t a t i nr e a c h e d1 4 3 m g m lu n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n b a s e do nt h es h a k i n g i i a b a s t r a c t f l a s kf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，z 314w a sc u l t i v a t e di na10lm i n if e r m e n t a t i o nja r t h er e s u l tw a ss i m i l a rt ot h a ti nt h es h a k i n gf l a s k t h ec o n v e r s i o nr a t ew a s4 9 4 5 a n dt h ey i e l do f p r a v a s t a t i nw a s1 5 8 m g m l w i t ht h ee f f i c i e n tp u r i f i c a t i o ns y s t e mo f f i b r i nc o l u m n ，m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i na n ds e m i - p r e p a r e dh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , p r a v a s t a t i nw a ss u c c e s s f u l l yp u r i f i e df r o mt h e c u l t u r e s u p e m a t a n tw i t har e c o v e r yo f4 5 0 6 a n dap u r i t yo f9 9 0 2 t h em o l e c u l a rw e i g h t o ft h ep u r i f i e ds a m p l ew a sc o m f i r m e db ym s i tw a st h es a m ea st h ep r a v a s t a t i n s t a n d a r d z g 0 4 2 9a n dz 314a r es c r e e n e ds t r a i n sw i t hh i g hy i e l di np r o d u c i n gs t r e p t a v i d i n a n dp r a v a s t a t i n t h em e t h o d so fp r o d u c t sp u r i f i c a t i o na lee f f e c t i v ea n di n e x p e n s i v e t h e s ep r o v i d eav a l u a b l ep r o s p e c tf o rl a r g e - s c a l ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o na n di s o l a t i o n o fs t r e p t a v i d i na n dp r a v a s t a t i n k e y w o r d s ：a c t i n o m y c e t e ；s t r e p t a v i d i n ；p r a v a s t a t i n ； c l a s s i f i c a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o n ；i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n i i i 符号说明 符号说明 英文缩写 英文全称中文名称 s a s t r e p t a v i d i n 链霉亲和素 b a s b i o t i na v i d i ns y s t e m 生物素一亲和素系统 e l i s a g l l z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附分析 h p l c h i g hp e r c o r m 锄c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清白蛋白 p b s p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n 磷酸缓冲盐溶液 h r ph o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 辣根过氧化物酶 o p d o - p h e n y l e n e d i a m i n e 邻苯二胺 i p t g i s o p r o p y l t h i o - p - g a l a c t o s i d e异丙基一p d 硫代半乳糖苷 s d ss o d i u md o d e 圮y ls u l f a t e 十二烷基苯磺酸钠 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 d a b y , 3 - d i a m i n o b e n z i d i n ey , 3 一二氨基联苯胺 t g t r i g l y c e r i d e 甘油三酯 t ct o t a lc h o l e s t e r o l总胆固醇 h m g c o a 3 - h y d r o x y - 3 - m e t h y l g l u t a r y l - c o e n z y m ea 羟甲基戊二酰辅酶a d a p d i a m i n o p i m e l i ca c i d 二氨基庚二二酸 i 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：表莺 硼g 年占月马日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月 日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、己公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：张喜 m g 年岁月易日 第一章引言 1 1 1 放线菌简介 第一章引言 第一节放线菌 放线菌因其菌落成放射状而得名。放线菌在土壤中分布最多【l 】，大多数生活 在含水量较低、有机质丰富和微碱性的土壤中。多数情况下，泥土中散发出的“泥 腥味”就是由放线菌中链霉菌产生的土腥素造成的。放线菌大都好氧，属于化能 异养型【2 】，其能像真菌那样形成分枝菌丝，并在菌丝末端产生外生的分生孢子， 有些种类甚至形成孢子囊，因而曾被误认为是真菌。放线菌是抗生素、酶及其 抑制剂等有生理活性物质的丰富生产菌 3 】。迄今世界上已发现和分离出的40 0 0 余种抗生素，有9 0 是由放线菌产生的【4 】，其中又以链霉菌属的菌株产生的种类 最多。这些抗生素中有5 0 多种已经得到广泛的应用，如链霉素、红霉素、多氧 霉素、金霉素、卡那霉素、氯霉素和庆大霉素等被用于临床治疗人的多种疾病， 灭瘟素、井冈霉素、庆丰霉素等被用于农业生产。与化学性农药相比，农用抗 生素对环境没有污染，不仅能有效地防治植物病虫害，而且具有一定的植物生 长调节剂的作用，能够刺激植物的生长。但是，近百年来人们只分离到大约 1 0 2 0 土壤放线菌【5 】，因此分离余下的8 0 以上的未知放线菌，是微生物资源 开发的必要前提和关键之一l 6 】。 1 1 2 放线菌分类鉴定的研究进展 放线菌是一类d n a 的g + c 含量在5 0 以上具有分枝状菌丝体的革兰氏阳 性细菌【_ 7 1 ，广泛存在于不同的自然生态环境中。从1 8 7 5 年c o h n 发现放线菌至 今的1 0 0 多年中，科学技术的快速发展使放线菌分类学作为微生物分类学的分 支学科得到了长足的发展，经历了经典分类、化学分类、分子分类和多相分类 4 个时期，建立了如化学分类( c h e m o t a x o n o l o g y ) ，分子分类( m o l e c u l a r t a x o n o l o g y ) ，数值分类( n u m e r i c a lt a x o n o l o g y ) 等新的标准。目前，在伯杰氏 第一章引言 系统细菌学手册第四卷中，将放线菌在生物界的地位定为原核生物界、厚壁 菌门、放线菌纲、放线菌目，包括1 0 个亚目，3 1 个科，1 4 0 多个属 8 - 1 1 】。 1 1 2 1 放线菌的经典分类 早期的放线菌分类是以形态学和培养特征为主，以生理生化为辅。形态特 征包括基内菌丝的发育程度，有无气生菌丝和孢子、孢囊、菌核以及其它结构， 此外还要说明孢子链、孢子、孢囊、孢囊孢子的形状、大小、数目等。培养特 征是根据基丝和孢子丝的颜色对链霉菌进行分群【12 】；国际链霉菌计划( i s p ) 的 试验结果也是以孢子丝颜色为主，基丝和可溶性色素的颜色为辅来鉴别的。生 理生化特征中生化指标主要集中在几个酶的活性上，如：明胶液化、淀粉水解、 纤维素分解或在其上生长、牛奶凝固和胨化等【1 3 】。此外，对碳源的利用也是必 不可少的内容【1 4 15 1 。 1 1 2 2 放线菌的化学分类 放线菌的化学分类方法包括：放线菌的细胞壁氨基酸、多糖化学组分分类 b 6 、放线菌细胞膜磷酸类酯分类、细胞原生质膜上醌分类【1 7 1 、细胞膜枝菌酸分 类、细胞膜和细胞壁脂肪酸分类【1 8 】。从每种化学分类的鉴定内容看，都是由一 组数据来决定属种的。在数据之间，由于缺乏定量的相关关系，不同属的数据 不能截然分开，从而造成了分类的混乱状态，在实际应用中给分类者造成了一 定难度。近年来，仪器分析的方法越来越多地应用于化学分类学研究，随之而 来的是化学分类必然向着定量化方向发展。同时，不同学科的相互渗透也会促 使分类标准向着合理化的方向统一，从而形成公认的分类标准。 1 1 2 3 放线菌的分子分类 放线菌分子分类包括d n a 碱基组成比例( g + cm 0 1 ) 分析，基于核酸杂交 的d n a d n a ( r r n a ) 分子杂交技术 1 9 2 0 1 ，基于核酸结构分析的16 sr r n a 基 因序列分析【2 1 1 、1 6 s 2 3 sr r n a 转录间区序列的分析 2 2 2 3 1 、r n a - - 级结构的分析 2 4 - 2 7 ，基于d n a 指纹图谱的d n a 限制性片段长度多态性分析( r e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 2 8 1 、重复片段p c r 基因指纹分析( r e p e t i t i v e e l e m e n tp c rg e n o m i cf i n g e r pr i n t i n g , r e p p c r ) 【2 9 】、随机扩增的多型性d n a 分析 ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n aa n a l y s i s r a p d ) 、扩增性片段长度多型性 分析( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m a f l p ) 3 0 】以及变性梯度凝胶电泳 2 第一章引言 ( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 、温度梯度凝胶电泳 ( t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t g g e ) t 3 1 1 等。分子分类作为放线菌分 类学的一个新兴的分支，正展现出蓬勃生机。这些新兴的方法与经典分类方法、 化学分类方法相结合，互相交叉，彼此补充，将促进放线菌分类学的不断发展， 使放线菌分类体系日臻完善。 1 1 3 放线菌代谢产生的活性物质 放线菌广泛存在于不同的自然生态环境中，种类丰富，是生物活性物质的 主要生产菌，具有广泛的实际用途和巨大的经济价值。放线菌的生物活性产物 主要是次级代谢产物。所谓次级代谢产物是指生长和繁殖不必需的，由少数微 生物( 如放线菌) 产生的多种多样的化合物，它们的形成取决于培养条件，有 些次级代谢产物是作为一类密切相关的结构类群产生的。根据v i c u r o n a n t i b i o t i cl i t e r a t u r ed a t a b a s e 的统计，自1 9 5 0 年以来的研究报告和专 利显示，描述的微生物源生物活性代谢产物有3 16 0 0 多种，其中2 02 0 0 种具有体 外活性，从放线菌中发现的生物活性物质至少有110 0 0 多种【3 2 】。 现阶段国内外的学者不仅继续在土壤中分离放线菌，更是把注意力转向特 殊环境特别是海洋环境3 3 1 。与陆地放线菌不同，海洋放线菌多含有枝菌酸【3 4 1 。 现已从海洋放线菌中分离到了很多结构新颖、生物活性广泛的新化合物【35 | ，如 f e n i c a l d x 组从菌株s a l i n i s p o r at r o p i c ac n b 2 3 9 2 中分离得到具有良好的选择性细 胞毒活性的丫内酰胺类化合物1 【3 6 3 7 1 ，它具有强效蛋白酶体抑制剂活性，能够抗 癌、逆转耐药、治疗炎性细胞因子活化诱发的疾病【3 8 1 ，具有非常广阔的成药前 景。 。第二节链霉亲和素及其检测系统 1 2 1 链霉亲和素( s a ) 1 9 6 3 年，s t 印l e y 等首次从放线菌s 卸幻叼，c 甜口1 ，砌协豇培养液中分离得到链 霉亲和素( s t r e p t a v i d i n ，s a ) ，它被认为是具有抗生素活性的m s d 一2 3 5 复合物的 一部分。c h m e n t 等 4 0 1 的研究结果表明该复合物由两部分蛋白组成，并分别得到 各部分的结晶，分别为2 3 5 s 和2 3 5 l ，其中2 3 5 s 分子量较小。因为2 3 5 l 和来自鸡 3 蛋白的亲和素( a v i d i n ，a v ) 具有相同的结合生物素的能力，所以被称作链霉亲 和素。 链霉亲和素的相对分子量为7 20k d a ，由4 个完整的亚基组成( 图11 ) ，每个 亚基台有1 8 3 个氨基酸。在分泌过程中由丁发酵液中蛋白酶的作用，使链霉亲和 素失去前导肽和术端序列，形成约1 5 9 个氨基酸的单体，分子量降为1 50k d a ， 此即核心链霉亲和素，每个单体仍可以结合一个生物素分子，并能够进一步组 装形成四聚体链嚣亲和素。 链霉亲和素可以在高温、极端p h 和存在高浓度变性剂的环境下保持与生 物素的亲和性【4 ”。并且与亲和素相比，链霉亲和萦具有等电点低、含糖基少、 与生物素分子的结合具有高亲和力、强特异性、多级放大以及可行使桥聪作用 等特征。因此生物素链霉亲和素系统在低成本纯化、高灵敏度检测以及其它方 面具有卜分重要的实用价值4 24 ”。近年来开发的可与链霉亲和素特异性可逆 结合的链霉亲和素结合肽标签( s t r e p 标签) 又有力地推动了真核细胞表而展 示技术，以及蛋白质之间相互作用等方面的研究【埘4 ”。但昂贵的试剂价格，限 制了此敏感方法的推广和使用。因此开发和制各链霉亲和素产品，以满足国内 外市场需求，具有卜分重要的现实意义。 图11 四聚体链霉亲和素结构示意图 f i 9 1 ls t r u c t u r e o f t e t r a m e r i cs t a - e p t a , a d i n 第一章引言 1 2 2 生物素一链霉亲和素检测系统 1 2 2 1 酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 的原理 e l i s a 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相 载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免 疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本( 测定其中的抗体或抗原) 与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原 抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反 应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比 例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受 检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催 化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的灵敏度。 1 2 2 2 b a s e l i s a ( b i o t i n a v j d i n s y s t e me l i s a ) b a s 为生物素亲和素系统( b i o t i n a v i d i ns y s t e m ) 的略语。亲和素是一种糖蛋 白，分子量6 00 0 0 ，每个分子由4 个生物素结合亚基组成。生物素为小分子化 合物，分子量2 4 4 。用化学方法制成的衍生物素羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质 和糖等多种类型的分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲 和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，二者一经结 合就极为稳定。由于一个亲和素可与4 个生物素分子结合，因此可把b a s 与 e l i s a 法分为酶标记亲和素生物素( l a b ) 法和桥联亲和素生物素( a b c ) 法 两种类型。两者均以生物素标记的抗体( 或抗原) 代替原e l i s a 系统中的酶标 抗体( 或抗原) 。在l a b 中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加 酶标记的生物素以进一步提高敏感度。早在七十年代，人们就建立起了各种生 物素标记技术，合成了带有各种不同基因的生物素衍生物，使b a s 应用于医学 检测的各个领域。但由于亲和素是等电点为p i1 0 5 的糖蛋白，对聚苯乙烯和硝 酸纤维素膜等载体有较高的非特异性吸附，并且与组织细胞或d n a 也有非特异 性结合，因而在检测中常出现较高的阳性背景显色，使b a s 系统难以广泛应用 m 。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在e l i s a 中有替代前者的趋势。 b a s 在e l i s a 中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放 大。可以在固相上先预包被亲和素，利用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物 5 第一章引言 素结合，通过亲和素生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。这种包被 法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且可使其结合点充分暴露。另外，在常 规e l i s a 中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素酶结合物， 以放大反应信号。桥联法a b c - e l i s a ( a v i d i nb i o t i nc o m p l e x - e l i s a ) 夹心法 测抗原的过程见图1 2 。 羔i 土王王兰 _ b 抗俸 m 钫紊聿遥床和寨 h 酶- 皇物素 图1 2 桥联法, m 3 c e l i s a 夹心法测抗原 f i g1 2a gm e a s u r e m e n tb ya v i d i nb i o t i nc o m p l e x - e l i s a 目前，b a s 以其独特的生物学特性和多种多样的标记技术，被广泛应用于 免疫学、微生物学、免疫化学、免疫病理学及分子生物学等许多学科的实验研 究领域【4 7 】。 1 。2 3 微生物生产链霉亲和素的研究进展 目前链霉亲和素多使用s t r e p t o m y c e sa v i d i n i i 发酵获得，但其产量较低，仅 为1 0 5 0m g l 4 8 巧2 1 。2 0 0 1 年，刘丽盼5 4 1 等人从8 0 0 多株放线菌中筛选到了一 株能够生产链霉亲和素的放线菌，命名为l - 1 8 3 ，进行培养条件优化后，得到 链霉亲和素的产量也只有111m g l 。 一 鉴于使用放线菌直接发酵生产链霉亲和素产量较低，链霉亲和素已先后在 大肠杆菌 5 5 1 、苏云金芽孢杆斟5 明等细菌中成功地获得表达。但是在细菌中表达 产物多以包涵体形式存在，其溶解性较差，易于聚集，天然活性降低岭，因此 筛选高产链霉亲和素的菌株，以便大规模开发和制备链霉亲和素产品，满足国 内外市场需求，具有十分重要的现实意义。 6 第一章引言 第三节高血脂症及其治疗药物普伐他汀 1 3 1 高血脂症简介 高血脂又称高脂血症，严格的定义应该为血脂紊乱或血脂异常，是指人体 内血清( 浆) 脂质的浓度水平超出了正常范围。常见的高血脂变化表现为下列 一项或多项指标异常：血清总胆固醇( t c ) 水平升高；血清甘油三酯( t g ) 水平 升高；血清高密度脂蛋白胆固醇( h d l c ) 水平异常减低【5 引。临床上根据病因可 将高血脂分为原发性与继发性两大类，原发性高血脂可能与有关的基因、脂蛋 白及其受体或参与脂代谢的酶类异常有关【5 9 】；后者则由其他疾病或明确病因引 起，发生率较低。多年的基础和临床医学以及流行病学研究明确证实，高血脂 是引起人类动脉粥样硬化性疾病最主要的因素之一。常见的心脑血管动脉粥样 硬化性疾病有：冠心病( 包括心肌梗死、心绞痛及猝死) 、脑梗死( 脑血栓、栓塞 及脑出血) 以及周围血管狭窄或阻塞性疾病，这些病发病率和致残率高、危害大、 病情进展凶险，其死亡率约占人类总死亡率的半数左右，是当今人类的第一杀 手【鲫。 1 3 。2 高血脂症的治疗药物 降血脂药物又称血脂调节药，指一类可以调整脂质代谢的药物，能够降低 过高的血清总胆固醇或甘油三酯和( 或) 升高过低的血清高密度脂蛋白胆固醇 以改善血脂状况。由于人体胆固醇来源于食物及体内生化合成，而后者占全部 胆固醇来源的7 0 一- - 8 0 。因此，降血脂药按照疗效及机制可分为阻止胆固醇吸 收( 包括重吸收) 、抑制体内过多的胆固醇合成及促进胆固醇代谢三类药物。 1 3 2 。1 阻止胆固醇吸收的药物 此类药为胆酸螯合剂类药物，包括树脂类、新霉素类、b 2 谷固醇及活性炭 等 6 1 1 ，适用于原发性高胆固醇血症，是高p 脂蛋白血症的首选药【6 2 1 。该类药共同 的调血脂机制是在肠道与胆酸结合形成稳定的络合物，干扰肝肠循环，阻止胆 酸或胆固醇从肠道吸收，促进胆酸或胆固醇随粪便排出，促进胆固醇的降解及 排出 6 3 】。对妊娠高血脂患者，树脂类药物是惟一安全的降脂药物。 7 第一章引言 1 3 2 2 抑制胆固醇合成或促进胆固醇代谢的药物 从乙酰辅酶a 开始，在控制合成速度的关键酶羟甲基戊二酰辅酶a 还原酶 ( h m g c o a 还原酶) 及其他一些非关键酶的催化下，大约经过2 0 多个发骤最终 完成胆固醇在体内的合成【叫。然后再在乙酰胆固醇乙酰转移酶( a c a t ) 催化下在 胆固醇3 位羟基导入乙酰基生成胆固醇酯。因此，依据作用于胆固醇生物合成及 代谢过程中不同的酶，可将该类降脂药分为h m g c o a 还原酶抑制剂类、a c a t 抑制剂类及胆固醇生物合成过程中其他非关键酶抑制剂类。 1 h m g c o a 还原酶抑制剂 h m g c o a 还原酶抑制剂的代表药物是他汀类药物，由于其降血脂效果显 著，已成为降血脂的首选药物，也一直是研究开发的热点。 2 a c a t 抑制剂 a c a t 抑制剂 6 5 1 类药物开辟了新的高胆固醇血症治疗机制。通过抑制 a c a t ，使机体吸收胆固醇减少，从而降低血清中t c 。a c a t 能催化胆固醇三位 羟基辅酶a ，将酯酰基转入后生成胆固醇酯酶( c e ) ，后者对极低密度脂蛋白 ( v l d l ) 形成动脉硬化病变起关键作用，抑制a c a t 有利于降低t c 水平，减少病 变中的c e 。代表药物阿伐麦布被认为具有直接抗动脉粥样硬化作用，临床表明 其对降低血液中的t c 、v l d l 有很好的效果。其他正在研发中的药物包括微粒体 甘油三脂( m t p ) 抑制剂6 6 1 ，胆固醇酯转移蛋白( c e t p ) 抑制刹6 7 1 ，固醇断裂活化 蛋白( s c a p ) 配体【6 8 】等等。 1 3 2 3 升高密度脂蛋白( h d l ) 类药物 由于很多降血脂药物都兼有升h d l 的作用，因此，此类药物主要指以升高 h d l 为主的降血脂药物。h d l 的抗动脉粥样硬化作用可能与它能将周围组织包 括动脉壁内的胆固醇转运到肝脏进行代谢有关。最近研究发现，h d l 还具有抗 低密度脂蛋i 刍( l d l ) 氧化、修复损伤内皮细胞及稳定前列环素的活性。因此，保 持较高水平的h d l 可有效地改善血脂状况。 1 3 2 4 降t g 类药物 1 贝特类( 苯氧酸类) 贝特类降脂药物是一类人工合成的过氧化酶体增殖激活受体o t ( p p a r ( x ) 的配 第一章引言 体，能有效地延缓动脉粥样硬化的发展进程。贝特类是目前降t g 的最有效的首 选药物，对低密度脂蛋白胆固醇( l d l c ) 的疗效较差【6 9 1 。贝特类药物降脂机理为 激活p p a r a 诱导脂蛋白酯酶表达，促进v l d l 、乳糜微粒( c m ) 和中密度脂蛋白 ( i d l ) 等富含甘油三酯的脂蛋白颗粒中的甘油三酯水解；诱导肝脏特异性脂肪酸 转运蛋白和乙酰辅酶a 合成酶表达，促进肝脏摄取脂肪酸、抑制肝脏合成甘油三 酯，诱导肝细胞脂蛋白a p o ai 和a p o ai i 基因的表达，增i j i i h d l 合成及促进胆 固醇逆转运等。 2 烟酸类 烟酸类降脂药属b 族维生素，包括烟酸及其衍生物。当超过维生素作用的剂 量时，烟酸类可有明显的调节血脂的作用。烟酸类降脂药是一类广谱调血脂药， 对多种高脂血症有效，尤其适用于降低t g 的同时升高h d l c ，且可促使l d l 颗 粒转化为无致动脉粥样硬化的a 表型7 0 】。此外，烟酸类还是目前最有效的降低脂 蛋白a ( l pa ) 、升高h d l c 的药物。临床常用的烟酸缓释胶囊作用平缓，可降低普 通制剂的副作用。 3 多烯类 多烯类降脂药为多不饱和脂肪酸，降脂机制是与t c 结合为酯，促进其降解 为胆汁酸随胆汁排出，使血中t c 、t g 浓度下降，对h d l c 、l d l c 的水平影响 小，主要用于治疗高甘油三脂症。 1 3 3 羟甲基戊二酰辅酶a ( h m g - c o a ) 还原酶抑制剂 1 3 3 1 研究概况 血浆胆固醇主要有两种来源途径，一是从食物中吸收来的外源性胆固醇， 对于无确定疾病的高胆固醇血症的病人来说，单纯地通过饮食治疗减少外源性 胆固醇的摄入即可将血浆胆固醇控制在正常水平；另一途径是来自体内合成的 内源性胆固醇，人体中约7 0 胆固醇由体内合成，其中5 0 以上在肝脏合成。 因此抑制肝脏过多的胆固醇合成是防治心血管病的一种有效途径】。 胆固醇合成从乙酞辅酶a 开始，经过2 0 个步骤最终合成胆固醇。其合成 途径如图1 3 所示。 9 第一章引言 乙晚镰醇a - - - - - - - _ l 食 翮噱g - c 峨还琢奠 h m b 锨 柚n 柚 v c h z o m c 嘞 异为烯焦瓣麓豳 觏嘲一 图1 3 胆同醇的合成途径 f i g1 3p a t h w a yo fc h o l e s t e r o lb i o s y n t h e s i s 在这个途径中，l y n e n 和f e r g u s o n 于19 5 8 年分别地发现h m g - c o a 还原 酶是胆固醇合成的限速酶。在胆固醇生物合成过程中，h m g c o a 在h m g c o a 还原酶作用下还原成甲羟戊酸，然后再经一系列步骤合成胆固醇和其他产物 7 1 】。 h m g c o a 还原酶抑制剂结构式中的开放酸部分，与h m g c o a 极为相似，对 胆固醇生物合成限速酶( h m g - - c o a 还原酶) 有特异的竞争性抑制作用【7 2 1 。因 此，通过h m g c o a 还原酶抑制剂可减慢胆固醇的生物合成，从而降低血浆中 的胆固醇浓度，减少高胆固醇血症的发病几率。h m g c o a 还原酶抑制剂的发 现与开发，为治疗高血脂症导致的动脉硬化和冠心病提供了新的途径。 目前用于治疗高胆固醇血症的h m g c o a 还原酶抑制剂主要包括美伐他 汀、普伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀等，他们统称为他汀类药物。 1 3 3 2 他汀类药物 1 0 峄 酞 8 g 心 第一章引言 1 美伐他汀( c o m p a c t i n 、m l 一2 3 6 b ) 美伐他汀( 图1 4 ) 是一种真菌的次生代谢产物，于1 9 7 6 年由a k i r ae n d o 【7 3 j 从真菌桔青霉( p e n i c i l l i u mc i t r i n u m ) 中发现，并于同年由a c xb r o w n 7 4 】从 p e n i c i l l i u mb r v i c o m p a c t u m 中分离出来，不久即证明是h m g c o a 还原酶的选择 性和竞争性抑制剂。虽然美伐他汀能够降低人体内胆固醇水平，但随后发现一 种被称为普伐他汀的美伐他汀衍生物在这方面更具功效，从生物化学角度来说， 美伐他汀可以通过其结构内的某个特定碳的羟基化转化为普伐他汀。因此，美 伐他汀可以用作普伐他汀生产的中间体或初始材料【| 7 5 】。作为生产普伐他汀的前 体或原料，其纯度在不低于8 0 时即可使用。 2 普伐他汀( p r a v a s t a t i n ) 普伐他汀( 图1 4 ) 适用于原发性高胆固醇血症，普法他汀最初作为美伐他 汀在狗尿中的微量代谢活性组分而被发现f 7 6 】，由于其能显著降低人体血浆中胆 固醇水平，所以在临床上被用于治疗高血脂症( i ia 和i ib 型) ( 7 刀。它通过两方 面发挥其降脂作用：一是通过可逆性抑制h m g c o a 还原酶的活性，使细胞内胆 固醇的量有一定程度的降低，导致细胞表面l d l 受体数增加，从而加强受体介导 的l d l c 的分解代谢及血液中l d l c 的清除；二是通过抑制l d l c 的前体 v