（植物学专业论文）水稻osas2基因的分离及其在拟南芥和水稻中的功能分析.pdf

英文缩写符号及中英文对照表 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 i 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：曼垄 导师签名：龛蚴 山东农业大学博士学位论文 水稻o s a s 2 基因的分离及其在拟南芥和水稻中的功能分析 专业：植物学 指导教师：张宪省教授 博士研究生：马燕 摘要 叶是高等植物重要的侧生器官。研究表明，叶发育的调控机理十分复杂。环境因素 和植物自身发育过程的基因共同作用调节叶的发育。 单子叶禾本科植物的叶与双子叶植物的叶在形态和结构上具有明显的差异，两者的 发育调节机制也可能存在差异。近年来，人们借助于拟南芥、金鱼草等一些模式材料进 行植物叶发育的研究，对双子叶叶发育的调控机理有了较深入的了解。但是对于单子叶 植物叶发育过程的分子机制了解甚少。水稻( o r y z a s a t i v a l ) 属于单子叶禾本科植物， 也是一种重要的粮食作物，研究其叶的发育具有重要的理论及生产实际意义。编码 l a t e r a lo r g a nb o u n d a r i e s ( l o b ) - d o m a i n 的基因为植物所特有，他们构成了 一个基因家族，对植物的生长发育起重要调节作用。在双子叶植物中，已有的研究结果 表明，许多具有l o b - d o m a i n 的基因决定叶等侧生器官的极性建立，并对侧生器官的发 育起重要的调控作用。本研究从水稻中分离出两个具有l o b d o m a i n 基因保守区域特征 的基因，并对其表达模式及功能进行了分析，研究工作为揭示水稻侧生器官发育的分子 机理提供了重要资料。主要结果和结论如下； 1 仍沮铭的分离及其序列特征 从水稻的幼叶中分离出o s a s 2 ( _ o r y z a s _ a t i v a a s y m m e t r i c l e a v e s 2 ) ( e f 5 4 0 7 6 6 ) 。 o s a s 2 基因的c d n a 全长为8 2 4b p ，编码2 7 0 个氨基酸残基。对其编码的氨基酸序列 分析表明，该基因编码的氨基酸序列具有l o b _ d o m a i n ，在l o b i d o m a i n 中具c 结构域 和g a s 结构域，是l o b - d o m a i n 基因家族第一类基因成员氨基酸序列比较分析与分 子进化树分析表明，o s a s 2 蛋白与拟南芥的a s 2 聚合在一起，是拟南芥a s 2 的同源基 因。 2 o s a s 2 的表达模式分析 应用r t - p c r 方法及原位杂交的方法对o s a s 2 表达模式进行了分析。o s a s 2 在水稻 的营养器官( 根、茎、叶) 和生殖器官( 花及授粉后的种子) 中广泛表达，在幼嫩的器 水稻o s a s 2 基因的分离及其在拟南芥和水稻中的功能分析 官中表达水平相对较高。原位杂交结果显示，与拟南芥a 9 2 不同，该基因在水稻苗端分 生组织中表达，但相对较弱，在叶原基、幼叶及生殖器官中表达较强。o s a $ 2 的m r n a 主要在幼叶的远轴面积累。以上结果表明，o s a s 2 基因可能参与苗端分生组织的特征决 定及侧生器官的发育调控。 3 o s a s 2 在拟南芥和水稻中的功能分析 过量表达拟南芥的a s 2 影响其侧生器官的发育及叶的近远轴极性建立。转3 5 s ： a s 2 植株的子叶及叶均向近轴面卷曲，叶狭长，在叶背面有的形成指状突起；在开花期，部 分转基因植株的花序不伸长，花梗短，花萼背面有凸起，花瓣向内卷曲，花不育。组织 学分析表明其叶肉组织近远轴极性分化异常。为了比较o s a $ 2 基因与拟南芥a s 2 基因 的功能，我们构建了3 5 s ：0 s a s 2 正义表达载体，转化野生型拟南芥。所有转3 5 s ：0 s a s 2 的拟南芥植株均比野生型植株明显矮小，叶狭窄，叶柄短而且较宽，叶片的延展受到严 重限制：子叶及叶向近轴面弯曲，并常扭曲，在叶的远轴面形成突起；在开花期，转 3 5 s ：0 s a s 2 的植株花序几乎不伸长，花器官发育异常，雄蕊花丝伸长受到抑制，子房比 野生型短，花常不育。对3 5 s ：0 s a s 2 转基因拟南芥植株莲座时的组织学分析表明，转 基因植株叶片的叶肉组织极性分化异常，远轴面细胞被具有近轴面特征的细胞取代。以 上研究结果表明，o s a s 2 与拟南芥a s 2 基因在决定叶近远轴极性建立的功能上具有一定 的保守性，但它们的功能也存在一定的差异。o s a s 2 影响拟南芥苗端分生组织及侧生器 官的正常发育。 为进一步研究o s a $ 2 的功能，分别构建u b i ：o s a s 2 正义表达载体及u b i ：a n t i - o s a s 2 反义表达载体，转化水稻。与对照相比，转u b i ：o s a s 2 的愈伤组织可产生绿色芽点，但 分化延迟。其中只有极少数绿色芽点能进一步分化产生异常的具有叶状结构的苗，随后 停止发育。组织学分析结果显示，转u b i ：o s a s 2 愈伤组织的细胞能保持较长时间的分裂 能力，但是细胞分化受到抑制。转基因愈伤组织中促进细胞分裂的基因o r y z a , c y c d 3 ；i 表达量提高。在分化绿色芽点的组织中，检测到水稻分生组织特征基因o s h l ( o r y g a s a t i v a h o m e o b o x l ) 及影响侧生器官分化的o s w o x 3 ( o r y z a s a t i v aw u s - l i k e h o m e o b o x 3 ) 基因有较高水平的表达。而转反义基因的愈伤组织与对照的愈伤组织相似，可分化成苗， 其表型正在进一步分析中。上述研究结果表明，不同于双子叶植物拟南芥的a s 2 基因， 水稻o s a s 2 基因不仅调节侧生器官的发育，而且在维持苗的正常分化方面亦起重要作 用。 在水稻中，o s a s 2 可能通过调节细胞分裂相关基因及分生组织特征基因的表达水 2 山东农业大学博士学位论文 平，维持苗的正常分化及侧生器官的正常发育。 4 o s l o b l 的分离及其表达模式 我们从水稻的根尖分离了o s l o b i ( _ o r y z as _ a t i v a 三0 四j ) ( e f 5 4 0 7 6 7 ) 。o s l o b l 基因的e d n a 全长为7 7 4b p ，编码2 5 3 个氨基酸残基。氨基酸序列分析表明，该基因 编码的氨基酸序列也具有l o b - d o m a i n ，在l o b - d o m a i n 中具c 结构域和g a s 结构域， 也是l o b d o m a i n 基因家族第一类基因成员。氨基酸序列比较分析与分子进化树分析表 明，o s l o b l 与拟南芥的l o b 聚合在一起，为水稻的l o b 同源基因：o s a s 2 与o s l o b l 之间也具有较高的同源性。 原位杂交结果显示，o s l o b l 的表达模式与o s a s 2 相似，在苗端分生组织、叶原基、 幼叶及花器官中均有表达，但o s l o b i 的m r n a 在幼叶中积累无极性。以上结果表明， o s l o b l 基因可能参与苗端分生组织的特征决定及侧生器官的发育调控。 关键词：水稻；拟南芥；o s a s 2 so s l o b l 基因分离；功能分析 3 水稻o s 彳s 2 基因的分离及其在拟南芥和水稻中的功能分析 f u n c t i o n a la n a l y s i so fo s a s 2g e n ei na r a b i d o p s i sa n dr i c e m a j o r ：b o t a n y s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rz h a n g x i a ns h e n g p h dc a n d i d a t e ：m ay a h l e a f i st h ei m p o r t a n tl a t e r a lo r g a n so f h i g h e rp l a n t s t h ed e v e l o p m e n to f l e a f i su n d e rt h e c o n l r o lo fb o t he n v i r o n m e n t a lf a c t o ma n di m c m a lg e n e t i cf a c t o r s i na d d i t i o nt ot h e d i f f e r e n c e so fl e a fm o r p h o l o g ya n ds t r u c t u r eb e h v 嘲t h em o n o c o t sa n dd i c o t s t h e m e c h a n i s mo fl e a fd e v e l o p m e n tm a yb ed i f f e r e n t i nr e c e n ty e a r s ，t h es t u d i e so nm u t a n t so f a r a b i d o p s i sa n da n t i r r h i n u mh a v ep r o v i d e di m p o r t a n tc l u e st ou n d e r s t a n dt h em o l e c u l a r m e c h a n i s mc o n t r o l l i n gl e a fd e v e l o p m e n to fd i c o t s h o w e v e r ，l i t t e ri sk n o w na b o u tt h e r e g u l a t i o no fl e a fd e v e l o p m e n ti nm o n o c o t s r i c ei sam o n o c o ta n da l li m p o r t a n tc e r e a l s oi t i si m p o r t a n tt od e t e r m i n et h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f i t sl e a f d e v e l o p m e m t h eg e n e sc o n t a i n i n gl a t e r a lo r g a nb o u n d a r i e s ( l o b ) - - d o m a i n , f o u n di n p l a n t so n l y , p l a y e da l li m p o r t a n tr o l ei np l a n td e v e l o p m e n t f o re x a m p l e ，m a n yl o b - d o m a i n g e n e so fd i c o th a db e e ni d e n t i f i e da n dt h e i rf u n c t i o ni nd e t e r m i n i n gp o l a r i t ) ，a n dd e v e l o p m e n t o fl a t e r a l o r g a n si n c l u d i n gl e a fw a sr e v e a l e d i nt h i ss t u d y , w ei s o l a t e dt w ol o b - d o m a i n g e n e s ，o s a s 2a n do s l o b l ，f r o mr i c e ( o r y z as a t i v a ) a n da n a l y z e dt h e i re x p r e s s i o np a t t e r n s a n df u n c t i o n si np l a n t d e v e l o p m e n t o u rd a t ap r o v i d es o m ei m p o r t a n ti n f o r m a t i o nt o u n d e r s t a n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo ff l e el e a fd e v e l o p m e n t t h er e s u l t sa n dc o n c l u s i o n s a r e a s f o l l o w s ： 1 b o i n t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fo s a s 2 t oi n v e s t i g a t et h er e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fl e a fa b a x i a l - a d a x i a lp o l a r i t yi nr i c e , w e i s o l a t e df u l ll e n g t hc d n a so fo s a s 2f r o mt h ey o u n gl e a v e st h ef u l ll e n g t ho fo s a s 2e d n a w a s8 2 4 b p , e n c o d i n ga p r e d i c t e dp r o t e i nw i t h2 7 0 a m i n oa c i dr e s i d u e s i ni t s nl e r n l i l n l 8 ，t h e p r o t e i n sh a dl o bd o m a i nw h i c hc o n t a i n i n gcm o t i fa n dg a sm o t i f s e q u e n c e sa n a l y s i s r e v e a l e dt h a to s a s 2b e l o n gt ot h ec l a s sil o bd o m a i nf a m i l y s e q u e n c i n ga n d p h y l o g e n e t i ca n a l y s i ss h o w e dt h a to s a s 2w a sc l o s e rt oa r a b i d o p s i sa s 2s u g g e s t i n gt h a t 0 s a s 2w e r et h eo r t h o l o g so f a s 2 4 山东农业大学博士学位论文 2 a n a l y s i go fo s a s 2e x p r e s s i o np a t t e r n t h e e x p r e s s i o np a t t e r no f o s a s 2w a sd e t e r m i n e db yr e v e r s et r a n s c r i p t a s e - m e d i a t e d ( r d p c ra n di ns i t uh y b r i d i z a t i o n o s a $ 2g e n eg a n s c f i p t s f e d e t e c t e di nr i c ev e g e t a t i v ea n d r e p r o d u c t i v eo r g a n s t h ee x p r e s s i o no fo s a s 2w f l $ h i g h e ri ny o u n go r g a n st h a ni nm a t u r e o r g a n s i ns i t uh y b r i d i z a t i o nr e v e a l e dt h a td i f f e r e n tf m m a s 2t h ee x p r e s s i o no fo s a s 2w a s d e t e c t e di ns h o o ta p i c a lm e r i s t e m b u tw a sl o w e rt h a nt h a ti nl e a fp r i m o r d i u m , y o u n gl e a fa n d r e p r o d u c t i v eo r g a n t h eo s a s 2m r n aa c c u m u l a t e di nt h ea b a x i a lp a r to fl e a fp r i r n o r d i 乱 t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a to s a s 2w e r ei n v o l v e di nt h ed e t e r m i n a t i o no fs h o o ta p i c a l m e r i s t e ma n dt h er e g u l a t i o no f l a t e r a lo r g a nd e v e l o p m e n t 3 f u n c t i o na n a l y s i so fo s a s 2i na r a b i d o p s ba n dr i c e t h eo v e r e x p r e s s i o no fa s 2f u n c t i o n e di nl a t e r a lo r g a nd e v e l o p m e n ta n dp o l a r i t y d e t e r m i n a t i o no f t r a n s g e n i cp l a n t s c o t y l e d o n sa n dl e a v e so f a r a b i d o p s i se x p r e s s e d3 5 s ： m 8 2 w e r en a r r o wa n dc u r l e dt o w a r dt h ea d a x i a ls i d e ，a n df i n g e r - l i k eo u t g r o w t ho nt h ea b a x i a ls i d e o fl e a f t h ee l o n g a t i o no fi n f l o r e s c e n c ew a ss e r i o u s l yr e m a i n e da n dt h es h o r tp e d u n c l e , p r o t r u s i v ec a l y c e so nt h ea b a x i a ls i & a n ds t e l i l ef l o w e rw e r ef o u n di ns o m et r a n s g e n i cp l a n t s f u r t h e ra n a l y s i so f t h er o s e t t el e a v e so f t r a n s g e n i cp l a n t sr e v e a l e dt h ep o l a r i t ya b n o r m a l i t yo f t h ei n t e m a lt i s s u e si nl e a f m e s o p h y l l t oc o m p a r et h ef u n c t i o n sb e t w e e no s a s 2a n da s 2 ，w et r a n s f e r r e d3 5 s ：o s a s 2i n t o a r a b i d o p s i sa n da n a l y z e dt h ep h e n o t y p eo ft r a n s g e n i cp l a n t s c o m p a r e dw i t ht h ew i l dt y p e t h et r a n s g e n i ca r a b i d o p s i se x h i b i t e dd w a r f i n gp l a n t , n a r r o w e rl e a f , s h o r t e ra n d w i d e rl e a f s t a l k a n ds m a l l e rl e a f t h ei n f l o r e s c e n c es t e m so f3 5 s ：0 s a s 2p l a n t sd i dn o te l o n g a t e i na d d i t i o n , t h et x a n s g e n i cp l a n th a da b n o r m a lf l o r a lo r g a n s ，s u c ha ss t 日i l ef l o w e ra n ds h o r t e rf i l a m e n t a n do v a r yt h a nt h o s eo ft h ew i l dt y p e f u r t h e ra n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h ea b a x i a lc e l l so f m e s o p h y uo f t r a u s g e n i cp l a n t so w n e d $ o m et r a i t so f t h ea d a x i a lc e l l s ，i n d i c a t i n gt h ea b n o r m a l p o l a r i t yo fm e s o p h y l lo ft m n s g e n i cp l a n t s o u rr e s u l t si n d i c a t e dt h a to s a s 2w b $ i n v o l v e di n t h er e g u l a t i o no fl a t e ro r g a nd e v e l o p m e n tw h i c hw a ss i l l l i l a tt oa r a b i d o p s i sa s b u tt h e ya l s o h a v e 9 0 m ed i f f e r e n tf u n c t i o u si nr e g u l a t el a t e r a lo r g a n sd e v e l o p m e n t o s a s 2a f f e c t e dt h e s h o o ta p i c a lm e r i s t e ma n dl a t e r a lo r g a nd e v e l o p m e n t t od e t e - t i n j n eo s a s 2f o n c t i o mi nr i c ed e v e l o p m e n t , t h eu b i ：o s a s 2a n du b i ：a n t i - o s a s 2 w e l et r a n s f e r r e di n t ot i e a l t h o u g hg r e e nt i s s u e sw e i ef o u n di nt h ec a l l u so v e r e x p r e s s e d 5 水稻o s a s 2 基园的分离及其在拟南芥和水稻中的功能分析 o s a s 2 ，t h ed i f f e r e n t i a t i o no ft r a n s g e n i ec a l l u sw a sl a t e rt h a nt h a to ft h ec o n t r 0 1 f e wg r e e n t i s s u e sc o u l dp r o d u c ea b n o r m a ls h o o t sw i t hl e a f - l i k et i s s u e ，h o w e v e r , t h eg r o w t ho fs e e d l i n g s w a sa n s t e da f t e r w a r d s h i s t o l o g ya n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h ec e l ld i v i s i o nc a p a c i t yo f t r a n s g e n i cc a l l u sk e p tl o n g e rt h a nt h a to ft h ec o n t r o l ，h o w e v e r ，t h ed i f f e r e n t i a t i o no ft h e s e c e l l sw a si n h i b i t e d ka d d i t i o n , t h ee x p r e s s i o no fo r y z a , c y c d 3 ；1 。ag e n ei n v o l v e di n p r o m o t i n gc e l ld i v i s i o n , w a sn p r e g u l a t e di nc a l l u s a n dt h eu p r e g u l a t e de x p r e s s i o no fo g y g d s a t i v ah o m e o b o x l ( o s h l ) ，am e r i s t e m - c h a r a e t e r i s t i cg e n e ，a n do r y z as a t i v aw u s - l i k e h o m e o b o x 3 ( o s w o x s ) , ag e n ei n v o l v e di nd i f f e r e n t i a t i o nd fl a t e r a lo r g a n s w e r ed e t e c t e di n t h e t r a n s g e n i e c a l l u so f o v e r e x p r e s s i n g o s a s 2 t h e t r a n s g e n i c c a l l u s e x p r e s s i n g u b i ：a n t i o s a s 2c o u l dd i f f e r e n t i a t ei n t op l a n t s ，w h i c hi ss i m i l a rt ot h a to ft h ec o n t r 0 1 t h e p h c n o t y p eo fu b i ：a n t i - o s a s 2p l a n t si sb e i n ga n a y z e d t h e s er e s u t ss u g g e s t e dt h a td i f f e r e n t f r o mt h ef u n c t i o no fa r a b i d o p s i s s 2 o s a s 2n o to n l yw a si n v o l v e di nl a t e r a lo r g a n d e v e l o p m e n tb u ta l s op l a y e da ni m p o r t a n t r o l ei ns h o o td i f f e r e 喇o na n d d e v e l o p m e n t o s a s 2m i g h tp l a yi t sr o l e si ns h o o td i f f e r e n t i a t i o na n dd e v e l o p m e n tb yr e g u l a t i n gt h e e x p r e s s i o nl e v e l so f t h eg e n e sw h i c hi n v o l v e di nc e l ld i v i s i o na n dm e r i s t e mf o r m a t i o n 4 i s o l a t i o na n de x p r e s s i o np a t t e r na n a l y s i so to s l o b l w ei s o l a t e df u l ll e n g t hc d n a so f o s l o b lf r o mt h er o o tt i p s t h ee d n al e n g t ha n dt h e p r e d i c t e dp r o t e i no fo s l o b lw e r e7 7 4 b pa n d2 5 3a m i n oa c i dr e s i d u e s r e s p e c t i v e l y n 忙 p r o t e i nh a dl o bd o m a i nw h i c hc o n t a i n i n gcm o t i fa n dg a sm o t i f s e q u e n c e sa n a l y s i s r e v e a l e dt h a to s l o b lb e l o n gt ot h ec l a s sil o bd o m a i nf a m i l y s e q u e n c i n ga n d p h y l o g e n e t i ea n a l y s i ss h o w e dt h a to s l o b lw a sc l o s e rt oa r a b i d o p s i sl o b ，s u g g e s t i n gt h a t o s l o b lw e r et h eo r t h o l o g so f l o b a so s a s 2 ，t h ee x p r e s s i o no f o s l o b lm a i n l yw a sd e t e c t e di ns h o o ta p i c a lm e r i s t e m , l e a f p r i m o r d i u m , y o u n gl e a fa n df l o r a lo r g a n h o w e v e r a p p a r e mp o l a r i t yo fo s l o b lm r n a d i s t r i b u t i o nw a sf o u n di ny o u n gl e a f 1 1 l c s er e s u l t si n d i c a t e dt h a td 吐0 四jw c t ei n v o l v e di n t h ed e t e r m i n a t i o no f s h o o ta p i c a lm c r i s t e r aa n dt h er e g u l a t i o no f l a t e r a lo r g a nd e v e l o p m e n t k e yw o r d s ：r i c e ；a r a b i d o p s i s ；o s a s 2 ；o s l o b l ；g e n ei s o l a t i o n ；f u n c t i o n a la n a l y s i s 6 山东农业大学博士学位论文 l 刖暑 叶是植物重要的地上器官，已经存在并迸化了约三亿六千万年( k n e r i c kc ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。为了适应自然环境，植物叶在漫长的进化过程中发展成今天这样的千姿百态。 绝大多数单叶由叶基( 1 e a f b a s e ) 、叶柄( p e t i o l e o r r a c h i s ) 和叶片( b l a d e o r l a m i n a ) 三 部分构成。但是不同物种叶的大小、颜色、形状差别非常大，即使是在同一植物中，叶 发育的不同阶段形状也可以完全不同。实验证据表明，叶发育的调控机理十分复杂。环 境因素和植物自身发育过程中的基因共同作用调节叶的发育过程。近年来，人们借助于 拟南芥、金鱼草等一些模式系统进行植物叶发育的研究，对叶发育的调控机理有了较深 入的了解。 l1 苗端分生组织与叶原基的起始 叶和花属于植物的侧生器官。侧生器官的原基是在地上部分的苗端分生组织( s h o o t a p i c a lm e r i s t e m ，s a m ) 中形成的( h u d s o nc ta 1 ，1 9 9 9 ；s c a n l o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。根据细胞质 的稠密程度和细胞的分裂速度，苗端分生组织可以被分为3 个部分：在s a m 的中央， 有一团缓慢分裂的细胞，组成s a m 的中心区( c e n t r a lz o n e ，c z ) 。这些细胞，始终处 于非分化的状态。在s a m 中心区的外围，细胞分裂的速度明显加快，这些快速分裂的 细胞，组成了s a m 的外周区( p e r i p h e r a lz o n e ，p z ) 。在外周区里，有一些成簇的细胞 性质开始发生变化，这些细胞称之为“基细胞”( f o u n d e rc e i l ) 。基细胞形成时，从表面 观察，细胞的形状并不发生明显变化，但是原位杂交实验显示这些细胞中的某些基因的 表达已经发生了改变。基细胞的分裂速度非常快，侧生器官的原基就是通过基细胞的分 裂形成的。肋区( 1 k 衄z o n e ，r z ) 细胞的分裂与分化形成茎的结构( k l a u sc ta 1 ，1 9 9 8 ； j e n n i f e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。( 图l - 1 ) 圈1 1 苗端分生组织的构造圈叶原基形成于边缘区域，原基以小的半球型产生并且发育成水平的叶片。在叶原基 中可以区分出背面与腹面姐) m ) l l i ( b ) 顶观图 7 水稻o s a $ 2 基因的分离及其在拟南芥和水稻中的功能分析 f i g ，1 - 1s c h e m e o f a s h o o t 却i c a l m e r i s t e m a l e a f p r i m o r d i u m i s f o r m e d i n t h e p p h e r d n c t h e p d m o r d i u m e m e r g e s a s a s m a l l d o m ee m d d e v e l o p s i n t o f l a t l e a v e s t h e a b a x i a la n da d a x i a ls i d e sa r c d i s t i n g u i s h e d i n t h e p r i m o r d i a a b , a b a x i a l s i d e ；a d a d a x i a ls i d e ；c z ，c e n t r a lz o n e ；p z , p e r i p h e r a lz o o e s i d ev i e w ；( b ) t o pv i e w 从系统发生的角度划分，苗端分生组织被划分成3 层细胞，l 1 、l 2 和l 3 ，侧生器 官的分化涉及到3 层细胞的协同作用。就植物叶的分化而言，这3 层细胞共同形成一个 叶原基，l l 发育成表皮，l 2 发育成叶肉组织，l 3 层细胞发育成维管束和髓( k l a u se ta 1 ， 1 9 9 8 ；j e n n i f e rv ta 1 ，2 0 0 0 ；白书农，2 0 0 3 ) 。 叶原基切除实验发现；先起始的叶原基会抑制自身周围的苗端分生组织起始新的叶 原基，这种效应可能是激素引起的( r h e i n h a r d te ta 1 ，2 0 0 0 ；m a t h y s ce ta 1 ，1 9 8 4 ) 。进一 步的研究表明，叶原基形成过程中，一定浓度的生长素诱导是必需的( v o g l e ra n d k u l d e m e i e r , 2 0 0 3 ) 。用生长素极性运输的抑制剂n p a ( n - i - n a p h t h y l p h t h a l a m i c a c i d ) 处 理番茄茎顶端，番茄茎的生长和s a m 的维持都不受影响，但是叶原基的形成完全停止 了，番茄的茎顶端呈针状。这种情况可能是外来的生长素无法在s a m 积累所造成。如 果在针状的茎顶端施加天然生长素i a a ，有i a a 的地方就被诱导长出叶原基( v o g l e ra n d k u h l e m e i e r , 2 0 0 3 ) 。这种现象在双子叶植物中普遍存在。拟南芥p i n l 突变体的表型就是 整个花序呈针状。p i n l 是由于生长素极性传导过程中的外运载体p i n 失去活性所造成 的突变体。同样，如果在p i n l 花序的顶端施加i a a ，这些地方就能够诱导长出花的原 基( r e i n h a r d te ta l ；2 0 0 0 ) 。从进化上讲，花是一种变态的叶，因此，这些植物的侧生器 官原基的诱导可能都有相似的调控机理。 在叶原基形成过程中，一些h o m c o b o x 基因起着极其重要的作用。玉米的 k n o t t e d l 1 i k e ( k n l ) 是植物中首先发现的h o m c o b o x 基因( v o i l b r e c h te a 1 ，1 9 9 1 ) 。 它编码一类转录因子，属于c l a s sik n o x 基因家族的成员。这类基因在基因功能和氨基 酸序列上具有同源性和保守性( k e r s t e t t e re ta 1 ，1 9 9 4 ) 。删j 基因参与s a m 的维持，它 的转录产物主要在茁端分生组织中表达，在幼叶原基中不表达，可能影响叶原基起始的 方式( j a c k s o n e t a l ，1 9 9 4 ；s m i t he t a l ，1 9 9 2 ) ，正常叶的发育需要抑制这类基因的表达。 在玉米中的隐性突变体( 1 0 s s - o f - f u n c t i o n ) 即k n l 抑制苗端分生组织产生侧生器官，异 位表达该基因则导致叶片上异位分生组织的形成( l i n c o l ne ta 1 ，1 9 9 4 ；l o n ge ta 1 ， 1 9 9 6 ) 。在双子叶植物中，k n l 的同源基因具有相似的功能。在拟南芥中，s a m 中表达 的k n o t t i d l 同源基因有4 个：k n a t l 、k n a t 2 、k n a t 6 衫s t m ( l i n c o l ne ta 1 1 9 9 4 ) 。 这些基因只在s a m 中表达而不在叶中表达( l i n c o l nc ta 1 ，1 9 9 4 ；l o n ge ta 1 ，1 9 9 6 ) 。对 s 山东农业大学博士学位论文 s t m 突变体的表型分析表明s t m 在苗端分生组织的形成中起着关键的作用。在s t m 突变 体中，从心形胚开始，胚的顶端分生组织的形成就受到抑制，最终突变体不能产生原套 一原体结构，但子叶发育正常( b a r t o na n dp o e t h i g ，1 9 9 3 ；e n d r i z z ie ta 1 ，1 9 9 6 ；l o n ge ta 1 ， 1 9 9 6 ) 。野生型拟南芥中，s t m m r n a 在球形胚中期( 约3 2 - 6 4 个细胞) 开始表达，仅 在即将形成胚的s a m 的缨胞中积累( l o n ge ta 1 ，1 9 9 6 ) ；在植株中，s t m 在s a m 中心 及边缘区表达，对维持苗端分生组织中央区域细胞处于未分化状态具有重要作用。过量 表达s t m 的3 5 s ：s t m 转基因植株体形矮小，不能产生正常的叶片( w i l l i a m s ，1 9 9 8 ) 。 k n o x 家族豹另一成